JP2009003267A

JP2009003267A - 細胞培養観察装置

Info

Publication number: JP2009003267A
Application number: JP2007165270A
Authority: JP
Inventors: Takayuki Uozumi; 孝之魚住; Taijiro Kiyota; 泰次郎清田
Original assignee: Nikon Corp
Current assignee: Nikon Corp
Priority date: 2007-06-22
Filing date: 2007-06-22
Publication date: 2009-01-08

Abstract

【課題】観察の対象となる細胞に含まれる蛍光物質の劣化を抑制する。
【解決手段】インキュベータ部１２の内部は、細胞の培養に適した培養環境に維持されており、透過光用LED４７は、細胞を観察するための光の合焦位置を検出する合焦位置検出時、および、細胞を透過する光の位相差により細胞を観察する位相差観察時に、培養環境内の観察の対象となる細胞に対し、近赤外領域の波長の光を照射する。また、蛍光用LED４８は、細胞に含まれる蛍光物質が励起した光により細胞を観察する蛍光観察時に、培養環境内の観察の対象となる細胞に対し、細胞に含まれる蛍光物質を励起させる波長の励起光を照射する。本発明は、例えば、細胞を培養するインキュベータに適用できる。
【選択図】図３

Description

本発明は、細胞培養観察装置に関し、特に、観察の対象となる細胞に含まれる蛍光物質の劣化を抑制することができるようにした細胞培養観察装置に関する。

従来、細胞の培養過程を観察する細胞培養観察装置では、細胞の培養に適した環境に維持されている培養環境で細胞が培養され、その細胞の位相差観察または蛍光観察が行われる。

位相差観察では、白色LED（Light Emitting Diode：発光ダイオード）やハロゲンランプなどが光源として用いられ、その光源からの光が観察の対象となる細胞に照射される。そして、画像の撮像に最適な焦点位置が検出され、その焦点位置にて、細胞を透過する光の位相差による画像が、CCD（Charge Coupled Devices：電荷結合素子）などの撮像素子により撮像される。

蛍光観察では、水銀ランプや、水銀ランプに類する光を発光する照明が光源として用いられ、その光源からの励起光が観察の対象となる細胞に照射されることにより、細胞に含まれる蛍光物質が励起され、その蛍光物質が蛍光する光による画像が、撮像素子により撮像される。

また、特許文献１には、光源である複数のLEDを、所定の外部トリガに基づいて駆動させ、それぞれのLEDからの励起光により細胞の蛍光観察を行う蛍光顕微鏡が開示されている。

特開２００５−１７３４８７号公報

ところで、従来の細胞培養観察装置では、位相差観察に用いられている光源の波長域が広く、その波長域には、微弱ながらも蛍光物質を励起させる波長が含まれることがあり、焦点位置の検出時や位相差観察時に、励起光が蛍光物質に照射され続けることがあった。また、励起光を用いて焦点位置の検出を行う細胞培養観察装置においては、蛍光物質に励起光が照射され続けていた。

このように、蛍光物質に励起光が照射され続けると、蛍光物質が劣化してしまい、蛍光観察時に、蛍光物質が観察に必要な光量の光を蛍光することができず、蛍光観察が困難になることがあった。

本発明は、このような状況に鑑みてなされたものであり、観察の対象となる細胞に含まれる蛍光物質の劣化を抑制することができるようにするものである。

本発明の一側面の細胞培養観察装置は、細胞の培養過程を観察する細胞培養観察装置であって、前記細胞の培養に適した培養環境を維持する培養環境維持手段と、前記細胞を観察するための光の合焦位置を検出する合焦位置検出時、および、前記細胞を透過する光の位相差により前記細胞を観察する位相差観察時に、前記培養環境内の観察の対象となる細胞に対し、近赤外領域の波長の光を照射する第１の照明手段と、前記細胞に含まれる蛍光物質が励起した光により前記細胞を観察する蛍光観察時に、前記培養環境内の観察の対象となる細胞に対し、前記細胞に含まれる蛍光物質を励起させる波長の励起光を照射する第２の照明手段とを備える。

本発明の一側面においては、細胞の培養に適した培養環境が維持され、細胞を観察するための光の合焦位置を検出する合焦位置検出時、および、細胞を透過する光の位相差により細胞を観察する位相差観察時に、培養環境内の観察の対象となる細胞に対し、近赤外領域の波長の光が照射される。また、細胞に含まれる蛍光物質が励起した光により細胞を観察する蛍光観察時に、培養環境内の観察の対象となる細胞に対し、細胞に含まれる蛍光物質を励起させる波長の励起光が照射される。

本発明の一側面によれば、観察の対象となる細胞に含まれる蛍光物質の劣化を抑制することができる。

以下に本発明の実施の形態を説明するが、本発明の構成要件と、明細書又は図面に記載の実施の形態との対応関係を例示すると、次のようになる。この記載は、本発明をサポートする実施の形態が、明細書又は図面に記載されていることを確認するためのものである。従って、明細書又は図面中には記載されているが、本発明の構成要件に対応する実施の形態として、ここには記載されていない実施の形態があったとしても、そのことは、その実施の形態が、その構成要件に対応するものではないことを意味するものではない。逆に、実施の形態が構成要件に対応するものとしてここに記載されていたとしても、そのことは、その実施の形態が、その構成要件以外の構成要件には対応しないものであることを意味するものでもない。

本発明の一側面の細胞培養観察装置は、細胞の培養過程を観察する細胞培養観察装置であって、
前記細胞の培養に適した培養環境を維持する培養環境維持手段（例えば、図３のインキュベータ部１２）と、
前記細胞を観察するための光の合焦位置を検出する合焦位置検出時、および、前記細胞を透過する光の位相差により前記細胞を観察する位相差観察時に、前記培養環境内の観察の対象となる細胞に対し、近赤外領域の波長の光を照射する第１の照明手段（例えば、図３の透過光用LED４７）と、
前記細胞に含まれる蛍光物質が励起した光により前記細胞を観察する蛍光観察時に、前記培養環境内の観察の対象となる細胞に対し、前記細胞に含まれる蛍光物質を励起させる波長の励起光を照射する第２の照明手段（例えば、図３の蛍光用LED４８）と
を備える。

以下、本発明を適用した具体的な実施の形態について、図面を参照しながら詳細に説明する。

図１は、本発明を適用した細胞培養観察装置の一実施の形態の構成例を示す斜視図である。

図１において、細胞培養観察装置１１は、インキュベータ部１２および架台部１３から構成されており、架台部１３の上部にインキュベータ部１２が配置されている。

インキュベータ部１２は、インキュベータ筐体２１およびインキュベータ扉２２から構成される。インキュベータ部１２では、インキュベータ筐体２１とインキュベータ扉２２とにより密閉された内部空間が、細胞を培養するのに適した環境を維持するように制御される。

例えば、インキュベータ筐体２１には、ペルチェ素子が用いられる温度調整装置、霧を噴出する噴霧装置、外部の二酸化炭素ボンベに接続されるガス導入部、内部空間の環境を検出する環境センサ（いずれも図示せず）などが設けらている。また、インキュベータ筐体２１およびインキュベータ扉２２は、内部に断熱材をそれぞれ有している。そして、例えば、インキュベータ筐体２１の内部空間の環境は、温度３７℃、湿度９０％、二酸化炭素濃度５％などに維持される。

インキュベータ扉２２は、インキュベータ筐体２１に対して開閉自在に取り付けられており、その表面には、細胞培養観察装置１１の操作に用いられる操作パネル２３が設けられている。

操作パネル２３は、例えば、ユーザにより操作されるタッチパネルであり、その表示部に、所定の間隔で細胞を撮像するスケジュールを設定するスケジュール設定画面や、撮像倍率や撮影ポイントなどの撮像条件を設定する撮像条件設定画面などのGUI（Graphical User Interface）を表示する。また、操作パネル２３は、ユーザの操作に応じた操作信号を、後述する図３の制御装置４４に供給する。

架台部１３は、筐体３１と扉３２Ａおよび３２Ｂとから構成されており、扉３２Ａおよび３２Ｂは、筐体３１に対して開閉自在に取り付けられている。また、架台部１３の内部には、後述する図３の蛍光用LED４８などが収納される。

次に、図２は、図１の矢印Ａ−Ａ方向から見た細胞培養観察装置１１の断面図である。

図２に示すように、インキュベータ筐体２１とインキュベータ扉２２とによりインキュベータ部１２の内部空間が密閉されており、この内部空間、即ち、細胞を培養するのに適した環境に維持されている空間を、以下、適宜、細胞培養環境と称する。

次に、図３を参照して、図１の細胞培養観察装置１１の構成について説明する。

図３の右側には、インキュベータ扉２２、並びに、架台部１３の扉３２Ａおよび３２Ｂを外した状態の細胞培養観察装置１１の正面図が示されている。図３の左側には、正面図の矢印Ｂ−Ｂ方向から見た細胞培養観察装置１１の断面図が示されている。

図３において、細胞培養観察装置１１は、ストッカ部４１、搬送部４２、観察ユニット４３、および制御装置４４から構成されている。

ストッカ部４１、および搬送部４２は、インキュベータ部１２の細胞培養環境内に収納されている。また、観察ユニット４３の上部は、インキュベータ部１２の細胞培養環境内に収納されており、観察ユニット４３の下部は、架台部１３の内部に収納されている。また、制御装置４４は、架台部１３の内部に収納されている。

ストッカ部４１は、培養される細胞が入れられる培養容器４５を複数収納する。ストッカ部４１には、図３に示すように、培養容器４５を載置する棚が、縦方向に複数設けられており、各々の棚は、その奥行き方向に、培養容器４５を複数載置することができる。

搬送部４２は、制御装置４４の制御に従って、所定の培養容器４５を、ストッカ部４１から観察ユニット４３に搬送する。

観察ユニット４３は、培養容器４５で培養されている細胞を撮像する撮像部４６や、培養容器４５で培養されている細胞に光を照射する透過光用LED４７および蛍光用LED４８などを備えており、培養容器４５で培養されている細胞の画像を撮像する。図３に示すように、透過光用LED４７は、インキュベータ部１２の細胞培養環境内に配置されており、撮像部４６および蛍光用LED４８は、インキュベータ部１２の細胞培養環境外の架台部１３の内部に配置されている。なお、観察ユニット４３については、図５を参照して詳述する。

制御装置４４には、ユーザの操作に応じた操作信号が、図１の操作パネル２３から供給され、制御装置４４は、ユーザの操作に応じて、細胞培養観察装置１１の各部を制御する。

例えば、制御装置４４は、搬送部４２を制御して、ストッカ部４１に収納されている所定の培養容器４５を、観察ユニット４３に搬送させる。また、制御装置４４は、操作パネル２３を制御して、スケジュール設定画面や撮影条件設定画面などのGUIを、操作パネル２３の表示部に適宜表示させる。また、制御装置４４は、インキュベータ筐体２１に設けられた環境センサの出力に応じて、細胞培養環境が、一定の温度、湿度、または二酸化炭素濃度に維持されるように、インキュベータ筐体２１に設けられた温度調整装置、噴霧装置、またはガス導入部をそれぞれ制御する。

次に、図４は、培養される細胞が入れられる培養容器４５の例を示す図である。

培養容器４５としては、例えば、ディッシュ４５Ａ、ウェルプレート４５Ｂ、または、フラスコ４５Ｃが用いられる。図４の１番上には、６個のディッシュ４５Ａが示されており、図４の上から２番目には、２４箇所のウェルを有するウェルプレート４５Ｂが示されており、図４の上から３番目（一番下）には、フラスコ４５Ｃが示されている。

ディッシュ４５Ａ、ウェルプレート４５Ｂ、またはフラスコ４５Ｃは、ホルダ５１によりそれぞれ保持され、ホルダ５１には、搬送部４２による搬送において利用される支持片５２が設けられている。また、ホルダ５１には、それぞれの培養容器４５（ディッシュ４５Ａ、ウェルプレート４５Ｂ、またはフラスコ４５Ｃ）を識別するための識別マーカ５３が付されている。

次に、図５を参照して、図３の観察ユニット４３について説明する。

図５の右側には、観察ユニット４３の正面図が示されており、図５の左側には、観察ユニット４３の側面図が示されている。

図５に示すように、観察ユニット４３は、透過光照明部６１、試料台６２、観察部６３、および蛍光照明部６４から構成される。

透過光照明部６１は、試料台６２の側部から上方向に延びた後に、試料台６２に載置される培養容器４５の上部に延びるようなアーム状の金物で形成されており、このアーム状の金物により、透過光照明部６１の内部と外部（即ち、細胞培養環境）とが仕切られている。また、透過光照明部６１の内部には、透過光用LED４７と透過光用光学系６５が収納されている。

透過光用LED４７は、例えば、600〜660ｎｍの波長域の光を発光し、透過光用LED４７から出力される光は、透過光用光学系６５を介して、試料台６２に載置される培養容器４５に照射される。

試料台６２は、透光性の材質により構成されており、透過光照明部６１からの光や、蛍光照明部６４からの光により励起した細胞に含まれる蛍光物質からの光が、観察部６３に導入されるようになっている。

また、試料台６２には、観察部６３に導入される光を集光する対物レンズ６６、対物レンズ６６を駆動してオートフォーカスを行うための駆動機構６７、および試料の所定の箇所を撮像することができるように、垂直方向（Ｚ方向）または水平方向（ＸおよびＹ方向）に、培養容器４５を移動させるステージ６８が設けられている。

観察部６３は、撮像部４６およびミラー６９から構成される。

ミラー６９は、透過光照明部６１からの光や、蛍光照明部６４の光により励起した細胞に含まれる蛍光物質からの蛍光を反射し、撮像部４６に入射させる。

撮像部４６は、CCDなどの撮像素子４６Ａを有しており、透過光照明部６１からの光による画像や、蛍光照明部６４からの光により励起した細胞に含まれる蛍光物質からの光による画像を撮像する。また、撮像部４６は、駆動機構６７やステージ６８を制御し、最適な焦点位置を検出するオートフォーカス制御部４６Ｂを有している。

オートフォーカス制御部４６Ｂは、駆動機構６７を制御して対物レンズ６６を駆動させ、撮像素子４６Ａにより撮像された画像に基づいて、概略的な焦点位置を検出する。その後、オートフォーカス制御部４６Ｂは、ステージ６８を制御して培養容器４５をＺ方向に微小量ずつ移動させ、それぞれのＺ方向の位置で撮像素子４６Ａにより撮像された画像に基づいて、最適な焦点位置を検出する。

蛍光照明部６４は、蛍光用LED４８ａ乃至４８ｃ、および蛍光用光学系７０から構成される。

蛍光用LED４８ａ乃至４８ｃは、それぞれ異なる波長の光、即ち、培養容器４５内の細胞（試料）の蛍光物質に応じた波長の光（励起光）を発光する。例えば、蛍光用LED４８ａは、440〜460ｎｍの励起光を発光し、蛍光用LED４８ｂは、460〜490ｎｍの励起光を発光し、蛍光用LED４８ｃは、520〜550ｎｍの励起光を発光する。また、蛍光用LED４８ａ乃至４８ｃは、図３の制御装置４４の制御に従って、撮像部４６による撮像のタイミングに同期して、発光する。

蛍光用光学系７０は、ミラー７１乃至７４、およびダイクロイックミラー７５乃至７７から構成され、蛍光用LED４８ａ乃至４８ｃからの励起光を反射または透過して、培養容器４５の細胞に照射させる。

ダイクロイックミラー７５乃至７７は、特定の波長の光を反射し、その他の波長の光を透過する。例えば、ダイクロイックミラー７５は、蛍光用LED４８ｂが発光する光を反射し、蛍光用LED４８ａが発光する光を透過する。ダイクロイックミラー７６は、蛍光用LED４８ａおよび４８ｂが発光する光を反射し、蛍光用LED４８ｃが発光する光を透過する。ダイクロイックミラー７７は、蛍光用LED４８ａ乃至４８ｃが発光する光を反射し、透過光照明部６１の透過光用LED４７が発光する光や、細胞に含まれる蛍光物質が蛍光することによる光を透過する。

次に、図６は、蛍光用LEDが発光する励起光の波長域と、その波長域の光により励起される蛍光タンパクとの対応関係の例を示す図である。

例えば、蛍光用LED（CFP）が発光する440〜460ｎｍの励起光により、励起波長439ｎｍおよび発光波長476ｎｍの蛍光タンパクであるECFPが励起される。

また、例えば、蛍光用LED（GFP）が発光する460〜490ｎｍの励起光により、励起波長458ｎｍおよび発光波長489ｎｍの蛍光タンパクであるAmCyan1が励起され、励起波長493ｎｍおよび発光波長505ｎｍの蛍光タンパクであるZsGreen1が励起され、励起波長484ｎｍおよび発光波長510ｎｍの蛍光タンパクであるEGFPが励起される。

また、例えば、蛍光用LED（RFP）が発光する520〜550ｎｍの励起光により、励起波長529ｎｍおよび発光波長539ｎｍの蛍光タンパクであるZsYelloW1が励起され、励起波長557ｎｍおよび発光波長579ｎｍの蛍光タンパクであるDsRed-Expressが励起され、励起波長563ｎｍおよび発光波長582ｎｍの蛍光タンパクであるDsRed2が励起され、励起波長556ｎｍおよび発光波長586ｎｍの蛍光タンパクである単量体DsRedが励起される。

また、図６に示されるように、位相差観察用のLEDとしては、600〜660ｎｍの近赤外領域の光が用いられる。

図１乃至図５で説明した細胞培養観察装置１１（図３）では、ユーザにより設定されたスケジュールに従って、観察の対象となる細胞を培養している培養容器４５が、ストッカ部４１から観察ユニット４３のステージ６８上に搬送される。そして、透過光用LED４７（図５）が発光し、透過光用LED４７からの光が、透過光用光学系６５を介して培養容器４５に照射される。この光は、対物レンズ６６により集光され、ダイクロイックミラー７７を透過し、ミラー６９に反射して、撮像部４６に導入される。そして、撮像部４６は、その光により画像を撮像する。

また、オートフォーカス制御部４６Ｂは、撮像素子４６Ａにより撮像された画像に基づいて、最適な焦点位置を検出し、最適な焦点位置が検出されると、撮像部４６は、その焦点位置で、培養容器４５内の細胞を透過する透過光による位相差画像を撮像する。その後、透過光用LED４７は発光を停止し、蛍光用LED４８ａ乃至４８ｃが、撮像部４６による蛍光画像の撮像に同期して順次発光する。

蛍光用LED４８ａが発光する励起光は、ミラー７１で反射され、ダイクロイックミラー７５を透過し、ダイクロイックミラー７６およびミラー７２乃至７４を経由して、ダイクロイックミラー７７で反射され、対物レンズ６６を介して培養容器４５の細胞に照射される。また、蛍光用LED４８ｂが発光する励起光は、ダイクロイックミラー７５で反射され、ダイクロイックミラー７６およびミラー７２乃至７４を経由して、ダイクロイックミラー７７で反射され、対物レンズ６６を介して培養容器４５の細胞に照射される。また、蛍光用LED４８ｃが発光する励起光は、ダイクロイックミラー７６を透過し、ミラー７２乃至７４を経由して、ダイクロイックミラー７７で反射され、対物レンズ６６を介して培養容器４５の細胞に照射される。

そして、蛍光用LED４８ａ乃至４８ｃがそれぞれ発光する光の波長域に応じて、培養容器４５内の細胞に含まれる蛍光物質が励起し、その蛍光物質からの光が対物レンズ６６およびダイクロイックミラー７７を介してミラー６９で反射され、撮像素子４６Ａに入射することにより、撮像素子４６Ａで、蛍光画像が撮像される。

このように、細胞培養観察装置１１では、最適な焦点位置を検出するときに、透過光用LED４７からの光、即ち、近赤外波長域の光が用いられるので、最適な焦点位置の検出時に、培養容器４５内の細胞に含まれる蛍光物質が励起することを回避することができる。これにより、蛍光物質が励起され続けることによる劣化を抑制することができる。また、蛍光物質の劣化を抑制することにより、蛍光観察時に、蛍光物質が観察に必要な光量の光を蛍光することができなくなることを回避することができ、蛍光観察を確実に行うことができる。

また、蛍光用LED４８ａ乃至４８ｃは、撮像部４６による撮像（露光時間）に同期して発光するので、必要最小限の励起光のみが細胞に照射される。

さらに、細胞培養観察装置１１では、蛍光観察時に、蛍光用LED４８ａ乃至４８ｃが、それぞれ異なる波長の光を発光するので、細胞に含まれる蛍光物質に応じて最適な励起光を発光するように、蛍光用LED４８ａ乃至４８ｃをそれぞれ選択することができる。即ち、励起光の選択の自由度を向上させることができる。

また、観察の対象となる細胞が変更され、蛍光物質が異なるときには、蛍光用LED４８ａ乃至４８ｃを、新たに観察の対象となる細胞に含まれる蛍光物質に応じた波長の光を発光するLEDに交換する必要がある。蛍光用LED４８ａ乃至４８ｃは、それぞれ交換可能に取り付けられており、上述したように、蛍光用LED４８ａ乃至４８ｃは、インキュベータ部１２の細胞培養環境外の架台部１３の内部に収納されているので、観察の対象となる細胞が変更されるときには、架台部１３（図１）の扉３２Ａまたは３２Ｂを開放して、蛍光用LED４８ａ乃至４８ｃを容易に交換することができる。

例えば、蛍光用LED４８ａ乃至４８ｃが、インキュベータ部１２の内部に収納されている場合には、蛍光用LED４８ａ乃至４８ｃを交換するには、インキュベータ部１２のインキュベータ扉２２を開放する必要がある。しかしながら、インキュベータ部１２の内部は細胞培養環境に維持されており、インキュベータ扉２２を開放することにより、細胞培養環境が汚染されるおそれがあり、蛍光用LED４８ａ乃至４８ｃを容易に交換することは困難である。これに対して、蛍光用LED４８ａ乃至４８ｃが、細胞培養環境外に配置されている場合には、蛍光用LED４８ａ乃至４８ｃを容易に交換することができる。

また、例えば、蛍光用LED４８ａ乃至４８ｃが、インキュベータ部１２の内部に収納されている場合には、蛍光用LED４８ａ乃至４８ｃが発光することによる発熱で、細胞培養環境の温度が変化するおそれがある。これに対し、蛍光用LED４８ａ乃至４８ｃを、細胞培養環境外に配置することで、蛍光用LED４８ａ乃至４８ｃからの発熱による細胞培養環境の温度変化を抑制することができる。

なお、透過光用LED４７は、透過光照明部６１のアーム状の金物によって、細胞培養環境から仕切られており、これにより、透過光用LED４７からの発熱による温度変化の影響も抑制することができる。

また、本発明は、撮像部４６により位相差画像または蛍光画像を撮像する細胞培養観察装置１１の他、例えば、ユーザが肉眼により位相差画像または蛍光画像を観察するような細胞培養観察装置に適用することができる。

なお、本発明の実施の形態は、上述した実施の形態に限定されるものではなく、本発明の要旨を逸脱しない範囲において種々の変更が可能である。

本発明を適用した細胞培養観察装置の一実施の形態の構成例を示す斜視図である。細胞培養観察装置１１の断面図である。細胞培養観察装置１１の正面図および断面図である。培養容器４５の例を示す図である。観察ユニット４３の正面図および側面図である。蛍光用LEDが発光する励起光の波長域と、蛍光タンパクとの対応関係の例を示す図である。

符号の説明

１１細胞培養観察装置，１２インキュベータ部，１３架台部，２３操作パネル，４１ストッカ部，４２搬送部，４３観察ユニット，４４制御装置，４５培養容器，４６撮像部，４７透過光用LED，４８蛍光用LED，６１透過光照明部，６２試料台，６３観察部，６４蛍光照明部，６５透過光用光学系，７０蛍光用光学系

Claims

細胞の培養過程を観察する細胞培養観察装置において、
前記細胞の培養に適した培養環境を維持する培養環境維持手段と、
前記細胞を観察するための光の合焦位置を検出する合焦位置検出時、および、前記細胞を透過する光の位相差により前記細胞を観察する位相差観察時に、前記培養環境内の観察の対象となる細胞に対し、近赤外領域の波長の光を照射する第１の照明手段と、
前記細胞に含まれる蛍光物質が励起した光により前記細胞を観察する蛍光観察時に、前記培養環境内の観察の対象となる細胞に対し、前記細胞に含まれる蛍光物質を励起させる波長の励起光を照射する第２の照明手段と
を備える細胞培養観察装置。
前記第２の照明手段は、前記培養環境維持手段の外側に設けられており、前記培養環境維持手段の外側から前記培養環境内の細胞に励起光を照射する
請求項１に記載の細胞培養観察装置。