JPWO2007145091A1 - 細胞培養装置 - Google Patents
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Abstract
Description
特許文献1の細胞培養装置は、細胞の核やミトコンドリアなどの微細な各器官の詳細を観察する場合には、最適な合焦点位置を検出するのに多大な時間を要していた。また、蛍光観察で撮影する蛍光画像が観察しようとする各器官に対応して鮮明に、精度よく観察することができない問題があった。さらに、従来の蛍光観察においては、励起光を照射し、細胞からの蛍光に基づき焦点調節を行っていたため、焦点調節中に蛍光の褪色や、励起光により細胞がダメージを受ける弊害があった。
請求項1の発明は、細胞の培養経過を観察する観察部(70)を有した細胞培養装置(10)において、前記観察部(70)の撮影光学系(71)の焦点位置を検出する焦点検出部(110)と、前記焦点検出部(110)により検出された前記焦点位置に基づいて、前記焦点位置から光軸方向に前記撮影光学系(71)を微小移動量ずつステップ移動させて複数の画像を撮影し、それらの画像に基づいて、最適な合焦点位置を判別する最適焦点判別部(120)と、前記最適焦点判別部(120)により検出された前記最適な合焦点位置に、前記撮影光学系(71)を移動して、前記細胞の蛍光画像を撮影する蛍光観察部(130)とを備える細胞培養装置(10)である。
以下、図面等を参照して、本発明の実施形態をあげて、さらに詳しく説明する。
図1は、本発明による実施形態の細胞培養装置を示す図である。なお、図1(A)は、細胞培養装置の外観図であり、図1(B)は、恒温槽内の詳細及び制御部の接続を示す図である。図2は、細胞培養装置の観察部の詳細を示す図である。図3は、観察部により撮影された観察画像の一例を示す図である。なお、図3(A)は、位相差画像を示す図であり、図3(B)は、蛍光画像を示す図であり、図3(C)は、位相差画像及び蛍光画像の重ね合わせ画像を示す図である。
恒温槽11は、温度37℃、湿度97%、CO2濃度5%の雰囲気に一定に保たれたチ
ャンバーである。
開閉扉12は、恒温槽11の正面の全面に設けられた扉であり、恒温槽11内に配置される収納部60、観察部70及び搬送部80のメンテナンスを実施するときなどに開閉される。また、開閉扉12上には、搬出入部13、情報表示部30及び操作入力部40が配置されており、使用者の操作性を向上させている。
搬出入扉14は、恒温槽11の内側に開閉を制限するロック機構を有した扉である。
細胞培養容器15は、細胞を培養させる容器であり、例えば、ディッシュ、ウェルプレート、フラスコなどである。
ホルダ16は、細胞培養装置10内の収納部60、観察部70及び搬送部80の各部に、細胞培養容器15を適正に配置させるための保持部材である。
情報表示部30は、情報記憶部20に記憶された情報や、細胞培養装置10の操作関連の情報などを表示するディスプレイであり、使用者の視認性をよくするために、図1(A)に示すように、傾斜機構32により情報表示部30を傾斜させることができる(矢印A)。
操作入力部40は、細胞の情報を入力したり、情報表示部30に表示された内容に応じて、細胞培養装置10の操作内容を決定し、制御部50に操作指示を入力したりする入力装置であり、複数のボタンから構成される。
制御部50は、恒温槽11内の雰囲気を一定環境に制御し、操作入力部40の操作内容に応じて、観察制御部100と、恒温槽11内の観察部70及び搬送部80とを統合して制御する制御回路である。
収納部60は、その内部が複数の収納区画61に分割され、個々の収納区画61に、細胞の入った細胞培養容器15を、ホルダ16を介して収納し、培養させる領域である。本実施形態では、鉛直方向に9段、水平方向に3列、合計27の収納区画61が設けられている。
対物レンズ部71は、細胞の種類や観察範囲の広さなどにより、選択的に使い分ける複数の対物レンズから構成されている。
Z軸機構部72は、ガイド機構72−1及び駆動モータ72−2を備え、対物レンズ部71を鉛直方向(Z軸方向)に微細に移動させて、焦点を調節する駆動機構である。
LED照明部74は、細胞培養容器15の細胞を照明するLEDを用いた照明であり、CCDカメラ部73の露光時間に同期させて画像撮影用の照明を発光し、また、焦点検出時におけるZ軸機構部72の移動に伴い、断続的に発光する。
蛍光照明部75は、細胞の器官を観察するために、細胞の蛍光性たんぱくを発現させる励起光を発する照明である。
蛍光フィルタ部76は、蛍光照明部75の励起光を光軸方向全体に照射して、励起光により発現した細胞の蛍光性たんぱくの像を、CCDカメラ部73に撮影させる波長選択式のダイクロイックミラー及びバンドパスフィルターで構成される。
XYステージ部78は、搬送部80から搬送された細胞培養容器15を、観察部70の観察位置に移動させる水平方向(XY方向)に自在に移動することができる精密ステージである。
焦点検出部110は、広域検出部111、限定検出部112及び詳細検出部113を備え、対物レンズ部71をZ軸機構部72により上下動させて、CCDカメラ部73の画像により合焦点の位置を自動的に検出(オートフォーカス)する回路である。焦点検出の時間を短縮させるために、情報記憶部20から細胞の情報及び細胞培養容器15の種類の情報などを読み出して、読み出した内容に基づいて、細胞の種類や細胞培養容器15の底面の厚みなどを考慮した焦点検出のための最適な対物レンズ部71の初期位置を演算し、対物レンズ部71をその初期位置に移動させることができる。なお、合焦点の位置は、画像中の画素のコントラストの最大及び最小値を画像内に取得し、その軌跡から算出された最大値となる位置(MaxMin法)か、又は、取得した画像のコントラストの各ラインにおける隣同士の画素データの差を計算し、その絶対値の和を、取得した画像毎に算出して、その最大値となる位置(Σ|Δ|法)にすることにより決定される。
限定検出部112は、広域検出部111より狭く限定された範囲において対物レンズ部71を駆動させながら焦点検出動作を実行するものである(限定スキャン動作)。具体的には、広域検出部111により求められた対物レンズ部71の合焦点位置を含む限定された範囲を焦点検出領域に設定し、対物レンズ部71の焦点深度に対して中程度に荒いステップ移動量でステップ駆動させて焦点検出を行うか、或いは対物レンズ部71を連続的に駆動させながら焦点検出を行う。
上述したように、広域検出部111、限定検出部112及び詳細検出部113の三段階の焦点検出部110を設けることにより、合焦点を精度良く検出できる。
この最適焦点判別部120により、最終的に得られた詳細検出部113の最適合焦点位置に基づいて、CCDカメラ部73により位相差画像の取得が実行される。図3(A)に示すような位相差画像が、CCDカメラ部73により取得される。
蛍光観察部130は、細胞の蛍光性たんぱくを蛍光照明部75により発現させて、蛍光フィルタ部76を介してCCDカメラ部73に蛍光画像を撮影させる回路である。なお、蛍光画像は、最適焦点判別部120により判別された最適な合焦点位置に、対物レンズ部71を移動させて撮影される。
図4は、細胞培養装置の使用方法を示すフローチャートである。図5は、細胞培養装置の対物レンズ部の検出開始位置を説明する図である。
細胞培養装置10は、細胞の観察作業を開始するときに(S200)、細胞培養容器15を、収納部60又は搬出入部13から観察部70のXYステージ部78へ搬送部80により搬送し(S201)、細胞及び細胞培養容器15の情報を情報記憶部20から読み出して確認し、また、読み出した情報に基づいて、観察部70の対物レンズ部71の焦点検出の初期位置を演算する(S202)。続いて、XYステージ部78が、図2に示すように、細胞培養容器15を観察部70の撮影光路上に移動し(S203、矢印D)、Z軸機構部72が、対物レンズ部71を演算した初期位置へ移動させる(S204、矢印E)。
続いて、限定検出部112により、広域検出部111で検出された焦点位置を、限定した限定領域に対して検出し(S206)、更に、詳細検出部113により、限定検出部112で検出された焦点位置を、限定領域よりも更に限定した詳細領域に対して検出して、焦点検出部110の合焦点位置とする(S207)。ここで、限定検出部112及び詳細検出部113の検出開始位置は、前述の広域検出部111の検出開始位置(初期位置)よりも段階的に低く設定され、スキャン範囲が狭くなるように設定されている。例えば、限定検出部112の検出開始位置は、図5に示すように、スキャン開始点Bに設定され、広域検出部111の検出開始位置より下方に設定される。
焦点検出部110により合焦点位置が検出されたら、その点を基準点として、最適焦点判別部120により、対物レンズ部71を、その基準点から上下(焦点)方向に複数点、微細にステップ移動させて、ステップ移動毎の位相差画像(図3(A))を撮影するとともに、最適な合焦点位置を判別する(S208)。撮影した位相差画像は、情報表示部30に表示するのとともに、情報記憶部20に観察情報として記憶させる(S209)。
重ね合わせ処理を実施するときは(S214、Yes)、画像処理部140により、位相差画像と蛍光画像とを重ね合わせる画像処理を行い(S215)、重ね合わせた画像(図3(C))を情報表示部30に表示するとともに、情報記憶部20に保存させて(S216)、保存が完了したら作業終了となる(S217)。
また、蛍光観察を実施しないとき(S210、No)、及び、重ね合わせ処理を実施しないときは(S214、No)、そのまま作業終了となる(S217)。
ここで、収納部60に収納される複数の細胞培養容器15のそれぞれに個別の識別番号(ID)を付して、最初に観察したときの最適な合焦点位置を情報記憶部20に記憶させることによって、次回の観察時にその記憶した合焦点位置を用いて、最適な合焦点位置をすばやく検出することが可能となる。特に、定期的な観察を必要とする場合などに、効率よく、迅速に細胞の観察を実施することができる。
第一番目の観察ポイントに対しては、上述した図4の制御に従い最適合焦点位置が求められ、そこでの複数の位相差画像や蛍光画像を取得し、情報記憶部20に保存する。
第一番目の観察ポイントから別の第二番目の観察ポイントに移動した場合には、最適合焦点位置を次のように求めることで、操作効率を向上できる。すなわち、第一番目の観察ポイントで得られた広域検出部111の最適合焦点位置、あるいは限定検出部112の最適合焦点位置に基づいて、次の焦点検出部(限定検出部112あるいは詳細検出部113)を実行すれば処理効率を向上できる。この処理は、図4のステップS206或いはステップS207以降の処理を実行することになる。
以上より、実施形態の細胞培養装置10は、対物レンズ部71の合焦点位置を検出する焦点検出部110と、合焦点位置に基づいて最適な合焦点位置を判別する最適焦点判別部120と、対物レンズ部71を最適な合焦点位置に移動させて蛍光観察を行う蛍光観察部130とを備えているので、最適な合焦点位置を迅速に検出して、細胞の蛍光画像を鮮明に、精度よく観察することができる。
Claims (6)
- 細胞の培養経過を観察する観察部を有した細胞培養装置において、
前記観察部の撮影光学系の焦点位置を検出する焦点検出部と、
前記焦点検出部により検出された前記焦点位置に基づいて、前記焦点位置から光軸方向に前記撮影光学系を微小移動量ずつステップ移動させて複数の画像を撮影し、それらの画像に基づいて、最適な合焦点位置を判別する最適焦点判別部と、
前記最適焦点判別部により検出された前記最適な合焦点位置に、前記撮影光学系を移動して、前記細胞の蛍光画像を撮影する蛍光観察部と、
を備える細胞培養装置。 - 請求項1に記載の細胞培養装置において、
前記焦点検出部は、
前記撮影光学系の光軸方向に広い範囲を焦点検出領域に設定し、この広い焦点検出領域を焦点検出する広域検出部と、
前記広域検出部の広い焦点検出領域より狭い限定された領域であって、前記広域検出部で検出された合焦点位置を含む領域を限定焦点検出領域に設定し、この限定焦点検出領域を焦点検出する限定検出部と、
前記限定検出部の限定焦点検出領域より狭い限定された領域であって、前記限定検出部で検出された合焦点位置を含む領域を詳細焦点検出領域に設定し、この詳細焦点検出領域を焦点検出する詳細検出部とを備えること、
を特徴とする細胞培養装置。 - 請求項1又は請求項2に記載の細胞培養装置において、
前記焦点検出部は、前記撮影光学系をステップ状又は連続的に移動させて各焦点位置を検出し、
前記最適焦点判別部は、前記焦点検出部の前記ステップ状又は連続の移動量よりも小さい移動量で前記撮影光学系を移動させること、
を特徴とする細胞培養装置。 - 請求項1から請求項3までのいずれか1項に記載の細胞培養装置において、
前記最適な合焦点位置の前記画像と、前記蛍光観察部により撮影した前記蛍光画像とを重ね合わせて重ね合わせ画像を作成する画像処理部を備えること、
を特徴とする細胞培養装置。 - 細胞の培養状態を観察する観察部を有する細胞培養装置において、
前記観察部の光軸方向に広い範囲を焦点検出領域に設定し、この広い焦点検出領域を焦点検出する広域検出部と、
前記広域検出部の広い焦点検出領域より狭い限定された領域であって、前記広域検出部で検出された合焦点位置を含む領域を限定焦点検出領域に設定し、この限定焦点検出領域を焦点検出する限定検出部と、
前記限定検出部の限定焦点検出領域より狭い限定された領域であって、前記限定検出部で検出された合焦点位置を含む領域を詳細焦点検出領域に設定し、この詳細焦点検出領域を焦点検出する詳細検出部と、
前記詳細検出部で検出された合焦点位置を含み、前記光軸方向に所定の焦点検出領域を設定し、この所定の焦点検出領域内を前記観察部の光学系を移動させながら複数枚の画像を取得する画像取得手段とを備えること、
を特徴とする細胞培養装置。 - 細胞培養容器を載置するステージと、前記細胞培養容器内の細胞の培養状態を観察する観察部と、前記ステージ及び前記観察部を相対移動させる移動手段とを有する細胞培養装置において、
前記観察部の光軸方向に広い範囲を焦点検出領域に設定し、この広い焦点検出領域を焦点検出する広域検出部と、
前記広域検出部の広い焦点検出領域より狭い限定された領域であって、前記広域検出部で検出された合焦点位置を含む領域を限定焦点検出領域に設定し、この限定焦点検出領域を焦点検出する限定検出部と、
前記限定検出部の限定焦点検出領域より狭い限定された領域であって、前記限定検出部で検出された合焦点位置を含む領域を詳細焦点検出領域に設定し、この詳細焦点検出領域を焦点検出する詳細検出部と、
前記詳細検出部で検出された合焦点位置を含み、前記光軸方向に所定の焦点検出領域を設定し、この所定の焦点検出領域内を前記観察部の光学系を移動させながら複数枚の前記細胞の画像を取得する画像取得手段と、
前記移動手段を制御して前記細胞培養容器内において異なる観察ポイントに移動させ、移動後の前記観察ポイントにおいて前記画像取得手段により前記細胞の画像を取得させる際に、移動前の観察ポイントの前記広域検出部の合焦点位置、又は、移動前の観察ポイントの前記限定検出部の合焦点位置を用いて、次の処理を実行するよう前記限定検出部、前記詳細検出部及び前記画像取得手段を制御する制御手段とを備えること、
を特徴とする細胞培養装置。
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