JP2002153260A - 一細胞長期培養顕微観察装置 - Google Patents

一細胞長期培養顕微観察装置

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Abstract

(57)【要約】 【課題】 特定の一細胞に由来する細胞群を培養するこ
とや、細胞を培養する過程で相互作用させる細胞を特定
しながら培養観察すること、細胞濃度を一定にしたまま
細胞を培養する培養している細胞群の中の特定の細胞の
みにシグナル物質等の薬剤などの細胞と相互作用する物
質を散布し、その細胞と他の細胞との変化の違いを観察
すること等を可能とする新しい技術手段を提供する。ま
た、特定の状態にある細胞のみを回収し、その細胞の遺
伝子、発現ｍＲＮＡ等の解析、あるいは生化学的測定を
行うことを可能とする新しい手段を提供する。 【解決手段】 基板状に設けた穴からなる細胞培養部
と、細胞培養部の上面を覆う半透膜と、半透膜上部に設
けた培養液交換部を有する細胞培養容器を備え、細胞培
養容器への細胞培養液の供給手段と、細胞培養部内の細
胞を長期観察することのできる顕微光学手段を具備して
いるものとする。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】この出願の発明は一細胞長期
培養顕微観察装置に関するものである。さらに詳しく
は、この出願の発明は、微生物や細胞を用いたバイオテ
クノロジーの研究分野において、特定の細胞の状態を顕
微鏡観察しながら、１細胞単位で培養することのでき
る、細胞の長期培養顕微観察装置とこれを用いた方法に
関するものである。
【０００２】
【従来の技術】従来の生物学、医学、薬学の分野では、
細胞の状態の変化、あるいは細胞の薬物等に対する応答
を観察するのに、細胞集団の値の平均値をあたかも一細
胞の特性であるかの様に観察してきた。しかしながら、
実際には細胞の集団の中で細胞周期が同調しているもの
はまれであり、各々の細胞が異なった周期でタンパク質
を発現している。これらの問題を解決するべく、同調培
養の手法が開発されているが、培養された細胞の由来が
全く同一の一細胞からではないことから、培養前の由来
細胞各々の遺伝子の違いがタンパク質発現の違いを生み
出す可能性があり、実際に刺激に対する応答の結果を解
析するときに、そのゆらぎが細胞反応機構自体が普遍的
に持つ応答ゆらぎに由来するものなのか、細胞の違い
（すなわち遺伝情報の違い）に由来するゆらぎなのか明
らかにすることは難しかった。また、同様の理由から細
胞株についても、一般には完全に一細胞から培養したも
のではないため、刺激に対する応答の再現性が細胞各々
の遺伝子の違いによってゆらぐものか明らかにするのは
難しかった。さらにまた、細胞に対する刺激（シグナ
ル）は、細胞周辺の溶液に含まれるシグナル物質、栄
養、溶存気体の量によって与えられるものと、他の細胞
との物理的接触によるものの２種類がある。従来、バイ
オテクノロジーの研究分野において細胞の観察を行う場
合は、大型培養器にて培養された細胞群の一部を一時的
に培養器から取り出して顕微鏡にセットし、観察を行っ
ていた。あるいは、顕微鏡全体をプラスチックの容器で
囲い温度を管理し、その中に小さい別の容器を用い二酸
化炭素濃度、及び湿度を管理しつつ、顕微鏡観察を行っ
ていた。このとき、細胞を培養しながら、古くなった培
養液と新鮮な培養液を交換することで溶液条件を一定に
する方法として多数の提案がなされている。たとえば特
開平１０−１９１９６１に開示されている方法では、循
環ポンプが、基材表面に対する培地のレベルを基材の上
端縁高さより高いレベルと下端縁高さより低いレベルと
の間で上げ・下げ操作し、上記低レベルに下がると培地
を供給し、上記高レベルに上がると培地を排出する機構
によって栄養状態を一定に保っている。また、特開平８
−１７２９５６では、培養容器内に、新たな培地を培養
容器に導入する導入管と、培養容器の培地を外部に排出
する排出管と、培養容器の気体部分とポンプとを連通す
る気管の各一端を挿入し、前記導入管、排出管及び気管
の夫々の管路に培養容器内への菌の侵入を阻止するフィ
ルターを設けており、培養槽の栄養状態を一定に保つ構
成になっている。
【０００３】しかし、これらの提案にもかかわらず、培
養細胞の溶液環境と、細胞間の物理的接触を制御しなが
ら培養する方法は知られていない。また、培養する場
合、特定の一細胞のみを選択し、その一細胞を細胞株と
して培養する技術は知られていない。そして、細胞を観
察する場合に、細胞の溶液環境条件を制御し、かつ、容
器中での細胞濃度を一定に制御する技術、あるいは相互
作用する細胞を特定しながら培養観察する技術も知られ
ていない。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】以上のことから明らか
なように、従来の技術では、細胞の培養を行う場合、細
胞群から培養を開始するため、完全に同一の遺伝子を持
つ細胞株ではなかった。また、従来の技術では、培養を
行うときに特定の細胞同士を選別し、その相互作用ある
いは濃度を制御しながら培養を行うことは難しかった。
さらに、従来の技術では培養槽の培養液を交換すること
で溶液環境を一定に保つ工夫をしていたが、培養槽内で
培養中の特定の細胞の環境を速やかに変化させ、その応
答を観察することは難しかった。
【０００５】そこで、この出願の発明は、以上のとおり
の従来技術の問題点を解消し、特定の一細胞に由来する
細胞群を培養することや、細胞を培養する過程で相互作
用させる細胞を特定しながら培養観察すること、細胞濃
度を一定にしたまま細胞を培養している細胞群の中の特
定の細胞のみにシグナル物質等の薬剤などの細胞と相互
作用する物質を散布し、その細胞と他の細胞との変化の
違いを観察すること等を可能とする新しい技術手段を提
供することを課題としている。また、この出願の発明
は、特定の状態にある細胞のみを回収し、その細胞の遺
伝子、発現ｍＲＮＡ等の解析、あるいは生化学的測定を
行うことを可能とする新しい手段を提供することを課題
としている。
【０００６】
【課題を解決するための手段】この出願の発明は、上記
の課題を解決するものとして、基板上に設けた穴からな
る細胞培養部と、細胞培養部の上面を覆う半透膜と、半
透膜上部に設けた培養液交換部を有する細胞培養容器を
備え、細胞培養容器への細胞培養液の供給手段と、細胞
培養部内の細胞を長期観察することのできる顕微光学手
段を具備していることを特徴とする一細胞長期培養顕微
観察装置を提供する。
【０００７】そして、上記の装置について、構成上の形
態の特徴についてもこの出願の発明において提供してい
る。たとえば、この出願の発明の上記の一細胞長期培養
顕微観察装置では、顕微観察系の光路上に小さな培養容
器を配置し、前記容器内部は、細胞を培養するための小
さな穴からなる細胞培養部と、穴から細胞が出ないよう
にその上面を被覆する細胞が通過できない程度の目の粗
い光学的に透明な半透膜と、その上面は培養液が循環す
る溶液交換部液交換部で構成される。また、細胞培養部
は１つあるいは複数の幅数μｍから数百μｍ程度の小さ
な穴からなり、その穴に目的細胞を誘導し培養する手段
を有している。ここで細胞培養部では液循環部からの拡
散により細胞が成長するのに必要な栄養や酸素が液交換
部より常に細胞に供給され排泄物あるいは分泌物は逆に
取り除かれる手段と、光学的に細胞を観察する手段とを
有している。また、光ピンセット等の非接触捕獲技術お
よび各穴の間に作られた運搬路により、細胞培養部の各
穴の細胞数、穴の中の細胞の種類を制御する手段を有し
ている。
【０００８】また、この出願の発明の装置では、ベルチ
ェ素子等の温度制御手段によって、前記容器内部の液温
を制御する手段を有し、さらに本発明は、培養液溜めよ
り液交換部に培養液を送り出す送液管に脱気セルや気体
置換セル等の脱気手段を配置し、培養液の溶存気体の種
類および濃度を自由に制御できる手段を有する。
【０００９】さらにまた、この出願の発明の装置では、
ピペット等の先端を特定の穴の上面に誘導して薬剤等を
散布することで、半透膜を隔てた特定の穴の中の細胞の
みに薬剤の影響を与える手段や、ピペット等によって上
記半透膜を貫通し、特定の穴から特定の一細胞を抽出す
る手段を有し、また、同様にピペット等によって特定の
穴に封入剤等を導入する手段を有する。
【００１０】
【発明の実施の形態】この出願の発明は、上記のとおり
の特徴をもつものであるが、以下に、その実施の形態に
ついて説明する。
【００１１】まず、明確にしておかねばならないこと
は、この出願の発明において規定されている「一細胞」
との表現は、一細胞のみを取扱うということに限定され
てはいない。細胞培養部の穴においては複数個体の細胞
が培養されてよいのであって、この出願の発明が特徴と
していることは、このような複数個の培養であっても、
単一の特定の細胞の培養経緯等を制御し、かつ観察する
ことを可能としていることにある。「一細胞」との規定
はこのことを意味している。
【００１２】また、「長期」との規定いついても、絶対
的基準として理解されるものでなく、個々の細胞の種類
に応じた相対的な規定であって、しかも、従来の方法に
比べてより長期での培養経緯等の制御と観察が可能とさ
れていることとして理解されるべきである。
【００１３】この出願の発明においては、以上のことが
前提とされている。図１は、この出願の発明の長期培養
顕微鏡観察装置の基本構成の一例を示したものである。
この図１に沿って説明すると、この出願の発明の長期培
養観察装置は、微生物や細胞を培養し、その培養液を交
換できるようにした培養容器１０５を備えている。そし
て、この培養容器１０５内に送られる培養液の成分や温
度、雰囲気、気体の種類、濃度等を調節しながら培養液
を提供する培養液の供給・廃棄系と、培養容器１０５内
の細胞を経時的に観察し、ビデオやパソコン等に記録す
る顕微観察光学系を備えている。
【００１４】より具体的に例示説明すると、細胞が培養
される培養容器１０５には、容器内に残留した空気等の
気体を排出するための気体排出弁１０４が設けられてお
り、培養容器１０５が培養液で満たされる構造になって
いる。培養容器１０５の底面の大きさは顕微観察に適し
た大きさである。また、この培養容器１０５は、ステー
ジ１０７の上に乗っている。
【００１５】培養液供給・廃棄部について説明すると、
培養容器１０５に複数の種類や、濃度の異なる培養液を
供給する機能を有する培養液供給装置１２１から供給さ
れた培養液はまずヒーター１２２により液温調節され、
チューブにより導かれて溶存気体交換装置１２３により
空気等の溶存気体の成分が調整される。次いでポンプ１
２４により流速を調節され、チューブ１２５を介して培
養容器１０５に送られる。
【００１６】培養容器１０５には、もう一つのチューブ
１２６が配置されており、培養容器１０５内の溶液はチ
ューブ１２６を通り廃液溜め１２８にポンプ１２７の吸
引により送られる。ここで、ポンプ１２４とポンプ１２
７は、観察するときには同じ流速で培養容器１０５の培
養液の供給と排出を行うが、気体排出弁１０４が閉じた
状態では、ポンプ１２４とポンプ１２７のいずれか一方
を省略することができる。廃液溜め１２８にはヒーター
が取り付けられて培養液の温度を調節できるようにし、
ポンプによりチューブを通して培養液溜めに空気等を送
ることにより、培養液中の空気を飽和した状態にするこ
ともできる。
【００１７】廃液溜め１２８には培養液溜めをチューブ
により連結し、弁を開閉することによって培養液を培養
液供給装置１２１等の供給装置に循環させることもでき
る。この場合、チューブの途中にフィルターを配設して
廃液中の余分な成分を除去するようにしてもよい。
【００１８】図１に示された基本構成での光学系では、
上下二方向より試料を照射することができるようにして
いる。上部の光源１０１より照射された光は、フィルタ
ー１０２により特定の波長に調整されコンデンサレンズ
１０３によって集光されて、培養容器１０５に照射され
る。照射された光は、透過光として対物レンズ１３１で
の観察に用いられる。培養容器１０５内部の透過光像
は、ミラー１１３によってカメラ１１５に誘導され、カ
メラの受光面に結像する。従って、培養容器１０５およ
び培養容器底面で実際に細胞を培養する細胞培養部基板
１０６の素材は、光学的に透明な素材であることが望ま
しい。具体的には、ホウケイ酸ガラス、石英ガラス等の
ガラスや、ポリスチレン等の樹脂やプラスチック、ある
いはシリコン基板等の固体基板を用いる。また、特にシ
リコン基板を用いる場合は波長９００ｎｍ以上の波長の
光を観測に用いる。下部の光源１１０より照射された光
はフィルター１１１により波長選択された後に、ダイク
ロイックミラー１１２によって対物レンズ１３１に誘導
されている。培養容器１０５内部の蛍光観察の励起光と
して用いられる。培養容器１０５から発した蛍光は再度
対物レンズ１３１によって観測され、フィルター１１４
によって励起光をカットした後の蛍光と透過光のみをカ
メラ１１５で観察することができる。このとき、フィル
ター１０２、１１１、１１４の組み合わせを調整するこ
とで、透過光のみをカメラ１１５で観察したり、あるい
は蛍光のみを観察したり、透過光像と蛍光像を同時に観
察することもできる。光路内には、レーザー光源１０８
で発生させたレーザー光を可動ダイクロイックミラー１
０９によって対物レンズ１３１に導入する機構も備わっ
ている。このレーザーを光ピンセットとして用いる場合
には、可動ダイクロイックミラーを移動させることで、
培養容器１０５内でのレーザーの集束位置を動かすこと
が可能である。また、カメラで得られた画像データは画
像処理解析装置１１６によって解析され、その他培養容
器１０５に付属した温度計測器の温度を観測した結果な
どさまざまな解析結果を基に可動ダイクロイックミラー
１０９や、培養容器１０５が載っている温調機能付ステ
ージの位置を制御するためにＸ−Ｙ−Ｚ方向に自在に移
動させるステージ移動用モーター１３２を駆動すること
ができる。これによって細胞の形状を認識したり、認識
後にその細胞を追跡し、つねに画像の中心に位置させた
り、対物レンズとの距離を調節することで画像のピント
を特定の細胞に合わせたりすることが可能である。ある
いは、一定時間の周期で可動ダイクロイックミラー１０
９や、培養容器１０５が載っている温調機能付ステージ
１０７を制御したり、一定間隔ででステージ移動用モー
ター１３２を駆動することが出来る。
【００１９】図２は、図１に例示した培養容器の配置を
例示したものであり。図３および図５は、この図２のＡ
−Ａ断面を例示したものである。この図２に示した培養
容器２０２には、前記と同様に、気体排出弁２０１、培
養液供給のためのチューブ２０３と廃液の排出のための
チューブ２０４が設けられて、また培養容器２０２の底
部には、図１における細胞培養部基板１０６と同じ、細
胞培養部基板２０５が配設されている。
【００２０】培養容器２０２については、たとえばガラ
ス製とすることができるが、ガラス以外にも、ポリプロ
ピレン、ポリスチレン等の樹脂製であって、光学的に透
明な各種の容器を用いることができる。
【００２１】また、シリコン基板等の固体基板を用いて
波長９００ｎｍ以上の近赤外光で観察することもでき
る。図３の断面図は、細胞培養のためのこの出願の発明
の培養容器とこれに備えられた構成について例示してい
る。
【００２２】前記図１の培養液供給装置１２１から送液
された培養液は、図３のチューブ３０２を介して培養容
器３０１の液交換部３０１Ａに溜められる。そして、こ
の液交換部３０１Ａに溜められた新鮮な培養液は、細胞
培養部３０６内の古くなった培養液と半透膜３０４を介
して交換される。
【００２３】細胞培養部３０６は、基板３０５に設けた
複数の穴によって構成されている。この穴の上面には半
透膜３０４がシールされている。従って穴３０６内に封
入された細胞は、この穴から出ることができず、また培
養液部からバクテリア等の雑菌が入らないような構造に
なっている。
【００２４】この穴の大きさは、細胞１個の大きさより
も大きいことが必要である。従って、細胞を培養する場
合は、細胞の大きさにもよるが、一般にその大きさはた
とえば、その開口径が３ｍｍ以下で、深さが３００μｍ
以下とすることができる。より好ましくは、この出願の
発明の所期目的の効果的な達成のためには、開口径が１
μｍ〜１ｍｍの範囲、さらに好ましくは１０μｍ〜５０
μｍの範囲にあるものとし、深さが１００μｍ以下とす
る。また、これらの開口径と深さは培養する細胞の大き
さ、種類によって適宜に調節される。
【００２５】また培養容器３０１の液交換部３０１Ａの
高さについても、培養液の拡散を考えると、穴の深さよ
りｈが大きいことが望ましい。そしてまた細胞培養部基
板の厚みは、１００倍の対物レンズを用いて顕微観察、
光トラップを行う場合には、開口数の高い対物レンズを
用いることから、肉厚の薄い基板を用いる必要がある。
たとえば基板がホウ珪酸ガラスである場合、０．３ｍｍ
以下の厚さの基板を用いる必要がある。
【００２６】細胞培養部３０６を構成する穴は、前記の
とおり複数あってよく、この穴の中で、目的とする細胞
が培養されることになる。培養液の廃液は、液交換部３
０１Ａよりチューブ３０３により抜き出されることにな
る。細胞培養部３０６の穴は、その深さが非常に浅いの
で、培養液の交換は速やかに行われ、チューブ３０３よ
り古い培養液が排出されることになる。
【００２７】半透膜３０４については、細胞が通りぬけ
られず、外界のバクテリア等が入らない程度の大きさの
微細孔を持つものとする。この出願の発明においては、
より具体的には、半透膜は、分子量ＭＷ１００００以上
で、０．２μｍ以下のポアサイズの光学的に透明なもの
であることが好ましい。
【００２８】半透膜３０４は、上記のように、細胞が通
りぬけられない程度のポアサイズを有していることか
ら、培養容器３０１の液交換部が３０１Ａから雑菌が入
ってくることも、細胞培養部３０６の穴から細胞が液交
換部３０１Ａに流れ出してしまうこともない。
【００２９】基板３０５と培養容器３０１とは、たとえ
ば図３に例示したように、シリコンシール等の接着シー
ル３０７によって密着させる。これによって、液交換部
３０１Ａから培養液が漏れ出ることが防止される。そし
て、細胞培養部３０６の穴の上部以外では、基板３０５
に対して、半透膜３０４が密着シールされて隙間がない
ようにする。これは、細胞培養部３０６が複数の穴によ
って構成される場合、一つの穴と別の穴の間で細胞が移
動することができないようにするためである。
【００３０】このような基板３０５と半透膜３０４との
密着のための手段としては、たとえばアビジンとビオチ
ンとの結合を利用した方法が有効である。図４はこの結
合を例示した概要断面図である。半透膜４０１としてセ
ルロース膜を、細胞培養部の基板４０２にガラスを用い
た場合、半透膜４０１と基板４０２との間では、半透膜
４０１の−ＯＨ基を部分的に−ＣＨＯ基に変換し、これ
をアミノ基が修飾されたビオチンと−（ＣＯ）−ＮＨ−
結合させる。このようにして半透膜４０１表面にビオチ
ン４０４が修飾される。他方、ガラス基板４０２表面に
シランカップリング剤によりアミノ基を表面に修飾し、
その後、−ＣＨＯ基を持ったビオチンと反応させること
で、半透膜と同様に基板４０２表面にビオチンを修飾す
ることができる。ここでアビジン４０３を添加し、ビオ
チン−アビジン結合で細胞培養部基板４０２に半透膜４
０１を接着させる。
【００３１】このようにして、細胞培養部４０５の穴の
部分を除いて、半透膜４０１と基板４０２の各々の表面
に結合配設したビオチン（４０４）が、アビジン４０３
を介して相互に結合して密着するようにしている。これ
に優れたシール効果が実現される。
【００３２】図５は、基板５０１に設けた細胞培養部５
０２の穴での細胞５０３の培養の状況を例示した概要図
である。この出願の発明による培養によれば、たとえば
６０倍の対物レンズを使用した場合でも、通常のプレパ
ラートと同様に、位相差顕微鏡、微分干渉顕微鏡、蛍光
顕微鏡で、細胞培養部５０２の穴の中の細胞５０３を観
察することができる。なお、図５においては、半透膜５
０４も示されている。
【００３３】また、図５では、椀状の穴を例示している
が、その形状は、方形、多角形等の各種であってよい。
細胞培養部としての穴は、たとえば図６のように均一な
いしは略均一の大きさのものとして、基板６０１上に、
複数の細胞培養部６０２として所定の等間隔のパターン
で配置させることができる。また、図７のように、基板
７０１上に大きさが段階的に異なる穴としての細胞培養
部７０２、７０３、７０４、７０５、７０６を設けても
よい。図８は、この大きさの異なる細胞培養部８０２、
８０４の穴での細胞８０３、８０５の培養の状況を例示
した概要図である。このとき、ともに穴内の細胞数は１
であるが細胞数を穴の容積で割った細胞濃度は異なる。
このように穴の容積をコントロールすることで同一の細
胞数で、異なる濃度での細胞の反応を観察することがで
きる。
【００３４】そして、細胞培養部としての穴の配置パタ
ーンや配置数、さらには穴の大きさやその形状について
は適宜に定めてよいことは言うまでもない。この出願の
発明によれば、たとえば細胞培養部の穴の大きさ（直
径）を変えることにより目的対象としている細胞の平均
自由行程の大きさを変えたり、同じ大きさ（直径）の穴
に入れる目的対象細胞の数を変えることにより細胞密度
を変化させたりすることが可能となる。また、細胞培養
のための穴の形状を変えて、その形状の細胞に与える影
響、効果を観察することもできる。
【００３５】また、この出願の発明によれば、たとえば
図９に例示したように、ガラス等の基板９０１に、細胞
培養部９０２としての複数の穴と、この穴を連結し、細
胞１個がかろうじて通ることのできる細い流路としての
溝９０３を、基板９０１の表面に設けてもよい。この流
路としての溝９０３を設けることにより、たとえば細胞
の移動速度や走行性等を測定することができる。あるい
は光ピンセット等の微粒子捕捉手段を用いて、流路を介
して細胞を隣接した別の細胞培養部穴に移すことができ
る。光ピンセットを用いることで、細胞を分離、選択し
たり、穴の中で特定の細胞同士を相互作用させたり、穴
の中の細胞数を制御することが可能である。
【００３６】図１０は、このような細胞移動の操作を例
示した平面概要図である。基板１００１には、細胞培養
部１００２としての穴と、これらを連結する流路として
の溝１００３を設け、細胞培養部１００２の穴Ａから別
の穴Ｂに、光ピンセット１００５手段によって細胞１０
０４を溝１００３を通して移動可能としている。この場
合の光ピンセット１００５手段は、これまでによく知ら
れている手段であって、レーザー集束光を対象細胞に照
射することによって細胞を捕捉し、捕捉した状態のま
ま、レーザー集束光の移動により細胞を移動可能とする
手段である。
【００３７】このような光ピンセット１００５の手段に
よれば、たとえば図１１に例示したように、基板１１０
１に設けた細胞培養部１１０２の穴と、細胞溜め１１０
４の穴とを流路としての溝１１０３で連通させて構造に
おいて、細胞溜め１１０４の穴から特定の細胞を光ピン
セットにより細胞培養部１１０２の穴にもってくること
ができ、逆に細胞培養部１１０２の穴から、細胞溜め１
１０４の穴へ特定の細胞を移行ないし捨てることもでき
る。あるいはまた、図１２に例示したように、細胞培養
部基板１２０１上に、１細胞精製培養系を組むこともで
きる。この場合は、まず、試料導入部１２０２に細胞を
外部から導入し、この中の１細胞を光ピンセット等の捕
捉手段を用いて溝を移動させ、細胞培養用穴１２０４に
誘導する。この溝の途中には細胞トラップ用穴１２０３
が置かれており、１２０２から細胞が泳いで穴１２０４
に進入するのを防いでいる。次に、穴１２０４で１細胞
から培養され増殖した細胞群から、再び特定の状態の細
胞１つを取り出し、これを同様に捕獲手段を用いて溝を
移動させて、第２の培養用穴１２０６に誘導する。途中
には、同様に細胞トラップ用穴１２０５がある。穴１２
０６で培養された細胞は、増殖してある一定の状態にな
ったとき、細胞観察用穴１２０８に、細胞運搬用溝１２
０７を経て運搬され、観察等がなされる。
【００３８】図１３は、図２で示した実施例とは異なる
別の培養容器の一例を示したものである。この例では、
外部からピペット１３０７を導入して、半透膜１３０４
を貫通させ、穴１３０６中の細胞を選択的に回収する。
そのため、培養容器１３０１は上面が開放されており、
容器中に満たされた培養液１３１３の上にはミネラルオ
イル１３１２を張ることで、雑菌の混入を防いでいる。
チューブ１３０２を通じて矢印１３１１の方向の流れで
導入される培養液の量は、矢印１３１７の方向に吸引さ
れる溶液の量より少なくなっており、液面高さ調節部１
３１５を用いることで、この液面高さが溶液出口１３１
６より低くなると、空気が吸引され溶液の吸引が止ま
り、液面の高さが上がって出口１３１６を塞ぐと再び培
養液が吸引され、結果として液面の高さが一定に保たれ
る。この例では、液面高さ調節部を培養容器１０５とは
別途設置することにより、液面の波紋が光学観察に影響
を与えないようにしている。ここでピペット１３０７
は、細胞を吸引するために用いることも出来るが、特定
の穴や溝を塞ぐために、充填剤を注入したり、特定の細
胞を半透膜を貫通して細胞培養部に導入することに用い
ることもできる。たとえば、図１２で示した１細胞精製
培養系の試料導入部１２０２に特定の試料を導入する場
合に用いることができる。このときは、ピペットによっ
て導入された細胞は、他の細胞等が半透膜の破れから侵
入する前に、光ピンセット等の捕獲手段によって、半透
膜でシールされた穴まで溝を通って動かせば、コンタミ
の問題なく実験することが出来る。また、本実施例でピ
ペット１で１細胞単位で特定の状態の細胞を回収できる
ことから、この１細胞の遺伝子多型解析、ｍＲＮＡ発現
解析等も行うことが出来る。
【００３９】図１４は、特定の穴１４０２中の細胞に、
誘導等をかけるため試薬を導入する実施例を示してい
る。この場合のピペットは二重構造をしており、内側の
ピペット１４１１から溶液を放出し、外側のピペット１
４１２から吸引を行う。これによって、内側のピペット
１４１１から放出された溶液は、その出口近傍にのみ分
布し、外側のピペット１４１２からの吸引によって、外
側のピペット１４１２から外の領域には溶液が漏れ出な
い構造になっている。したがって、このピペットを特定
の穴の近傍に持ってゆくことで、特定の細胞のみに作用
を与えることができる。
【００４０】なお、この発明の前記のとおりの光ピンセ
ット等の捕捉移動の手段による細胞の移動で、細胞培養
部の穴内での特定細胞の濃度を制御することや、相互作
用する細胞の特定、相互作用期間の制御等が可能となる
が、細胞の捕捉と移動のための手段は、上記の光ピンセ
ットに限られることはない。たとえば超音波を用いる手
段であってもよいし、電場を利用する手段であってもよ
い。
【００４１】図１５には、細胞培養部基板１５０１に複
数の電極１５０１、１５０５、１５０８を導入した実施
例の一つを示している。細胞は溶液中でその表面状態に
応じて、特異的な電荷を持つことから、たとえば電極１
５０２に正の電荷を印加すると、反対の電荷を持つ細胞
１５１１を穴１５０３まで引き寄せることができる。こ
の手法を用いることで、穴１５０３、１５０６、１５０
９それぞれに、負の電荷の強さに応じた細胞が集まるこ
とになる。また、電極１５０５、１５０８に負の電荷を
印加すれば、細胞は各穴の間を移動することができなく
なる。
【００４２】また、図１６には、細胞培養部基板１６０
１に電極１６０２、１６０３を配置し、超音波振動子１
６０４、１６０５を配置した実施例の一つを示してい
る。この例では、細胞を操作する非接触力として電界１
６１１、超音波輻射圧１６１２を用いている。電界は細
胞の持つ表面電荷に応じた外力を細胞に与え、また、超
音波輻射圧は細胞のサイズおよび硬さに応じた外力を細
胞に及ぼす。このとき用いる超音波の振動数は超音波に
よる気泡（キャビテーション）発生を抑制するため１Ｍ
Ｈｚ以上の周波数を用いることが望ましい。この実施例
では、具体的に、超音波輻射圧と電場を互いに直交する
異なる方向に作用させることで、細胞の持つ電荷とサイ
ズに応じた細胞分布を２次元に展開することができる。
また、この例では電界による外力と超音波による外力を
１つの基板上で組み合わせることで細胞の種類に応じた
分離を行ったが、電界、超音波による外力をそれぞれ単
独で用いて細胞の運搬に用いても良い。これによって光
ピンセットで用いたような細胞ハンドリングが可能であ
る。
【００４３】そして、この出願の発明においては、細胞
培養部としての穴中の細胞数を計測する手段を備えるこ
とができ、さらには、細胞培養部の穴に、半透膜を貫通
して導入でき、穴内部の特定の細胞を回収したり、ある
いは、穴内に試薬や封入材を注入もしくは回収すること
のできるピペットを備えることもできる。その他細部の
実施上の形状については以上の例示説明に何ら限定され
ることなしに、各種各様のものが可能とされることは言
うまでもない。
【００４４】たとえば以上のとおりのこの出願の一細胞
長期培養顕微観察装置においては、たとえば次のような
優れた効果が得られることになる。 （１）特定の細胞を隔離し、長時間観察することができ
る。
【００４５】（２）培養液の種類、温度を培養途中に自
由に変えることができる。 （３）培養する容器の容積、形状を自由に設定すること
ができる。 （４）培養する細胞の数を培養途中に正確に制御するこ
とができる。
【００４６】（５）培養している容器に他の雑菌は入っ
てこない。 この出願の上記装置を用いることにより、たとえば図１
７に例示したように、大腸菌の成長観察においては、各
世代間での成長速度、分裂する長さに差はなく、２倍の
長さになると分裂することが確認される一方で、図１８
のように、成長には細胞培養部の穴の大きさ、つまり容
積への依頼性が確認された。図１８で、largr は２×１
０-7ｍｌを、small は２×１０-9ｍｌを示している。
【００４７】また、図１９のように、世代による分裂時
間と、初期菌数による分裂時間には相違があり、１回目
の分裂では分裂開始に時間がかかり、１細胞の場合には
複数細胞の場合よりも分裂開始に時間がかかることが確
認された。
【００４８】このようなことは、一細胞レベルでの長期
培養と顕微観察を可能とするこの出願の発明の装置と方
法とによってはじめて可能とされるのである。
【００４９】
【発明の効果】以上詳しく説明したとおり、この出願の
発明によって、従来技術の問題点を解消し、特定の一細
胞に由来する細胞群を培養することや、細胞を培養する
過程で相互作用させる細胞を特定しながら培養観察する
こと、細胞濃度を一定にしたまま細胞を培養する培養し
ている細胞群の中の特定の細胞のみにシグナル物質等の
薬剤などの細胞と相互作用する物質を散布し、その細胞
と他の細胞との変化の違いを観察することなどを可能と
する新しい技術手段が提供される。また、この出願の発
明により、特定の状態にある細胞のみを回収し、その細
胞の遺伝子、発現ｍＲＮＡ等の解析、あるいは生化学的
測定を行うことを可能とする新しい手段が提供される。
【図面の簡単な説明】
【図１】この発明の基本構成の一例を示す模式図であ
る。
【図２】図１で示した１細胞培養部の装置構成を示す模
式図である。
【図３】図２で示した１細胞培養部のＡ−Ａ断面を示す
模式図である。
【図４】基板と半透膜の接着方法の一例を示す模式図で
ある。
【図５】細胞培養部の細胞捕獲の様子を示す模式図であ
る。
【図６】基板表面の穴の構造の一例を示す模式図であ
る。
【図７】基板表面の穴の構造の一例を示す模式図であ
る。
【図８】図７で示した大きさの異なる基板表面の穴の断
面構造を示す模式図である。
【図９】基板表面の穴の構造の一例を示す模式図であ
る。
【図１０】光ピンセットを用いて図９で示した穴の間で
細胞を運搬する手段を説明する模式図である。
【図１１】基板表面の穴の構造の一例を示す模式図であ
る。
【図１２】基板表面の穴の構造の一例を示す模式図であ
る。
【図１３】細胞培養部の装置構成の一例を示す模式図で
ある。
【図１４】細胞培養部の装置構成の一例を示す模式図で
ある。
【図１５】基板表面の穴の構造の一例を示す模式図であ
る。
【図１６】基板表面の穴の構造の一例を示す模式図であ
る。
【図１７】大腸菌の世代間の成長速度、分裂長さの観察
結果を例示した図である。
【図１８】大腸菌の成長についての容積依存性の観察結
果を例示した図である。
【図１９】大腸菌の分裂について、世代による分裂時間
と、初期菌数による差の観察結果を示した図である。
【符号の説明】
１０１、１１０ 光源 １０２、１１１ フィルター １０３、１１４ コンデンサレンズ １０４ 気体排出弁 １０５ 培養容器 １０６ 細胞培養部基板 １０７ 温調機能付ステージ １０８ レーザー光源 １０９ 可動ダイクロイックミラー １１２ ダイクロイックミラー １１３ ミラー １１５ カメラ １１６ 画像処理解析・記録装置 １２１ 培養液供給装置 １２２ ヒーター １２３ 溶存気体交換装置 １２４、１２７ ポンプ １２５、１２６ チューブ １２８ 廃液溜め １３１ 対物レンズ １３２ ステージ移動用モーター ２０１ 気体排出弁 ２０２ 培養容器 ２０３、２０４ チューブ ３０１ 培養容器 ３０１Ａ 液交換部 ３０２、３０３ チューブ ３０４ 半透膜 ３０５ 細胞培養部基板 ３０６ 細胞培養部 ３０７ 接着シール ４０１ 半透膜 ４０２ 細胞培養部基板 ４０３ アビジン ４０４ ビオチン ４０５ 細胞培養部 ５０１ 細胞培養部基板 ５０２ 細胞培養部 ５０３ 細胞 ５０４ 半透膜 ６０１ 細胞培養部基板 ６０２ 細胞培養部 ７０１ 細胞培養部基板 ７０２、７０３、７０４、７０５、７０６ 細胞培養部 ８０１ 細胞培養部基板 ８０２、８０４ 細胞培養部 ８０３、８０５ 細胞 ９０１ 細胞培養部基板 ９０２ 細胞培養部 ９０３ 溝 １００１ 細胞培養部基板 １００２ 細胞培養部 １００３ 溝 １００４ 細胞 １００５ 光ピンセット １１０１ 細胞培養部基板 １１０２ 細胞培養部 １１０３ 溝 １１０４ 細胞溜め １２０１ 細胞培養部基板 １２０２ 試料導入部 １２０３、１２０５ 細胞トラップ用穴 １２０４、１２０６ 細胞培養用穴 １２０７ 溝 １２０８ 細胞観察用穴 １３０１ 培養容器 １３０２、１３０３ チューブ １３０４ 半透膜 １３０５ 細胞培養部基板 １３０６ 穴 １３０７ 接着シール １３０８ ピペット １３１１、１３１４、１３１７ 培養液の流れ １３１２ ミネラルオイルの膜 １３１３ 培養液 １３１５ 液面高さ調節部 １３１６ 溶液出口 １４０１ 細胞培養部基板 １４０２ 穴 １４０３ 細胞 １４０４ 半透膜 １４１１ 溶液放出ピペット部 １４１２ 溶液吸引ピペット部 １４１３ ピペット放出液の流れ １４１４ ピペット吸引液の流れ １５０１ 細胞培養部基板 １５０２、１５０５、１５０８ 電極 １５０３、１５０６、１５０９ 穴 １５０４、１５０７ 溝 １５１０ 細胞の動く方向 １５１１、１５１２ 細胞 １６０１ 細胞培養部基板 １６０２、１６０３ 電極 １６０４、１６０５ 超音波振動子 １６１１ 電場の向き １６１２ 超音波輻射圧の向き
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｍ 1/42 Ｃ１２Ｍ 1/42 (72)発明者 井之上 一平 埼玉県大宮市佐知川1499−８ (72)発明者 若本 祐一 東京都杉並区下高井戸１−１−13−307 (72)発明者 森口 裕之 東京都世田谷区代田２−36−20 ハイツ浅 野101号 Ｆターム(参考） 4B029 AA02 AA07 AA08 AA09 BB11 DD06 DF05 DF06 DG06 FA01 FA04 FA09 GA03 GB02 GB03 GB06 GB08 GB09 HA05 HA10

Claims (20)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 基板上に設けた穴からなる細胞培養部
    と、細胞培養部の上面を覆う半透膜と、半透膜上部に設
    けた培養液交換部を有する細胞培養容器を備え、細胞培
    養容器への細胞培養液の供給手段と、細胞培養部内の細
    胞を長期観察することのできる顕微光学手段を具備して
    いることを特徴とする一細胞長期培養顕微観察装置。
  2. 【請求項２】 細胞培養部の穴の径は１マイクロメート
    ル以上，１ｍｍ以下、深さは１００マイクロメートル以
    下であることを特徴とする請求項１の一細胞長期培養顕
    微観察装置。
  3. 【請求項３】 容器は光学的に透明な材質でできている
    ことを特徴とする請求項１の一細胞長期培養顕微観察装
    置。
  4. 【請求項４】 半透膜は、アビジンおよびビオチンを用
    いた結合によって基板の上面に固定されていることを特
    徴とする請求項１の一細胞長期培養顕微観察装置。
  5. 【請求項５】 半透膜は分子量１００００以上、０．２
    マイクロメートル以下のポアサイズの光学的に透明な半
    透膜であることを特徴とする請求項１の一細胞長期培養
    顕微観察装置。
  6. 【請求項６】 細胞培養部の穴は少なくても２つ以上基
    板の上面に設けられていることを特徴とする請求項１の
    一細胞長期培養顕微観察装置。
  7. 【請求項７】 細胞培養部の穴が、細胞が通過できる基
    板上面に設けられた流路によって別の穴に連通されてい
    ることを特徴とする請求項６の一細胞長期培養顕微観察
    装置。
  8. 【請求項８】 細胞培養容器には廃液排出手段が具備さ
    れており、培養液供給手段より培養液交換部に供給され
    る培養液が半透膜を介して細胞培養部穴内の廃液と交換
    され、廃液が廃液排出手段により排出されるようにした
    ことを特徴とする請求項１の一細胞長期培養顕微観察装
    置。
  9. 【請求項９】 容器には容器内に残留した気体を排出す
    るための弁が配設されていることを特徴とする請求項１
    の一細胞長期培養顕微観察装置。
  10. 【請求項１０】 培養液の温度を制御するための手段が
    具備されていることを特徴とする請求項１の一細胞長期
    培養顕微観察装置。
  11. 【請求項１１】 細胞を捕捉し、移動させる手段を具備
    することを特徴とする請求項１の一細胞長期培養顕微観
    察装置。
  12. 【請求項１２】 細胞を捕捉し、移動させる手段として
    光ピンセット手段を具備することを特徴とする請求項１
    １の一細胞長期培養顕微観察装置。
  13. 【請求項１３】 細胞を捕捉し、移動させる手段として
    超音波を用いる手段を具備することを特徴とする請求項
    １１の一細胞長期培養顕微観察装置。
  14. 【請求項１４】 細胞を捕捉し、移動させる手段として
    電場を用いる手段を具備することを特徴とする請求項１
    １の一細胞長期培養顕微観察装置。
  15. 【請求項１５】 細胞培養部の穴に試薬を散布し、試薬
    を回収するピペットを具備することを特徴とする請求項
    １の一細胞長期培養顕微観察装置。
  16. 【請求項１６】 顕微光学手段の光路上にフィルターを
    入れることにより、細胞を蛍光観察できるようにしたこ
    とを特徴とする請求項１の一細胞長期培養顕微観察装
    置。
  17. 【請求項１７】 画像データを取得する手段と、画像デ
    ータにより特定の細胞の形状を認識する手段と、特定の
    細胞を視野の中央に維持するためにステージの位置、対
    物レンズの焦点深さを制御する手段とを有することを特
    徴とする請求項１の一細胞長期培養顕微観察装置。
  18. 【請求項１８】 細胞培養部の穴の中の細胞数を計測す
    る手段を有することを特徴とする請求項１の一細胞長期
    培養顕微観察装置。
  19. 【請求項１９】 細胞培養部の穴の中に半透膜を貫通し
    て導入でき、穴内部の特定の細胞を回収したり、あるい
    は、試薬や封入材を注入するピペットを具備することを
    特徴とする請求項１または１５の一細胞長期培養顕微観
    察装置。
  20. 【請求項２０】 請求項１ないし１９のいずれかの装置
    を用いて細胞を長期観察することを特徴とする一細胞長
    期培養顕微観察方法。
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