WO2004094587A1

WO2004094587A1 - 細胞刺激装置及び細胞刺激方法

Info

Publication number: WO2004094587A1
Application number: PCT/JP2004/005818
Authority: WO
Inventors: Miwako Ozaki; Koichi Ito
Original assignee: Riken
Priority date: 2003-04-22
Filing date: 2004-04-22
Publication date: 2004-11-04
Also published as: US20090170178A1; JP2004344003A

Abstract

　本発明の目的は、生体外で効率よく大量の神経細胞に、細胞を傷つけることなく、直接電気刺激を与えるための電気刺激装置を提供することである。本発明によれば、培養細胞を入れるための培養容器の一方から前記培養細胞に接触しないか、細胞表面に接触する距離まで延びる正または負のうち一方の第一の電極と、前記培養容器の他方から前記培養細胞に接触しないか、細胞表面に接触する距離まで延びる正または負のうち他方の第二の電極とを備え、前記第一の電極と前記第二の電極とにより細胞を刺激する電場を形成することを特徴とする、細胞刺激装置が提供される。

Description

明細書

細胞刺激装置及び細胞刺激方法技術分野

本発明は、細胞刺激装置及び細胞刺激方法に関するものである。より詳細には、本発明は、培養細胞に非接触又は表面に軽く接触する程度の状態で該培養細胞に電気的刺激を与えることができる細胞刺激装置及ぴ細胞刺激方法に関するものである。背景技術

神経細胞の特徴の一つは、細胞自体が神経活動と呼ばれる電気的な活動を有することである。未熟な神経細胞が分化 ·発達していく過程において、神経細胞は神経伝達物質や神経栄養因子などの刺激に反応してィオンチャンネルや伝達物質受容体などを発現し、神経細胞固有の伝達物質感受性や興奮性（固有の神経活動）を獲得していき、そのパターンが神経細胞の個々の歴史や個性を表現していると考えられる。また、近年ではこの神経活動、即ち電気的な刺激が逆に神経に関連する物質の動態を制御していることも明らかとなってきている。

本発明者らはこれまで、神経活動とその生物学的役割を明らかにするために研究を行ってきた。その結果、神経活動のパターン（電気的活動のパターン）が情報コードシステムとして働いている可能性があることが明らかになつてきた。本発明者らの研究の最終的な目標は、神経活動のパターンを制御することにより脳の可塑性を制御することであるが、そのために重要なことは、神経活動（神経ィンパルス）のパターンの持つ役割を明らかにし、神経活動のパターンを解読し、神経活動のパターンのプロフアイリングを行うことである。そのためには、人為的によくコントロールされた刺激条件下で実験を行うことが必要であった。

また、神経細胞の電気的な活動を制御することにより、脳の可塑性を制御し、治療に応用することも可能である。再生医療においても、特に神経の再生においては、神経細胞の電気的な活動を持たせることが正常な機能を獲得する上で必須と考えられている。そのためには、生体外で効率よく大量の神経細胞に細胞を傷つけることなく、直接電気刺激を与えるための電気刺激装置が必須であった。細胞に電気刺激を与えるための従来の方法としては、（1 )電極を神経細胞に揷入することにより刺激する方法、または（2 ) 刺激用電極基盤上に神経細胞を接着させることにより刺激する方法が知られている。しかし、上記（1 ) の方法では、一度に多数の細胞を刺激することが困難であり、また細胞へのダメージも大きいという欠点がある。また、上記（2 ) の方法では、電極基盤上に接着できる神経細胞は極めて少なく、実用的な刺激装置として機能させることは困難であるという欠点がある。発明の開示

本発明は上記した従来技術の問題点を解消することを解決すべき課題とした。即ち、本発明は、生体外で効率よく大量の神経細胞に、細胞を傷つけることなく、直接電気刺激を与えるための電気刺激装置を提供することを解決すべき課題とした。本発明はまた、生体外で効率よく大量の神経細胞に、細胞を傷つけることなく、直接電気刺激を与えることができる細胞刺激方法を提供することを解決すベき課題とした。

本発明者らは上記課題を解決するために鋭意検討した結果、培養細胞を入れるための培養容器の一方から前記培養細胞に接触しないか、細胞表面に接触する距離まで延びる正または負のうち一方の第一の電極と、前記培養容器の他方から前記培養細胞に接触しないか、細胞表面に接触する距離まで延びる正または負のうち他方の第二の電極とを備えた細胞刺激を用いて、前記第一の電極と前記第二の電極とにより電場を形成して、該電場により細胞を刺激することにより、細胞に所望の電気的刺激を与えることができることを見出し、本発明を完成するに至つた。

即ち、本発明によれば、培養細胞を入れるための培養容器の一方から前記培養細胞に接触しないか、細胞表面に接触する距離まで延びる正または負のうち一方の第一の電極と、前記培養容器の他方から前記培養細胞に接触しないか、細胞表面に接触する距離まで延びる正または負のうち他方の第二の電極とを備え、前記第一の電極と前記第二の電極とにより細胞を刺激する電場を形成することを特徴とする、細胞刺激装置が提供される。

好ましくは、培養細胞を入れるための培養容器の上面又は側面の一方から前記培養細胞に接触しないか、細胞表面に接触する距離まで延びる正または負のうち一方の第一の電極と、前記培養容器の上面又は側面の他方から前記培養細胞に接触しないか、細胞表面に接触する距離まで延びる正または負のうち他方の第二の電極とを備え、前記第一の電極と前記第二の電極とにより細胞を刺激する電場を形成することを特徴とする、上記の細胞刺激装置が提供される。

好ましくは、前記第一の電極は、円形のリング電極である。

好ましくは、前記第二の電極は、一本の点電極であるか、複数の多点電極であるか、メッシュ状のシート状電極であるか、あるいは多点電極を含むシート状電極である。

本発明の別の側面によれば、前記の何れかの細胞刺激装置を用いて、前記第一の電極と前記第二の電極とにより電場を形成し、該電場により培養細胞を刺激することを特徴とする、細胞の電気的刺激方法が提供される。

好ましくは、本発明の細胞の電気的刺激方法で刺激する培養細胞は神経細胞で

図面の簡単な説明

図 1は、第一の電極が円形のリング電極（小型）であり、第二の電極が一本の点電極である場合の細胞刺激装置を示す。

図 2は、第一の電極が円形のリング電極（大型）であり、第二の電極が一本の点電極である場合の細胞刺激装置を示す。

図 3は、第一の電極が円形のリング電極（大型）であり、第二の電極が複数の多点電極である場合の細胞刺激装置を示す。

図 4は、第一の電極が円形のリング電極であり、第二の電極がメッシュ状のシ一ト状電極である場合の細胞刺激装置を示す。

図 5は、第一の電極が円形のリング電極であり、第二の電極が多点電極を含むシート状電極である場合の細胞刺激装置を示す。

図 1〜5において、 1は正（又は負）の電極、 2は負（又は正）の電極、 3は配線、 4は培養容器本体、 5は培養容器蓋部、 6は細胞、 7は電源を示す。

図 6は、 P MA刺激によるニューレグリンのタンパク質分断を示す。

脳橋核二ユーロン及び小脳顆粒細胞を 7 D I V (days in vitro) で抗 N R G β 1抗体で染色した。両ニューロンで、細胞体及びニューロン性プロセスは N R G 陽性であった（図 Α)。スケールバー； 6 0 μ ΐη

図 Βでは、脳橋核ニューロン及び顆粒細胞を、膜貫通型の N R Gをトランスフェクシヨンしたものとしないものについて調製し、 ΡΜΑで 6 0分間刺激し、条件培地を回収した。条件培地のチロシンリン酸化活性を小脳顆粒細胞を用いて調ベた。顆粒細胞培養物を、回収 ·濃縮した条件培地で 5〜1 0分間刺激した。顆粒細胞からのライセートを S D S— P AG Eで分解し、ブロットを抗一ErbB4抗体で免疫沈降した後、抗ホスホチロシン抗体（4 G 1 0 ) で検出した。 1 8 0 k Dのチロシンリン酸化したバンドを刺激により検出した（図 B )。条件培地を P N

(トランスフエクションしない脳橋核ニューロン）、 t P N (トランスフエクションした脳橋核ニューロン）、 G C (トランスフエクシヨンしない顆粒細胞）、及び t G C (トランスフエクシヨンした顆粒細胞）から回収した。結果を図 Cに要約する。実験は独立に 3又は 4回繰り返した。

図 Dでは、小脳顆粒細胞を用いて、条件培地刺激後の CREB—リン酸化を確かめた。血清飢餓小脳顆粒細胞を、脳橋核二ユーロン及ぴ顆粒細胞培養物から回収した条件培地で処理した（ 5〜： L 0分間）。脳橋核二ユーロンからの条件培地を a、 b及ぴ cにおいて刺激のために使用した。 d、 e及ぴ f では、条件培地を顆粒細胞培養物から調製した。 a、 d ：対照

b、 e ：ベクター（pEGFP— N3)

c、 f : p NRG-GF P

刺激した顆粒細胞は、固定化後、ホスホー CREB抗体で染色した。 PMA刺激（6 0分間）により放出された可溶型を濃縮し、培養顆粒細胞に加えた。条件培地は、パネル c及ぴ f において内生の NRG及ぴ組み換え NRGを含むはずである。 b 及び eからの差し引きは、組み換え mNRGから切断された NRGの作用を示した。 ErbB及ぴ CREBリン酸化アツセィ系を使用して、 E及ぴ Fにおいてタンパク質分解に必要なアミノ酸配列を同定した。 E LYQKRVLT配列は膜貫通ドメインの細胞外並列の上に位置していた。配列を欠失またはリジンからグリシンに変異させた場合、タンパク質分解の効率は Fに示す通り阻害された。リジン残基はプロテアーゼによる認識に必須のァミノ酸であつた。

図 7は、電気刺激による CREB—リン酸化活性を示す。

脳橋二ユーロン及ぴ小脳顆粒細胞を 18日齢の胎児マウス及ぴ生後 7日のマウスからそれぞれ調製した。ニューロンを 7日間培養し、異なるパターンの電気刺激で刺激した。電気刺激後、 CREB—リン酸ィ匕を顆粒細胞を用いて調べた（図 A及ぴ B)。抗 PCREB抗体に陽性の細胞を計数し、全細胞数に対して標準化した。各皿からランダムな 5箇所の顕微鏡視野（20倍）を細胞計数のために撮影した。独立した実験から、 3〜 5枚の皿を計数した。 CREBリン酸化の効率は 50Hz刺激で最高であった。リン酸化は TTXにより部分的にプロックされた。

図 8は、電気刺激による N R Gのタンパク質分断を示す。

電気刺激後、 ErbB4のチロシンリン酸化活性を PMA刺激により同一の方法で測定した。パネル Aは、脳橋核ニューロン及ぴ顆粒細胞においては、 ErbB4に対する条件培地のチロシン一リン酸化活性の効率が 50Hzの刺激で最高あることを示す。チロシンリン酸化は PKC阻害剤である H 7によりブロックされた。結果をグラフに要約する（図 B)。図 C及ぴ Dでは、小脳顆粒細胞を用いて条件培地刺激による刺激後に、 CREBリン酸化を確認した。血清飢餓小脳顆粒細胞を、電気刺激後の顆粒細胞培養物から回収した条件培地で試験した（15分間）。

Full - NRG:これらの実験では、全長 NRGを顆粒細胞にトランスフエクシヨンした。 Del-NRG： NRGのアミノ酸番号 197〜216を欠失させ、タンパク質はタンパク質分解に耐性である。

最後に、免疫沈降後のィムノブロットにより切断された NRGを直接検出した結果を Gに示す。検出の手法を図 E及ぴ Fに要約する。 mNRGを電気刺激後にトランスフエクシヨンした（トランスフエクション効率；〜 5 %) 約 5 X 10⁷ 個の顆粒細胞から、条件培地を回収した。培地をセントリコンを用いて濃縮し、抗ー s NRG抗体で免疫沈降した。抗体としては、切断型 NRGの c末端のみを認識する抗 s N R Gポリクローナル抗体（実施例 1で作成した抗体）を使用した。免疫沈降後に、 NRGi3 1のみを認識する抗 NRG 1抗体を用いてウェスタンブロット分析を行った。図 Gに示す通り、 5 OH zの刺激で切断型 NRGのシグナルが検出できた。このシグナルは P K C阻害剤である H 7により消失した。これらの結果から、培地中に放出された N R G量は周波数の刺激に応じて異なることが分かる。

図 9は、リアルタイム定量 PCR法により定量した NMDA及ぴ GAB AA受容体サブュニット発現を示す。

図 Aでは、インビトロで 1〜21日間 1 OmMの KC 1を用いて培養した顆粒細胞を用いて、 NMDA及ぴ GABAA受容体サブユニット発現を調べた。電気刺激実験のために 7D I V (days in vitro) を選択した。 7D I Vでは、顆粒細胞は未だ生きているが、 NMDA受容体、 NR2C、 2 B及び GABAA受容体 β 2サブュニット mRNAは減少している。 GABAA受容体 α 1及ぴ γ 2mR NAは 7D I Vでは保持されていた。異なるパターンの電気刺激後に RT— PC Rのリアルタイム定量分析を行った。 NR2C及び 2サブユニットの転写を異なる周波数で制御した。 N R 2 C転写は、 1. 0及ぴ 100 H zの刺激で促進され（図 B)、 100Hzで検出された増加は TTX処理でブロックされた。し力し、 1. OH zでの増加は TTXでは強くはブロックされなかった。一方、 ]32転写は、 0. 1〜10Hzの刺激で NR2Cよりも強く促進され、増加は TTX処理でブロックされた。 10 OH ζでの増加は ΤΤΧで部分的にブロックされた。 0. 1Ηζ ; η=6、 1Ηζ ; η= 18、 10Hz ; n= 10、 50Hz ; n=12_s 100Hz ； n = 26、 T T Xで非刺激； n = 3、 1Hz及び T ΤΧ； η = 6、 10 OH ζ &ΤΤΧ ; η= 6、 * ρ < 0. 001、 * * ρ < 0. 00001 図 Cでは薬理実験を電気刺激の下で行つた。 N R 2 Cの場合、 1及ぴ 100 Η ζで増加した転写は全てのアンタゴニスト及びプロッカーにより部分的にプロックされた。しかしながら、 ΜΚ801は NR 2 CmRNA発現を強くブロックした。 ]32の場合、 MK801に加えて CNQXは 1. 0及ぴ 100Hzの刺激で転写をブロックした。 10 OH zでの mRN Aの増加は非特異的カルシウムプロッカーにより強く阻害されたが、 1. 0Hzでの増加は明らかにはブロックされなかった。何れの場合も、直接的電気刺激は、少なくとも基底レベルまで受容体の活性化を部分的に模倣できた。 AP 5 ；競合 NMD A受容体アンタゴニスト、 MK801 ；非競合 NMD A受容体アンタゴニスト、 CNQX； AMP A受容体アンタゴニスト、 C d &EGTA；非特異的カルシウムチャンネルブロッカー。各実験は独立に 3〜 8回繰り返した。

図 10は、周波数依存形式で制御された NMD A及び GAB AA受容体サブュニット発現の模式図を示す。

小脳顆粒細胞は、苔状線維から興奮シグナルを、そしてゴルジ体から GAB A A受容体を介して阻害シグナルを受ける。これらの活性の組み合わせが、ニュー口ン活性のパタ一ンを決定する。苔状線維によつて刺激されない顆粒細胞でも自発的活性を有する。比較的低い周波数において、 NR 2C及ぴ 2サブユニット発現は共に検出されたが、 2発現は NR 2 Cよりも促進された（1)。一方、 Ν R2C発現は、 10 ΟΗζのような高周波数でより強く誘導された。 NR2Cの発現は苔状線維刺激顆粒細胞で誘導される可能性があり、相当量の受容体活性化に関与している（111)。

図 1 1は、受容体活性化のモデル及びニューロン活性のパターンを示す。発明を実施するための最良の形態

本発明の細胞刺激装置は、培養細胞を入れるための培養容器の一方から前記培養細胞に接触しないか、細胞表面に接触する距離まで延びる正または負のうち一方の第一の電極と、前記培養容器の他方から前記培養細胞に接触しないか、細胞表面に接触する距離まで延びる正または負のうち他方の第二の電極とを備え、前記第一の電極と前記第二の電極とにより細胞を刺激する電場を形成することを特徴とするものである。

上記した第一の電極及び第二の電極はそれぞれ正又は負の電極を構成し、両者を組み合わせて使用することにより、細胞を刺激するための電場が形成される。上記した第一の電極及び第二の電極はそれぞれ培養容器の上面又は側面から培養細胞に接触しないか、細胞表面に接触する距離まで延びるように設置されている。本発明の一例では、第一の電極は円形のリング電極とし、第二の電極を一本の点電極、複数の多点電極、メッシュ状のシート状電極、あるいは多点電極を含むシート状電極とすることができる。以下、上記したような本発明の各種の実施の形態を図面に基づいて説明する。

図 1は、本発明の第一の態様の細胞刺激装置を示すものであり、具体的には、第一の電極が円形のリング電極（小型）であり、第二の電極が一本の点電極である場合の細胞刺激装置を示す。図 1の上段の図は側面図を示し、中段の図は斜視図を示し、それぞれ、正（又は負）の電極 1 (一本の点電極）と負（又は正）の電極 2 (円形のリング電極）とが、培養容器蓋部 5の異なる位置から配線 3により電源 7に接続された状態で、培養容器本体 4の底面上で培養している細胞 6の表面に接触する地点まで延びている状態を示す。なお、電極 1と電極 2は片方が正の電極の場合は、他方が負の電極になるように選択される。図 1の下段の図は、上面から見た電極 1と電極 2の位置関係を示す。

図 2は、本発明の第二の態様の細胞刺激装置を示すものであり、具体的には、第一の電極が円形のリング電極（大型）であり、第二の電極が一本の点電極である場合の細胞刺激装置を示す。図 2の上段の図は側面図を示し、正（又は負）の電極 1 (一本の点電極）と負（又は正）の電極 2 (円形のリング電極）とが、培養容器蓋部 5の異なる位置から配線 3により電源 7に接続された状態で、培養容器本体 4の底面上で培養している細胞 6の表面に接触する地点まで延びてレヽる状態を示す。なお、電極 1と電極 2は片方が正の電極の場合は、他方が負の電極になるように選択される。図 2の下段の図は、上面から見た電極 1と電極 2の位置関係を示す。

図 3は、本発明の第三の態様の細胞刺激装置を示すものであり、具体的には、第一の電極が円形のリング電極（大型）であり、第二の電極が複数の多点電極である場合の細胞刺激装置を示す。図 3の上段の図は側面図を示し、正（又は負）の複数の多点電極 1と負（又は正）の電極 2 (円形のリング電極）とが、培養容器蓋部 5の異なる位置から配線 3により電源 7に接続された状態で、培養容器本体 4の底面上で培養している細胞 6の表面に接触する地点まで延びている状態を示す。なお、電極 1と電極 2は片方が正の電極の場合は、他方が負の電極になるように選択される。図 3の下段の図は、上面から見た電極 1と電極 2の位置関係を示す。

図 4は、本発明の第四の態様の細胞刺激装置を示すものであり、具体的には、第一の電極が円形のリング電極であり、第二の電極がメッシュ状のシート状電極である場合の細胞刺激装置を示す。図 4の上段の図は側面図を示し、正（又は負 ) の電極 1 (メッシュ状のシート状電極）と負（又は正）の電極 2 (円形のリング電極）とが、培養容器蓋部 5から配線 3により電源 7に接続された状態で、培養容器本体 4の底面上で培養している細胞 6の表面に接触する地点まで延ぴている状態を示す。なお、電極 1と電極 2は片方が正の電極の場合は、他方が負の電極になるように選択される。図 4の下段の図は、上面から見た電極 1と電極 2の位置関係を示す。第二の電極 1においては、メッシュ状に形成された電極 2が、全体としてはシートを形成している。

図 5は、本発明の第五の態様の細胞刺激装置を示すものであり、具体的には、第一の電極が円形のリング電極であり、第二の電極が多点電極を含むシート状電極である場合の細胞刺激装置を示す。図 5の上段の図は側面図を示し、正（又は負）の電極 1 (多点電極を含むシート状電極）と負（又は正）の電極 2 (円形のリング電極）とが、培養容器蓋部 5から配線 3により電源 7に接続された状態で、培養容器本体 4の底面上で培養している細胞 6の表面に接触する地点まで延びている状態を示す。なお、電極 1と電極 2は片方が正の電極の場合は、他方が負の電極になるように選択される。図 5の下段の図は、上面から見た電極 1と電極 2 の位置関係を示す。第二の電極 2においては、多数の電極（多点電極） 1が全体としてはシートを形成している。

図 1〜図 5に構造を示す本発明の細胞刺激装置においては、培養細胞に接触しないか、細胞表面に接触する距離まで延びる正と負の電極の組み合わせにより培養容器中の培地内に電場を形成し、この電場により細胞を電気的に刺激することができる。本発明においては、刺激する細胞の種類や性質、形成する電場の強さ、並びに電場を形成する領域などに応じて、上記した図 1〜図 5に記載した構造を有する細胞刺激装置の中から最も適したものを適宜選択して使用することができる。

以下の実施例により本発明をさらに具体的に示すが、本発明は実施例によって限定されるものではない。実施例

実施例 1 ：分泌型ニューレグリンを特異的に認識する抗体の作製

( 1 ) 抗原ハプテンペプチドの設計

タンパク質の限定分解反応を補足する抗ぺプチド抗体を調製するためには、標的とする基質タンパク質の切断部位に関する情報が必要である。本実施例では分泌型ニューレグリンの C末端を含む短いペプチド（5 merあるいは 6 mer) にシスティン残基を付加したペプチドを合成し、ハプテンとして用いた。具体的には、 Cys-Glu-Leu-Tyr-Gln及ぴ Cys- Glu- Leu-Tyr- Gin Lysの混合ぺプチドを抗原として用いた。

( 2 ) 用いた試薬

合成ハプテンペプチド

KLH (keyhole limpet hemocyanin) in 50%グリセローノレ（約 80°/omg/ml) [Calibiochem社〕

DMFA (ジメチルホルムアルデヒド）

MBS (m—マレイミドベンゾィルー N—ヒドロキシスクシンイミドエステル） [Pierceネェ J

ゲル濾過カラム（フアルマシア PD- 10)

50mMリン酸ナトリウムパッファー（pH7. 5)

lOOmMリン酸ナトリウムバッファー（pH7. 2)

免疫

フロイント完全アジュパント（FCA)

フロイント不完全アジュバント（FIA)

シリンジ '注射針など

抗体のァフィ二ティー精製

lOOmM HEPESバッファー（pH7. 5)

Affigel 10または 15 〔バイオラッド社〕

30%酢酸 I

20%エタノール

PBS

50mMクェン酸パッファー（pH3. 0)

2 M トリスバッファー（ρΗ9· 5)

20%グリセ口ール含 Na-PBS

( 3 ) 抗原 (ハプテン Zキャリア複合体)の調製

① MBS/活性化 KLHを調製する。 KLH約 40m_g (0. 5ml)を 50mM リン酸ナトリウムバッファー（ρΗ7· 5) 1. 5mlに加え、スターラーを用いて撹拌する。次に、 9. 3mgの MBSを 0. 38mlの DMFAに溶解したものを（用時調製）、これに加える。 MBS添加後、室温で 30分撹拌する。その後、 2，000rpmで 2分程度遠心し、上清を以下で用いた。

② MBS/活性化 KLHをフリーの MBSから分離する。フアルマシア PD- 10カラムをを 50mMリン酸ナトリゥムバッファー（ρΗ7· 5) 40〜50mlで洗浄し、平衡化しておく。これに①の遠心上清 2mlを添加し、ゲルに浸潤した後に 0. 5mlのパッファーを加える。浸潤し終わった時点で溶出液の回収を始め（最初の 2. 5mlを prevoid として捨てる）、 2mlの溶出液（MBSZ活性化 KLH) を回収する。これで 4回分の力ップリングに使用することのできる標品が得られる。

③ 合成ハプテンぺプチドを活性化 KLHに力ップリングする。合成ぺプチド 5mg 程度を 4. 5mlの lOOmMリン酸 Naバッファー（pH7. 2) に溶解し、撹拌する。この際、 pH試験紙を用レ、て溶液の pHが下がっていないことを確認する。これに、 0. 5ml の MBS/活性化 KLHを加え、 4°Cで一昼夜撹拌する。その後、透析する必要はない。これを免疫原として使用する。保存は _20°Cまたは一 80°Cで行う。

( 4 ) 免疫

① ゥサギを用いてポリクローナル抗体を調製した。まず、体重約 3kgのゥサギに対して 1次免疫を行う。抗原溶液 0. 3mlに対して 0. 6mlの FCAを加え、撹拌後、超音波処理 [Branson Sonifier 185 (bath type)、 power 7〜 1 0、 3分程度〕によってェマルジヨンを調製する。これを、左右の背筋上に位置する皮下部分に 10 ケ所程度に分けて注射する。注射針は 18Gあるいは 21Gを用いる。

② 約 1力月後に 2次免疫を行う。この場合は、 0. 3mlの抗原溶液に対して 0. 6ml の FLAを用いて、同様にェマルジヨンを調製する。左右の大腿筋に注射する。

③ 2次免疫の 2週間後と 4週間後に、 3次免疫及び 4次免疫を行う。この場合は、 0. 15mlの抗原溶液を 0. 45mlの PBSで希釈し、①と同様に背中に皮下注射を行う。用いる注射針は 26Gでよい。

④ 4次免疫の約 1週間後に、部分採血を行う。 40〜50ml程度採血し抗体の生成状態をチェックした後、ァフィ二ティー精製を行う。良好であれば、約 1ヶ月休ませて、 2回ほど追加免疫を行って、全採血を行う。

( 5 ) 抗体のァフィ二ティー精製

① ァフィ二ティーゲルを調製する。ァフィ二ティー担体としては Affigel 10 または 15を用いる。まず、ハプテンペプチド l〜5mgを 4mlの lOOmM HEPESバッファー（pH7. 5) に溶解する。次に、 l〜2mlの Affigelをグラスフィルター上で吸引洗浄し（氷冷蒸留水 10ml X 2回）、直ちにペプチド溶液に加える。一昼夜 4°C で回転撹拌した後、フリーのペプチドを除くために、再度グラスフィルター上で吸引洗浄する。この場合は、十分量の蒸留水以外に 30¾酢酸や 20%エタノ一ルを用いて完全に洗浄し、最後に PBSで平衡化しておく。保存は冷蔵で行う。

② 特異的抗体をァフィ二ティーカラムに吸着させる。ァフィ二ティーゲルを力ラムに（内径 5〜10mm程度）に詰め、 PBSで洗浄する。非働化血清 10mlを同量の PBSで希釈し、フィルター（0. 22または 0. 45 μ πι) を通し、カラムに添加する。透過液を回収し、 3〜4回再添加を繰り返す（流速は 1ml/分程度）。さらに、約 50ml の PBSでカラムを洗浄する。

③ 抗体を回収する。あらかじめ 0. 5mlの 2 M トリスバッファー（pH9. 5) を入れておいたチューブに、ァフィ二ティーゲルから抗体を溶出させる。溶出は、 5ml の 50mMクェン酸バッファー（_PH3. 0)を 1ml/分程度の速度で添加して行う。次に、溶出液を透析チューブに移し、 20%グリセロール含 Na-PBS に対して透析を行う

(4°C、一昼夜)。抗体の定量は、 280nmの吸収を計測して行う（lmg IgG/ml、 A₂₈₀ = 1. 4)。通常、 l〜10mgの特異的 IgGが回収される。保存は、分注後一 80°Cで行

実施例 2 ：ニューレグリンの病態作用機序

(方法）

( 1 ) 細胞の調製

脳橋核の神経細胞およぴ小脳顆粒細胞を各々 E 1 8 B A L B Z Cおよび P 7マウスから標準法によって調製した。 7 DIV (days in vitro) 培養物を、両方の細胞種における PMA及ぴ電気刺激のために使用した。顆粒細胞は、受容体サブュニット発現の定量のために、 10111]^の1：じ 1条件下インビトロで 1〜21日間培養した。脳橋核ニューロンは、 10°/。馬血清を含む DMEM (Gibco BRL) で 1又は 2日間培養し、その後、 B-27 (Gibco BRL) を補充した Neurobasal培地（Gibco BRL) で維持した。培養物には、 B- 27 (Gibco BRL) を補充した Neurobasal培地

(Gibco BRL) から成る培地を供給した。 G F Pタグ及ぴベクターを含む全長の NRGプラスミド（pEGFP、 Clontech) を Lipof ectamine (登録商標） 2000 (Gibco BRL) により各々トランスフエクシヨンした（脳橋核のトランスフエクシヨン効率； 1〜 3 %、顆粒細胞； 5〜 10 %)。トランスフエクシヨンの 24〜 36時間後にニューロンを 1 _μΜの PMA (Tocris) で 60分間刺激した。

(2) 切断型の NRGの検出

本実施例における電気刺激は、本明細書中上記した構造を有し、図 1から 5に示した構造を有する細胞刺激装置を用いて行った。

組み換え全長 mNRGをトランスフエクシヨンした 5 X 10⁶〜5 X 10⁷細胞に 30分間の電気刺激（lmA、 30〜60V細胞外）を加えた後、細胞から得られた条件培地を回収し、セントリコン 10及ぴ 100 (Millipore) を用いて濃縮し、大分子量（> 100 kD) 及び小分子量（< 10 kD) のタンパク質を除去した。 7 D I Vの顆粒細胞は、脳橋核二ユーロン及ぴ顆粒細胞から得た濃縮条件培地で処理した。 ErbB リン酸化において、ポリクローナル抗 _ErbB4抗体

(Santa Cruz) による免疫沈降後に、マウスモノクローナル抗ホスホチロシン抗体（4G 10)を用いて標準法によりウェスタンブロット分析を行った（Rieff HI 他 JNeurosci, 19 (24) , 10757—10766(1999))。免疫沈降試験のために、ライセートを免疫沈降抗体の適当な稀釈物と一緒に 4でで 1時間ィンキュペートした後、プロテイン Α—Sepharose と一緒に 4 °Cで 1時間インキュベートした。次いで、ライセートを 15000 r pmで 3分間遠心し、上清を廃棄した。ペレットを溶解緩衝液で 2回洗浄し、ゲルローディング緩衝液に再懸濁した。試料を 3分間煮沸し、タンパク質を電気泳動で分離した。 C R E Bリン酸ィ匕を検出するために、 7 D I Vの培養顆粒細胞を、条件培地で 1.0〜15分間刺激した後、 4%パラホルムアルデヒドで 10分間固定ィ匕し、ポリクローナル抗一 NRGi3 1抗体、ポリクローナル抗一PCREB抗体（BioLabs) で染色した。染色した顆粒細胞をレーザー共焦点顕微鏡（Carl Zeiss) で観察した。 Alexa (登録商標）染料（Molecular probe) を二次抗体として使用した。

(結果)

( 1 ) 脳橋核ニューロン及び小脳顆粒細胞における NRGの膜貫通型のタンパク質分断

図 6 Aの実験で使用した小脳顆粒細胞及ぴ脳橋核ニューロンの分散初代培養物の状態を調べた。脳橋核ニューロン（PN) は、 18日目の胚（E 18) から調製し、小脳顆粒細胞（GC) は出生後 7日目（P 7) 力 ^調製した。培養ニューロンでの mNRGのタンパク質分断の有無を調べるために、抗 ErbB及び抗ホスホチロシン抗体による免疫沈降、及ぴ抗 PCREB抗体を用いた免疫細胞化学分析を、 GF P- t a gを含む組み換え全長 NRG ]3 1をトランスフエクシヨンした場合としない場合について、 PKC活性化因子であるホルボール一 1 2_ミリステートー 13—ァセテート（PMA) で 60分間刺激した脳橋核ニューロン及ぴ顆粒細胞を用いて行った。

苔状線維と顆粒細胞の間のシナプスにおける N R G受容体に関連して、 ErbB 2 及び ErbB 4が小脳系に関与していることは既報である（Ozaki M他 Nature, 390, 691-694(1997) ；及び Ozaki M他 Neurosci Res, 30 (4), 351-354 (1998) )₀ ErbB4 の発現は、小脳顆粒細胞ではィンビトロ及ぴィンビボで ErbB2の発現よりも強かつた。サイタリック AMP応答部位結合タンパク質（CREB) のリン酸化が、 ErbB4 シグナル伝達経路のさらに下流に関与していた（Taberbero A 他 Mol Cell Neurosci, 10, 309-322 (1998) )₀ PMAで処理後の脳橋核ニューロン及び顆粒細胞の培養物の条件培地を回収し、濃縮し、顆粒細胞に 5〜10分間適用した。抗 ErbB4抗体による免疫沈降後に、顆粒細胞からのライセートを SDS-PAGEで解析し、ブロットを抗一ホスホチロシン抗体（抗ー TYK) で検出した。トランスフエクションしない脳橋核ニューロン（None)、ベクターをトランスフエクシヨンした脳橋核 (vPN)、 NRGをトランスフエクシヨンした脳橋核ニューロン（t PN)、ベクタ一をトランスフエクシヨンした顆粒細胞（vGC)、及び mNRGをトランスフエクシヨンした顆粒細胞（t GC) から、条件培地を回収した。 mNRGをトランスフエクシヨンした脳橋核二ユーロン及ぴ顆粒細胞は共に、トランスフエクシヨンしないニューロン及びベクターのみをトランスフエクションした細胞と比較して、強いリン酸化活性を示した（図 6 B、図 6 C)。上昇した s NRG量は、顆粒細胞を用いて ErbBリン酸化によって確認した。 mNRGをトランスフエクションしたニューロンから得られた条件培地による 1 80 kDのチロシン一リン酸化バンドは、 PMA刺激を用いた場合に顕著であった（図 6 B)。トランスフエクシヨンした脳橋核二ユーロン及び顆粒細胞を P K C阻害剤である H 7で処理した場合の条件培地では、リン酸化活性は抑制された。内在性 NRGは ErbBリン酸ィ匕の顕著な活性を示さなかった。しかし、リコンビナント（組み換え） mNRGを培養ニューロンにトランスフエタトした場合、 ErbB4 リン酸化は顕著であった。これらの結果は、 PKC活性化後に s NRGが組み換え mNRGから産生したことを示す。図 6 Cにおいて、リン酸ィヒの比率は、 ErbB4抗体による免疫沈降後にブロットした ErbB4シグナルに対して標準化した。

CREB—リン酸化の結果を図 6の Dに示す。 PMA刺激（60分間）により放出される可溶型をスピンカラムを用いて濃縮し、培養顆粒細胞に添加した。刺激した顆粒細胞を固定後、抗ホスホ CREB抗体で染色した。脳橋核ニューロンからの条件培地を刺激（a、 b及ぴ c) のために使用し、顆粒細胞培養物からの条件培地を刺激（d、 e及ぴ f ) のために使用した。パネル Dは、コントロール（_a、 d)、ベクター（b、 e) 及ぴ全長 NRG (c、 f ) を示す。条件培地（ c及ぴ f ) は、切断された内在性及ぴ組み換えの NRGを有するはずである。 cから bの引き算及ぴ f から eの引き算は、組み換え mNRG由来の s NRGにより誘発される CREBリン酸化を示す。条件培地による 5分以上の処理後に、異なる CREB リン酸化が観察された。生培養顆粒細胞を使用した場合には、 KC 1刺激による NRG の放出は明白には観察されなかった。

全長 mNRGをトランスフエクシヨンした脳橋核ニューロン及ぴ顆粒細胞からの条件培地は、 ErbB—及び CREB—リン酸化の異なる活性を示した。 ErbB—及ぴ CREB-リン酸化活性の測定から、タンパク質分断に必要なァミノ酸配列を同定した。図 6 E及び 6 Fに示す通り、 ELYQKRVLT領域内の欠失変異体は、タンパク質分断を明白には示さなかった。この領域内の Kから Gへの点変異は表、図 6 Fに示す通り切断の減少を生じた。 NRGはメタ口プロテアーゼ（ADAM s)フアミリープロテア一ゼの基質として報告されている（ShirakabeK他 J Biol Chem, 276(12), 9352-9358 (2000) )₀ メタ口プロテアーゼによる NRG切断は、主としてゴルジ体で起こると報告されている。 mNRGのある種のタンパク質分断は細胞表面で起こることが報告されている（Loeb JA他 Mol Cell Neurosci, 11(1-2), 77-91(1998))。 NRGのタンパク質分断は、細胞の種類、 NRG及びプ口テアーゼのタンパク質局在、及び時期に依存して複数のプロテアーゼによって調節されている可能性がある。

(2) パターン化電気刺激による N R Gのタンパク質分断

CREB—リン酸化活性を、抗ー PCREB抗体を用いた免疫細胞化学分析により測定し、電気刺激による小脳顆粒細胞の CREBリン酸化の最適条件を調べた。顆粒細胞を異なる周波数で 5分間電気的に直接刺激した（図 7の A及ぴ B)。 1Hzから 1 0 OH zの周波数でリン酸化活性が検出され、 50Hzが最適であった。 50H zでの CREB—リン酸化活性は、ナトリウムチャンネルブロッカー TTXで 36. 6 ± 5. 45 %ブロックされた。図 Bにおいて、 PCREB—陽性細胞を計測し、全細胞数に対して標準化した。これらの実験は、異なる周波数によりニューロン細胞内に異なる状況が生じることを示唆する。 N R Gのタンパク質分断に最適な周波数は 5 OH zであった。

N R Gのタンパク質分断が異なるパターンの電気刺激で生じるかどうかを確かめるために、異なる周波数での電気刺激後に、 ErbBリン酸化を抗ー TYK及ぴ抗ー ErbB4抗体を用いた免疫沈降により検出した。 GC及ぴ P N培養物を、刺激装置にパラレルに接続したマルチ白金電極を装着した 35 mm皿中で電気的に刺激した。電気刺激は、定常電流で 30秒間、 0. 1〜 100 H zで連続的に送られる 0. 2ms e cの矩形パルスの交流（1mA) で行なった。十分に切断された形の N RGを入手するために、ニューロンを異なる周波数で 30分間刺激した。各々の刺激により、刺激されたニューロンには、異なる定常状態のカルシウムレベルが付与される。高周波数は高い定常状態のカルシウムレベルを示す。刺激中の培地の p H及び温度は、刺激しない場合と同じであった。

抗一 ErbB4抗体で落とした切断型 NRGは、抗 TYK抗体を用いた免疫プロットにより検出した。リン酸化の効率は、 ErbB4 シグナルに対して標準化することにより測定した。リン酸化シグナルは、他の周波数の場合と比較して 50 H zの刺激で有意に強かった（図 8八及ぴ図86)。条件培地の CREB—リン酸化活性も 5 OH zの刺激が最適であった（図 8C及ぴ図 8D)。さらに、 PNNからの条件培地も CREBリン酸化において GCと同様の傾向を示した。 5 OH zの刺激で、 77.4土 2.08%の GCは PCREB陽性であり、 100 H zの刺激では、 62.5±4.17%の GCが PCREB 陽性である。 PCREB の反応ピークは 5 OH zで観察された（n=15、コント口ールに対して P<0. 00018、 t検定）。 5 OH zの刺激による CREBリン酸化は H 7により阻害された（n= 7、 5 OH z刺激に対して P = 0. 003)。非切断型の NRG (欠失変異体）を顆粒細胞にトランスフエクシヨンし、細胞を 5 OH zで刺激した場合、 pCREB の数は有意に減少した（n = 5、 5 OHz刺激に対して P = 0. 005)。

上記方法を使用後、図 8 E〜Gに記載した方法を使用して切断型の NRGを検出した。実施例 1で作製した切断型ニューレグリンの C末端のみを認識する抗体

(抗 s NRG抗体）を使用した。電気刺激後、約 5 X 10⁷個のトランスフエクシヨンした顆粒細胞を使用して条件培地を回収した。 100 k D以上及ぴ 10 k D未満のタンパク質をセントリコン 10及ぴ 100遠心濾過を用いて除去し、セントリコン 10によりさらに濃縮した。その後、抗 s NRG抗体を用いて免疫沈降を行い、 NRGの ]3 1ァイソフォームのみを認識できる抗ー NRG 3 1抗体を用いてィムノプロットした。プロットを図 8 Gに示す。切断した NRGのシグナルは約 3 0〜 40 k Dの位置に検出された。 H 7で 5 0 H zの刺激の場合、切断型の NRGのシグナルは明白には検出されなかった。以上の結果から、 s NRG は、特定のパターンの電気刺激により開始かつ制御されたタンパク質分断により m N R Gから産生することが判明した。実施例 3 ：伝達受容体発現機構の解析

(方法） NMDA及ぴGABAA受容体サブュニットのリアルタイム定量分析電気刺激後、リアルタイム定量分析（ABI prism 7700， Perkin Elmer) を行つた。 Primer Express (PE Biosystems)を用いてプライマー及び TaqManプローブを設計した。各プライマーにより増幅した P C R産物はァガロースゲル上でシングルバンドであった。産物を直接配列によって確認した。使用した全プライマーは他の遺伝子と交差しなかった。薬理実験では、 TTX ( 1 μΜ、 Tocris), D— A P 5 (5 0 j M、 Tocris)、 MK 8 0 1 (2 5 μΜ、 Tocris)、 CNQX ( 1 0 μ M、 Tocris)、 C d (1 0 0 μΜ、 Wako Inc. ) 及び EGTA ( 1 mM、 Sigma) を使用した。

(結果）電気刺激により制御された NMD A及ぴ GABAA受容体サブュニットの発現

NMDA及ぴGABAA受容体サブュニット発現を制御できる電気活性のパターンを調べた。リアルタイム定量化ポリメラーゼ連鎖反応（P CR)法を用いて、 NMDA及ぴGABAA受容体サブュニットの mRNAの発現を、インビトロで 1〜2 1日目の培養中で定量した。先ず、培養顆粒細胞中の NMD A及ぴ GAB AA受容体の各サブユニットの mRNA発現レベルを調べた（図 9 A)。ニューロン特異的エノラーゼ（NS E) を対照として用いた。 P 7マウスから調製した 7 D I V (days in vitro) 培養ニューロンの性質は、成熟期でインビボで P 1 4マウスのものと理論的に同一である。インビポの P 1 4で、 NR 2 B発現は小脳顆粒細胞でシャツトダウンする一方、 N R 2 C発現は全顆粒細胞で見られる。 NM DA受容体のサブュニットの切り替えはマウスでは P 14でほぼ終了した。一方、 GAB AA の α 1、 ]32及び γ 2サブュニットはインビボの Ρ 14で大量発現していた。インビトロの状況をインビボに適合するように調整するために、インビトロで 7 Θ間培養した顆粒細胞を選択して電気刺激した。

培養顆粒細胞を異なる周波数（0〜100Ηζ) で 1mAで 30分間刺激した (図 9 B、 9 C)。刺激後の細胞の生物学的活性は化学染色及ぴ抗 NRG抗体染色によって確認したが、生細胞数の有意な差異は何れの場合も見られなかった。 N MDA受容体 NR 2 B及ぴ GAB ΑΑα 2、 γ 1の場合、電気刺激の効果は何れの周波数でも明白には検出されなかった。 NMDA受容体 NR 2 Cサブュニットの発現は、 1 Hz及ぴ 10 ΟΗζの周波数での直接刺激によって促進され、 100 Η ζなどの高周波数での刺激で検出された増加は ΤΤΧによりブロックされた。 1 Η ζの刺激による N R 2 Cの増加は、 Τ Τ Xにより強くはブロックされなかつた。 GAB ΑΑ受容体 ]32サブユニットの場合、 mRNA発現は、 0. 1から 1 0Hzの低周波数の刺激で増加した。低周波数の刺激による増加は TTXにより部分的にブロックされたが、 10 OH zによる j32の増加は TTXによりブロックされなかった。

薬理学的実験によれば、 NMD A及ぴ AMP A受容体活性、並びにカルシウムチャンネルが NR 2 C及び j32発現の保持に関与していることが示された。 1H zで刺激した NR 2 Cでは、 mRNAの発現は NMDA、 AMP A受容体アンタゴニストにより強く阻害された。刺激周波数 100 H zでは、特に MK 801 (非競合 NMD A受容体アンタゴニスト）が NR 2 C増加を強くブロックした。また、カルシウムチャンネルは、 AMP A受容体よりも NR 2 C発現に寄与していた。 1 H zで刺激した ]32では、刺激周波数 1Hzの NR2Cの場合と同様の結果であった。 100Hzで刺激した 2の mRNAの増加は、 NMDA、 AMPA受容体アンタゴニスト及びカルシウムチャンネルブロッカー（非特異的ブロッ力一； C d&EGTA) により阻害された。 NR 2 C及ぴ ]32の両方の場合で、力ルシゥムチャンネルブロッカーは高周波数でサブュニットの発現を強く阻害したが、低周波数では阻害しなかった。異なる周波数は、関与する顆粒細胞受容体の組み合わせと活性の度合いを制御していることがわかる。また、特定の電気刺激は、アンタゴニスト及ぴブロッカーの存在下でも正常な活性を部分的に回復することができた。 1 H _Zの刺激でカルシウムチャンネルプロッカーを用いた場合の例を示す（図 9 C、 β 2の場合)。

( C ) 考察

(実施例の考察）

図 1 0に示す通り、小脳顆粒細胞は、 NMD A及ぴ GA B AA受容体を介して苔状線維及びゴルジ細胞からの興奮性及び抑制性シグナルの入力のバランスを取つていると考えられる。顆粒細胞のニューロン発火のパターンは、各種受容体の関与によつてシナプス発達中に変化する。顆粒細胞における最終的神経活動のパターンは、伝達物質、神経ペプチド、及ぴ神経栄養因子、並びに、シナプス前部ニューロンを含む環境刺激からの他のものなどの分子の組み合わせによって決まる可能性が高い。分子の異なる組み合わせは、分子の挙動と電気活性のパターンの関係において、異なるパターンのニューロン発火をもたらすはずである。幾つかの遺伝子発現がパターン化された電気活性によつて調節されていることは既報である (Buonanno A他 Curr Opin Neurobiol, ' 9, 110-120 (1999) ) ₀ パターン化された電気活性によって分子のリン酸化活性が制御されていることは確かである (Buonanno A他 Curr Opin Neurobiol, 9, 110-120 (1999) ) ₀

実施例 2では、タンパク質分断などのタンパク質プロセシングが、パターン化された電気活性によつて制御されることを実証した。 N R Gのタンパク質分断は低周波数から高周波数で検出されたが、シナプス前細胞である苔状線維とシナプス後細胞である顆粒細胞からの N R Gのタンパク質分断に最適な刺激周波数は共に 5 0 H zであった。この現象は、分子的観点から、シナプス前後細胞間で神経活動のパターンが同調する機構を裏付けている。シナプス前部シグナルは先ずシナプス後部ニューロンを活性化し、次に、シナプス前部及ぴシナプス後部ニューロンを同調させる。シナプス後部細胞がシナプス前部細胞と同調する際に、シナブス後部ニューロンはオートクライン機構で自己活性化し、第 III期に入る可能性がある（図 1 0)。シナプス形成過程において、シナプス前部ニューロンからのシグナルや逆行性シグナル伝達を介した分子情報の交換の後に、 m N R Gは刺激依存型のタンパク質分断を受ける可能性もある。何れの場合も、 50H zの刺激はシナプス前部及びシナプス後部の-ユー口ンの間の伝達における中間段階と考えられる（図 1 0の I I )。

さらに、 s NRGにより調節される NR 2 C及ぴ 2発現の分子機構が明らかになった。低周波数の刺激では（ 1 H z：)、 β 2 RNAはグルタミン酸受容体及ぴ ErbB受容体の活性化を介して、 NR 2 C R N Aよりも多量に転写された。 NR 2 CmRNAは、高周波数（1 0 0H z) では 3 2よりも強く誘導され、グルタミン酸受容体（特に、 NMDA受容体）の活性化を伴なつた。 NRGのタンパク質分断の最適周波数である 5 0H zでは、 NR 2 C及ぴ ]3 2サブュニット発現は観察できなかった。 NR 2 C発現にはニューロン活動が必要であり、可溶型の N Gの産生効率は電気活動によつて制御されている可能性は既に提唱されている (Ozaki M他 The Neuroscientist；， 7(2), 146-154 (2001) )₀ 本実施例では、 NR Gのタンパク質分断が周波数に依存した形で電気活動のパターンによって制御されていることを初めて実証した。 NRGは NR 2 C及ぴ β 2サブュニット発現を誘導するのに必要であるけれども、発現段階（図 1 0の I及び III) 及び中間段階（図 1 0の II) の間で周波数の最適値に不一致が生じた。この不一致を説明するために、薬理学的実験を行った。この薬理学的実験の結果から、 ErbB受容体を含む複数の受容体が NR 2 C及ぴ j3 2サブュニット発現の制御に関与していることが判明した。

直接的電気刺激実験から、以下の 2つの事項が示唆される。（1)遺伝子発現を誘導するために必要な受容体の活性化には、細胞自身のもつ神経活動が必要な場合があり、（2)直接的電気刺激は、受容体及びイオンチャンネルプロッカーの効果を部分的に捕うことができる（図 9、 C)。シナプス成熟の過程において、特定のパターンのニューロン活性と受容体活性化の間にカスケ一ドが存在する可能性がある（図 1 1 )。受容体 Aが活性化される場合、ニューロンはパターン Aの神経活動を有する。次に、受容体 Bがパターン Aによって活性化され、パターン Bが産生する。その結果、ニューロンはパターン Aと Bをあわせた活動パターンを有する。カスケ一ドにおける各パターンの活動が分子挙動を制御する可能性がある。特定のパターンが分子挙動を制御し、ニューロン発火のパターンが、個々の受容体又はチャンネルの活性化の組み合わせによって構成されていると考えられる。構成された各パターン内に遺伝子発現リン酸化タンパク質のプロセッシングなどの分子の挙動を制御する一定の過程が存在するはずである。従って、活性化した受容体及ぴィオンチヤンネルの組み合わせ及びそれらの活性化の順序が、上記した不一致を解くための鍵を握っている可能性がある。

さらに、アンタゴニスト及ぴプロッカーによりブッロタ可能な受容体の幾つかの作用は、特定の電気刺激によって補うことができた。これは、シナプス前部二ユーロン、受容体及ぴチャンネル活性の役割がある特定パターンの電気活性によつて模倣できることを意味する。従って、ニューロン形成を人工的に制御する電気活性のパターンの役割を調べることは重要である。産業上の利用の可能性

本発明によれば、電気的刺激が直接細胞に及ぼされないから、細胞へのダメージが小さく、また多数の細胞に一度に電気的刺激を与えることができる。また細胞が電流の流れる通路に置かれるようになるため、細胞の電気的刺激を短時間で効率的に行えるようになる。即ち、本発明によれば、生体外で効率よく大量の神経細胞に、細胞を傷つけることなく、直接電気刺激を与えることができる。

Claims

請求の範囲

1 . 培養細胞を入れるための培養容器の一方から前記培養細胞に接触しない力細胞表面に接触する距離まで延びる正または負のうち一方の第一の電極と、前記培養容器の他方から前記培養細胞に接触しないか、細胞表面に接触する距離まで延びる正または負のうち他方の第二の電極とを備え、前記第一の電極と前記第二の電極とにより細胞を刺激する電場を形成することを特徴とする、細胞刺激

2 . 培養細胞を入れるための培養容器の上面又は側面の一方から前記培養細胞に接触しないか、細胞表面に接触する距離まで延びる正または負のうち一方の第一の電極と、前記培養容器の上面又は側面の他方から前記培養細胞に接触しないか、細胞表面に接触する距離まで延びる正または負のうち他方の第二の電極とを備え、前記第一の電極と前記第二の電極とにより細胞を刺激する電場を形成することを特徴とする、請求項 1に記載の細胞刺激装置。

3 . 前記第一の電極が円形のリング電極である、請求項 1又は 2に記載の細胞刺激装置。

4 . 前記第二の電極が一本の点電極である、請求項 1から 3の何れかに記載の細胞刺激装置。

5 . 前記第二の電極が複数の多点電極である、請求項 1カゝら 3の何れかに記載の細胞刺激装置。

6 . 前記第二の電極がメッシュ状のシート状電極である、請求項 1から 3の何れかに記載の細胞刺激装置。

7 . 前記第二の電極が多点電極を含むシート状電極である、請求項 1から 3 の何れかに記載の細胞刺激装置。

8 . 請求項 1カゝら 7の何れかに記載の細胞刺激装置を用いて、前記第一の電極と前記第二の電極とにより電場を形成し、該電場により培養細胞を刺激することを特徴とする、細胞の電気的刺激方法。

9 . 培養細胞が神経細胞である、請求項 8に記載の細胞の電気的刺激方法。