JP4666348B2 - ホログラフィックレーザー操縦を用いて物質を選別するシステムおよび方法 - Google Patents

Description

本発明は、２００２年７月３１日提出の米国仮特許出願第６０／３９９，３８６号、および２００２年１２月２０日提出の同第６０／４３５，５４１号からの優先権を主張し、これらの内容は、参照により本明細書に組み込まれる。本発明は、レーザー操縦を用いて、特にホログラフィック光トラッピングを用いて物質を選別するシステムおよび方法に関する。

米国産業界には、５０ミクロンより小さい複数の粒子または単位により構成される物質を伴う選別および分離のまだ対処されていない需要が数多くある。これらの需要は、ナノテクノロジーの製品製造を含むスペシャルティ化学品および物質分野における粒子分級および試料調製から、製薬およびバイオテクノロジー工業までの産業全体にわたっている。その他の例としては、医学、診断および農業分野における細胞選別および選択が含まれる。

これらの需要の重要性は、特殊化されたまたは部分的な解決策が開発された分野における年間支出額を探ることにより、ならびに現在は部分的な解決策すらない分野における選別／分離／精製された産出物の市場価値を評価することにより理解できる。前者の１つの例として、バイオテクノロジーおよび製薬産業は、たんぱく質精製のための設備および資材に毎年莫大な金額を費やしている。後者の１つの例として、農業部門において、家畜の子の性別を効率的に選択する方法が現在は皆無であるが、家畜分野のみにおいて、この産業において広く用いられている現行の人工授精プロセスの一部としてそのような精子選択を可能にすることにより価値が付加されるであろうと予測される。
なお、本出願に対応する外国の特許出願においては下記の文献が発見または提出されている。
特開平３−２９７３８５号公報 独国特許出願公開第１９９５２３２２号明細書 仏国特許出願公開第２７９８５５７号明細書 米国特許出願公開第２００２／０１６０４７０号明細書 米国特許出願公開第２００３／００３２２０４号明細書 米国特許第５７５２６９６号明細書 米国特許第６１５９７４９号明細書

畜産市場以外では、ヒトすい臓からの島細胞の精製プロセスは現在、タイプＩ糖尿病の新しい処置方法を開発している医学者の大きな関心事である。島移植方法における重要な進歩はなされてきたが、精製の問題は、いまだ残る障害の１つである。島細胞を精製する従来の方法は非効率的であり、細胞への損傷の原因となる。

タイプＩ型糖尿病において、患者すい臓中の既存の島細胞が損傷されており、人の生存に必要なインスリンをもはや産生しないので、島細胞移植は重要である。タイプＩ糖尿病のために現在の治療は、１日あたり１回〜５回のインスリン注射を伴う。この処置にもかかわらず、この疾病は、失明、切断を必要とする血流問題、腎不全、および死亡を含む合併症に至ることがよくある。移植において用いられる島細胞についてのより高い純度および低減された汚染物がこれらの合併症の発生を低減することが期待されている。

もし島細胞移植が利用可能であれば、米国における約１００万人のタイプＩ糖尿病現患者のうち、毎年少なくとも５０，０００人の患者が島細胞移植を受けるであろう。効果的な療法として島細胞移植が大規模に採用されると、コストの実質的な急騰が予測される。この急騰は、現行の処置が適正に施された場合でさえ、今日の処置方法（頻繁な注射）を用いることの困難さおよび深刻な結果により推進されるであろう。従って、島細胞精製は、非損傷的で非侵襲的なやり方でのヒト細胞の高度に選択的な選別を要求する１つの重要な問題にすぎない。

対処される必要がある別の問題は、癌のための前進放射線治療を受けている人々の骨髄中の癌細胞からの正常細胞の精製である。

さらに別の問題は、パーキンソン病のような病気の原因調査、およびその治療のための、幹細胞の選択である。

さらに別の関心事は、多数のヒト細胞を自動的に調べ、蛍光標識化が容易にできない複数の特性を有する細胞を選択する新規な方法を開発することであり、これは、医学診断の範囲および能力を大いに広げるであろう。

微視的な物体を扱う従来技術の１つが光トラッピングである。光トラッピングの効果の一般に容認される説明は、高開口数顕微鏡レンズにより集束された光のような、緊密に集束された光が急な強度勾配を有していることである。光トラップは、粒子をその誘電率に基づいてトラップするために、光ビームの勾配力を用いる。「粒子」は、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、化合物、たんぱく質、脂質、多糖類、配位子、細胞、抗体、抗原、細胞小器官、脂質、割球、細胞凝集、微生物、ペプチド、ｃＤＮＡ、ＲＮＡ等を含むがこれらに限定されない生物学的または他の化学的物質を意味する。

周囲の媒体よりも高い誘電率を有している粒子は、そのエネルギーを最小限にするために、電場が最も高い光トラップの領域へ移動する。周囲とのわずかな誘電率差分を少なくとも有している粒子は、この勾配に敏感であり、最高の光強度の点、すなわち光ビームの焦点に引き寄せられるか、またはこの焦点から排斥される。光トラップを構成する場合、粒子の屈折率よりも小さい屈折率を有する液状媒体中に浸漬された誘電性粒子の位置を操作するために単一の光ビームからの光勾配力が用いられるが、反射性、吸収性および低誘電率の粒子も操作し得る。

光トラップ中の光勾配力は、トラップされた粒子をビーム軸に沿って移動する傾向がある放射圧と競合する。１つの光トラップは、入力ビームの伝播方向および視準度を適切に選択することにより、１つの対物レンズの焦点体積内のどこに置いてもよい。１つの対物レンズの後部開口に入る１つの平行ビームが、１つのレンズの焦点面中心の１つの焦点に来るのに対して、ある１つの角度で入る別のビームは、中心からずれた１つの焦点に来る。わずかに発散している１つのビームが焦点面の下流で合焦するのに対して、１つの集束ビームは上流で合焦する。レンズの入力瞳に同時に入る多重ビームは各々、その入射角により決定される位置の焦点体積中に１つの光トラップを形成する。ホログラフィック光トラッピング技法は、単一入力ビームの波面上に多重ビームのための位相パターンを課すために１つの位相調整回折光学要素を用い、それによりその単一ビームを多重トラップに変換する。

光トラップを作り出すために１つの入力ビームの位相変調が好ましく、その理由は、トラッピングは、ビームの相対位相ではなく、ビームの強度に依存するからである。振幅変調は、トラップから光をそらし、トラップの有効性を減少することがある。

１個の粒子が光学的にトラップされると、トラップにより及ぼされた光勾配力は、散乱および吸収から生じる他の放射圧を超える。ガウスＴＥＭ００入力レーザービームについては、これは、ビーム直径が入口瞳の直径と実質的に一致するべきであることを一般に意味する。１つのトラップを形成するための好ましい最小開口数は、約０．９〜約１．０である。

光トラッピング技術の実施における１つの困難は、生成される各トラップが、それ自身の合焦された光のビームを一般に必要とすることである。興味のある多くのシステムは多重光トラップを必要とし、多重トラップ形態を達成するためにいくつかの方法が開発されてきた。１つの既存の方法は、種々のトラップ間でビームを「時分割」するために多重トラップ位置間で向け直される単一光ビームを用いる。しかしながら、トラップ数が増加するにつれて、各トラップが「オフ」状態にある間隔が長くなり、トラップが再度エネルギー印加される前に粒子がトラップ位置から離れて拡散することがある。すべてのこれらの問題により、この方法の実施は、１つのシステムあたり約１０個未満のトラップに制限された。

マルチトラップシステムを作り出す別の伝統的な方法は、多重の光ビームを同時に単独の高開口数レンズに通すことに頼っている。これは、多重レーザーを用いるか、あるいは単一レーザーのビーム中に１つ以上のビームスプリッタを用いることによってなされる。この手法に伴う１つの問題は、トラップ数が増加するにつれて、光学システムが次第により複雑になることである。これらの問題のため、この方法の既知の実施は、１システムあたり約５つ未満のトラップに制限される。

１つのマルチトラップシステムを達成するための第３のアプローチにおいて、単一レーザービームの波面を変更するために１つの回折光学要素（ＤＯＥ）（例えば、透過または反射幾何学のいずれか一方を利用した位相シフトホログラム）が用いられる。本発明は、Ｇｒｉｅｒらの米国特許第ＵＳ６，０５５，１０６号中に開示される。下流のレーザービームが本質的に、回折光学要素の正確な性質により固定された相対的位置および進行方向を有する多数の個別のレーザービームとなるように波面が変更される。実際には、ＤＯＥのフーリエ変換は、１組の強度ピークを生成し、強度ピークの各々は、個別のトラップまたは「ピンセット」として働く。

この第３のアプローチのいくつかの実施においては、１６〜４００の個別のトラッピング中心を作り出すために、固定透過ホログラムが用いられた。

固定ホログラムは、ホログラフィック光トラッピングの原理を実証するために用いられてきたが、ホログラムとして１つの液晶格子を用いることにより、トラップの各新しい配給について別個のホログラムの「製造」が可能になった。液晶格子によりトラッピングレーザーに課される空間的に変化する位相変調は、コンピュータによりリアルタイムで容易に制御でき、従って、様々な動的操作が可能になる。

複数の粒子を光学的にトラップするために使用し得る他のタイプのトラップとしては、光学ボルテックス、光学ボトル、光学回転体および光学ケージが含まれるが、これらに限定されない。１つの光学ボルテックスは、誘電率が周囲媒体よりも低い粒子または反射性の粒子、あるいは１つの光トラップにより反発される他のタイプの粒子を操作するために有用なゼロ電場エリアを取り囲む勾配を作り出す。そのような粒子は、そのエネルギーを最小にするため、電場が最も低い領域、すなわち、適切な形状にされたレーザービームの焦点のゼロ電場エリア、に移動する。光学ボルテックスは、ドーナツ（トロイド）の穴のようにゼロ電場のエリアを提供する。光学勾配は、放射状でドーナツ円周に最高電場がある。光学ボルテックスは、ドーナツの穴の内部に１つの小さい粒子を引き留める。この引き留めは、ゼロ電場の列に沿って小さい粒子上でボルテックスをスリップさせることによって達成される。

光学ボトルは、それが、焦点のおいてのみ１つのゼロ電場を有し、ボルテックスの一端において焦点を取り囲む他のすべての方向に１つの非ゼロ電場を有するという点で光学ボルテックスと異なる。１つの光学ボトルは、光学ボルテックスまたは光ピンセットによってトラッピングするには小さすぎるか吸収性がありすぎる原子およびナノクラスターのトラッピングに有用なことがある。（Ｊ．ＡｒｔおよびＭ．Ｊ．Ｐａｄｇｅｔｔ，「より高い強度の領域により取り囲まれた暗焦点を有するビームの生成：光学ボトルビーム」Ｏｐｔ．Ｌｅｔｔ．２５，１９１−１９３，２０００参照）

光学ケージ（米国特許第５，９３９，７１６号）は、大雑把に言えば、光学ボルテックスの巨視的な類縁物である。１つの光学ケージは、周囲媒体よりも低い誘電率でトラッピングされるには大きすぎたり反射性がありすぎたりする粒子を取り囲むために、光トラップの時間平均されたリングを形成する。

レーザービームが、位相パターニング光学要素を通ってまたは位相パターニング光学要素から反射される場合、位相パターニング光学要素は、１つの変更された位相プロファイルを有する複数のビームレットを発生させる。望まれる光トラップの数およびタイプに応じて、変更は、回折、波面整形、位相シフト、操縦、発散および収束を含み得る。選ばれた位相プロファイルに基づき、光トラップ、光学ボルテックス、光学ボトル、光学回転体、光ケージ、およびこれらの形態うちの２つ以上の組み合わせの形態で光トラップを生成するために位相パターニング光学要素を用い得る。

物質の操作に関して、ウイルスおよび細菌のピンセット操作が、誘電性球体のピンセット操作に加えて実証されてきた。原核生物およびウイルスに加えて、Ｔｅｔｒａｈｙｍｅｎａ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａのような広範囲にわたる原生生物のピンセット操作が成功している。さらに、白血球および頬上皮細胞のような体細胞、ならびに精子のような生殖細胞双方がトラップおよび操作された。

研究者らは、ダイヤ微粒子を用いて複数の細胞にタグを付け、次にダイヤ粒子をピンセットでつまむような、細胞を操作するための間接的方法を探索してきた。細胞操作は、細胞の伸張だけでなく顕微鏡分析のための細胞配向も含んでいた。組織細胞も、ｉｎ ｖｉｖｏと同じ空間分布でｉｎ ｖｉｔｒｏでピンセットを用いて配置されてきた。

細胞自体に加え、微小管、染色体、または球状ＤＮＡに沿って輸送された小胞のような細胞小器官を操作するために光ピンセットが用いられた。光ピンセットを用いて物体も細胞内に挿入された。

生物学的用途のための各種の選別プロセスも、光ピンセットを用いて可能である。アッセイおよび染色体最終のための従来の光トラッピングならびにライブラリを作るための選別は、すでに実証されている。薬物スクリーニングのための細胞アッセイも開発された。

従って、レーザー操縦される光トラップを用いる新しいタイプの選別の１つの例として、他の細胞、組織、および汚染物から貴重な細胞を単離する手法が必要とされる。さらに、（細胞）選別および精製の主要な産業ニーズへの光トラッピングの独特な寄与を達成する１つの方法が必要とされる。さらに、畜産市場において精子細胞を分離するニーズがある。

本発明は、レーザー操縦を用いる、特にホログラフィック光トラッピングを用いる物質選別物質のシステムおよび方法に関する。

本発明における１つの実施形態において、微視的物体を操作するためのツールとして用いられてきた技術である光トラッピングが用いられる。この効果の一般に認められている１つの説明は、高開口数の顕微鏡レンズにより合焦された光のような緊密に合焦された光は、急な強度勾配を有していることである。光トラップは、粒子をその誘電率に基づいてトラップするために光のビームの勾配力を用いる。そのエネルギーを最小限にするため、周囲媒体よりも高い誘電率に基づく粒子は、電場が最も高い光トラップの領域へ移動する。

本発明の光トラッピングは、細胞選別および精製をいくつかの方法で扱うために用いられる。例えば、光トラップにより物質に及ぼされる力は、その物質中の誘電率の正確な分布に敏感であり−従って、光学力は、物体の組成および形状に依存する。

さらに、その物体上の他の力は、その物体と周囲の流体との間の流体力学的相互作用に敏感であり−流体流動の制御は、物質の形状、サイズおよび表面粗さのような特徴を精査する。

さらに、１つの既知の位置に１つの物体を閉じ込めることにより、高速画像化および粒子特異性散乱測定のような付加的な自動化された質問の方法が可能になる。

本発明における１つの実施形態において、１つのマルチトラップシステムを実現する際に、単一のレーザービームの波面を変更するために回折光学要素（ＤＯＥ、すなわち、透過または反射幾何学を利用する位相シフトホログラム）が用いられる。下流のレーザービームが本質的に、相対的位置および進行方向が回折光学要素の正確な性質により固定された多数の個別のレーザービームになるように、波面は変更される。

本発明は、１つのレンズで１つのレーザービームを収束して光トラップを作り出すことにより光トラッピングを提供し、このレンズは、０．９未満の開口数を有し、最も好ましくは０．１未満になるまで好ましくは減少する。

ホログラフィックレーザー操縦を用いる選別は、選別される複数の物体について識別のクラスを設定するステップと、選別される１つの物体を選別エリア中に導入するステップと、その物体を、その同一性クラスに従って、操縦されたレーザーで操作するステップとを伴う。操作は、物体をその同一性クラスに基づいて異なる方法で、保持、移動、回転、標識付けまたは損傷することができる。従って、本発明により、ホログラフィック光トラッピングを用いる細胞選別への平行したアプローチを実現する１つの方法が提供される。

本発明の１つの実施形態において、生物学的物質の１つの試料の分光分析は、非弾性分光分析か偏光後方散乱に適した画像化照明源によって達成でき、前者は、化学的同一性の評価に有用であり、後者は、核サイズのような内部構造の寸法測定に適している。そのような分光学的方法を用いることにより、いくつかの実施形態において、細胞は質問される。ポジティブな結果（すなわち、１つの標識と反応または結合した細胞）を有していた細胞のスペクトルは、この画像化照明を用いて得ることができる。

所望のターゲット（すなわち、ＸまたはＹ染色体か、または疑わしい癌性、前癌性および／または非癌性細胞型等を持っている細胞）を同定するために、１つのコンピュータプログラムがスペクトルデータを分析し、次に、所望または選ばれたターゲット（すなわち、細胞型）を分離または閉じ込めるように位相パターニング光学要素（すなわち、光トラップ）を誘導するためにその情報を適用できる。閉じ込められた細胞は、閉じ込められた細胞と化学物質との反応または結合に基づいて、あるいはその物体の自然蛍光、または同一性標識もしくは背景標識としてその物体と関連付けられた物質の蛍光を用いて同定し得る。アッセイが完了次第、どの細胞を廃棄し、どの細胞を収集するかの選択がコンピュータおよび／またはオペレータを介して行うことができる。

細胞の操作は一般に、多重ビームを利用可能にすることによってより安全にされる。
釘のベッドのように、多重ピンセットは、細胞中のどの特定のスポットにおいても、より少ないパワーが導入されることを保証する。これによりホットスポットが排除され、損傷のリスクが低減される。吸収がレーザーパワーの自乗に比例するので、どのような破壊的な２光子過程も、大いに得をしている。第２のピンセットをただ加えることで、１つの特定のスポットでの２光子吸収が４分の１に減少する。Ｔｅｔｒａｈｙｍｅｎａのような大きい細胞は、効果的なトラッピングのために大量のレーザーパワーを要する。そのパワーを単一のトラップに入れることは、その細胞への損傷を直ちに引き起こすことになるであろう。

単に単一の細胞の操作でさえ、例えばホログラフィック光トラッピングを利用することによって大いに改善される。単一の頬上皮細胞は、片側の周囲に沿って細胞を持ち上げるピンセット列により操作し得る。結果として生じる回転により、その細胞の３６０度の眺めが可能になる。生物学的試料を眺めることについての利点に加え、試料を安定して配向できる機能もあり、これは、試料の配向に強く依存する散乱実験のような研究にとっての明らかな利益を有している。

広視野選別には、より高いスループットのような多くの利点がある。しかしながら、ＷＦＯＶにおける標準ピンセット操作は、過剰な放射圧のために失敗することがある。ホログラフィック光トラッピングを用いる広視野ピンセット操作は、光ビームの放射圧を大きく低減する光のエキゾチックモードを形成することを可能にし得る。例えば、ボルテックストラップは、光の変化する複数の位相がトラップの中心で相殺するので、１つの暗中心を有している。この暗中心は、ビームの中心まで進む光線の大部分がもはや存在しないことを意味している。光の放射圧の大部分を収容するのはまさにこれらのビームであり、従って、それらの除去により、軸方向トラッピングにおける困難が大いに緩和される。他のモード、例えば、ドーナツモードは同じ利点を有している。

本発明における１つの実施形態においては、その方法およびシステムは、各光トラップの動きおよび内容を追跡するための半自動化または自動化プロセスに適している。本発明における１つの実施形態においては、動きは、１つの光学データストリームを介して監視でき、この光学データストリームは、１人のオペレータの目視検査により、分光学的に、および／またはビデオモニタリングにより、眺めたり、１つのビデオ信号に変換したり、監視したり、分析したりできる。この光学データストリームは、強度を監視するための１つの光検出器、または光学データストリームを、１つのコンピュータおよびプログラムによる利用に適応したデジタルデータストリームに変換するためのどのような適切な装置によっても処理できる。このコンピュータプログラムは、細胞の選択および光トラップの発生を制御する。

本発明における他の複数の実施形態においては、細胞の動きは、位相パターニング光学要素を符号化することにより引き起こされた各光トラップの所定の動きに基づいて追跡される。加えて、いくつかの実施形態においては、１つのコンピュータプログラムは、各光トラップ中に閉じ込められている各細胞の１つの記録を維持する。

本発明における１つの実施形態においては、畜産のためのＸおよびＹ精子の細胞選別が実行される。肉牛産業において、子の雄／雌比率を現在の５０％：５０％から８５％：１５％に変えることができれば、年間の子の価値を劇的に増大させるであろう。より小さいが、同様の価値の増大が、酪農産業において生じるであろう。

本発明における１つの実施形態においては、複数の物体を選別する方法は、それらの物体を所定の流量で１つの入力チャンネル中に導入するステップと、１つのビーム操縦装置を用いて物体を送るステップと、１つの所定の基準をどれが満たすかを決定するために物体を評価するステップと、前記基準を満たす物体を、前記基準を満たさない物体から選別するステップとを含む。

本発明における別の実施形態においては、物体を選別する方法は、物体を１つの構造体の表面上に分布させるステップと、前記構造体中の物体を、１つのビーム操縦装置を用いて１つの所定の基準に従って評価するステップとを含む。

本発明におけるさらに別の実施形態においては、物体を選別する方法は、物体を１つのゲル中に分布させるステップと、１つの所定の基準を満たす物体を検出するステップと、前記基準を満たす物体を、前記基準を満たさない物体から選別するステップとを含む。

本発明におけるさらに別の実施形態においては、物体を選別するための装置は、１つの１つの光トラッピング装置を用いて形成された複数の光トラップと、１つの所定の流量でそれらの物体がその中に導入される１つの入力チャンネルと、少なくとも１つの出力チャンネルとを含み、それらの物体は、前記出力チャンネルに入る前に、１つの選別領域において、前記光トラップを用いて複数の所定の基準に従って選別される。

本発明におけるさらに別の実施形態においては、物体を選別するための装置は、１つのビーム操縦装置と、複数の物体がその上に分布される１つの表面を有している１つの構造体とを含み、それらの物体は、それらの物体が複数の所定の基準を満たすかどうかに従って、前記ビーム操縦装置を用いて選別される。

本発明におけるさらに別の実施形態においては、物体を選別するための装置は、物体を１つの入力チャンネル中に所定の流量で導入するための手段と、物体を送るための手段と、どの物体が所定の基準を満たすかを決定するために物体を評価するための手段と、前記基準を満たす物体を、前記基準を満たさない物体から選別するための手段とを含む。

本発明におけるさらに別の実施形態においては、物体を選別するための装置は、物体を構造体の表面上に分布させるための手段と、前記構造体中の物体を、１つのビーム操縦装置を用いて所定の基準に従って評価するための手段とを含む。

本発明におけるさらに別の実施形態においては、物体を選別するための装置は、物体を１つのゲル中に分布させるための手段と、１つの所定の基準を満たす物体を検出するための手段と、前記基準を満たす物体を、前記基準を満たさない物体から選別するための手段とを含む。

本発明におけるさらに別の実施形態においては、物体を選別する方法は、１つの光トラップを用いて物体にアクセスするステップと、前記物体を試験してその同一性を決定するステップと、前記同定された物体を、所定の基準に従って選別するステップとを含む。

本発明におけるさらに別の実施形態においては、物体を選別するための装置は、１つの光トラップを用いて物体にアクセスするための手段と、前記物体を試験してその同一性を決定するための手段と、前記同定された物体を、所定の基準に従って選別する手段とを含む。

本発明におけるさらに別の実施形態においては、物体を選別するための装置は、照明のための１つのレーザービームを提供する１つのレーザーと、前記ビームを複数のビームレットに回折させる１つの回折光学要素と、ビームレットを収束させて、それによって、光トラップを形成するための光学データストリームという結果になる光勾配条件を生成する１つの対物レンズとを含む１つのビーム操縦装置と、物体が導入されトラップされ選別される１つの試料室とを含む。

本発明におけるさらに別の実施形態においては、物体を操作する方法は、物体を評価システムに導入するステップと、１つのビーム操縦装置を用いて、１つの所定の基準に従って物体を評価するステップと、前記ビーム操縦装置を用いて、前記所定の基準に従って物体を操作するステップとを含む。

本発明におけるさらに別の実施形態においては、物体を破壊する方法は、１つのビーム操縦装置を用いて１つの物体にアクセスするステップと、前記物体を試験して、その同一性を決定するステップと、前記同定された物体を所定の基準に従って選別するステップと、前記物体が前記所定の基準を満たす場合に、前記識別された物体を破壊するステップとを含む。

最後に、本発明におけるさらに別の実施形態においては、物体を破壊するための装置は、１つのビーム操縦装置を用いて１つの物体にアクセスするための手段と、前記物体を試験して、その同一性を決定するための手段と、前記同定された物体を所定の基準に従って選別するための手段と、前記物体が前記所定の基準を満たす場合に、前記識別された物体を破壊するための手段とを含む。

このように、以下の詳細な説明がよりよく理解されるため、そして技術へのこの寄与がよりよく認識されるために、本発明におけるいくつかの特徴を、どちらかと言えば大まかに概説した。当然、以下で記述され、本明細書に添付される特許請求の範囲の主題を形成する本発明における追加の特徴がある。

この点で、本発明における少なくとも１つの実施形態を詳細に説明する前に、本発明は、以下の説明中に記載または図面中に例示される構成の詳細および構成要素の配置への適用に限定されないことが理解されるべきである。本発明における方法および装置は、他の実施形態ならびに様々な方法で実施および実行が可能である。また、ここで用いられる語法および専門用語、ならびに以下に含まれる要約は、説明の目的のためであり、限定するものとみなされるべきではない。

従って、当業者は、本開示が基づいている概念が、本発明のいくつかの目的を実行するための他の構造、方法およびシステムを設計するための基礎として利用できることを理解するであろう。従って、特許請求の範囲はそのような同等の構成を、それらが本発明における方法および装置の精神および範囲から逸脱しない限り含んでいるとみなされることが重要である。

図１に例示されるようなホログラフィック光トラッピング装置またはシステム１００において、光は、１つのレーザーシステムから入射し、下向きの矢印により示されるように進入し、システム１００にパワーを供給する。

１つの位相パターニング光学要素１０１は、好ましくは、１つの動的表面を有する１つの動的光学要素（ＤＯＥ）であり、これは、日本のＨａｍａｍａｔｓｕ製造の「ＰＡＬ−ＳＬＭシリーズＸ７６６５」、どちらもコロラド州ラファイエットのＢｏｕｌｄｅｒ Ｎｏｎｌｉｎｅａｒ Ｓｙｓｔｅｍ製造の「ＳＬＭ ５１２ＳＡ７」または「ＳＬＭ ５１２ＳＡ１５」のような位相オンリー空間光変調器（ＳＬＭ）でもある。これらの動的位相パターン化された光学要素１０１は、ビームレットを生成しビームレットの形を選択するために変え得る媒体中に符号化された１つのホログラムにより複数のビームレットを生成するためにコンピュータ制御される。図１の左下で生成された１つの位相パターン１−２は、水１０５中に懸濁された１μｍ直径シリカ球１０４で充填された右下に示されるトラップ１０３を作り出す。従って、システム１００は、左下に示される動的ホログラムにより制御される。

レーザービームは、複数のレンズ１０６、１０７を通って二色鏡１０８へ進む。ビームスプリッタ１０８は、１つの二色鏡、１つのフォトニックバンドギャップ鏡、全方向鏡、または他の同様な装置で構成される。ビームスプリッタ１０８は、光トラップ１０３を形成するために用いられる光の波長を選択的に反射し、他の波長を透過する。ビームスプリッタ１０８のエリアから反射された光の部分は、次に、合焦（対物）レンズ１０９の平面後部開口と対をなす１つの平面中の実質的に配置された符号化された位相パターニング光学要素にの１つのエリアを通される。

単一ビーム光トラッピング（レーザーまたは光ピンセットとも呼ばれる）においては、本発明の前は、許容できる光トラップのために高お開口数レンズが必要であると考えられていた。この考えの１つの基礎は、光トラッピングについては、粒子をトラップするために衝突光の電場中の勾配が用いられることであった。大きいトラッピング力を有するためには、電場中の大きい勾配（または光線の数密度）を有する必要があると考えられていた。通常これを達成する方法は、明視野を高開口数レンズに通すことである。

および広視野内の試料の観察およびトラッピングに伴う１つの問題は、そのような観察およびトラッピングが低開口数の対物レンズを要するということである。以前の教示に反して、本発明は、例えば図１における対物レンズ１０９として低開口数レンズを提供する。この状況において観察およびトラップできることは、微視的に製造された部品の設置のようなあるいは、例えば、細胞のような多数の物体での作業ような、低倍率レンズによりもたらされる広視野から恩恵を得るどのような用途においても有益であろう。

本発明に従う１つの例として、水１０５中に懸濁させた複数の３ミクロンシリカ球１０４を、かつてない低開口数の複数のレンズ１０９でトラップした。用いたレンズ１０９は、Ｎｉｋｏｎにより製造された。
（ａ） ０．１０のＮＡを有するＰｌａｎ４×
（ｂ） ０．２５のＮＡを有するＰｌａｎ１０×

適切な位相パターニング光学要素は、それらが、合焦された光のビームまたは他のエネルギー源をどのよう誘導するかによって、透過性または反射性として特徴付けられる。透過性回折光学要素は、光のビームまたは他のエネルギー源を透過させるのに対して、反射性回折光学要素はビームを反射する。

位相パターニング光学要素１０１は、静的または動的な１つの表面を有していると分類することもできる。適切なパターニング光学要素の例としては、回折格子、反射格子、および透過格子を含む格子、多色ホログラムを含むホログラム、ステンシル、光整形ホログラフィックフィルタ、多色ホログラム、レンズ、鏡、プリズム、波長板等を含むホログラムのような１つ以上の固定表面領域が含まれる。静的な透過性位相パターニング光学要素は、１つの固定表面により特徴付けられる。

しかしながら、いくつかの実施形態においては、位相パターニング光学要素１０１自身が可動であり、その結果、適切な領域を選択するためにレーザービームに関して位相パターニング光学要素１０１を動かすことにより１つ以上の固定表面領域の選択を考慮に入れている。

静的な位相パターニング光学要素は、１つのスピンドルに取り付け、１つの制御された電気モーター（図示せず）で回転できる。静的な位相パターニング光学要素は、１つの固定表面と複数の離散的領域を有している。静的な位相パターニング光学要素の他の実施形態においては、透過性か反射性の固定表面は、実質的に連続的に変化する複数の領域を含む１つの非均質な表面、あるいは離散的な領域と、実質的に継続的に変化する複数の領域との組み合わせを含んでいる。

それらの機能に対し時間依存的局面を有している動的な位相パターニング光学要素回の適切な例としては、コンピュータ生成回折パターン、位相シフト材料、液晶位相シフト配列、ピストンモードマイクロミラー配列を含むマイクロミラー配列、空間光変調器、電気・光学的デフレクター、音響・光学的変調器、変形可能鏡、反射性ＭＥＭＳ配列等が含まれる。動的な位相パターニング光学要素１０１を用いると、位相パターニング光学要素１０１を含む媒体１０５は、１つのホログラムを符号化し、このホログラムは、回折または収束のような、合焦された光のビームの位相プロファイルにおける対応する変化という結果になるパターン化された位相シフトを合焦された光のビームに付与するために変更され得る。加えて、媒体１０５は、光トラップ１０３の位置の変化を生み出すために変更し得る。各光トラップ１０３を独立して動かすために媒体１０５を変更できることが、動的な位相パターニング光学要素１０１の利点である。

ビームレットの位相プロファイルが、周辺においてはそれほど強くなく、周辺から内方の領域でより強い実施形態において、後部開口を約１５パーセント未満だけオーバーフィルすることは、後部開口をオーバーフィルせずに形成された光トラップよりも、周辺においてより大きい強度を有する光トラップの形成に有益である。

いくつかの実施形態においては、光トラップの形状は、その元の形状から、ポイント光トラップ、光学ボルテックス、ベッセルビーム、光学ボトル、光学回転体または光ケージの形状に変更し得る。光トラップは、２または３次元で動かし得る。位相パターニング光学要素は、レーザー光に、例えばガウスシアンをガウス−ラゲールモードに変換することにより、特定の位相モードを付与するのにも有用である。従って、１つのビームレットをガウス−ラゲールモードに形成できる一方で、別のビームレットをガウスモードに形成し得る。ガウス−ラゲールモードの利用は、放射圧を低減することによりトラッピングを大きく向上させる。

１． 画像化システム

現行の機器デザインは、一次画像化システム１１０用に１つの高解像度ＣＣＤカメラを用いる。ＣＣＤカメラ（図５の参照番号５１１を参照）の主要な利点は、この技術が成熟した技術なので、有利な価格／性能比である。ＣＣＤカメラの別の利点は、その広いダイナミックレンジおよびデジタル出力の生成が容易なことである。

画像は、オペレータのレーザーへの不注意による照射の可能性を最小限にするためだけでなく、トラップの位置を選択するための基準フレームを提供するために、コンピュータスクリーン（図５の参照番号５１０参照）上で見られる。

２． ユーザーインタフェース

ａ． 物体ディスプレイ

ユーザーインタフェースは、ＣＣＤカメラにより取得された視野を表示する１つのコンピュータスクリーンで構成されている。ユーザーは、マウスでトラップの場所を指定する。位置を削除する選択肢もある。

以下でより詳細に説明されるように、ユーザーは、標本の損傷を回避できるように、トラップあたりのパワーを指定することもできる。加えて、トラップパワーを変えることができることが望ましい。なぜならば、トラッピングは、標本ごとに変わることが予想される標本の屈折率と懸濁媒体との差に依存するからである。

ｂ． ホログラム

トラップの場所を指定する目的は、入力をホログラム計算に提供することである。ホログラムは本質的に、そのフーリエ変換が所望のトラップ配列を引き起こす１つの関数である。しかしながら、液晶ディスプレイの場合には、この関数は位相物体（すなわち、どのようなエネルギーも吸収することなく波面の位相を変更する物体）である。

ｃ． トラップの組を選択するための方法

多数のトラップが必要とされる場合、コンピュータマウスでそれらの位置を指定するための時間は、過度に長くなり得る。従って、必要な時間を低減するためのいくつかの選択肢がある。

１つの物体を特定の方向に動かすためにトラップを使用することが所望されることがよくある。これは、１本の線を描くようにマウスを使用することにより（ドラッギングにより）達成し得る。コンピュータプログラムは、１本の線を、順次展開され、標的上のロックを失うことなくその標的を複数の小さいステップで動かすように共に十分近い一連のトラップについての要求であると解釈する。

本発明は、トラップの高さを変更する能力も含んでいる。１つのレーザービームが対物レンズ１０９の光学軸と平行であれば、レンズ１０９の焦点面と同じ高さに１つのトラップが生じる。１つのトラップの高さの変更は、１つのトラップを形成している光のビームが、顕微鏡の対物レンズ１０９に入る際にわずかに収束（または発散）するようにホログラムを調整することによって達成される。１つのトラップの高さの調整は、複数のレンズを用いることにより可能であるが、１つのホログラフィック光トラッピング（ＨＯＴ）だけで、各個別のトラップの高さを、他のどのトラップとも無関係に調整することが可能になる。これは、液晶ホログラムにより引き起こされた位相変調を調整するコンピュータプログラムによって達成される。

３． 試料ホルダー

ａ． 一般

本発明の試料室２００（図２Ａおよび２Ｂ参照）は、安価で使い捨てである。本発明の試料室２００は以下で説明されるが、本発明の別の目的は、異なる用途について変更できる柔軟なデザインを創出することである。

試料室２００は、１つの顕微鏡スライド２０１の表面上に位置している。試料室２００は、標本または物体を導入するための一連のチャンネル２０３を含んでいる。チャンネル２０３は、細い管２０４（市販品）により、供給および収集貯留室に接続されている。複数の試料または物体は、液状媒体中に懸濁され、チャンネル２０３を介してワーキングエリアに導入される。
試料室２００は、１つのカバースリップ２０５により覆われる。

ｂ． 試料室の製作

本発明における１つの実施形態において、室２００を製作するためにポリ（ジメチルシロキサン）（ＰＤＭＳ）樹脂が用いられる。このプロセスは、標準のＣＡＤ／ＣＡＭ法を用いてコンピュータ上でチャンネル２０３の所望のパターンを作成することおよび従来のフォトレジスト／エッチング手法を用いてそのパターンをフォトマスクに転写することを伴う。次にフォトマスクは、シリコンウェーハ上にエッチングされる反転チャンネルパターンを作成するためのネガマスクとして用いられる。チャンネル２０３の深さは、エッチング時間により制御される。シリコンウェーハは、実際の試料室２００のネガレプリカである。最終ステップは、ウェーハ上にＰＤＭＳを注いで重合させることによりポジの試料室２００を作成することを伴う。これの結果、ガラススライド２０１に接合され、カバースリップ２０５が上に載ったＰＤＭＳ型が得られる。ＰＤＭＡへのガラスの接合は、露出表面を活性化する酸素エッチングによって行われる。

一貫した品質を保証するために、いくつかの付加的なステップが必要である。例えば、ＰＤＭＳ溶液／硬化剤は、気泡形成を防止するために、真空下に保たれる。シリコンウェーハは、ＰＤＭＳがウェーハに固着しないように、シラン処理される。レプリカの洗浄および適切な環境制御の維持を伴う様々なステップがある。これらは、標準の技術である。

複数のチャンネル２０３は、接着剤２１４を用いて保持された複数の小型注射針２０６を用いてマイクロボア２０４に接続されており、注射針は、ＰＤＭＳ型を通って、複数の小さい円形ウェル２０７に挿入されており、ウェルは各チャンネル２０３に接続している。複数の試料溶液が、複数のマイクロポンプ２０８を用いてチャンネル２０３に導入される。

図２Ｂは、２１０において注射器ポンプ２０８を介して１つの試料を導入するための典型的な構成の１つの図を示す。媒体は２１１において導入され、排出物は２１で収集され、所望の収集は２１３でなされる。

図３は、上記で説明されたプロセスから実際に作成された図２Ｂの図の走査電子顕微鏡写真を示している。チャンネルは、ほぼ幅５０ミクロンで深さ５０ミクロンである。図４は、研究中の標本操作が行われる「ワーキング」体積の走査電子顕微鏡写真を示している。これらの図は、チャンネル２０３が滑らかかつ清浄であることを明らかに示している。チャンネル２０３は断面が矩形であるが、他の形状も同様に考案し得る。チャンネル２０３は、試料を「ワーキングエリア」へ流すことができるように設計されており、ワーキングエリアの形状は、実験の要件向けに注文設計できる。

ｃ． ホログラフィック光トラップ

複数のトラッピングポイントを順次扱い、従って時分割方式である走査光トラップとは異なり、ホログラフィック光トラップは、それらのトラップの各々を連続的に照明する。連続的に照明されるトラップと同じトラッピング力を走査光トラップが達成するには、走査光トラップは、少なくとも同じ時間平均強度を提供しなければならない。このことは、走査トラップが、少なくともトラッピング領域数に比例する係数倍高いピーク強度を有していなければならないことを意味する。このより高いピーク強度は、トラップされた物質における光学的に引き起こされる損傷の機会を増加させる。この損傷は、少なくとも３つの以下の機構により生じ得る：（１）局所的加熱につながる単一光子吸収、（２）光化学的変換につながる単一光子吸収、および（３）光化学的変換につながる多光子吸収。事象（１）および（２）は、トラッピング物質および周囲の液体媒体により弱く吸収される光の波長を選ぶことによって緩和し得る。事象（３）は、より一般的な問題であり、より長波長の光を用いることによって、ある程度緩和し得る。かくして、ホログラフィック光トラップは、全体の力を単一のポイントに作用させたりある時間の間により高い強度で作用させたりすることにより物体を潜在的に損傷するのではなく、１つの物体上の複数のポイント間により少ない量の力を連続的に分布することにより、繊細な物質をより穏やかにかつより効果的に操作し得る。

本発明における１つの実施形態においては、チャンネル２０３のどのような所望のパターンでも標準のＣＡＤ／ＣＡＭコンピュータプログラムによってデザインできるという点でデザインは柔軟性がある。チャンネル２０３が互いに衝突しないように十分に離れている限り、パターンの複雑度は要因ではない。図２Ｂおよび図３に見られる通り、単一のチップを、１回を超える実験用に用い得るように、複数組のチャンネル２０３を容易に収容できる。さらに、ひとたび１つの型が作られると、この型は、数千の試料室を製作するために用い得るので、この方法論は、大量生産技術に容易に対応可能である。単一の室の限界原価は、大量生産時には数セント程度になるであろうと見積もられる。

４． 光学システム

ａ． ホログラム合成

ホログラフィック光トラップの初期バージョンは、各種の材料から製作された固定ホログラムを用いた。これらは、数百個までのトラップを作成するためにホログラムを用いることの原理を実証するのに十分であった。しかしながら、これらのホログラムの主要な欠点は、それらのホログラムが静的であり、単一のホログラムを作るのに何時間もかかることであった。毎秒あたりホログラムを多数回形成可能なコンピュータ駆動液晶ディスプレイを作成するハードウェアの出現によって、動的なデバイスとしての光トラップの使用が実用的な現実になった。ホログラムを計算するための原理を以下説明する。

ｂ． 顕微鏡

光学システム１１０は、１つの標準高品質光学顕微鏡で構成される。対物レンズは、１つの長作動距離集光レンズと連結された１つの高開口数レンズ１０９である。この高開口数対物レンズ１０９は、トラッピング用に用いられる。長作動距離集光レンズは、画像の解像度をある程度低減することがある一方で、トラッピングを損なうことはなく、配管類および容器を収容するために、試料スライド近くに余分な空間を提供する。物体は、複数のトラップでそれらを保持し顕微鏡の台を垂直または側方へ移動させることによって移動できる。

本発明における１つの実施形態においては、トラップにおいて２００マイクロワットを生み出すために約２ｍＷのレーザーパワーが用いられる。２Ｗレーザーから利用可能なこのパワーレベルは、約１０００個のトラップを作成するのに十分である。１つの緑色レーザー（５３２ｎｍ）が用いられるが、他の波長も用いることができ、例えば、５３２ｎｍの値の近傍で吸収する物質を扱うための遠赤外レーザーが含まれる。

トラッピングは、屈折率勾配に依存し、従って、周囲媒体の屈折率に近い屈折率を有する物質は、より高いパワーレベルのトラップを必要とする。加えて、損傷に対する物質の許容範囲はトラップパワーに伴って変わり、従って、ユーザーがこのパラメーターを制御できることが望ましい。ユーザーは、グラフィックインタフェース上に表示された「パワースライダー」を用いてどの特定のトラップのパワーレベルも増大できる。

ｃ． 液晶ホログラム（空間光変調器またはＳＬＭとも呼ばれる）

空間光変調器１０８は本質的に、１つの静電場により制御される１つの液晶配列であり、この静電場が今度はコンピュータプログラムによって制御できる。液晶配列には、印加される電場に基づいて光の位相を異なる量だけ遅延させる特性がある。

ネマティック液晶デバイスは、１つの大きい位相オンリー変調深さが必要なディスプレイまたは用途に用いられる（２Πまたはそれ以上）。ネマティック液晶分子は、通常はデバイス表面と平行になっており、液晶の複屈折のために最大の遅延をもたらす。電場が印加されると、それらの分子はその電場と平行に傾く。電圧が増大すると、異常軸に沿って屈折率、従って複屈折が事実上減少し、デバイスの遅延の低減を引き起こす。

ｄ． レーザー

有用なレーザーとしては、固体レーザー、ダイオードポンプレーザー、ガスレーザー、アレキサンドライトレーザー、自由電子レーザー、ＶＣＳＥＬレーザー、ダイオードレーザー、Ｔｉ−サファイアレーザー、ドープされたＹＡＧレーザー、ドープされたＹＬＦレーザー、ダイオードポンプレーザー、およびフラッシュランプポンプＹＡＧレーザーが含まれる。１０ｍＷ〜５Ｗで作動するダイオードポンプＮＤ：ＹＡＧレーザーが好ましい。

生物学的物質を調査するための配列を形成するために用いられるレーザービームの好ましい波長としては、赤外、近赤外、可視赤、緑色、および可視青波長が含まれ、約４００ｎｍ〜約１０６０ｎｍの波長が最も好ましい。

５． 運転方法

本発明における１つの実施形態においては、（Ａｒｒｙｘ，Ｉｎｃ．，Ｃｈｉｃａｇｏ，Ｉｌｌｉｎｏｉｓにより販売されているＢｉｏＲｙｘシステムのような）１つの光トラッピングシステム５００（図５参照）は、１つのＮｉｘｏｎ ＴＥ２０００シリーズ顕微鏡５０１を含み、この顕微鏡中に、１つのホログラフィック光トラッピングユニット５０５を用いて複数の光トラップを形成するためのマウントが設置されている。１つのハウジングが取り付けられるノーズピース５０２は、マウントを介して顕微鏡５０１中に直接的に嵌合する。画像化のために、試料５０６を照明するため、対物レンズ５０４の上方に照明源５０３が設けられる。

本発明における１つの実施形態においては、光学トラップシステム１００（図１および５参照）は、光学要素の近傍にある第１の光チャンネルの一方の端部と、第１の光チャンネルに垂直に形成された第２の光チャンネルと交差しこれと連通する第１の光チャンネルの他方の端部とを含む。第２の光チャンネルは、１つの顕微鏡レンズ設置タレットすなわち「ノーズピース」の基部内に形成される。ノーズピースは、Ｎｉｘｏｎ ＴＥ ２００シリーズ顕微鏡に適合するようにされている。第２の光チャンネルは、やはり第２の光チャンネルに垂直な第３の光チャンネルと連通している。第３の光チャンネルは、ノーズピースの頂面からノーズピースの基部を通っており、１つの対物レンズ集束レンズ１０９と平行である。集束レンズ１０９は、後部開口を形成している１つの頂部と１つの底部とを有している。第２の光チャンネルと集束レンズの後部開口との間の第３の光チャンネル中に、１つの二色鏡ビームスプリッタ１０８が置かれている。

複数の光学トラップを形成するための光学トラップシステム内の他の構成要素としては、位相パターニング光学要素１０１から出て第１の光チャンネルを通るビームレットを反射する第１の鏡、第１の光チャンネル内に配置され第１の鏡により反射されたビームレットを受け取るように整合された複数の転送光学部品１０６の第１の組、第１の光チャンネル内に配置され転送レンズの第１の組を通るビームレットを受け取るように整合された転送光学部品１０７の第２の組、および第１の光チャンネルと第２の光チャンネルとの交点に置かれ転送光学部品の第２の組および第３の光チャンネルを通るビームレットを反射するように整合された第２の鏡１０８が含まれる。

複数の光トラップを生成するために、１つのレーザービームが、レーザー５０７（図５参照）から１つのコリメータおよび１つの光ファイバ端部５０８を通って誘導され、回折光学要素５０９の動的表面から反射される。光ファイバのコリメータ端を出る光ビームは、回折光学要素の動的表面により複数のビームレットに回折される。各ビームレットの数、タイプおよび方向は、動的表面媒体中に符号化されたホログラムを変更することによって制御および変えることができる。次にこれらのビームレットは、第１の鏡で反射して転送光学部品の第１の組を通り第１の光チャンネルを下り転送光学部品の第２の組を通って第２の鏡へ行き、二色鏡５０９において対物レンズ５０４の後部開口まで誘導され、対物レンズ５０４を通って集束され、その結果、複数の光トラップを形成するのに必要な光勾配条件を生み出す。二色鏡５０９を通って分割される光の部分は、画像化のために、１つの光学データストリームを形成している第３の光チャンネルの下方部分を通過する（図１参照）。

生物学的物質の１つの試料の分光分析は、分光分析か偏光後方散乱に適した１つの画像化照明源５０３によって達成でき、前者は化学的同一性の評価に有用であり、後者は核サイズのような内部構造の寸法測定に適している。そのような顕微鏡的方法を用いて、いくつかの実施形態において、細胞が質問される。スペクトルデータを分析し、ＸまたはＹ染色体か、または疑わしい癌性、前癌性および／または非癌性細胞型を持っている細胞を同定するために、１つのコンピュータ５１０が使用できる。次に、コンピュータプログラムは、選択された細胞型を閉じ込めるように光トラップを誘導するための情報を適用できる。次に、閉じ込められた細胞は、閉じ込められた細胞と化学物質との反応または結合に基づいて同定し得る。

本発明の方法およびシステムは、各光トラップの動きおよび内容を追跡するための半自動化または自動化プロセスに適している。動きは、ビデオカメラ５１１、スペクトル、または１つの光学データストリームを介して監視でき、これは、細胞の選択および光トラップの生成を制御するコンピュータプログラムを提供する。

他の実施形態においては、位相パターニング光学要素を符号化することによって引き起こされる各光トラップの所定の動きに基づいて細胞の動きが追跡される。加えて、いくつかの実施形態においては、各光トラップ中に閉じ込められている各細胞の記録を維持するために、１つのコンピュータプログラムが用いられる。

次に光学データストリームは、１人のオペレータの目視検査により、分光学的に、および／またはビデオモニタリングにより、眺めたり、１つのビデオ信号に変換したり、監視したり、分析したりできる。この光学データストリームは、強度を監視するための１つの光検出器、または光学データストリームを、１つのコンピュータによる利用に適応した１つのデジタルデータストリームに変換するためのどのような適切な装置によっても処理できる。

ＳＬＭを利用しない１つのアプローチにおいて、動きは、物体を第１の組の光トラップから、第２の組、第３の組、第４の組等へ移すことによって達成される。物体を第１の位置から第２の位置へ動かすために、１つの静的位相パターニング光学要素は、対応する所定の位置の第２の組において光トラップの第２の組を生成する第２の領域とレーザービームを位置合わせさせるために、１つのスピンドルまわりで回転される。第１の位置の適切な近傍に、光トラップの第２の組を構成することによって、プローブは、光トラップの第１の組から光トラップの第２の組まで通すことができる。この一連の手順は、所望の一に対応する適切な領域に整合させるために位相パターニング光学要素を回転することによって、プローブを、所定の位置の第２の組から所定の位置の第３の組へ、この位置の第３の組から所定の位置の第４の組へ、そしてこの所定の位置の第４の位置から以下同様に通しながら継続する。光トラップの１つの組の終了と次の生成との間の時間間隔は、それらのプローブが流れ出す前に、光トラップの次の組へ確実に移送されるための所要時間である。

広い近接から狭い近接への複数の物体の千鳥状の動きにおいては、複数の細胞の千鳥状の動きは同じように生じる。しかしながら、複数の物体が光トラップの第１の組から第２の組へ通され、第２の組から次の位置へ移動される時に、複数のトラップの千鳥状配置により、間違った光トラップによる複数の物体の閉じ込めを引き起こし得る２個の物体への近すぎるトラップの組の設置をすることなく、複数の物体を密に充填することが可能になる。

１つの物体または細胞がひとたび１つのトラップと相互作用すると、その細胞を調査するために複数の空間的方法を使用し得る。ポジティブな結果を有した細胞（すなわち、１つの標識と反応したか、その標識と結合した細胞）のスペクトルは、非弾性的分光分析か偏光後方散乱に適切した画像化照明を用いて得ることができる。所望の複数の標的を同定し、それらの所望の標的を分離するために位相パターニング光学要素を誘導するために、１つのコンピュータがスペクトルのデータを分析できる。アッセイ完了時に、どの細胞を廃棄しどの細胞を収集するかの選択をコンピュータおよび／またはオペレータを介して行える。

光学蠕動（図９参照）は、マイクロ流体チャンネル４０１中のトラップの平行な列４００を用いる現行のプロセスであり、トラップの列は、トラップの第１の列がパワーを切られた場合に、１つの列中にトラップされた複数の粒子４０２が他の列中のトラップに引き込まれることを列間の間隔が可能にするように配置されている。光学蠕動は、（用途に関して後述されるような）蛍光標識の代わりとしておよびこれと組み合わせて用い得る。このプロセスは、粒子が、トラップの列の配置により指定された所望の方向へ動かされるように時間調節されたトラップの列の消滅を時間調節することにより動作する。１個の粒子の一方の側または他方の側のトラップの列がオンであるかオフであるかを選ぶことにより、その粒子は、１つの方向に前方または後方へ移動され得る。多数のトラップを使用することにより、多数の粒子を、ある特定の方向へ一斉に動かし得る。従って、トラップに引き付けられた複数の粒子を、ある特定のエリアに移動させることができ、要望があればそこで収集することができる。

同様に、列中のトラップ間の間隔をある特定の方向に向かって徐々に減少させることおよび／またはトラップの列の曲率を変化させることにより、それらを集中するために、複数の粒子を１つの合焦パターン中に一掃して集中させることができる。そのようなパターンを逆転させると、粒子を拡散させることになるであろう。

トラップの列間の間隔は、粒子の動きを加速するために比較的大きくしたり、粒子の動きの速度を落とすために比較的狭くしたりできる。同様に、選択されトラップまたは列の強度、従って、粒子へのそれらの効果を変えることも利用できる。流れを集束または発散することによって、複数の粒子を結合したり分離したりできる。加えて、光学蠕動は、例えば、物質を細かく分離するための複雑かつ特定のパラメーター値の組を生成するために、粘性抵抗または電場の差動効果と組み合わせることができる。トラッピングおよび他の力に対抗することによって、２つの力の均衡点が、１つの粒子がトラップで動くか他の力で動くかを決定する。

本発明における１つの実施形態においては、光学蠕動は、対応する一連のホログラフィック光トラッピングパターンを実現するために一連の位相パターンを通って循環する１つのホログラフィックシステムによって実現できる。そのようなパターンは、１つのプリズムの面上に設置された反射性回折光学要素の表面起伏中に符号化でき、各パターンは１つのモーターによって所定位置に回転される。同様に、透過性回折光学要素を、１つのディスクの周辺に設置し、複数のパターンを通って循環するように回転できる。フィルム上に符号化された切り換え可能な位相格子および位相ホログラムも用いることができる。

トラッピング力が外部駆動力よりもかなり大きい流体の流れのような、外部のバイアス力により直線配列を過ぎて駆動される粒子については、粒子はトラップされる。バイアス力がより大きい場合、粒子は配列を通り過ぎて流れる。これらの両極端の間では、バイアス力は、複数の粒子の何分の１かについてトラッピング力を異なる程度で超え、配列の主軸方向に沿ってトラップからトラップへ粒子を飛び移らせる。配列が４５°まで回転される場合にゼロ正味偏向が観察されることがあり、その理由は、（１）正および負の移動が同じ確率で生じるから、または、（２）粒子が、［１１］の方向にロックされるようになり、配列を通って対角線状にジャンプするからである。

１つの配列によってより大きく影響された粒子は、バイアス力によってより大きく影響された粒子よりも大きい角度まで偏向され得る。複数の粒子に及ぼされる光勾配力は、ほぼａ３として変化する（ａ＝半径）。複数の粒子にかかるストークス抵抗は、「ａ」として変化する。従って、より大きい複数の粒子はトラップ配列により不釣合に影響される一方で、より小さい複数の粒子はより小さい偏向を受ける。配列を最適偏向角度近くに向け、最も大きい粒子をホッピング条件、したがって、より小さい粒子よりも大きい偏向、に設定するために強度を調整する。様々に偏向された複数の粒子は、第１の配列の下流の付加的配列によって、収集またはさらに分別し得る。

分別のためのいくつかの従来手法により、印加された力の方向での分離が達成される。
しかしながら、そのような手法は、連続的ではなくて試料のバッチにおいて働く。

微小分別（ｍｉｃｒｏｆｒａｃｔｉｏｎａｔｉｏｎ）のための他の従来手法は、障害物または障壁の２次元格子で構成される微細加工ふるいを利用する。例えば、障壁の非対称配置により、ふるいを通過する複数の粒子のブラウン運動が修正され、それらの粒子を、粒子の拡散係数に依存する経路を流れるようにする。しかしながら、微細加工された格子の使用は目詰まりし、粒子サイズおよびタイプについて調整できない。

図６には、本発明に従う粒子選別の一例が示されている。例示される例は側方偏向を示しているが、光学蠕動をこの同じシステムにおいて得ることができる。ビデオ画像の表示は物質の光ベースの分離を示しており、この場合、粒子サイズに基づいて物体を分離するように調整されている。左上のチャンネル中の流れは、１、２．２５、および４．５μｍ粒子を含んでおり、別の流れが左下から流入している。重ね合わせられた複数の線は、システムレーザーパワーがオフの場合の、チャンネルの流れの各々をそれぞれを示している。レーザーパワーがオンにされた場合、交差領域における光（重ね合わされた緑色のボックスにより示される）は、４．５μｍ粒子を上方の流れから抽出し、それらの粒子を、重ね合わされた白色の経路により示されるように、右下のチャンネルへ送り出す。

６． 精子選別における応用

ａ． 背景

本発明における１つの応用において、光トラッピング技術を用いることにより、高解像度の高スループット細胞選別装置が実現される。細胞選別のための新しい基礎としてのこの技術の実現に対するニーズは、多くの選別問題で必要な細胞特徴の高解像度の決定を実行する従来のフローサイトメーターの失敗によって証明される。畜牛業界におけるＸおよびＹ染色体を持つ精子を互いに分離するこの例において、流量は今日の最新システムのレートから実質的に縮小される。その理由は、従来のフローサイトメトリーは、蛍光／非蛍光の決定をすることが最も得意であり、このモードで、３０，０００細胞／秒の出力を出すレートで動作し得るからである。この問題が、異なる蛍光レベル間での区別の問題になると（精子分離の問題におけるように）、これらの方法は非常に非能率的になる。ＸおよびＹ染色体を持つ精子の蛍光が約４％異なる精子分離の問題においては、レートは毎秒約４，０００個の出力細胞にまで低下する。（Ｊ．Ｌ．Ｓｃｈｅｎｋ，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ，Ｔｈｅ Ｒａｎｇｅ Ｂｅｅｆ Ｃｏｗ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ ＸＶＩ，１９９９参照）

ｂ． ホログラフィック光トラップを用いる選別

本発明の高解像度の高スループット細胞選別を実現する方法は、以下の構成要素を有している：すなわち、マイクロ流動の開発、光トラップシステム開発（ファンネルシステムのためのトラッピング構成要素および分離システムのためのトラップ構成要素）、高解像度蛍光測定、システム制御（ホログラム計算を含む）、および機械的設計である。

第１の構成要素は、入力試料を運ぶ１つの流体入力チャンネルと、分離された細胞を入力チャンネルから運び出す２つの出力チャンネルとを有する１つのフローセルである。第２の構成要素は、「送る」機能を実行する１組のトラップである（この「送る機能」は、従来のフローサイトメーターにおいて液滴フローを形成するノズルの等効物である）。第３の構成要素は検出システムであり、最後に、第４の構成要素は選別システムである。図７Ａ−７Ｂは、これら４つの構成要素間の関係を例示している。

この例においては、精子は分離のための１つの試料標的として用いられる。ＸおよびＹ染色体を持つ精子を区別するための従来の方法は、存在する全蛍光が存在する全ＤＮＡの目安となるようにＤＮＡと特異的に結合する色素である、Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２を利用するものである。この蛍光の測定により、内在する染色体荷重の性質の推定が得られる。（Ｓｃｈｅｎｋ，１９９９；また、Ｅｒｉｋ Ｂ．ｖａｎ Ｍｕｎｓｔｅｒ，Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ，ｖｏｌｕｍｅ ４７，ｐａｇｅ １９２，２００２）。

本発明のこの提案された実施形態に、高いスループットを達成することを可能にさせる本質的な特徴は、物質を平行列に同時かつ互いに近接して走らせることができるその固有の能力である。この最初の実現のため、１０ミクロンで互いに隔てられた１０本の入力列３００を有する流れシステムが作り出される。これは、１１０ミクロンの入力貯留室からの流れに全幅を設定する。出力チャンネル３０２、３０３はそれぞれ、入力チャンネル３０１と同じ１１０ミクロン幅であり、図７Ａおよび７Ｂに示されるように、入力チャンネル３０１と平行に走っている。「出力チャンネル」３０２、３０３中に１種類の緩衝液が導入され、この緩衝液は、入力チャンネル３０１中で維持されているのと同じ流量でこれらのチャンネルに供給される。合計３つのこれらのチャンネル３０１、３０２、３０３は、対象となる流れ範囲全体にわたり層流を維持するように設計される。特定の細胞が入力チャンネル３０１から、出力チャンネル３０２、３０３１の１つへ移される選別領域において、合計３つの流れは隣接していてそれらの間に機械的分離は全くない。層流はどのような物質も、その物質を１つの流れチャンネルから別のチャンネルへ移すために特定の外力が導入されない限り、それらのそれぞれの流れ中に保持する。

ファンネリングトラップ３０５は、入力細胞３０６に作用し、その結果、それらは両方ともうまく定義された流れの列中を移動し、入力細胞３０６は、オペレータにより設定される最小距離３０６で互いに隔てられる。チャンネル３０１、３０２、３０３中の流量は、この最小距離３０６、分離機能を実行しているデバイスの「更新」速度、および所望の全体的細胞処理速度により設定される。我々のサンプルケースにおける最小距離を２０ミクロン（精子頭部を完全に分離するには十分であるが、尾部の瑣末な重なりは可能にする距離）とし、処理速度を１，５００細胞／秒と想定すると、このシステムは３ｍｍ／秒の流速を用いる［１５，０００細胞／秒）×（２０ミクロン／細胞列）÷（１０列）］。（これをチェック）

ファンネリングシステムは、１つの回転ホイール中に取り付けられた１組の静的なホログラムにより設定された複数の低強度トラップ３０５の１つのパターンで構成されており、このパターンは回転パターンの関数として変化する。最も下流のファンネリングトラップは、強度および位置が固定されており、流れの細胞列間の分離を維持するためだけに働く。上流のトラップ３０５は、凝集細胞の流れを妨害し個別のまたは未凝集細胞を通過させるように作動するために、強度および位置の双方を時間と共に変更できるようにされている。

選別決定がそれに基づいてなされる測定は、ファンネリングトラップ３０５の下流領域で行われるか、またはファンネリングシステムのさらに向こうの領域において行われ得る。この初期のシステムについては、測定は高解像度蛍光検出で構成される。しかしながら、将来、散乱測定のような、他の能動的な選別基準が実現されたり、前に概説されたような光学偏向を用いる手法のような受動的手法が利用されたりするかもしれない。

デバイスの最終的な構成要素は、細胞を出力チャンネル３０２、３０３のうちの１つに進路を変えたり、またはそれらの細胞が入力チャンネル３０１の流れの中に留まることを可能にしたりするために選別基準が利用される分離システムである。この構成要素について決定的なパラメーターは、分離を駆動する動的なトラップ３０５の配列を実現するために使用される高開口数対物レンズ３０４の視野である。この視野の幅は、個別のチャンネル幅と同じ１１０ミクロンである。しかしながら、長さは、流量、チャンネル深さ、およびこれらのトラップを制御するために使用される光学デバイスの更新レートに依存する。

現在、本発明における１つの実施形態は、光トラッピングシステムの駆動において非常に効果的な位相マスクを作り出す複数の空間光変調器を含む。これらのデバイスは、３０Ｈｚ以上の更新レートを有している。１０ミクロンの推定チャンネル深さを用い、精子細胞が１ミクロン刻みで移動されるものと仮定すると、１個の細胞を入力チャンネル３０１の中心から、どちらかの出力チャンネル３０２、３０３の中心へ移動するために空間光変調器の１０回の更新が利用される。３０Ｈｚの更新値を用いると、これらの１０ステップは、１／３秒で生じる。３ｍｍ／秒の流量においては、これらの１０ステップは、流れ方向における１ｍｍの長さにおいて実現される。従って、分離構成要素のための対物レンズ３０４は、１１０ミクロン×１０００ミクロンのワーキングエリアを持つことになるであろう。このプロジェクトの１つの重要な開発分野は、このレンズアセンブリのデザインである。レンズデザインにおけるトレードオフは一般に、視野と開口数との間にある。すなわち、ある特有の複雑度の１つのレンズアセンブリについて、これらのエリアの１つの大幅な性能向上には他のエリアの性能低下が付いてくる。集積回路エレクトロニクスの高解像度リソグラフィック製造のような分野で用いられる高性能レンズが相当複雑なのは、この理由からである。しかしながら、本発明は、これらのレンズアセンブリの性能レベルのかなり下にある。

７． 広視野ボルテックスピンセット操作の開示

広視野でのピンセット操作は、比較的低開口数の顕微鏡対物レンズを要する。物体を軸方向に光学トラップする能力は、最大勾配を軸方向に有するやり方で１つの光ビームを合焦させることに頼っている。これは、光円錐が最も広い可能な半径で形成されるべきであることを意味している。円錐の半径は、対物レンズの開口数により直接決定される。すなわち、高開口数は、広い円錐半径を意味する。これは、広視野についての諸要件と直接衝突する。このことが従来、軸方向における広視野でのピンセット操作を困難にしてきた。軸方向のピンセット操作の困難さへの主たる寄与の１つは、合焦された光ビームの放射圧である。特に、密度において周囲媒体と十分に適合された粒子、例えば、ポリスチレン微粒子について、放射圧は粒子をトラップから吹き飛ばし得る。低開口数対物レンズを用いると、軸方向の十分なピンセット操作力で放射圧を克服することは困難である。しかしながら、ホログラフィック光トラップには、光ビームの放射圧を大きく減らす光のエキゾチックモードを形成する能力がある。例えば、ボルテックストラップは、光の変化する複数の位相がトラップの中心で相殺するので、１つの暗中心を有している。この暗中心は、ビームの中心まで進む光線の大部分がもはや存在しないことを意味している。光の放射圧の大部分を収容するのはまさにこれらのビームであり、従って、それらの除去により、軸方向トラッピングにおける困難が大いに緩和される。他のモード、例えば、ドーナツモードは同じ利点を有している。

物体または細胞の操作（押すこと、操縦、選別）は一般に、多重ビームを利用可能にすることによってより安全にされる。釘のベッドのように、多重ピンセットは、細胞中のどの特定のスポットにおいても、より少ないパワーが導入されることを保証する。これによりホットスポットが排除され、損傷のリスクが低減される。吸収がレーザーパワーの自乗に比例するので、どのような破壊的な２光子過程も、大いに得をしている。第２のピンセットをただ加えることで、１つの特定のスポットでの２光子吸収が４分の１に減少する。ピンセットの１つの配列により定位置に保持されるＴｅｔｒａｈｙｍｅｎａのような大きい細胞は、効果的なトラッピングのために大量のレーザーパワーを要する。そのパワーを単一のトラップに入れることは、その細胞への損傷を直ちに引き起こすことになるであろう。

最後に、単に単一の細胞の操作でさえ、ホログラフィック光トラッピングを利用することによって大いに改善される。単一の頬上皮細胞は、片側の周囲に沿って細胞を持ち上げるピンセット列により操作し得る。結果として生じる回転により、その細胞の３６０度の眺めが可能になる。生物学的試料を眺めることについての利点に加え、試料を安定して配向できる機能もあり、これは、試料の配向に強く依存する散乱実験のような研究にとっての明らかな利益を有している。

８． 回転ディスクベース細胞選別

典型的な牛射精液中の精子は数が多く、精子がもはや機能しなくなる前に利用可能な時間も少ないので、商業的に成り立つ精子選別装置のためには毎秒多数（１００万個のオーダー）の精子が選別される。ホログラフィック光トラップを用いた選別により、多数の細胞を並行して処理するその能力を通して大きな利点がもたらされる。

多くの部位に迅速にアクセスするためにレーザーを使用するための技術は、回転レーザーディスク、ＣＤプレイヤー、またはＤＶＤプレイヤーという形ですでに存在する。これらのデバイスは、信じられないほどの高速で複数の部位にアクセスするために、ディスクの回転運動をレーザーの半径方向運動と組み合わせている。例えば、典型的なＤＶＤプレイヤーは、ディスク上の約４０億個の別個の「ビット」に約２時間でアクセスできる。この回転ディスク方式を光トラッピングと組み合わせる（図８参照）ことにより、同様な速度で細胞にアクセスすることが可能になり、ホログラフィック光トラッピングは、これらの速度を１００倍以上増大させる。

図８に示されるように、複数の物体または細胞が試料取り入れ口７００において導入され、適切な試料送出システム７０１を用いて、これらの細胞は、モーター制御により回転される試料分布ディスク７０２に提供される。制御および分析システム７０４に接続されている画像化およびトラッピングシステム７０３は細胞を選別し、それらの細胞は、試料室７０５および７０６中で収集される。

細胞をディスク表面上に分布させるための多くの機構がある。個別の細胞を収容する流体室、細胞を固定化するゲル、細胞を結合する粘着性または蝋状表面、または細胞を凍結して固体にすることさえも、すべて利用できる方法である。細胞が、それらの相対的位置を維持するようにひとたび位置させられたら、それらの細胞は適切に測定し得る。光トラッピングは、所望の細胞か不要の細胞のいずれかを表面または容積から解放するために用い得る。２つを超えるグループへの選別が望まれる状況において、各グループは１回のシングルパスで開放することができ、複数パスを実行し得る。

９． 溶融可能な基体を用いた細胞および非生物学的物質の選別

蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）のような技術は、十分に確立されてはいるが、これらの技術が逐次処理方法であるという事実が悩みである。生物学において標識付け色素が広く用いられているので、これらの色素に基づく選別が可能である。これらの色素は、染色された標本と未染色の標本との間である波長または波長範囲の吸収の違いを、選別されるべき複数のグループがそのような吸収の違いを本来的に示さないと想定して、作り出すことがよくある。
ホログラフィック光トラップは、標本を加熱することと、その標本を操作して標本の高温で溶解する基体中へ標本を入れることの双方を行うために用い得る。埋め込まれる標本は、後にバルク温度の上昇によって放出できる。加えて、標本の配列全体を同時に処理する広帯域高出力光源により細胞が照明される、より速くいっそう平行な処理方法が可能である。同じ方法の組を、吸収スペクトルが異なる非生物学的試料に適用したり、そうするように選択的にできる。

１０． ゲルベース選別

ホログラフィック光レーザートラップは、それらが複数の物体を３次元でアクセスし移動することが可能であるという点で、物体の操作に関する１つの大きな利点がある。生物学的選別の応用がより高度化するにつれ、より大数の標本が、しばしば短時間で選別される必要がある。ホログラフィック光トラップの３次元アクセスは、これらの選別の応用が実現できることを意味している。大量の細胞あるいは逐次的または２次元基体上で選別することが煩雑もしくは不可能であろう生物学的関心のある他の標本が効果的に選別できる。

そのような３次元選別の１つの実施例は、可逆的ゲル化プロセスに頼っている。複数の細胞は、１つの網様構造中でゲル化され、次に、所望のまたは不要の細胞のいずれか一方が、ホログラフィック光トラップを用いてそのゲルから抽出される。これらのトラップからの熱は、ゲルを溶解し、複数の出口経路を提供するために用い得る。

代わりに、細胞は、何らかの基準に基づいて、ホログラフィック光学レーザートラップで選択的に殺滅される。次にゲル全体が溶解され、生きている細胞が死んだ細胞から分離される。ただ殺滅する代わりに、より破壊的な熱爆発を発生させることができ、これは、細胞をずっと小さい構成要素に分解し、一定の細胞を再度一緒に分類または結び付けて、サイズに基づいた選別を行うことができる。

１１． 生物学的標本の殺滅

多様な用途が、生物学的標本を選択的に殺滅できる能力の恩恵を受ける。血液から病原体を除去することは、そのような応用の１つである。細胞選別は、別の応用である。複数の細胞が同定され、１つ以上の細胞群が殺滅され、次に死んだ細胞が除去される。この殺滅は、レーザー自体の光エネルギーによって実行され、この機能を実行するために光トラップを必ずしも必要としない。

本質的には、レーザービームによって細胞が加熱されるか、細胞周囲の媒体が加熱されて、細胞を損傷および殺滅する。ホログラフィック光トラップは、それらの汎用性および３次元制御のため、それらの細胞の選択的で大規模な殺滅を可能にする。

１２． 電子部品の固定

小さい電子部品を移動するためまたは電子部品を所定位置に固定するために、上記技術の多くを用い得ることに留意されたい。

上記の実施形態に関連して本発明を具体的に示してきたが、本発明の精神および範囲を逸脱することなく形態および細部における様々な他の変更をなし得ることが当業者に理解されるであろう。

本発明における１つの実施形態における、ホログラフィック光トラッピングシステムを概略的に例示する。 本発明における１つの実施形態に従って、試料ホルダー中に導入される試料を示す概略側面図である。 本発明における１つの実施形態に従って、試料ホルダー中に導入される試料を示す概略平面図である。 本発明における１つの実施形態における試料室の走査電子顕微鏡写真を示す。 本発明における１つの実施形態における試料室のワークエリアの拡大図を示す。 本発明における１つの実施形態における物体を選別するためのホログラフィック光トラッピングシステムの概略図である。 本発明における１つの実施形態における選別のための側方偏向の一例である。 本発明における１つの実施形態におけるファンネリングトラップの概略正面図である。 本発明における１つの実施形態におけるファンネリングトラップの側面図である。 本発明における１つの実施形態における回転ディスクベースの細胞選別装置である。 本発明における１つの実施形態における光学蠕動である。

Claims (14)

1. 複数の物体を選別する方法であって、
   前記複数の物体を所定の流量で入力チャンネル中に導入する段階と、
   ビーム操縦装置を用いて１組のホログラムにより設定された低強度の光トラップのパターンを提供する段階であって、前記入力チャンネルにおいて、凝集した物体の流れを妨害し、かつ個別の物体を通過させるべく、当該光トラップの強度及び位置を時間と共に変更できる段階と、
   前記複数の物体の分離を維持すべく、強度及び位置が固定された低強度の光トラップのパターンを提供する前記ビーム操縦装置を用いて前記複数の物体を層流へ送る段階と、
   所定の基準をどれが満たすかを決定するために前記複数の物体を評価する段階と、
   前記基準を満たす物体を、前記基準を満たさない物体から選別する段階であって、複数の前記光トラップを用いて、前記入力チャンネルから複数の出力チャンネルの１つへ、選別された前記物体を移動させる段階と
   を備える方法。
2. 前記入力チャンネルと平行して配置された前記複数の出力チャンネル中に１種類の緩衝液を、前記入力チャンネルにおけると同じ流量で層流の平行列が形成されるように導入する段階を更に備える、請求項１に記載の方法。
3. 前記選別する段階が、前記基準を満たした前記物体を、前記入力チャンネルから前記複数の出力チャンネルの１つへ移送する段階を更に備える、請求項１または２に記載の方法。
4. 前記選別する段階が実行される時に、前記入力チャンネルと前記複数の出力チャンネルにおける前記層流との間に機械的分離が全くない、請求項１から３のいずれかに記載の方法。
5. 前記層流の前記平行列中の物体間の最小距離を、前記送る段階の前記ビーム操縦装置を用いて維持する段階を更に備える、請求項２に記載の方法。
6. 前記入力チャンネルおよび前記複数の出力チャンネル中の前記流量は、前記最小距離、選別段階の性能の更新速度、および全体的物体処理速度により設定される、請求項５に記載の方法。
7. 前記基準が、蛍光検出、散乱測定および光学偏向を含む、請求項１から６のいずれかに記載の方法。
8. 前記選別する段階における前記ビーム操縦装置を実現するために用いられる１つの対物レンズの視野の幅が、前記入力チャンネルおよび前記複数の出力チャンネルの視野の幅と同じである、請求項１から７のいずれかに記載の方法。
9. 前記入力チャンネルの長さおよび前記複数の出力チャンネルの長さが、前記流量、前記チャンネルの深さ、および前記チャンネルの各々の前記更新速度に依存する、請求項６に記載の方法。
10. 前記ビーム操縦装置を駆動するために、複数の位相マスクを作り出す複数の空間光変調器が用いられ、前記複数の空間光変調器の少なくとも１つの更新速度は少なくとも３０Ｈｚである、請求項１から９のいずれかに記載の方法。
11. 前記対物レンズが、１つの比較的低い開口数を有している、請求項８に記載の方法。
12. 前記ビーム操縦装置からの１つの光ビームの円錐の半径が、前記開口数から直接決定される、請求項１１に記載の方法。
13. 多重光ビームが用いられる、請求項１２に記載の方法。
14. 複数の物体を選別するための装置であって、
    前記複数の物体を所定の流量で入力チャンネル中に導入するための手段と、
    １組のホログラムにより設定された低強度の光トラップのパターンを提供する手段であって、前記入力チャンネルにおいて、凝集した物体の流れを妨害し、かつ個別の物体を通過させるべく当該光トラップの強度及び位置を時間と共に変更できるビーム操縦装置を有する手段と、
    前記複数の物体の分離を維持すべく、強度及び位置が固定された低強度の光トラップのパターンを提供する前記ビーム操縦装置を有し、前記複数の物体を層流へ送る手段と、
    所定の基準をどの物体が満たすかを決定するために前記複数の物体を評価するための手段と、
    選別された前記物体を前記入力チャンネルから複数の出力チャンネルの１つへ移動させることで、前記基準を満たす物体を前記基準を満たさない物体から選別する手段と
    を備える装置。

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