JP3688820B2 - レーザトラッピング装置及びこれを利用したマイクロマニピュレータ - Google Patents
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、レーザ光を集光光学系によりその焦点上に集光させて微小検体が浮遊する媒質中に照射し、その焦点位置にある微小検体を光学的にトラップするレーザトラッピング装置とこれを利用したマイクロマニピュレータに関する。
【０００２】
【従来の技術】
従来より、赤外光の波長のレーザ光を光源として生物粒子を光学トラップすることが行われている（特公平５−６１３６号公報参照）。
これは、可視光レーザ（Ａｒレーザ：波長５１４ｎｍ）を光源として生物粒子をトラップしたときは光による生物損傷が観察されたのに対し、赤外光レーザ（ＹＡＧレーザ：波長１０６４ｎｍ）を光源として生物粒子をトラップしたときには光による生物損傷が観察されなかったというＡｓｈｋｉｎらの実験結果に基づくものである。
【０００３】
しかしながら、赤外光レーザを用いた光学トラップは、可視光を用いた光学トラップと比べると以下のような問題点がある。
第一に、可視光は目に見えるので目に入ったときには瞼を閉じたり光線を遮ることで危険を回避できるのに対し、赤外光は目に見えないため目に入ったことに気付かず目を損傷しやすい。
第二に、可視光は視認できるので装置をセットしたときに光学系の調整が容易であるのに対し、赤外光は視認できないので光学系の調整が困難である。
第三に、一般に波長が長いほどトラップ力が弱く、例えば、粒径３μｍのポリスチレンラテックス粒子の場合、ＹＡＧレーザ（赤外光：波長１０６４ｎｍ）のトラップ力は、赤色光（可視光：波長６００ｎｍ）のトラップ力より２５％小さく、粒径１μｍの場合は、ＹＡＧレーザのトラップ力は赤色光のトラップ力に比して４５％も小さい。
第四に、光学トラップは対物レンズ（集光光学系）の焦点位置で行われ、この焦点位置のビームスポット径は波長に比例し、波長が長い程ビームスポット系は大きくなるので、可視光に比して赤外光の方が小さい検体をトラップしにくくなる。
第五に、レーザトラッピング装置に使用するレンズ，ミラーその他の光学要素は、低コストに抑えるために一般顕微鏡用の汎用品を使用しており、これらは、可視光領域の光を対象として設計されているため、赤外線領域の光を使用した場合には、光の透過率が低下してレーザ光の利用効率が下がるだけでなく、収差が増えて集光性が低下してしまう。
例えば、１００倍の対物レンズの場合、赤色光（可視光：波長６００ｎｍ）の透過率は９０％以上あるが、ＹＡＧレーザ（赤外光：波長１０６４ｎｍ）の光透過率は３０％以下まで下がるため、同じ強度の光を照射しようとすれば赤外光は可視光の三倍程度の出力の光源を使用しなければならない。
また、赤外光を使用した場合には、レンズの収差が大きくなることにより、焦点位置におけるビームスポット系が大きくなり、小さい検体のトラップ力が低下してしまう。
ただし、これらはいずれもレンズ設計の問題であり、赤外線の透過率を向上させたり、収差を低く抑えるように設計することはもちろん技術的に可能であり、そのような赤外線専用の光学レンズを使用すれば、光の透過率や収差の問題は解消されるが、専用品を設計製作した場合にはコストが嵩み、装置全体の価格が高くなるという別の問題を生ずる。
【０００４】
このように赤外光は可視光に比して多くの欠点があるにもかかわらず、生物粒子の光学トラップに用いられているのは、生きた状態で一つの個体を分離する要望が高いからである。
例えば、微小検体となる大腸菌は遺伝子操作を行うために頻繁に使用されるが、この場合に、所定の媒質液中に分散させて遺伝子操作を行った後、媒質液中に分散する大腸菌を媒質液ごとマイクロピペット等で吸入し、これを培養槽に移植して培養し、大量のＤＮＡを複製させるようにしている。
しかし、媒質液中に分散している大腸菌は、個体差により、その全てが遺伝子操作されているわけではなく、これをマイクロピペットで吸入するときには同時に多数の大腸菌を吸入してしまうため、培養された大腸菌は遺伝子操作されたものとされないものが混合した状態になり、遺伝子操作されたものの収率が低い。したがって、１個の大腸菌から培養することができればこれを純粋培養することができるので、その大腸菌が遺伝子操作されていれば、遺伝子操作された大腸菌だけを収率１００％で得ることが可能になる。
【０００５】
ここで、１個の大腸菌を取り出すために光学トラップの技術を用いる場合、大腸菌を生きた状態のまま取り出すことが前提になるが、前述したＡｓｈｋｉｎの他、坂野らの研究（静電気学会論文集／１９９１年１０月）によっても、大腸菌にＡｒレーザ光を0.64ｍＷ／μｍ2 で照射した場合、約７秒で動きが停止しているのに対し、ＹＡＧレーザーを倍の強度の1.28ｍＷ／μｍ2 で２時間以上照射しても動きは止まっていないと報告されており、波長５１４ｎｍと波長１０６４ｎｍとで光損傷を比較し、赤外光領域の波長が可視光領域の波長に比して生物の光損傷に対して安全であると結論付けていることから、可視光領域の波長の光による生物粒子の光学トラップの可能性は否定されていた。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、可視光領域の波長の光を用いて生きたまま大腸菌をトラップすることができれば、上述したように、赤外線領域の光を使用する場合に比して、数多くの利点がある。
そこで、本発明者らは、生物に照射されるレーザ光の波長とその生物の光損傷の関係を研究した。
まず、Ｆ．Ｂｒｙａｎｔの研究 ( Archives of biochemistry and biophysics Vol.135 / 1969 : Absolute optical cross sections of cellsand chloropla-sts)によれば、大腸菌やイースト菌の分光吸光度は可視光領域で変化するが、この原因は菌の光の吸収によるものではなく光の散乱によるものであることが報告されている。
また、本発明者らが積分球を用いた分光光度計を用いてより広い波長範囲２００〜１１００ｎｍの光で同様の実験を行ったところ、図４に実線で示すように分光吸光度は波長に応じて変化し、これより、大腸菌やイースト菌は波長３００ｎｍ以下の光に対して光吸収が大きく、それ以上の光に対しては１１００ｎｍまでの波長領域で光吸収は非常に小さく、しかも、波長による吸収の差はほとんどないことが確認された。
したがって、Ａｓｈｋｉｎらや坂野らの報告で生物損傷が観察されたＡｒレーザ（可視光：波長５１４ｎｍ）のレーザ光の波長は、大腸菌などに照射しても光吸収のない３００〜１１００ｎｍの領域内であり生物損傷はない筈であるが、現実には生物損傷が観察されていることから、この生物損傷は通常の光吸収によるものではない非線形なものであることが推定される。
一方、坂野らが実験で用いた光パワー密度0.64ｍＷ／μｍ2 （＝６４万ｋＷ／ｍ2 ）は、晴天時の地上で受ける太陽の光パワー密度１ｋＷ／ｍ2 の６４万倍もある。このような高密度の光の場では、光とそれを照射された物質間にさまざまな非線形な相互作用が起こり、その中でも最も起こりやすいのが２光子吸収である。この２光子吸収は、光強度の２乗に比例して起こる吸収であって、通常の光強度では起こらない。
そして、Ｄ．Ｄｉｎｋｅｌらは、イースト菌に５８０ｎｍの光を照射したことろ、２光子吸収が観察されたと報告している ( Analytica chimica acta 236/1992, Remote two-photon excited fluorescence sensing in a simulated ferme-ntation broth)。この実験では、イースト菌の蛋白質を構成する必須アミノ酸の一種であるトリプトファンが５８０ｎｍの２個の光子を吸収し、あたかも５８０ｎｍの半波長の２９０ｎｍの紫外線を照射されたと同じ励起状態になったのである。
すなわち、Ａｓｈｋｉｎらや坂野らの報告において、Ａｒレーザ（可視光：波長５１４ｎｍ）で生物損傷が観察されたのは、その波長が可視光領域によるものだからではなく、２光子吸収現象により５１４ｎｍの半波長の２５７ｎｍの光が照射されたと同じ状態になったからと考えることができる。
【０００７】
このことより、本発明者らは、大腸菌やイースト菌などの生物粒子をレーザ光で光学トラップする場合、これらを構成する蛋白質や核酸が吸収するとされている１５０ｎｍ以上，３００ｎｍ未満の波長( 図４：実線参照）と、２光子吸収により吸収される３００ｎｍ以上，６００ｎｍ未満の波長（図４：破線参照）のレーザ光を用いた場合には、生物損傷が生ずるという結論に至った。なお、生物粒子には、色素を持つものと持たないものがあり、大腸菌，イースト菌，ゾウリムシなどのように色素を持たないものは、色素による光の吸収は生じないが、ミドリムシ，赤血球，光合成細菌などのように色素を有するものは、その色素により特定の色の光を吸収し、生物損傷を起こす場合がある。
【０００８】
そこで本発明は、これらの考察に基づき、色素を持たない生物粒子については、可視光領域の波長のレーザ光を用いて生物損傷を起こすことなく光学トラップすることができ、色素を持つ生物粒子についても生物損傷を起こすことなく確実に光学トラップできるようにすることを技術的課題としている。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
この課題を解決するために、本発明に係るレーザトラッピング装置は、微小検体が浮遊する媒質中に焦点位置を有する集光光学系を通して前記媒質中にレーザ光を照射し、当該レーザ光を前記集光光学系の焦点位置に集光させてその焦点位置にある微小検体を光学的にトラップするレーザトラッピング装置において、前記レーザ光の波長が、可視光領域に含まれ、且つ、６００ｎｍ以上に選定されていることを特徴とする。
【００１０】
本発明によれば、微小検体を光学トラップするために照射するレーザ光の波長が、６００ｎｍ以上であるから、その波長は、生物粒子を構成する蛋白質や核酸に吸収される１５０〜３００ｎｍの範囲外であり、また、２光子吸収により吸収される３００〜６００ｎｍの範囲外でもあるため、微小検体として色素を持たない生物粒子を光学トラップする場合に、生物損傷が生ずることがない。
しかも、その波長は可視光領域に含まれ、視認することができるので、目に入ったときの危険を回避でき、装置をセットしたときに光学系の調整も容易に行うことができる。
また、赤外光に比して波長が短いので、同じ出力の光であれば、トラップ力が強く、さらに、焦点位置のビームスポット径は波長に比例するので、赤外光に比してビームスポット系は小さくなり、赤外光に比して小さい検体をトラップしやすくなる。
そして、レーザトラッピング装置に使用するレンズ，ミラーその他の光学要素は、低コストに抑えるために一般顕微鏡用の汎用品を使用しても、透過率や収差などの光学性能を低下させることがなく、装置全体のコストを低減できる。
【００１１】
また、本発明に係る他のレーザートラッピング装置は、前記微小検体として色素を有する生物粒子を用いる場合に、前記レーザ光の波長が、６００ｎｍ以上の可視光領域に含まれ、且つ、その微小検体の色素が吸収しない波長に選定されていることを特徴とする。
この発明によれば、微小検体を光学トラップするために照射するレーザ光の波長が、６００ｎｍ以上であるから、その波長は、生物粒子を構成する蛋白質や核酸に吸収される１５０〜３００ｎｍの範囲外であり、また、２光子吸収により吸収される３００〜６００ｎｍの範囲外でもあり、さらに、微小検体の色素により吸収しない光の波長に選定されているので、微小検体として色素を持つ生物粒子を光学トラップする場合に、生物損傷が生ずることがない。
【００１２】
【発明の実施の形態】
以下、本発明の実施形態を、図面に基づいて具体的に説明する。
図１は本発明に係るレーザートラッピング装置を用いたマイクロマニピュレータを示すフローシート、図２はそれに使用するセルプレート、図３（ａ）〜（ｅ）はその操作手順を示す説明図である。
【００１３】
図中１は、セルプレート２に保持させた媒質液に分散浮遊している微生物 (微小検体) から選んだ一の微生物３を取り出すマイクロマニピュレータであって、前記セルプレート２が倒立顕微鏡４のステージ５上に置かれている。このマイクロマニピュレータ１は、顕微鏡４の視野下で、媒質液に分散浮遊した微生物中から選んだ微生物３にレーザ光を照射してその照射位置にある微生物３をトラップするレーザトラッピング手段７と、微生物３をトラップした状態で、セルプレート２を移動させるか、又は、レーザ光を走査させて、当該微生物３を他の微生物から分離させる検体分離手段８とを備えている。
【００１４】
媒質液を保持するセルプレート２は、倒立顕微鏡４のカバーガラスとなる0.17ｍｍのプレート本体１０の上に、多数の微生物が分散浮遊している媒質液を貯留する第一セル１１Ａと、微生物が浮遊していない媒質液を貯留する第二セル１１Ｂが、その上面を開口して所定間隔離れて形成されると共に、微生物の自由移動を阻止する狭小な誘導路１２で連通されている。
【００１５】
したがって、誘導路１２は、その底面が倒立顕微鏡４のカバーガラスとなる光学平面で形成されると共に、その途中には、微生物が浮遊しない媒質液を貯留するバッファセル１１Ｃがその上面を開口して形成され、これにより、誘導路１２が、第一セル１１Ａとバッファセル１１Ｃとを連通する第一の誘導路１２ａと、バッファセル１１Ｃと第二セル１１Ｂとを連通する第二の誘導路１２ｂとから形成される。
【００１６】
そして、前記各セル１１Ａ〜１１Ｃは、プレート本体１０の表面に形成された媒質液注入口となる大径の凹部１３Ａ〜１３Ｃ内に形成され、各セル１１Ａ〜１１Ｃの上面開口部が、凹部１３Ａ〜１３Ｃの底面を水平方向にスライドされる蓋体１４Ａ〜１４Ｃによって開閉されるようになされている。
この場合に、凹部１３Ａ〜１３Ｂと各蓋体１４Ａ〜１４Ｃが互いに接する面は、光の波長オーダーの隙間で摺接するように光学研磨されている。これにより、蓋体１４Ａ〜１４Ｃをスライドさせても、誘導路１２内に流れを作らずに各セルを開閉することができる。
【００１７】
なお、大腸菌を分離するセルプレート２において、各凹部１３Ａ〜１３Ｃは直径９ｍｍ×深さ２ｍｍ程度、各セル１１Ａ〜１１Ｃは直径２ｍｍ×深さ1.8 ｍｍ程度、セル１１Ａ，１１Ｃ間及びセル１１Ｃ，１１Ｂ間を連通する誘導路１２ａ及び１２ｂの長さは夫々約９ｍｍ程度、誘導路１２ａ，１２ｂの断面は縦横各 0.1ｍｍ程度に形成されている。
【００１８】
倒立顕微鏡４は、ステージ移動装置１５によりＸ−Ｙ方向に移動可能に配設されたステージ５の下方に対物レンズ１６が配設されると共に、その光軸上にセルプレート２内を撮影するＣＣＤカメラ１７がセットされ、当該ＣＣＤカメラ１７で撮影された像がディスブレイ装置１８に表示される。
なお、対物レンズ１６としては例えば倍率 100倍，ＮＡ＝1.30の液浸対物レンズが使用されている。
【００１９】
そして、前記レーザトラッピング手段７は、倒立型顕微鏡４の対物レンズ１６を透過するレーザ光により第一セル１１Ａ内の微生物３をトラップするようになされ、レーザ光源１９から出力されるレーザ光の光路中には、レーザ光の照射位置をＸ方向及びＹ方向に移動させるスキャニングミラー２０ｘ，２０ｙを有するスキャニング装置２１及びダイクロイックミラー２２が介装され、当該ダイクロイックミラー２２で反射された反射されたレーザ光が対物レンズ１６を透過し、第一セル１１Ａ内に集光されるように成されている。
また、微小検体として大腸菌などのように色素を持たない生物粒子を光学トラップする場合、前記レーザ光源１９から出射されるレーザ光の波長は、可視光領域に含まれ、且つ、６００ｎｍ以上に選定されており、本例では波長６９０ｎｍの半導体レーザを使用している。
【００２０】
また、前記検体分離手段８では、前記レーザトラッピング手段７で特定の微生物３をトラップした状態で、ステージ移動装置１５によりセルプレート２を移動させたり、スキャニング装置２１によりレーザ光を走査することにより、当該微生物３を前記第一セル１１Ａから誘導路１２を通って第二セル１１Ｂに移動させて第一セル１１Ａ内の他の微生物から分離させるようになされている。
なお、３０は、マイクロマニピュレータ１を制御する制御装置であって、その入力側には、ＣＣＤカメラ１７，キーボード３１，マウス３２が接続され、その出力側には、ディスプレイ装置１８，レーザ光源１９の駆動装置３３，レーザスキャニング装置２１のドライバ３４，ステージ移動装置１５が接続されている。
【００２１】
以上が本発明装置の一例であって、次に、その作用について図３（ａ）〜（ｆ）を伴って説明する。
まず、セルプレート２をステージ５にセットし、図３（ａ）に示すように、微生物の存在しない清浄な媒質液を、第二セル１１Ｂが形成された凹部１３Ｂに注ぎ込み、蓋体１４Ｂが媒質液に浸漬されたところで当該蓋体１４Ｂをスライドさせて第二セル１１Ｂの上面開口部を塞ぐ。なお、このとき、第二セル１１Ｂ内の媒質液は毛管現象により誘導路１２ｂ内を流れてバッファセル１１Ｃ内に流出する。
【００２２】
次いで、図３（ｂ）に示すように、微生物の存在しない清浄な媒質液を、バッファセル１１Ｃが形成された凹部１３Ｃに注ぎ込み、蓋体１４Ｃが媒質液に浸漬されたところで当該蓋体１４Ｃをスライドさせてバッファセル１１Ｃの上面開口部を塞ぐ。
なお、このとき、バッファセル１１Ｃ内の媒質液は毛管現象により誘導路１２ａ内を流れて第一セル１１Ａ内に流出する。
【００２３】
そして、図３（ｃ）に示すように、多数の微生物が分散浮遊する媒質液を、第一セル１１Ａが形成された凹部１３Ａに注ぎ込み、蓋体１４Ａが媒質液に浸漬されたところで当該蓋体１４Ａをスライドさせて第一セル１１Ａの上面開口部を塞ぐ。
このとき、蓋体１４Ａと凹部１３Ｂとの摺接面は光学研磨されているので、蓋体１４Ａをスライドすることによって、第一セル１１Ａ内の媒質液が誘導路１２ａ，１２ｂを通って、バッファセル１１Ｃや第二セル１１Ｂ内に流出することはない。
また、各セル１１Ａ〜１１Ｃの上面開口部は全て蓋体１４Ａ〜１４Ｃにより閉鎖されており、しかも各蓋体１４Ａ〜１４Ｃは媒質液に浸漬されているので、媒質液が蒸発したとしても、蓋体１４Ａ〜１４Ｃで塞がれた各セル１１Ａ〜１１Ｃの外側の凹部１３Ａ〜１３Ｃ内に貯留されている媒質液が蒸発することとなり、各セル１１Ａ〜１１Ｃ内にはその影響が及ばない。したがって、セル１１Ａ〜１１Ｃ内の媒質液は停止された状態に維持され、誘導路１２内に流れが形成されることもない。
【００２４】
この状態で、第一セル１１Ａ内をディスプレイ装置１４で観察しながら、任意の微生物３に対し、スキャニング装置２２によりレーザ光を照射すれば、図３（ｄ）に示すようにその位置で微生物３がトラップされる。
このとき、レーザ光の波長は６９０ｎｍに選定されているので、微生物３が光吸収及び２光子吸収を起こす波長１５０〜６００ｎｍから外れているので、微生物３を損傷することなく光学トラップを行うことができる。
【００２５】
この状態で、図３（ｅ）に示すように、ステージ移動装置１５によりステージ５を移動させることにより、レーザ光でトラップした特定の微生物３を第一セル１１Ａから誘導路１２ａを通りバッファセル１１Ｃに移動し、さらに、誘導路１２ｂを通り第二セル１１Ｂまで移動する。
このとき、第一セル１１Ａと第二セル１１Ｂを連通する誘導路１２が、微生物の自由移動を阻止し得る程度に狭小に形成されているのて、第一セル１１Ａ内の他の微生物が誘導路１２を泳いで第二セル１１Ｂに達する確率は極めて低く、したがって、第二セル１１Ｂにはレーザ光でトラップした特別の微生物３のみが存在することになる。
【００２６】
また、本例では、誘導路１２の途中にバッファセル１１Ｃが形成されているので、万一、微生物が泳いで第一セル１１Ａから誘導路１２ａを通りバッファセル１１Ｃに達したとしても、再びバッファセル１１Ｃから誘導路１２ｂを通って第二セル１１Ｂに達することは皆無に等しく、したがって、第二セル１１Ｂ内には、レーザ光でトラップした特定の微生物３のみが存在し、他の微生物は存在しない。
したがって、このセルプレート２を用いて第二セル１１Ｂの微生物を培養すれば、または、マイクロピペットなどにより当該微生物を移植して培養すれば、例えば遺伝子操作した大腸菌を１個の菌から１００％の収率で純粋培養することがきる。
【００２７】
なお、バッファセル１１Ｃは、誘導路１２の途中に一つだけ形成する場合に限らず、必要に応じて任意の数だけ形成することができ、場合によっては、設けなくてもよい。
また、微小検体としては、大腸菌のような微生物に限らず、微粒子などであってもよい。
さらに、本例では、セルプレートに第一セル１１Ａと第二セル１１Ｂを一つずつ形成した場合について説明したが、本発明はこれに限らず、第二セル１１Ｂを複数形成して、夫々を誘導路１２を介して第一セル１１Ａと連通させるようにしてもよい。なお、この場合に、全ての第二セル１１Ｂに微生物の浮遊してない媒質液を注入して、夫々の上面開口部を蓋体１４Ｂで閉じた後、最後に、微生物の分散浮遊している媒質液を第一セル１１Ａに注入させて、その上面開口部を蓋体１４Ａで閉じればよい。
【００２８】
このように、本例によれば、微小検体３を光学トラップするために照射するレーザ光の波長が６９０ｎｍであるから、その波長は、生物粒子を構成する蛋白質や核酸に吸収される１５０〜３００ｎｍの範囲外であり、また、２光子吸収により吸収される３００〜６００ｎｍの範囲外でもあるため、微小検体として色素を持たない生物粒子を光学トラップする場合に、生物損傷が生ずることがない。
しかも、その波長は可視光領域に含まれ、視認することができるので、目に入ったときの危険を回避でき、マイクロマニピュレータ１を組み立てるときなどに光学系の調整も容易に行うことができる。
また、赤外光に比して波長が短いので、同じ出力の光であれば、トラップ力が強く、さらに、焦点位置のビームスポット径は波長に比例するので、赤外光に比してビームスポット系は小さくなり、赤外光に比して小さい検体をトラップしやすくなる。
そして、マイクロマニピュレータ１に使用するレンズ，ミラーその他の光学要素として、比較的安価な一般顕微鏡用の汎用品を使用しても、透過率や収差などの光学性能を低下させることがない。
【００２９】
なお、上述の説明では、微小検体として大腸菌などの色素を持たない微生物を光学トラップする場合について説明したが、微小検体として色素を持つ微生物を光学トラップする場合は、前記レーザトラッピング手段７のレーザ光源１９として、そのレーザ光の波長が、６００ｎｍ以上の可視光領域に含まれ、且つ、その微小検体の色素により吸収されない波長に選定されている。
例えば、ミドリムシを微小検体とする場合、その色素となるクロロフィルは、４００〜７００ｎｍの光を吸収するので、これをトラップする場合には波長が７００ｎｍ以上の可視光レーザを照射しなければならない。
すなわち、微小検体として色素を持つ微生物を光学トラップする場合は、その微生物が有する色素により光吸収を起こして光損傷を生ずることがある。
したがって、本発明のように、微生物を構成する蛋白質や核酸による光吸収及び２光子吸収される波長領域１５０〜６００ｎｍの範囲外の可視光領域に含まれ、且つ、その微生物の色素により吸収されない波長に選定されていれば、光による生物損傷を起こすことなく光学トラップを行うことができる。
【００３０】
【発明の効果】
以上述べたように、本発明によれば、光学トラップを行うレーザ光の波長が、６００ｎｍ以上の可視光に選定されているので、生物粒子の光吸収及び２光子吸収を生ずる光の波長１５０〜６００ｎｍの範囲外であるため、微小検体として色素を持たない生物粒子を光学トラップする場合に生物損傷が生ずることがなく、また、その波長は可視光領域に含まれ視認することができるので、目に入ったときの危険を回避できるだけでなく、装置をセットしたときに光学系の調整も容易に行うことができるという効果を有し、赤外光に比して波長が短いので同じ出力の光であればトラップ力が強く、焦点位置のビームスポット径が赤外光に比して小さいので赤外光に比して小さい検体をトラップすることができ、さらに、レーザトラッピング装置に使用するレンズ，ミラーその他の光学要素は、低コストに抑えるために一般顕微鏡用の汎用品を使用しても、透過率や収差などの光学性能を低下させることがなく、装置全体のコストを低減できるという大変優れた効果を有する。
また、微小検体として色素を有する生物粒子を用いる場合に、前記レーザ光の波長が、６００ｎｍ以上で、且つ、その微小検体の色素が吸収しない波長に選定されているので、従来生物損傷がないとされていた赤外光により光学トラップしたときに生物損傷を生ずるものであっても、生物損傷を起こさずに確実にトラップすることができるという効果を有する。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明に係るレーザートラッピング装置を用いたマイクロマニピュレータを示すフローシート。
【図２】それに使用するセルプレートを示す斜視図。
【図３】（ａ）〜（ｅ）はその操作手順を示す説明図。
【図４】大腸菌の吸光度を示すグラフ。
【符号の説明】
１・・・・・マイクロマニピュレータ
２・・・・・セルプレート
３・・・・・微生物（生物粒子）
４・・・・・倒立顕微鏡
５・・・・・ステージ
７・・・・・レーザトラッピング手段
８・・・・・検体分離手段
１０・・・・・プレート本体
１１Ａ・・・・第一セル
１１Ｂ・・・・第二セル
１２・・・・・誘導路
１４Ａ〜１４Ｃ・・・・蓋体
１６・・・・・対物レンズ（集光光学系）
１９・・・・・レーザ光源
【発明の属する技術分野】
本発明は、レーザ光を集光光学系によりその焦点上に集光させて微小検体が浮遊する媒質中に照射し、その焦点位置にある微小検体を光学的にトラップするレーザトラッピング装置とこれを利用したマイクロマニピュレータに関する。
【０００２】
【従来の技術】
従来より、赤外光の波長のレーザ光を光源として生物粒子を光学トラップすることが行われている（特公平５−６１３６号公報参照）。
これは、可視光レーザ（Ａｒレーザ：波長５１４ｎｍ）を光源として生物粒子をトラップしたときは光による生物損傷が観察されたのに対し、赤外光レーザ（ＹＡＧレーザ：波長１０６４ｎｍ）を光源として生物粒子をトラップしたときには光による生物損傷が観察されなかったというＡｓｈｋｉｎらの実験結果に基づくものである。
【０００３】
しかしながら、赤外光レーザを用いた光学トラップは、可視光を用いた光学トラップと比べると以下のような問題点がある。
第一に、可視光は目に見えるので目に入ったときには瞼を閉じたり光線を遮ることで危険を回避できるのに対し、赤外光は目に見えないため目に入ったことに気付かず目を損傷しやすい。
第二に、可視光は視認できるので装置をセットしたときに光学系の調整が容易であるのに対し、赤外光は視認できないので光学系の調整が困難である。
第三に、一般に波長が長いほどトラップ力が弱く、例えば、粒径３μｍのポリスチレンラテックス粒子の場合、ＹＡＧレーザ（赤外光：波長１０６４ｎｍ）のトラップ力は、赤色光（可視光：波長６００ｎｍ）のトラップ力より２５％小さく、粒径１μｍの場合は、ＹＡＧレーザのトラップ力は赤色光のトラップ力に比して４５％も小さい。
第四に、光学トラップは対物レンズ（集光光学系）の焦点位置で行われ、この焦点位置のビームスポット径は波長に比例し、波長が長い程ビームスポット系は大きくなるので、可視光に比して赤外光の方が小さい検体をトラップしにくくなる。
第五に、レーザトラッピング装置に使用するレンズ，ミラーその他の光学要素は、低コストに抑えるために一般顕微鏡用の汎用品を使用しており、これらは、可視光領域の光を対象として設計されているため、赤外線領域の光を使用した場合には、光の透過率が低下してレーザ光の利用効率が下がるだけでなく、収差が増えて集光性が低下してしまう。
例えば、１００倍の対物レンズの場合、赤色光（可視光：波長６００ｎｍ）の透過率は９０％以上あるが、ＹＡＧレーザ（赤外光：波長１０６４ｎｍ）の光透過率は３０％以下まで下がるため、同じ強度の光を照射しようとすれば赤外光は可視光の三倍程度の出力の光源を使用しなければならない。
また、赤外光を使用した場合には、レンズの収差が大きくなることにより、焦点位置におけるビームスポット系が大きくなり、小さい検体のトラップ力が低下してしまう。
ただし、これらはいずれもレンズ設計の問題であり、赤外線の透過率を向上させたり、収差を低く抑えるように設計することはもちろん技術的に可能であり、そのような赤外線専用の光学レンズを使用すれば、光の透過率や収差の問題は解消されるが、専用品を設計製作した場合にはコストが嵩み、装置全体の価格が高くなるという別の問題を生ずる。
【０００４】
このように赤外光は可視光に比して多くの欠点があるにもかかわらず、生物粒子の光学トラップに用いられているのは、生きた状態で一つの個体を分離する要望が高いからである。
例えば、微小検体となる大腸菌は遺伝子操作を行うために頻繁に使用されるが、この場合に、所定の媒質液中に分散させて遺伝子操作を行った後、媒質液中に分散する大腸菌を媒質液ごとマイクロピペット等で吸入し、これを培養槽に移植して培養し、大量のＤＮＡを複製させるようにしている。
しかし、媒質液中に分散している大腸菌は、個体差により、その全てが遺伝子操作されているわけではなく、これをマイクロピペットで吸入するときには同時に多数の大腸菌を吸入してしまうため、培養された大腸菌は遺伝子操作されたものとされないものが混合した状態になり、遺伝子操作されたものの収率が低い。したがって、１個の大腸菌から培養することができればこれを純粋培養することができるので、その大腸菌が遺伝子操作されていれば、遺伝子操作された大腸菌だけを収率１００％で得ることが可能になる。
【０００５】
ここで、１個の大腸菌を取り出すために光学トラップの技術を用いる場合、大腸菌を生きた状態のまま取り出すことが前提になるが、前述したＡｓｈｋｉｎの他、坂野らの研究（静電気学会論文集／１９９１年１０月）によっても、大腸菌にＡｒレーザ光を0.64ｍＷ／μｍ2 で照射した場合、約７秒で動きが停止しているのに対し、ＹＡＧレーザーを倍の強度の1.28ｍＷ／μｍ2 で２時間以上照射しても動きは止まっていないと報告されており、波長５１４ｎｍと波長１０６４ｎｍとで光損傷を比較し、赤外光領域の波長が可視光領域の波長に比して生物の光損傷に対して安全であると結論付けていることから、可視光領域の波長の光による生物粒子の光学トラップの可能性は否定されていた。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、可視光領域の波長の光を用いて生きたまま大腸菌をトラップすることができれば、上述したように、赤外線領域の光を使用する場合に比して、数多くの利点がある。
そこで、本発明者らは、生物に照射されるレーザ光の波長とその生物の光損傷の関係を研究した。
まず、Ｆ．Ｂｒｙａｎｔの研究 ( Archives of biochemistry and biophysics Vol.135 / 1969 : Absolute optical cross sections of cellsand chloropla-sts)によれば、大腸菌やイースト菌の分光吸光度は可視光領域で変化するが、この原因は菌の光の吸収によるものではなく光の散乱によるものであることが報告されている。
また、本発明者らが積分球を用いた分光光度計を用いてより広い波長範囲２００〜１１００ｎｍの光で同様の実験を行ったところ、図４に実線で示すように分光吸光度は波長に応じて変化し、これより、大腸菌やイースト菌は波長３００ｎｍ以下の光に対して光吸収が大きく、それ以上の光に対しては１１００ｎｍまでの波長領域で光吸収は非常に小さく、しかも、波長による吸収の差はほとんどないことが確認された。
したがって、Ａｓｈｋｉｎらや坂野らの報告で生物損傷が観察されたＡｒレーザ（可視光：波長５１４ｎｍ）のレーザ光の波長は、大腸菌などに照射しても光吸収のない３００〜１１００ｎｍの領域内であり生物損傷はない筈であるが、現実には生物損傷が観察されていることから、この生物損傷は通常の光吸収によるものではない非線形なものであることが推定される。
一方、坂野らが実験で用いた光パワー密度0.64ｍＷ／μｍ2 （＝６４万ｋＷ／ｍ2 ）は、晴天時の地上で受ける太陽の光パワー密度１ｋＷ／ｍ2 の６４万倍もある。このような高密度の光の場では、光とそれを照射された物質間にさまざまな非線形な相互作用が起こり、その中でも最も起こりやすいのが２光子吸収である。この２光子吸収は、光強度の２乗に比例して起こる吸収であって、通常の光強度では起こらない。
そして、Ｄ．Ｄｉｎｋｅｌらは、イースト菌に５８０ｎｍの光を照射したことろ、２光子吸収が観察されたと報告している ( Analytica chimica acta 236/1992, Remote two-photon excited fluorescence sensing in a simulated ferme-ntation broth)。この実験では、イースト菌の蛋白質を構成する必須アミノ酸の一種であるトリプトファンが５８０ｎｍの２個の光子を吸収し、あたかも５８０ｎｍの半波長の２９０ｎｍの紫外線を照射されたと同じ励起状態になったのである。
すなわち、Ａｓｈｋｉｎらや坂野らの報告において、Ａｒレーザ（可視光：波長５１４ｎｍ）で生物損傷が観察されたのは、その波長が可視光領域によるものだからではなく、２光子吸収現象により５１４ｎｍの半波長の２５７ｎｍの光が照射されたと同じ状態になったからと考えることができる。
【０００７】
このことより、本発明者らは、大腸菌やイースト菌などの生物粒子をレーザ光で光学トラップする場合、これらを構成する蛋白質や核酸が吸収するとされている１５０ｎｍ以上，３００ｎｍ未満の波長( 図４：実線参照）と、２光子吸収により吸収される３００ｎｍ以上，６００ｎｍ未満の波長（図４：破線参照）のレーザ光を用いた場合には、生物損傷が生ずるという結論に至った。なお、生物粒子には、色素を持つものと持たないものがあり、大腸菌，イースト菌，ゾウリムシなどのように色素を持たないものは、色素による光の吸収は生じないが、ミドリムシ，赤血球，光合成細菌などのように色素を有するものは、その色素により特定の色の光を吸収し、生物損傷を起こす場合がある。
【０００８】
そこで本発明は、これらの考察に基づき、色素を持たない生物粒子については、可視光領域の波長のレーザ光を用いて生物損傷を起こすことなく光学トラップすることができ、色素を持つ生物粒子についても生物損傷を起こすことなく確実に光学トラップできるようにすることを技術的課題としている。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
この課題を解決するために、本発明に係るレーザトラッピング装置は、微小検体が浮遊する媒質中に焦点位置を有する集光光学系を通して前記媒質中にレーザ光を照射し、当該レーザ光を前記集光光学系の焦点位置に集光させてその焦点位置にある微小検体を光学的にトラップするレーザトラッピング装置において、前記レーザ光の波長が、可視光領域に含まれ、且つ、６００ｎｍ以上に選定されていることを特徴とする。
【００１０】
本発明によれば、微小検体を光学トラップするために照射するレーザ光の波長が、６００ｎｍ以上であるから、その波長は、生物粒子を構成する蛋白質や核酸に吸収される１５０〜３００ｎｍの範囲外であり、また、２光子吸収により吸収される３００〜６００ｎｍの範囲外でもあるため、微小検体として色素を持たない生物粒子を光学トラップする場合に、生物損傷が生ずることがない。
しかも、その波長は可視光領域に含まれ、視認することができるので、目に入ったときの危険を回避でき、装置をセットしたときに光学系の調整も容易に行うことができる。
また、赤外光に比して波長が短いので、同じ出力の光であれば、トラップ力が強く、さらに、焦点位置のビームスポット径は波長に比例するので、赤外光に比してビームスポット系は小さくなり、赤外光に比して小さい検体をトラップしやすくなる。
そして、レーザトラッピング装置に使用するレンズ，ミラーその他の光学要素は、低コストに抑えるために一般顕微鏡用の汎用品を使用しても、透過率や収差などの光学性能を低下させることがなく、装置全体のコストを低減できる。
【００１１】
また、本発明に係る他のレーザートラッピング装置は、前記微小検体として色素を有する生物粒子を用いる場合に、前記レーザ光の波長が、６００ｎｍ以上の可視光領域に含まれ、且つ、その微小検体の色素が吸収しない波長に選定されていることを特徴とする。
この発明によれば、微小検体を光学トラップするために照射するレーザ光の波長が、６００ｎｍ以上であるから、その波長は、生物粒子を構成する蛋白質や核酸に吸収される１５０〜３００ｎｍの範囲外であり、また、２光子吸収により吸収される３００〜６００ｎｍの範囲外でもあり、さらに、微小検体の色素により吸収しない光の波長に選定されているので、微小検体として色素を持つ生物粒子を光学トラップする場合に、生物損傷が生ずることがない。
【００１２】
【発明の実施の形態】
以下、本発明の実施形態を、図面に基づいて具体的に説明する。
図１は本発明に係るレーザートラッピング装置を用いたマイクロマニピュレータを示すフローシート、図２はそれに使用するセルプレート、図３（ａ）〜（ｅ）はその操作手順を示す説明図である。
【００１３】
図中１は、セルプレート２に保持させた媒質液に分散浮遊している微生物 (微小検体) から選んだ一の微生物３を取り出すマイクロマニピュレータであって、前記セルプレート２が倒立顕微鏡４のステージ５上に置かれている。このマイクロマニピュレータ１は、顕微鏡４の視野下で、媒質液に分散浮遊した微生物中から選んだ微生物３にレーザ光を照射してその照射位置にある微生物３をトラップするレーザトラッピング手段７と、微生物３をトラップした状態で、セルプレート２を移動させるか、又は、レーザ光を走査させて、当該微生物３を他の微生物から分離させる検体分離手段８とを備えている。
【００１４】
媒質液を保持するセルプレート２は、倒立顕微鏡４のカバーガラスとなる0.17ｍｍのプレート本体１０の上に、多数の微生物が分散浮遊している媒質液を貯留する第一セル１１Ａと、微生物が浮遊していない媒質液を貯留する第二セル１１Ｂが、その上面を開口して所定間隔離れて形成されると共に、微生物の自由移動を阻止する狭小な誘導路１２で連通されている。
【００１５】
したがって、誘導路１２は、その底面が倒立顕微鏡４のカバーガラスとなる光学平面で形成されると共に、その途中には、微生物が浮遊しない媒質液を貯留するバッファセル１１Ｃがその上面を開口して形成され、これにより、誘導路１２が、第一セル１１Ａとバッファセル１１Ｃとを連通する第一の誘導路１２ａと、バッファセル１１Ｃと第二セル１１Ｂとを連通する第二の誘導路１２ｂとから形成される。
【００１６】
そして、前記各セル１１Ａ〜１１Ｃは、プレート本体１０の表面に形成された媒質液注入口となる大径の凹部１３Ａ〜１３Ｃ内に形成され、各セル１１Ａ〜１１Ｃの上面開口部が、凹部１３Ａ〜１３Ｃの底面を水平方向にスライドされる蓋体１４Ａ〜１４Ｃによって開閉されるようになされている。
この場合に、凹部１３Ａ〜１３Ｂと各蓋体１４Ａ〜１４Ｃが互いに接する面は、光の波長オーダーの隙間で摺接するように光学研磨されている。これにより、蓋体１４Ａ〜１４Ｃをスライドさせても、誘導路１２内に流れを作らずに各セルを開閉することができる。
【００１７】
なお、大腸菌を分離するセルプレート２において、各凹部１３Ａ〜１３Ｃは直径９ｍｍ×深さ２ｍｍ程度、各セル１１Ａ〜１１Ｃは直径２ｍｍ×深さ1.8 ｍｍ程度、セル１１Ａ，１１Ｃ間及びセル１１Ｃ，１１Ｂ間を連通する誘導路１２ａ及び１２ｂの長さは夫々約９ｍｍ程度、誘導路１２ａ，１２ｂの断面は縦横各 0.1ｍｍ程度に形成されている。
【００１８】
倒立顕微鏡４は、ステージ移動装置１５によりＸ−Ｙ方向に移動可能に配設されたステージ５の下方に対物レンズ１６が配設されると共に、その光軸上にセルプレート２内を撮影するＣＣＤカメラ１７がセットされ、当該ＣＣＤカメラ１７で撮影された像がディスブレイ装置１８に表示される。
なお、対物レンズ１６としては例えば倍率 100倍，ＮＡ＝1.30の液浸対物レンズが使用されている。
【００１９】
そして、前記レーザトラッピング手段７は、倒立型顕微鏡４の対物レンズ１６を透過するレーザ光により第一セル１１Ａ内の微生物３をトラップするようになされ、レーザ光源１９から出力されるレーザ光の光路中には、レーザ光の照射位置をＸ方向及びＹ方向に移動させるスキャニングミラー２０ｘ，２０ｙを有するスキャニング装置２１及びダイクロイックミラー２２が介装され、当該ダイクロイックミラー２２で反射された反射されたレーザ光が対物レンズ１６を透過し、第一セル１１Ａ内に集光されるように成されている。
また、微小検体として大腸菌などのように色素を持たない生物粒子を光学トラップする場合、前記レーザ光源１９から出射されるレーザ光の波長は、可視光領域に含まれ、且つ、６００ｎｍ以上に選定されており、本例では波長６９０ｎｍの半導体レーザを使用している。
【００２０】
また、前記検体分離手段８では、前記レーザトラッピング手段７で特定の微生物３をトラップした状態で、ステージ移動装置１５によりセルプレート２を移動させたり、スキャニング装置２１によりレーザ光を走査することにより、当該微生物３を前記第一セル１１Ａから誘導路１２を通って第二セル１１Ｂに移動させて第一セル１１Ａ内の他の微生物から分離させるようになされている。
なお、３０は、マイクロマニピュレータ１を制御する制御装置であって、その入力側には、ＣＣＤカメラ１７，キーボード３１，マウス３２が接続され、その出力側には、ディスプレイ装置１８，レーザ光源１９の駆動装置３３，レーザスキャニング装置２１のドライバ３４，ステージ移動装置１５が接続されている。
【００２１】
以上が本発明装置の一例であって、次に、その作用について図３（ａ）〜（ｆ）を伴って説明する。
まず、セルプレート２をステージ５にセットし、図３（ａ）に示すように、微生物の存在しない清浄な媒質液を、第二セル１１Ｂが形成された凹部１３Ｂに注ぎ込み、蓋体１４Ｂが媒質液に浸漬されたところで当該蓋体１４Ｂをスライドさせて第二セル１１Ｂの上面開口部を塞ぐ。なお、このとき、第二セル１１Ｂ内の媒質液は毛管現象により誘導路１２ｂ内を流れてバッファセル１１Ｃ内に流出する。
【００２２】
次いで、図３（ｂ）に示すように、微生物の存在しない清浄な媒質液を、バッファセル１１Ｃが形成された凹部１３Ｃに注ぎ込み、蓋体１４Ｃが媒質液に浸漬されたところで当該蓋体１４Ｃをスライドさせてバッファセル１１Ｃの上面開口部を塞ぐ。
なお、このとき、バッファセル１１Ｃ内の媒質液は毛管現象により誘導路１２ａ内を流れて第一セル１１Ａ内に流出する。
【００２３】
そして、図３（ｃ）に示すように、多数の微生物が分散浮遊する媒質液を、第一セル１１Ａが形成された凹部１３Ａに注ぎ込み、蓋体１４Ａが媒質液に浸漬されたところで当該蓋体１４Ａをスライドさせて第一セル１１Ａの上面開口部を塞ぐ。
このとき、蓋体１４Ａと凹部１３Ｂとの摺接面は光学研磨されているので、蓋体１４Ａをスライドすることによって、第一セル１１Ａ内の媒質液が誘導路１２ａ，１２ｂを通って、バッファセル１１Ｃや第二セル１１Ｂ内に流出することはない。
また、各セル１１Ａ〜１１Ｃの上面開口部は全て蓋体１４Ａ〜１４Ｃにより閉鎖されており、しかも各蓋体１４Ａ〜１４Ｃは媒質液に浸漬されているので、媒質液が蒸発したとしても、蓋体１４Ａ〜１４Ｃで塞がれた各セル１１Ａ〜１１Ｃの外側の凹部１３Ａ〜１３Ｃ内に貯留されている媒質液が蒸発することとなり、各セル１１Ａ〜１１Ｃ内にはその影響が及ばない。したがって、セル１１Ａ〜１１Ｃ内の媒質液は停止された状態に維持され、誘導路１２内に流れが形成されることもない。
【００２４】
この状態で、第一セル１１Ａ内をディスプレイ装置１４で観察しながら、任意の微生物３に対し、スキャニング装置２２によりレーザ光を照射すれば、図３（ｄ）に示すようにその位置で微生物３がトラップされる。
このとき、レーザ光の波長は６９０ｎｍに選定されているので、微生物３が光吸収及び２光子吸収を起こす波長１５０〜６００ｎｍから外れているので、微生物３を損傷することなく光学トラップを行うことができる。
【００２５】
この状態で、図３（ｅ）に示すように、ステージ移動装置１５によりステージ５を移動させることにより、レーザ光でトラップした特定の微生物３を第一セル１１Ａから誘導路１２ａを通りバッファセル１１Ｃに移動し、さらに、誘導路１２ｂを通り第二セル１１Ｂまで移動する。
このとき、第一セル１１Ａと第二セル１１Ｂを連通する誘導路１２が、微生物の自由移動を阻止し得る程度に狭小に形成されているのて、第一セル１１Ａ内の他の微生物が誘導路１２を泳いで第二セル１１Ｂに達する確率は極めて低く、したがって、第二セル１１Ｂにはレーザ光でトラップした特別の微生物３のみが存在することになる。
【００２６】
また、本例では、誘導路１２の途中にバッファセル１１Ｃが形成されているので、万一、微生物が泳いで第一セル１１Ａから誘導路１２ａを通りバッファセル１１Ｃに達したとしても、再びバッファセル１１Ｃから誘導路１２ｂを通って第二セル１１Ｂに達することは皆無に等しく、したがって、第二セル１１Ｂ内には、レーザ光でトラップした特定の微生物３のみが存在し、他の微生物は存在しない。
したがって、このセルプレート２を用いて第二セル１１Ｂの微生物を培養すれば、または、マイクロピペットなどにより当該微生物を移植して培養すれば、例えば遺伝子操作した大腸菌を１個の菌から１００％の収率で純粋培養することがきる。
【００２７】
なお、バッファセル１１Ｃは、誘導路１２の途中に一つだけ形成する場合に限らず、必要に応じて任意の数だけ形成することができ、場合によっては、設けなくてもよい。
また、微小検体としては、大腸菌のような微生物に限らず、微粒子などであってもよい。
さらに、本例では、セルプレートに第一セル１１Ａと第二セル１１Ｂを一つずつ形成した場合について説明したが、本発明はこれに限らず、第二セル１１Ｂを複数形成して、夫々を誘導路１２を介して第一セル１１Ａと連通させるようにしてもよい。なお、この場合に、全ての第二セル１１Ｂに微生物の浮遊してない媒質液を注入して、夫々の上面開口部を蓋体１４Ｂで閉じた後、最後に、微生物の分散浮遊している媒質液を第一セル１１Ａに注入させて、その上面開口部を蓋体１４Ａで閉じればよい。
【００２８】
このように、本例によれば、微小検体３を光学トラップするために照射するレーザ光の波長が６９０ｎｍであるから、その波長は、生物粒子を構成する蛋白質や核酸に吸収される１５０〜３００ｎｍの範囲外であり、また、２光子吸収により吸収される３００〜６００ｎｍの範囲外でもあるため、微小検体として色素を持たない生物粒子を光学トラップする場合に、生物損傷が生ずることがない。
しかも、その波長は可視光領域に含まれ、視認することができるので、目に入ったときの危険を回避でき、マイクロマニピュレータ１を組み立てるときなどに光学系の調整も容易に行うことができる。
また、赤外光に比して波長が短いので、同じ出力の光であれば、トラップ力が強く、さらに、焦点位置のビームスポット径は波長に比例するので、赤外光に比してビームスポット系は小さくなり、赤外光に比して小さい検体をトラップしやすくなる。
そして、マイクロマニピュレータ１に使用するレンズ，ミラーその他の光学要素として、比較的安価な一般顕微鏡用の汎用品を使用しても、透過率や収差などの光学性能を低下させることがない。
【００２９】
なお、上述の説明では、微小検体として大腸菌などの色素を持たない微生物を光学トラップする場合について説明したが、微小検体として色素を持つ微生物を光学トラップする場合は、前記レーザトラッピング手段７のレーザ光源１９として、そのレーザ光の波長が、６００ｎｍ以上の可視光領域に含まれ、且つ、その微小検体の色素により吸収されない波長に選定されている。
例えば、ミドリムシを微小検体とする場合、その色素となるクロロフィルは、４００〜７００ｎｍの光を吸収するので、これをトラップする場合には波長が７００ｎｍ以上の可視光レーザを照射しなければならない。
すなわち、微小検体として色素を持つ微生物を光学トラップする場合は、その微生物が有する色素により光吸収を起こして光損傷を生ずることがある。
したがって、本発明のように、微生物を構成する蛋白質や核酸による光吸収及び２光子吸収される波長領域１５０〜６００ｎｍの範囲外の可視光領域に含まれ、且つ、その微生物の色素により吸収されない波長に選定されていれば、光による生物損傷を起こすことなく光学トラップを行うことができる。
【００３０】
【発明の効果】
以上述べたように、本発明によれば、光学トラップを行うレーザ光の波長が、６００ｎｍ以上の可視光に選定されているので、生物粒子の光吸収及び２光子吸収を生ずる光の波長１５０〜６００ｎｍの範囲外であるため、微小検体として色素を持たない生物粒子を光学トラップする場合に生物損傷が生ずることがなく、また、その波長は可視光領域に含まれ視認することができるので、目に入ったときの危険を回避できるだけでなく、装置をセットしたときに光学系の調整も容易に行うことができるという効果を有し、赤外光に比して波長が短いので同じ出力の光であればトラップ力が強く、焦点位置のビームスポット径が赤外光に比して小さいので赤外光に比して小さい検体をトラップすることができ、さらに、レーザトラッピング装置に使用するレンズ，ミラーその他の光学要素は、低コストに抑えるために一般顕微鏡用の汎用品を使用しても、透過率や収差などの光学性能を低下させることがなく、装置全体のコストを低減できるという大変優れた効果を有する。
また、微小検体として色素を有する生物粒子を用いる場合に、前記レーザ光の波長が、６００ｎｍ以上で、且つ、その微小検体の色素が吸収しない波長に選定されているので、従来生物損傷がないとされていた赤外光により光学トラップしたときに生物損傷を生ずるものであっても、生物損傷を起こさずに確実にトラップすることができるという効果を有する。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明に係るレーザートラッピング装置を用いたマイクロマニピュレータを示すフローシート。
【図２】それに使用するセルプレートを示す斜視図。
【図３】（ａ）〜（ｅ）はその操作手順を示す説明図。
【図４】大腸菌の吸光度を示すグラフ。
【符号の説明】
１・・・・・マイクロマニピュレータ
２・・・・・セルプレート
３・・・・・微生物（生物粒子）
４・・・・・倒立顕微鏡
５・・・・・ステージ
７・・・・・レーザトラッピング手段
８・・・・・検体分離手段
１０・・・・・プレート本体
１１Ａ・・・・第一セル
１１Ｂ・・・・第二セル
１２・・・・・誘導路
１４Ａ〜１４Ｃ・・・・蓋体
１６・・・・・対物レンズ（集光光学系）
１９・・・・・レーザ光源
Claims (5)
- 微小検体が浮遊する媒質中に焦点位置を有する集光光学系（16）を通して前記媒質中にレーザ光を照射し、当該レーザ光を前記集光光学系（16）の焦点位置に集光させてその焦点位置にある微小検体（３）を光学的にトラップするレーザトラッピング装置において、前記レーザ光の波長が、可視光領域に含まれ、且つ、６００ｎｍ以上に選定されていることを特徴とするレーザトラッピング装置。
- 微小検体が浮遊する媒質中に焦点位置を有する集光光学系（１６）を通して前記媒質中にレーザ光を照射し、当該レーザ光を前記集光光学系（１６）の焦点位置に集光させてその焦点位置にある微小検体（３）を光学的にトラップするレーザトラッピング装置において、前記微小検体として色素を有する生物粒子を光学的にトラップする場合に、前記レーザ光の波長が、６００ｎｍ以上の可視光領域に含まれ、且つ、その微小検体の色素により吸収されない波長に選定されていることを特徴とするレーザトラッピング装置。
- セルプレート（２）に保持させた媒質液に分散浮遊している微小検体中から任意の微小検体（３）を分離するマイクロマニピュレータであって、
前記セルプレート（２）は、そのプレート本体 (10) に、多数の微小検体が分散浮遊した媒質液を貯留する第一セル(11A) と、微小検体が浮遊しない媒質液を貯留する第二セル(11B) が、夫々その上面を開口して所定間隔離れて形成されると共に、微小検体の自由移動を阻止する狭小な誘導路（12）を介して互いに連通され、
当該セルプレート（２）の第一セル(11A) に貯留された媒質液中に焦点位置を有する集光光学系（16）を通して、波長が可視光領域に含まれ、且つ、６００ｎｍ以上に選定されたレーザ光を照射し、当該レーザ光を前記集光光学系（16）により集光させてその焦点位置にある微小検体（３）を光学的にトラップするレーザトラッピング手段（７）と、
当該レーザトラッピング手段（７）により微小検体（３）をトラップした状態で、セルプレート（２）を移動させるか又はレーザ光を走査させて、当該微小検体（３）を前記第一セル(11A) から前記誘導路（12）を通って前記第二セル (11B)に移動させる検体分離手段（８）とを備えたことを特徴とするマイクロマニピュレータ。 - 微小検体として色素を持つ生物粒子を用い、セルプレートに保持させた媒質液に分散浮遊している微小検体中から任意の微小検体（３）を分離するマイクロマニピュレータであって、
前記セルプレート（２）は、そのプレート本体 (10) に、多数の微小検体が分散浮遊した媒質液を貯留する第一セル(11A) と、微小検体が浮遊しない媒質液を貯留する第二セル(11B) が、夫々その上面を開口して所定間隔離れて形成されると共に、微小検体の自由移動を阻止する狭小な誘導路（12）を介して互いに連通され、当該セルプレート（２）の第一セル(11A) に貯留された媒質液中に焦点位置を有する集光光学系（16）を通して、波長が６００ｎｍ以上の可視光領域に含まれ、且つ、その微小検体の色素により吸収しない波長に選定されたレーザ光を照射し、当該レーザ光を前記集光光学系（16）により集光させてその焦点位置にある微小検体（３）を光学的にトラップするレーザトラッピング手段（７）と、当該レーザトラッピング手段（７）により微小検体（３）をトラップした状態で、セルプレート（２）を移動させるか又はレーザ光を走査させて、当該微小検体（３）を前記第一セル(11A) から前記誘導路（12）を通って前記第二セル (11B)に移動させる検体分離手段（８）とを備えたことを特徴とするマイクロマニピュレータ。 - 前記セルプレートは、プレート本体（10）に、微小検体が分散浮遊した媒質液を貯留する第一セル(11A) と、微小検体が浮遊しない媒質液を貯留する第二セル(11B) が、夫々その上面を開口して所定間隔離れて形成されると共に、微小検体の自由移動を阻止する狭小な誘導路（12）を介して互いに連通され、前記各セル(11A，11B)の上面開口部が、水平方向にスライドする蓋体(14A〜14C)で開閉される請求項３及び４記載のマイクロマニピュレータ。
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