JPH1156341A

JPH1156341A - 微小検体分離装置及びこれに用いる微小検体分離用セルプレート

Info

Publication number: JPH1156341A
Application number: JP22339397A
Authority: JP
Inventors: Yuko Morito; 戸祐幸森; Shuji Kano; 野修司鹿; Koji Horio; 尾浩司堀
Original assignee: Moritex Corp
Current assignee: Moritex Corp
Priority date: 1997-08-20
Filing date: 1997-08-20
Publication date: 1999-03-02

Abstract

(57)【要約】【課題】多数の微小検体が混在する微小検体群から任意
の一の微小検体を短時間で、且つ、連続的に取り出すこ
とができるようにする。【解決手段】セルプレート(1) のサンプル摘出流路
(7) 及び誘導路(6) を滅菌水を満たし, 媒質液注入セル
(4) に微小検体(2,2・・) が分散浮遊する媒質液を満た
す。そして、倒立顕微鏡(3) の視野下でレーザマニピュ
レーションを行って前記セル(4) 内の任意の一の微小検
体(2a)を捕捉し、誘導路(6) を通ってサンプル摘出流路
(7) まで移送する。次いで、サンプル摘出流路(7) 内に
水流を形成すると、微小検体(2a)がその流れに乗って流
出端(7out)から滴下される。この水流により微小検体(2
a)を流して摘出する度毎に、媒質液注入セル(4) から他
の一の微小検体(2a)をレーザーマニピュレーションによ
りサンプル摘出流路(7) に移送すれば、微小検体(2a)を
一つずつ分離して連続的に取り出すことができる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、顕微鏡の視野下で
媒質液に分散浮遊している生物粒子（微生物），非生物
粒子（ＤＮＡを付着させた非生物粒子を含む）などの微
小検体群から、任意の一の微小検体を選択的に捕捉し
て、これを他の微小検体群から分離する微小検体分離装
置及びこれに用いる微小検体分離用セルプレートに関す
る。

【０００２】

【従来の技術】例えば、微小検体となる大腸菌は遺伝子
操作を行うために頻繁に使用されるが、この場合に、所
定の媒質液中に分散させて遺伝子操作を行った後、媒質
液中に分散する大腸菌を媒質液ごとにマイクロピペット
等で吸入し、これを培養槽に移植して培養し、大量のＤ
ＮＡを複製させるようにしている。しかし、媒質液中に
分散している大腸菌は、個体差により、その全てが遺伝
子操作されているわけではなく、これをマイクロピペッ
トで吸入するときには同時に複数の大腸菌を吸入してし
まうため、培養された大腸菌は遺伝子操作されたものと
されないものが混合した状態になり、遺伝子操作された
ものの収率が低い。ここで、１個の大腸菌から培養する
ことができればこれを純粋培養することができるので、
その大腸菌が遺伝子操作されていれば、遺伝子操作され
た大腸菌だけを収率１００％で得ることが可能になる。

【０００３】しかしながら、微生物や微粒子などの微
小検体を光学顕微鏡の視野下で一つだけ取り出す場合
に、その大きさがある程度大きければ問題ないが、大腸
菌のようにあまりにも小さいと、レンズの光学的性質よ
り視野が制限され、他の微小検体の混入がないことを顕
微鏡で確認しながら取出すことは極めて困難であった。
例えば、１００μｍの長さの微小検体を取り出す場合、
分解能１０μｍ，焦点深度３００μｍ，ＮＡ＝ 0.034,
視野径１０ｍｍのレンズを用いれば、直径２００μｍの
マイクロピペットを使用することにより、他の微小検体
の混入がないことを顕微鏡で確認しながら取り出すこと
ができるが、大腸菌のように１μｍ程度の長さしかない
微小検体は、光学レンズの限界である分解能0.26μｍ，
ＮＡ＝1.3 (100倍の油浸対物レンズ) のレンズを用いた
としても、その焦点深度は0.2 μｍ，視野は２００μｍ
しかないので、マイクロピペット内に１ｍｍ³の媒質液
を吸い込むときに、他の微小検体が混入していないこと
を顕微鏡で確認しながら吸い込むことはできない。

【０００４】また、微小検体が顕微鏡で確認できる程
度の大きさだとしても、マイクロピペットに吸い込む１
ｍｍ³の媒質液に多数の微小検体が存在する場合は、多
数の微小検体を同時に吸い込んでしまったり、多数の微
小検体がマイクロピペットの先端外側に付着して媒質液
を滴下する際に混入する可能性がある。したがって、媒
質液を大量に吸い込んで複数の微小検体を同時に取り出
すことはできても、微小検体を１個だけ取り出すことは
困難であり、このために、希釈作業を繰り返し行わなけ
ればならないという面倒があった。さらに、希釈作業を
した結果、媒質液中の微小検体の存在密度が少なかった
としても、大腸菌等のように動きが比較的速い（数μｍ
〜数十μｍ／ｓ）ものについてはその動きに追従してマ
イクロピペットを操作すると、マイクロピペットで媒質
液をかき回してしまい、微小検体自身が流動する媒質液
により押し流されるので、捕捉することが困難になると
いう問題を生ずる。

【０００５】そこで本発明は、多数の微小検体が混在
する微小検体群から任意の一の微小検体を短時間で、且
つ、連続的に取り出すことができるようにすることを技
術的課題としている。

【０００６】

【課題を解決するための手段】この課題を解決するため
に、本発明は、媒質液に分散浮遊している微小検体群か
ら任意の一の微小検体を分離する微小検体分離装置であ
って、倒立顕微鏡のカバーガラスとなるガラス板を底板
とし、上面開口部を気密に塞ぐバルブを備えた媒質液注
入セルが、微小検体の自由移動を阻止する狭小な誘導路
を介してサンプル摘出流路に連通された微小検体分離用
セルプレートと、前記媒質液注入セルに貯留された媒質
液中に分散浮遊する微小検体群から選んだ一の微小検体
をレーザー光で捕捉した状態で、当該微小検体を前記サ
ンプル摘出流路まで誘導するレーザートラッピング装置
と、前記サンプル摘出流路の流入端側から流出端側に向
かう水流を形成する水流形成装置とを備えたことを特徴
とする。

【０００７】本発明によれば、微小検体分離用セルプ
レートのサンプル摘出流路に滅菌水を流し、サンプル摘
出流路及び誘導路を滅菌水で満たした状態で、サンプル
摘出流路の水流を停止させる。次いで、この状態で、微
小検体が分散浮遊する媒質液を媒質液注入セルに充填
し、当該セルに形成されたバルブを閉じ、このセルプレ
ートを倒立顕微鏡にセットする。そして、倒立顕微鏡で
媒質液注入セル内を観察しながら、その下面から当該セ
ル内にレーザー光を照射して任意の一の微小検体を捕捉
し、当該一の微小検体をレーザーマニピュレーションに
より誘導路を通ってサンプル摘出流路まで移送する。こ
こで、水流形成装置によりサンプル摘出流路の流入端側
から流出端側へ流れる水流を形成すると、サンプル摘出
流路まで移送された一の微小検体がその流れに乗って流
出端から滴下される。したがって、例えば微小検体とし
て大腸菌を用いる場合に、サンプル摘出流路から滴下さ
れた滅菌水を培地を形成したシャーレなどで受けるよう
にすれば、その水滴中には一つの大腸菌しか存在しない
ので、これを培養することにより遺伝子操作された大腸
菌を１００％の収率で得ることが可能となる。そして、
サンプル摘出流路に形成した水流により微小検体を流し
て摘出する度毎に、媒質液注入セルから他の一の微小検
体をレーザーマニピュレーションによりサンプル摘出流
路に移送すれば、微小検体を一つずつ分離して連続的に
取り出すことができる。

【０００８】

【発明の実施の形態】以下、微小検体として大腸菌を用
いる場合を例に、本発明の実施の形態を、図面に基づい
て具体的に説明する。図１は本発明に係る微小検体分離
用セルプレートを示す図、図２は微小検体分離装置を示
す全体構成図、図３〜図６は微小検体分離用セルプレー
トの他の実施形態を示す図、図７は微小検体分離用セル
プレートに用いるマイクロポンプを示す図である。

【０００９】図１に示す微小検体分離用セルプレート
１は、例えば、媒質液に分散浮遊している大腸菌（微小
検体）２，２・・群から、任意の一の大腸菌２ａを分離
するもので、倒立顕微鏡３のカバーガラス１Ａとなる厚
さ約0.17ｍｍの白板ガラス（屈折率ｎ＝1.52）を底板と
し、その上面に厚さ約３ｍｍの流路形成用ガラス１Ｂを
融着した２層構造に形成されている。なお、セルプレー
ト１の底面側からレーザー光を照射したときに、その光
がガラスの表面及び融着面で屈折しないように、カバー
ガラス１Ａの表裏両面及びこれに接する流路形成用ガラ
ス１Ｂの底面は光学研磨（表面の凹凸がサブミクロンオ
ーダーまで平滑になるように研磨）されている。

【００１０】そして、当該セルプレート１には、上面
開口部４ａを気密に塞ぐバルブ５を備えた媒質液注入セ
ル４が、大腸菌２の自由移動を阻止する狭小な誘導路６
を介してサンプル摘出流路７に連通されている。前記バ
ルブ５は樹脂成形されて、流路形成用ガラス１Ｂに形成
された媒質液注入セル４の上面開口部４ａに連通してそ
の上方に取り付けられており、当該上面開口部４ａに連
通する流路５ａと直交して円柱形の弁座５ｂが介装され
ている。この弁座５ｂには、その直径方向に流路５ｃが
貫通形成され、ハンドル５ｄを操作して当該弁座５ｂを
回動させて、前記流路５ａを導通／遮断させるように成
され、これにより、上面開口部４ａを開放し又は気密に
塞ぐように成されている。前記誘導路６は、当該セルプ
レート１を大腸菌の分離用に使用する場合、長さが約９
ｍｍ程度、断面が縦横各 0.1ｍｍ程度に選定されてい
る。

【００１１】また、サンプル摘出流路７は、その流入
端７in側及び流出端７out 側が夫々キャピラリーチュー
ブ８in，８out で形成され、流入端７in側のキャピラリ
ーチューブ８inがポンプ（水流形成装置）９に接続され
ている。このポンプ９としては、サンプル摘出流路７に
水流を形成し得るものであれば任意のものを採用するこ
とができ、一般的なポンプはもちろんのこと、空気圧を
利用して滅菌水を押し出すようにしたものや、電気浸透
流を利用したものであってもよい。電気浸透流は、細い
ガラス管内に水を充填すると、その水がプラスに帯電す
る性質を利用したもので、サンプル摘出流路７の流入端
７inから流出端７out に至るまで、キャピラリーチュー
ブ８in，８out を含めてガラスで形成し、サンプル摘出
流路７の流入端７in側に正極，流出端７out 側に負極の
電極（図示せず）を設けておく。そして、前記各電極に
高電圧（例えば２００Ｖ／ｃｍ程度）を印加すると、サ
ンプル摘出流路７内でプラスに帯電している水が移動
し、流入端７in側から流出端７out 側に向かう流れが形
成される。

【００１２】さらに、サンプル摘出流路７と誘導路６
との合流点７ｐから前記摘出流路７を構成するキャピラ
リーチューブ８out の流出端７out に至るまでの流路容
積が、前記流出端７out から滴下される水滴一滴分の体
積と略等しく選定されている。例えば、前記摘出流路７
及びキャピラリーチューブ８out の内径が 250μｍ（0.
25ｍｍ）のときに、前記合流点７ｐから流出端７out に
至るまでの流路容積が水滴一滴分の体積１０〜２０ｍｍ
³に等しければ、その流路の距離は約２０〜４０ｃｍと
なる。

【００１３】また、上述したようなセルプレート１を
用いた微小検体分離装置１０は、図２に示すように、前
記微小検体分離用セルプレート１の媒質液注入セル４に
貯留された媒質液中に分散浮遊する大腸菌２，２・・群
から選んだ一の大腸菌２ａをレーザー光で捕捉した状態
で、当該大腸菌２ａを前記サンプル摘出流路７まで誘導
するレーザートラッピング装置１１が、前記倒立顕微鏡
３に一体に組み込まれて形成されている。倒立顕微鏡３
は、Ｘ−Ｙ方向に移動可能に配設されたステージ１２の
下方に駆動装置１３ａにより上下動可能な対物レンズ１
３が配設され、その光軸上にセルプレート１の媒質液注
入セル４及び誘導路６内を撮影するＣＣＤカメラ１４が
セットされ、当該ＣＣＤカメラ１４で撮影された像がデ
ィスプレイ装置１５に表示される。

【００１４】そして、前記レーザートラッピング装置
１１は、倒立顕微鏡３の対物レンズ１３を透過するレー
ザー光により媒質液注入セル４内の大腸菌２を捕捉する
ようになされている。具体的には、レーザー光源１６か
ら出力されるレーザー光の光路中に、レーザー光の照射
位置をＸ方向及びＹ方向に移動させるスキャニングミラ
ー１７ｘ，１７ｙを有するスキャニング装置１８と、ダ
イクロイックミラー１９が介装され、当該ダイクロイッ
クミラー１９で反射されたレーザ光が前記対物レンズ１
３を透過し、媒質液注入セル４内に集光して大腸菌２を
捕捉し、スキャニング装置１８により、または、ステー
ジ１２を移動させることにより、捕捉した大腸菌２を誘
導路６に沿って移動できるように成されている。なお、
２０は、微小検体分離装置１０をコントロールする制御
装置であって、その入力側には、ＣＣＤカメラ１４，キ
ーボード２１，マウス２２が接続され、その出力側に
は、ポンプ９に空気を供給するコンプレッサ９ａ，対物
レンズ１３の駆動装置１３ａ，ディスプレイ装置１５，
レーザー光源１６の駆動装置２３，スキャニング装置１
８のドライバ２４，ステージ移動装置２５，シャーレ自
動送り装置２６が接続されている。このシャーレ自動送
り装置２６は、培地が形成された多数のシャーレ２７，
２７・・を配列したテーブル２８を移動させて、サンプ
ル摘出流路７の流出端７out から水滴が落ちる度に、各
シャーレ２７を順次前記流出端７out の真下に位置決め
するように成されている。

【００１５】また、レーザー光源１６は、微小検体と
して大腸菌２などのように色素を持たない生物粒子を光
学トラップする場合、前記レーザ光源１６から出射され
るレーザー光の波長は、可視光領域に含まれ、且つ、６
００ｎｍ以上に選定されており、本例では波長６９０ｎ
ｍの半導体レーザーを使用しているが、その波長は微小
検体の種類に応じて任意に選択することができる。ま
た、対物レンズ１３としては例えば倍率 100倍，ＮＡ＝
1.30の液浸対物レンズが使用されている。

【００１６】以上が本発明に係る微小検体分離装置及
びそれに用いるセルプレートの一構成例であって、次に
その作用について説明する。まず、セルプレート１のサ
ンプル摘出流路７及びこれに連通されている誘導路６内
に滅菌水を充填する。この場合、滅菌したセルプレート
１を倒立顕微鏡３のステージ１２にセットし、サンプル
摘出流路７の流入端７in側のキャピラリーチューブ８in
をポンプ９に接続し、バルブ５を開いた状態でポンプ９
から滅菌水を供給すると、滅菌水はサンプル摘出流路７
の流入端７inから流出端７out に向かって流れると同時
に、誘導路６との合流点７ｐから誘導路６内に流入す
る。これにより、サンプル摘出流路７及びこれに連通さ
れている誘導路６内に滅菌水が充填され、この時点でポ
ンプ９を停止する。

【００１７】次いで、大腸菌２，２・・群から任意の
一の大腸菌２ａを分離する操作を行う。この場合、媒質
液注入セル４内に、多数の大腸菌２，２・・が分散浮遊
した媒質液をピペットなどで注入し、バルブ５を閉じ
る。そして、倒立顕微鏡３で媒質液注入セル４内を観察
しながら、レーザートラッピング装置１１により任意の
一の大腸菌２ａにレーザー光を照射して、これを捕捉す
る。この状態で、スキャニング装置１８により、又は、
倒立顕微鏡３のステージ１２を移動させ、微小検体２ａ
をレーザー光で捕捉したまま誘導路６を通ってサンプル
摘出流路７まで移動させる。

【００１８】そして、ポンプ９を起動させ、サンプル
摘出流路７に水流を形成すると、大腸菌２ａがその水流
に乗って流され、その流出端７out から滴下する水と共
に外部に流出される。このとき、媒質液注入セル４の上
面開口部４ａはバルブ５により気密に塞がれているの
で、サンプル摘出流路７に水流を形成することにより媒
質液注入セル４内の媒質液がサンプル摘出流路７に流れ
出すことはない。また、誘導路６は大腸菌２の自由移動
を阻止し得る程度に狭小に形成されているので、多数の
大腸菌２がサンプル摘出流路７に勝手に泳ぎ出すことも
少ない。

【００１９】さらに、本例では、誘導路６とサンプル
摘出流路７の合流点７ｐから流出端７out に至るまでの
容積が、流出端７out から滴下される水滴一滴分の体積
より小さくなるように選定されているので、流出端７ou
t から滴下される水滴中には大腸菌２ａが一つしか存在
しない状態となる。したがって、培地を形成したシャー
レ２７にこれを滴下して培養すれば、大腸菌２ａと同じ
遺伝子を有する大腸菌を１００％の収率で簡単に得るこ
とができ、その一の大腸菌２ａが遺伝子操作されている
ものであれば、培養された全ての大腸菌は遺伝子操作さ
れていることとなる。そして、流出端７out から水滴が
滴下される度に、シャーレ自動送り装置２６によりシャ
ーレ２７を順次位置決めし、上述の動作を繰り返せば、
多数の大腸菌が存在する大腸菌２，２・・群から任意の
一の大腸菌２ａを連続的に効率よく分離することができ
る。

【００２０】図３（ａ）〜（ｅ）は微小検体分離用セ
ルプレート１の他の実施形態の要部を示すもので、いず
れも、媒質液注入セル４に注入した媒質液中に分散され
ている多数の大腸菌２を、当該セル４内により確実に閉
じ込めておく機能を付加したものである。

【００２１】図３（ａ）は誘導路６を蛇行して形成
し、その全長を長くしたもので、大腸菌２が誘導路６に
沿って泳いでもサンプル摘出流路７に達するまでに十分
に時間がかかるように成されている。また、誘導路６は
もともと自由移動を阻止し得る程度に狭小に形成されて
いるだけでなく、実際には媒質液注入セル４からサンプ
ル摘出流路７まで大腸菌２が一定の速さで泳ぎきること
は決してなく、途中で引き返したり止まったりするの
で、このような比較的単純な構成でも、媒質液注入セル
４内の大腸菌２がサンプル摘出流路７へ泳ぎ出すことを
防止する効果は高い。

【００２２】図３（ｂ）は誘導路６内で媒質液注入セ
ル４に向かう水流を形成する水流形成機構３０を備えた
もので、上面開口部３１ａを気密に塞ぐバルブ３２を備
えた滅菌水貯留セル３１が形成され、当該滅菌水貯留セ
ル３１とサンプル摘出流路７に連通させる滅菌水供給流
路３３が、誘導路６とサンプル摘出流路７の合流点７ｐ
近傍に、誘導路６と対向するように形成されている。そ
して、媒質液注入セル４及び滅菌水貯留セル３１には、
前記滅菌水供給流路３３及び誘導路６内に媒質液注入セ
ル４へ向かう電気浸透流を形成するための電極３４，３
５が配設されている。また、媒質液注入セル４に大腸菌
流出防止用フィルタ４３及びバルブ４４を介装した水抜
用流路４５が形成されると共に、前記滅菌水供給流路３
３に不純物流入防止フィルタ４６が介装されている。そ
して、バルブ５を閉じ、バルブ３２及び４４を開いて、
媒質液注入セル４側の電極３４を負極とし、滅菌水貯留
セル３１側の電極３５を陽極として、両者間に高電圧を
印加すると、滅菌水貯留セル３１から媒質液注入セル４
へ向かう電気浸透流が形成され、大腸菌２，２・・群は
媒質液注入セル４内に確実に閉じ込められる。次いで、
レーザートラッピング装置１１で任意の一の大腸菌２ａ
を捕捉してサンプル摘出流路７まで移送した時点で、ポ
ンプ９によりサンプル摘出流路７に水流を形成して当該
一の大腸菌２ａを押し流す。

【００２３】図３（ｃ）は、媒質液注入セル４内また
は誘導路６内に不平等電界を形成して誘電泳動作用によ
り他の大腸菌２，２・を捕捉する誘電泳動用電極３６，
３６が配されている。したがって、各電極３６間に例え
ば交流電圧を印加して不平等電界が形成すると、誘電泳
動作用により大腸菌２は電界密度の高い部分に吸着さ
れ、これにより他の大腸菌２はサンプル摘出流路７内に
移動することはなく、媒質液注入セル４内または誘導路
６内に確実に閉じ込めておくことができる。

【００２４】図３（ｄ）は、誘導路６の途中にペルチ
ェ素子３７ａを用いたマイクロバルブ３７が形成されて
いる。このマイクロバルブ３７は例えば温度を上げるこ
とにより、誘導路６内の水を局部的に加熱して蒸発気泡
を発生させ、その気泡により誘導路６を上流と下流に分
断し、逆電流を流して温度を下げることにより、誘導路
６内に形成された蒸発気泡を消滅させ、当該気泡により
分断された誘導路６の上流と下流を導通させるようにな
されている。また、温度を下げることにより、誘導路６
内の水を局部的に冷却して凍らせて誘導路６を上流と下
流に分断し、逆電流を流して温度を上げることにより、
誘導路６内で凍った水を溶かして、分断された誘導路６
の上流と下流を導通させるようにしてもよい。このよう
に、マイクロバルブ３７で誘導路６を分断しておけば、
他の大腸菌２は、サンプル摘出流路７内に移動すること
はなく、媒質液注入セル４内または誘導路６内に確実に
閉じ込めておくことができる。

【００２５】図３（ｅ）は、誘導路６にバブルバルブ
（マイクロバルブ）３８が形成されている。このバブル
バルブ３８は、空気室３９が通路４０を介して誘導路６
に連通されて成り、空気室３９の周囲には、その内部の
空気を膨張／収縮させるペルチェ素子などのヒータ／ク
ーラ４１が配設されている。また、通路４０が誘導路６
と連通する合流点６ｐは、当該通路４０から吹き出した
気泡が移動しないように、その上流側と下流側にくびれ
４２が形成されている。したがって、ヒータ／クーラ４
１により、空気室３９内の温度を上昇させると内部空気
が膨張して通路４０を介して合流点６ｐに気泡が形成さ
れるので、当該気泡により誘導路６がその上流と下流に
分断され、空気室３９内の温度を下げると内部空気が収
縮するので合流点６ｐに形成された気泡が吸い込まれ、
これにより誘導路６の上流と下流が導通される。この場
合も、バブルバルブ３８により誘導路６を分断しておけ
ば、他の大腸菌２は、サンプル摘出流路７内に移動する
ことはなく、媒質液注入セル４内または誘導路６内に確
実に閉じ込めておくことができる。

【００２６】さらに、図４に示すセルプレート１は、
サンプル摘出流路７に、当該流路７内を流れる水の圧力
を変化させる絞り５１が設けられると共に、当該絞り５
１により形成される高圧部５２で分岐して低圧部５３で
合流するバイパス流路５４が形成されている。また、バ
イパス流路５４には、その途中に前記媒質液注入セル４
が形成されて、前記媒質液注入セル４より高圧部５２側
のバイパス流路５４が誘導路６となり、媒質液注入セル
４の低圧部５３側のバイパス流路５４に大腸菌２の流出
を阻止するフィルタ５５が介装されて成る。これによれ
ば、レーザートラッピング装置１１で任意の一の大腸菌
２ａをサンプル摘出流路７まで移送した時点で、ポンプ
９によりサンプル摘出流路７に水流を形成すると、当該
一の大腸菌２ａが押し流されると共に、バイパス流路５
４内には高圧部５２側から低圧部５３側へ流れる水流が
その圧力差により自然に形成される。したがって、バイ
パス流路５４の途中に形成された媒質液注入セル４内の
他の大腸菌２が高圧部５２側からサンプル摘出流路７に
泳ぎ出すことはなく、また、媒質液注入セル４より低圧
部５３側のバイパス流路５４にはフィルタ５５が介装さ
れているので、媒質液注入セル４内の他の大腸菌２がバ
イパス流路５４内の流れに乗って低圧部５３側からサン
プル摘出流路７に流出することもない。

【００２７】図５に示すセルプレート６１は、一の大
腸菌２ａをマイクロピペット６２で吸引するタイプのも
ので、多数の大腸菌２，２・・が分散浮遊している媒質
液を貯留する媒質液槽６３が形成されている。媒質液槽
６３には、貯留されている媒質液中の大腸菌群から選ん
だ一の大腸菌２ａにレーザー光を照射して捕捉した状態
でこれをマイクロピペット６２で吸引する吸引位置Ｖを
中心にして、その一端側に、超高周波振動又は超音波振
動の波動により他端側へ向かう水流を形成してレーザー
光で捕捉されなかった他の大腸菌２，２・・群を払拭す
る振動発振器６４が配されると共に、その他端側に、前
記水流により流された大腸菌２，２・・を追い込む微小
検体追込エリア６５が形成されている。６６は、前記振
動発振器６４から出力される超高周波振動又は超音波振
動により形成される水流が媒質液槽６３内を循環したと
きに、前記微小検体追込エリア６５に追い込まれた大腸
菌２，２・・が前記吸引位置Ｖに戻らないように阻止す
るフィルタ（微小検体流入阻止手段）である。

【００２８】このセルプレート６１によれば、媒質液
槽６３に、多数の大腸菌２，２が分散浮遊している媒質
液を貯留し、倒立顕微鏡３で観察しながら任意の一の大
腸菌２ａを捕捉した状態で、振動発振器６４により超高
周波振動又は超音波振動を出力すると、振動発振器６４
から微小検体追込エリア６５に向かい、フィルタ６６を
通り再び振動発振器６４に戻る循環水流が形成される。
このとき、レーザー光により捕捉された一の大腸菌２ａ
はそのトラップ力により水流に抗して吸引位置Ｖから動
かず、他の大腸菌２は微小検体追込エリア６５に追い込
まれる。また、媒質液は媒質液槽６３内を循環するが、
当該液槽６３には、微小検体追込エリア６５から流出し
ようとする大腸菌２を阻止するフィルタ６６が配設され
ているので、吸引位置Ｖから他の大腸菌２，２・・は払
拭され、吸引位置Ｖには一の大腸菌２ａしかいない状態
を作りだすことができる。したがって、ここでマイクロ
ピペット６２によりその大腸菌２ａを吸引すれば、その
周囲には他の大腸菌２，２・・は存在しないので、確実
に一の大腸菌２ａを分離することができる。なお、大腸
菌２，２・・が前記吸引位置Ｖに戻らないように阻止す
る微小検体流入阻止手段として、フィルタ６６を用いる
場合に限らず、微小検体追込エリア６５に不平等電界を
形成して、誘電泳動作用により他の大腸菌２，２・・を
捕捉する誘電泳動用電極（図示せず）を設ける場合であ
ってもよい。

【００２９】図６に示すセルプレート７１も、一の大
腸菌２ａをマイクロピペット７２で吸引するタイプのも
のであるが、本例のセルプレート７１には、媒質液を所
定の方向に循環させるマイクロポンプ７３を介装した循
環流路７４が形成されている。マイクロポンプ７３の吐
出口７３out 側を循環流路７４の上流側７４Ｕとし、吸
込口７３in側を循環流路７４の下流側７４Ｄとしたとき
に、その上流側７４Ｕに、大腸菌群から選んだ一の大腸
菌２ａにレーザー光を照射して捕捉した状態でこれをマ
イクロピペット７２で吸引する吸引位置Ｖを設定し、そ
の下流側７４Ｄに、レーザー光で捕捉されなかった他の
大腸菌２，２・・を追い込む微小検体追込エリア７５が
形成されている。そして、マイクロポンプ７３の吸込口
７３inには、循環水流により追い込まれてきた他の大腸
菌２，２・・がマイクロポンプ７３内に吸い込まれない
ように阻止するフィルタ（微小検体流入阻止手段）７６
が設けられている。なお、マイクロポンプ７３は任意の
構造のものを採用し得るが、例えば図７に示すように、
吸込口７３inと吐出口７３out がテーパ通路で形成され
たポンプ室７７の上下両面をピエゾディスク７８，７８
で挟んだものを用いた場合、当該ピエゾディスク７８，
７８に変位を与えてポンプ室７７を拡張，収縮させるこ
とにより、吸込口７３inから吸い込んだ媒質液が吐出口
７３out から吐き出される。

【００３０】これによれば、循環流路７４に多数の大
腸菌２，２が分散している媒質液を貯留させ、倒立顕微
鏡３で観察しながら吸引位置Ｖで任意の一の大腸菌２ａ
を捕捉した状態で、マイクロポンプ７３により循環水流
を形成すると、他の大腸菌２，２・・はその水流により
微小検体追込エリア７５に追い込まれる。また、マイク
ロポンプ７３の吸込口７３inにはフィルタ７６が設けら
れているので、循環水流により追い込まれてきた大腸菌
２，２・・がマイクロポンプ７３を通過して吸引位置Ｖ
に戻ることはない。したがって、前述と同様に、吸引位
置Ｖには、一の大腸菌２ａしかいない状態を作りだすこ
とができ、マイクロピペット７２によりその大腸菌２ａ
を吸引すれば、その周囲には他の大腸菌２，２・・は存
在しないので、確実に一の大腸菌２ａを分離することが
できる。

【００３１】なお、マイクロピペット６２，６３の吸
引手段は、例えば弾性膜げ形成されるダイアフラム（図
示せず）を変位させてピペット６２，６３内の圧力を変
化させたり、ピペット６２，６３内の温度をコントロー
ルしてその温度変化に基づく内部空気の体積変化を利用
するもの等、任意の手段を採用し得る。また、マイクロ
ピペット６２，６３は、ロボットアーム（図示せず）の
先端に取り付けられて、例えば、セルプレート１と培地
を形成したシャーレ２７（図１ご参照）との間を往復移
動するように成され、吸引した微粒子や微生物を所定の
シャーレ２７の上に吐出するように成されている。

【００３２】なお、上述の説明では、微小検体として
微生物、特に大腸菌を用いた場合について説明したが、
本発明は、それ以外の微生物はもちろん、非生物粒子群
から一の粒子を分離したり、ＤＮＡを付着させた非生物
粒子群から一のＤＮＡを非生物粒子ごと分離する際にも
適用し得る。

【００３３】

【発明の効果】以上述べたように、本発明によれば、分
離すべき任意の一の微小検体しか存在しない状態を容易
に作りだすことができ、面倒な作業が一切必要ないの
で、多数の微小検体が混在する微小検体群から任意の一
の微小検体を短時間で、且つ、連続的に取り出すことが
できるという大変優れた効果を奏する。

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明に係る微小検体分離用セルプレートを
示す図。

【図２】微小検体分離装置を示す全体構成図。

【図３】（ａ）〜（ｅ）は微小検体分離用セルプレート
の他の実施形態を示す図。

【図４】微小検体分離用セルプレートのさらに他の実
施形態を示す図。

【図５】微小検体分離用セルプレートのさらに他の実
施形態を示す図。

【図６】微小検体分離用セルプレートのさらに他の実
施形態を示す図。

【図７】それに使用するマイクロポンプの例を示す
図。

【符号の説明】

１・・・・微小検体分離用セルプレート１Ａ・・・カバーガラス２，２ａ・・大腸菌
（微小検体）３・・・・倒立顕微鏡４・・・・・媒質液
注入セル４ａ・・・上面開口部５・・・・・バルブ６・・・・誘導路７・・・・・サンプ
ル摘出流路７in・・・流入端７out ・・・流出端９・・・ポンプ（水流形成装置）１０・・・・微小検
体分離装置１１・・・・レーザートラッピング装置３０・・・
・水流形成機構３６・・・・誘電泳動用電極３７・・・・マイ
クロバルブ３８・・・・バブルバルブ（マイクロバルブ）５１・・・・絞り５２・・・・高圧
部５３・・・・低圧部５４・・・・バイ
パス流路５５・・・・フィルタ６１・・・・セル
プレート６２・・・・マイクロピペット６３・・・・媒質
液槽Ｖ・・・・・吸引位置６４・・・・振動
発振器６５・・・・微小検体追込エリア６６・・・・フィ
ルタ７１・・・・セルプレート７２・・・・マイ
クロピペット７３・・・・マイクロポンプ７３out ・・吐出
口７３in・・・吸込口７４・・・・循環
流路７４Ｕ・・・上流側７４Ｄ・・・下流
側７５・・・・微小検体追込エリア７６・・・・フィ
ルタ

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者堀尾浩司神奈川県横浜市青葉区あざみ野南一丁目３番３号株式会社モリテックス横浜技術センター内

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】媒質液に分散浮遊している微小検体（2,
2・・) 群から任意の一の微小検体 (2a) を分離する微小
検体分離装置であって、倒立顕微鏡（３）のカバーガラス（1A）となるガラス板
を底板とし、上面開口部（4a）を気密に塞ぐバルブ
（５）を備えた媒質液注入セル（４）が、微小検体（2,
2・・) の自由移動を阻止する狭小な誘導路（６）を介し
てサンプル摘出流路（７）に連通された微小検体分離用
セルプレート（１）と、前記媒質液注入セル（４）に貯留された媒質液中に分散
浮遊する微小検体（2, 2・・) 群から選んだ一の微小検体
（2a）をレーザー光で捕捉した状態で、当該微小検体
（2a）を前記サンプル摘出流路（７）まで誘導するレー
ザートラッピング装置（11）と、前記サンプル摘出流路（７）の流入端（7in)側から流出
端（7out）側に向かう水流を形成する水流形成装置
（９）とを備えたことを特徴とする微小検体分離装置。
【請求項２】媒質液に分散浮遊している微小検体（2,
2・・) 群から任意の一の微小検体（2a）を分離する微小
検体分離装置（10）に用いる微小検体分離用セルプレー
トであって、倒立顕微鏡（３）のカバーガラス（1A）となるガラス板
を底板とし、上面開口部（4a）を気密に塞ぐバルブ
（５）を備えた媒質液注入セル（４）が、微小検体（2,
2・・) の自由移動を阻止する狭小な誘導路（６）を介し
てサンプル摘出流路（７）に連通され、前記誘導路（６）は、前記媒質液注入セル（４）に貯留
された媒質液中に分散浮遊する微小検体（2, 2・・) 群か
ら選んだ一の微小検体（2a）をレーザー光で捕捉した状
態で、当該微小検体（2a）を前記サンプル摘出流路
（７）まで誘導可能に形成されたことを特徴とする微小
検体分離用セルプレート。
【請求項３】前記サンプル摘出流路（７）と誘導路
（６）との合流点（7p）から前記摘出流路（７）の流出
端（7out) に至るまでの流路容積が、前記流出端（7ou
t) から滴下される水滴一滴分の体積以下に選定された
請求項２記載の微小検体分離用セルプレート。
【請求項４】前記誘導路（６）が蛇行して形成された
請求項２記載の微小検体分離用セルプレート。
【請求項５】前記誘導路（６）に、サンプル摘出流路
（７）側から媒質液注入セル（４）へ向かう水流を形成
する水流形成機構（30）を備えた請求項２記載の微小検
体分離用セルプレート。
【請求項６】前記誘導路（６）の途中又は媒質液注入
セル（４）内で不平等電界を形成して、他の微小検体
（2, 2・・) を電気的に捕捉する誘電泳動用電極（36，3
6）が配設された請求項２記載の微小検体分離用セルプ
レート。
【請求項７】前記誘導路（６）の途中に、当該誘導路
（６）を導通／遮断させるマイクロバルブ（37，38）が
形成されて成る請求項２記載の微小検体分離用セルプレ
ート。
【請求項８】前記サンプル摘出流路（７）に、当該流
路（７）内を流れる水の圧力を変化させる絞り（51）が
設けられると共に、当該絞り（51）により形成される高
圧部（52) で分岐して低圧部（53）で合流するバイパス
流路（54）が形成され、当該バイパス流路（54）には、その途中に前記媒質液注
入セル（４）が形成されて、前記媒質液注入セル（４）
より高圧部（52）側のバイパス流路（54）が前記誘導路
（６）となり、前記媒質液注入セル（４）より低圧部
（53）側のバイパス流路（54）には、微小検体（２）が
サンプル摘出流路（７）に流出することを阻止するフィ
ルタ（55）が介装されて成る請求項２記載の微小検体分
離用セルプレート。
【請求項９】媒質液に分散浮遊している微小検体（2,
2・・) 群から任意の一の微小検体（2a）をマイクロピペ
ット（62）で吸引して分離する微小検体分離用セルプレ
ートであって、媒質液を貯留する媒質液槽（63）が形成され、当該媒質
液槽（63）には、前記微小検体（2, 2・・) 群から選んだ
一の微小検体（2a）にレーザー光を照射して捕捉した状
態でこれをマイクロピペット（62）で吸引する吸引位置
（Ｖ）を中心にして、その一端側に、超高周波振動又は
超音波振動の波動により他端側へ向かう水流を形成して
レーザー光で捕捉されなかった他の微小検体（2, 2・・)
群を払拭する振動発振器（64）が配されると共に、その
他端側に、前記水流により流された微小検体（2, 2・・)
群を追い込む微小検体追込エリア（65）が形成され、前記振動発振器（64）から出力される超高周波振動又は
超音波振動により形成される水流が媒質液槽（63）内を
循環したときに、前記微小検体追込エリア（65）に追い
込まれた微小検体（2, 2・・) 群を前記吸引位置（Ｖ）に
戻さないように阻止する微小検体流入阻止手段（66）を
備えた微小検体分離用セルプレート。
【請求項10】媒質液に分散浮遊している微小検体（2,
2・・) 群から任意の一の微小検体（2a）をマイクロピペ
ット（72）で吸引して分離する微小検体分離用セルプレ
ートであって、媒質液を所定の方向に循環させるマイクロポンプ（73）
を介装した循環流路（74）が形成され、前記マイクロポンプ（73）の吐出口（73out)側を循環流
路 (74) の上流側 (74U)とし、吸込口 (73in) 側を循環
流路 (74) の下流側 (74D)としたときに、その上流側(7
4U) に、前記微小検体（2, 2・・) 群から選んだ一の微小
検体 (2a) にレーザー光を照射して捕捉した状態でこれ
をマイクロピペット（72）で吸引する吸引位置 (Ｖ）を
設定し、その下流側（74D)に、レーザー光で捕捉されな
かった他の微小検体（2, 2・・) 群を追い込む微小検体追
込エリア（75）が形成され、マイクロポンプ（73）の吸込側には、循環水流により追
い込まれてきた微小検体（2, 2・・) をマイクロポンプ
（73）内に吸い込まないように阻止する微小検体流入阻
止手段（76）を備えた微小検体分離用セルプレート。