CN114778422B - 一种基于微液滴操控技术的自动化细胞分选系统及其方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种基于微液滴操控技术的自动化细胞分选系统及其方法。本发明将微流控技术与光镊技术相结合，对离散微小液滴内的靶细胞进行独立移动控制，具有精准操控性强、样本及试剂消耗少、反应时间短、隔绝污染以及操作人员技能要求低的优点；基于可编程的微液滴控制技术、精准识别的细胞识别模块及能够对悬浊液内细胞进行操控的细胞操控模块实现全自动化细胞分选，节省了人力资源，避免了二次感染的隐患；本发明具有通用性强的特点，在同一微液滴控制芯片上不仅适用于多类别悬浊液内的靶细胞进行分选，而且还能够对同一悬浊液内的多种靶细胞同时进行分选；本发明将为生命科学的研究提供一种新型的操作及分析工具。

Description

一种基于微液滴操控技术的自动化细胞分选系统及其方法
技术领域
本发明涉及，具体涉及一种基于微液滴操控技术的自动化细胞分选系统及其分选方法。
背景技术
数字微流控(digital microfluidics，DMF)技术是一种对离散液滴进行独立操控的新型液滴操纵技术，其操纵的液滴尺寸一般在微升至皮升级别，常见的驱动方法包括介电润湿、介电泳、声表面波、静电力、磁力等。其中，基于介电润湿的电操控数字微流控技术通过改变疏水表面上液滴的接触角进而完成对离散液滴的精确控制，能够实现液滴分配、移动、合并与分裂等操作的一体化和自动化，是目前发展最为迅速的一种流体驱动形式。DMF技术因其在自动化、微型化、集成化与高并行性等方面的显著优势使之迅速脱颖而出，相较于传统的集中实验室，可极大地减少试剂的消耗，并具有小型便携的潜能，在分子诊断、细胞研究、DNA测序、化学发光检测等生命科学的研究领域具有极大的应用价值。
拉曼技术作为一种分子振动光谱技术，可以精确反映单个分子的振动信息，被认为是一种超灵敏、非标记的检测分析技术。由于其超高灵敏度、高分辨率、抗光漂白和不受水干扰等优势，由此技术发展产生的表面增强拉曼探针被广泛应用于DNA分析、蛋白质分析、生物成像等领域。
光镊的概念最早由美国科学家Ashkin提出，它实际上是一种在强聚焦光斑下对微粒实施捕获、移动、旋转的工具。由于其利用光对微粒进行操控，因而具有无机械接触和低损伤的特点，对生物细胞的热损伤几乎可忽略不计，非常适合生命科学的研究领域。基于数字微流控芯片的操控平台，利用光对单细胞或其他微粒进行捕获成为光学操纵的常用手段。
细胞分选是指从大量非均一的细胞群体中分选获得某种特定的细胞。常见的细胞分选包括细胞筛选分选、离心分选、激光诱导荧光分选、流式分选以及免疫磁珠分选。这些方式是利用不同种类的细胞在尺寸、密度、形状、可变形性及亲和性的特点,基于微流体操控技术利用外力作用实现分选，如介电泳分选、磁力吸附、光力分选和声力分选等。然而上述方式只能适用于细胞尺寸形状差别明显及能够产生荧光或化学发光的细胞进行分选，细胞种类的适应性仍有很大的局限性。此外上述方式通常需要专业的实验室设备及人员，大量的试剂及较长的操作时间，多步烦琐的操作与前处理，这不仅给非专业人士设置了较高的门槛，而且细胞的分选结果严重依赖于操作人员的操作技能和操作经验。因此，亟需一种不受细胞尺寸、显色及发光性质影响且能自动化精准实现靶细胞的分选方法。
发明内容
基于上述技术及需求，本发明提出了一种基于微液滴操控技术的自动化细胞分选系统及其分选方法。
本发明的一个目的在于提出一种基于微液滴操控技术的自动化细胞分选系统。
本发明的基于微液滴操控技术的自动化细胞分选系统包括：微液滴操控芯片、微液滴驱动平台、细胞识别模块、细胞操控模块、伺服运动控制系统和上位机；微液滴驱动平台、细胞识别模块、细胞操控模块和伺服运动控制系统分别连接至上位机；细胞识别模块和细胞操控模块分别放置在伺服运动控制系统上；
微液滴操控芯片包括上极板、下极板和导电垫片；下极板从下至上依次包括下基底、电极阵列、介电层和下疏水层；在下基底上设置电极阵列，电极阵列包括储液池电极、驱动电极、地电极和接触电极；多个储液池电极排布成二维阵列构成二维储液池电极阵列，二维储液池电极阵列中有空隙，二维储液池电极阵列的空隙中设置有多个驱动电极，并且每一个储液池电极的边缘均通过相应的驱动电极连接至位于二维储液池电极阵列空隙中的驱动电极，每一个储液池电极、驱动电极和地电极分别连接至一个接触电极，并通过接触电极连接至微液滴驱动平台；地电极接地；在电极阵列上覆盖介电层，在介电层上覆盖下疏水层，细胞悬浊液和细胞培养液位于下疏水层上；上极板依次包括上基底、导电层和上疏水层，上极板倒扣在样品上，上疏水层朝下对着细胞悬浊液和细胞培养液，导电层通过导电垫片连接至地电极；细胞悬浊液和细胞培养液能够在下疏水层与上疏水层之间流动；
将含有靶细胞的细胞悬浊液和细胞培养液分别放置在不同的储液池电极上；首先上位机控制微液滴驱动平台对盛放有细胞悬浊液的储液池电极通电，储液池电极产生介电润湿力，然后将连接盛放有细胞悬浊液的储液池电极两侧的驱动电极同时通电，两侧的驱动电极产生介电润湿力，向两侧拉扯细胞悬浊液，使得细胞悬浊液形成长条状，再对储液池电极断电，此时细胞悬浊液不受储液池电极的介电润湿力作用，只受两侧驱动电极的介电润湿力作用，从而两侧驱动电极向两侧拉扯细胞悬浊液，最终将细胞悬浊液分成两个独立的悬浊液液滴并分别位于两侧的驱动电极上；同样，对盛放有细胞培养液的储液池电极通电然后对连接盛放有细胞培养液的储液池电极两侧的驱动电极同时通电，再对储液池电极断电，最终将细胞培养液分成两个独立的培养液液滴并分别位于两侧的驱动电极上；按照移动路径，上位机控制微液滴驱动平台分别对位于悬浊液液滴和培养液液滴的移动路径上的驱动电极依次通电，分别驱使被分离出来悬浊液液滴和培养液液滴按照设定的移动路径移动，直至将悬浊液液滴和培养液液滴驱动至相邻的两个驱动电极上并位于成像视野中，并让悬浊液液滴和培养液液滴融合，即悬浊液液滴和培养液液滴的边界有接触但二者不混合；
上位机控制细胞识别模块发出激发光照射在位于成像视野中的悬浊液液滴上，并接收产生的信号光，一部分信号光传输至细胞识别模块的光谱仪，得到细胞的光学信号，并将光学信号输出至上位机；上位机中预先存储预定的靶细胞的信号，上位机将视野中的光学信号与预设的靶细胞的信号进行对比，进而从悬浊液液滴选出一个或多个靶细胞；若视野中未发现靶细胞，上位机对伺服运动控制系统发出驱动信号，控制细胞识别模块移动至下一区域进行靶细胞识别，直至发现靶细胞；另一部分信号光进入细胞识别模块的摄像机，摄像机将被识别的靶细胞的图像传输至上位机，上位机对被识别的靶细胞进行定位；
上位机根据细胞识别模块获取的靶细胞的位置，对伺服运动控制系统发出驱动信号，控制伺服运动控制系统带动细胞操控模块运动到靶细胞的位置；上位机控制细胞操控模块发出的光束聚焦在选定细胞悬浊液中靶细胞的位置，形成光镊，从而拾取靶细胞，并通过控制伺服运动控制系统带动细胞操控模块移动，从而控制光镊将靶细胞从细胞悬浊液中移入至细胞培养液中远离悬浊液液滴的边缘位置；同时，在光镊拾取靶细胞并移动至融合的培养液液滴的过程中，通过摄像机实时观测光镊的拾取过程，确保光镊对靶细胞操作的控制；
靶细胞移动至融合的培养液液滴中后，对位于培养液液滴两侧的驱动电极通电，产生介电润湿力，向两侧拉扯培养液液滴，最终从培养液液滴中分离出包含有靶细胞的子培养液液滴；同时，在分离含有靶细胞的子培养液液滴的过程中，上位机控制细胞操控模块形成的光镊拾取并移动靶细胞，使得靶细胞始终跟随被分离的子培养液液滴移动，最终获得脱离后的子培养液液滴中只含有靶细胞。
伺服运动控制系统包括伺服控制器、电机组和传动系统；其中，伺服控制器连接至电机组，电机组连接至传动系统；伺服控制器连接至上位机；上位机通过伺服控制器控制电机组驱动传动系统移动。
细胞识别模块放置在传动系统上；细胞识别模块采用拉曼光学系统；拉曼光学系统包括第一激光器、第一准直镜、第一二向色镜、第二二向色镜、物镜、照明光源、第一分光镜、第二分光镜、反光镜、透镜、滤光片、光谱仪和摄像机；第一激光器、光谱仪和摄像机连接至上位机；照明光源发出照明光依次穿过第二分光镜、第一分光镜、第二二向色镜后，由物镜聚焦，透过上极板聚焦至下极板上，形成一个明场视野；上位机控制第一激光器发出激光，通过第一准直镜变成平行光，依次经过第一和第二二向色镜后，通过物镜聚焦投射至细胞悬浊液，产生拉曼散射，细胞悬浊液的反射光束依次穿过物镜和第二二向色镜，抵达第一分光镜后，部分光线经第一分光镜后至反光镜，依次穿过透镜和滤光片进入光谱仪中进行光学信号的分析和识别，得到成像视野中的拉曼信号，并将拉曼信号输出至上位机；上位机中预先存储预定的靶细胞的拉曼信号，上位机将视野中的拉曼信号与预设的靶细胞的拉曼信号进行对比，进而从细胞悬浊液选出一个或多个靶细胞；另一部分光线经第一分光镜后至第二分光镜，经第二分光镜后进入摄像机，摄像机将被识别的靶细胞的图像传输至上位机，上位机对被识别的靶细胞进行定位；若成像视野中未发现靶细胞，上位机对伺服控制器发出驱动信号，控制电机组运动，通过传动系统带动拉曼光学系统移动至下一区域进行靶细胞识别。
细胞操控模块放置在传动系统上；细胞操控模块采用光镊光学系统；光镊光学系统包括第二激光器和第二准直镜，并与拉曼光学系统共用第一二向色镜、第二二向色镜和物镜；第二激光器发出激光通过第二准直镜变成平行光，依次经过第一和第二二向色镜至物镜，物镜聚焦的激光投射到细胞悬浊液产生光梯度力形成光镊；第二激光器连接至上位机；上位机根据细胞识别模块获取的靶细胞位置，对伺服控制器发出驱动信号，控制电机组运动，通过传动系统带动细胞操控模块运动将光镊调整至靶细胞的拾取位置；然后通过控制伺服运动控制系统带动光镊将靶细胞从细胞悬浊液移入细胞培养液的指定位置。
含有靶细胞的细胞培养液用于免疫分析、核酸提取、单细胞PCR扩增或原位杂交等功能研究以及不同细胞之间的差异化研究，这对于蛋白质组学分析、基因组学分析、转录组学分析是至关重要的。
下基底采用玻璃、硅、纸、聚脂薄膜及PCB(印刷电路板)中的一种；上基底为透明的材料玻璃或亚克力板；介电层用于累计电荷，防止液滴操作过程中击穿电极，介质层的材料采用聚对二甲苯、SU-8光刻胶、SiO2、Si3N4、Al2O3、聚二甲基硅氧烷或聚对二甲苯；下疏水层和上疏水层采用透明的材料，Teflon(特氟龙)、CYTOP(氟树脂)分散液或FluoroPel(氟胶)通过旋涂和烘烤工艺固结。
导电垫片设置在上疏水层与下疏水层之间，用来支撑上极板，在下极板的地电极的上表面两侧各设置一个导电垫片，上极板的上疏水层位于导电垫片上；在上疏水层对应导电垫片处开设有通孔，导电层通过导线经过通孔连接至导电垫片。
第一激光器的激光的波长为266nm～1064nm；第二激光器的激光的波长为700～1300nm。
储液池电极、驱动电极、地电极和接触电极采用多晶硅、金属及其氧化物；储液池电极的尺寸为72mm2～200mm2；驱动电极的尺寸为4mm2～16mm2；导电层采用氧化铟锡；导电垫片采用导电胶带。
本发明的另一个目的在于提出一种基于微液滴操控技术的自动化细胞分选系统的分选方法。
本发明的基于微液滴操控技术的自动化细胞分选系统的分选方法，包括以下步骤：
1)将含有靶细胞的细胞悬浊液和细胞培养液分别放置在不同的储液池电极上；
2)首先上位机控制微液滴驱动平台对盛放有细胞悬浊液的储液池电极通电，储液池电极产生介电润湿力，然后将连接盛放有细胞悬浊液的储液池电极两侧的驱动电极同时通电，两侧的驱动电极产生介电润湿力，向两侧拉扯细胞悬浊液，使得细胞悬浊液形成长条状，再对储液池电极断电，此时细胞悬浊液不受储液池电极的介电润湿力作用，只受两侧驱动电极的介电润湿力作用，从而两侧驱动电极向两侧拉扯细胞悬浊液，最终将细胞悬浊液分成两个独立的悬浊液液滴并分别位于两侧的驱动电极上；同样，对盛放有细胞培养液的储液池电极通电然后对连接盛放有细胞培养液的储液池电极两侧的驱动电极同时通电，再对储液池电极断电，最终将细胞培养液分成两个独立的培养液液滴并分别位于两侧的驱动电极上；按照移动路径，上位机控制微液滴驱动平台分别对位于悬浊液液滴和培养液液滴的移动路径上的驱动电极依次通电，分别驱使被分离出来悬浊液液滴和培养液液滴按照设定的移动路径移动，直至将悬浊液液滴和培养液液滴驱动至相邻的两个驱动电极上并位于成像视野中，并让悬浊液液滴和培养液液滴融合，即悬浊液液滴和培养液液滴的边界有接触但二者不混合；
3)上位机控制细胞识别模块发出激发光照射在位于成像视野中的悬浊液液滴上，并接收产生的信号光，一部分信号光传输至细胞识别模块的光谱仪，得到细胞的光学信号，并将光学信号输出至上位机；上位机中预先存储预定的靶细胞的信号，上位机将视野中的光学信号与预设的靶细胞的信号进行对比，进而从悬浊液液滴选出一个或多个靶细胞；若视野中未发现靶细胞，上位机对伺服运动控制系统发出驱动信号，控制细胞识别模块移动至下一区域进行靶细胞识别，直至发现靶细胞；另一部分信号光进入细胞识别模块的摄像机，摄像机将被识别的靶细胞的图像传输至上位机，上位机对被识别的靶细胞进行定位；
4)上位机根据细胞识别模块获取的靶细胞的位置，对伺服运动控制系统发出驱动信号，控制伺服运动控制系统带动细胞操控模块运动到靶细胞的位置；上位机控制细胞操控模块发出的光束聚焦在选定细胞悬浊液中靶细胞的位置，形成光镊，从而拾取靶细胞，并通过控制伺服运动控制系统带动细胞操控模块移动，从而控制光镊将靶细胞从细胞悬浊液中移入至细胞培养液中远离悬浊液液滴的边缘位置；同时，在光镊拾取靶细胞并移动至融合的培养液液滴的过程中，通过摄像机实时观测光镊的拾取过程，确保光镊对靶细胞操作的控制；
5)靶细胞移动至融合的培养液液滴中后，上位机通过伺服运动控制系统控制微液滴操控芯片，对位于培养液液滴两侧的驱动电极通电，产生介电润湿力，向两侧拉扯培养液液滴，最终从培养液液滴中分离出包含有靶细胞的子培养液液滴；同时，在分离含有靶细胞的子培养液液滴的过程中，上位机控制细胞操控模块形成的光镊拾取并移动靶细胞，使得靶细胞始终跟随被分离的子培养液液滴移动，最终获得脱离后的子培养液液滴中只含有靶细胞。
本发明的优点：
(1)本发明将微流控技术与光镊技术相结合，提出了一种基于微液滴控制的自动化细胞分选系统，与传统实验室基传统微流控分选分析装置相比，该系统能够对离散微小液滴(微升至皮升级别)内的靶微粒(包含细胞及细胞裂解后的物质微粒)进行独立移动控制，具有精准操控性强、样本及试剂消耗少、反应时间短、隔绝污染以及操作人员技能要求低的优点；
(2)本发明基于可编程的微液滴控制技术、精准识别的细胞识别模块及能够对悬浊液内细胞进行操控的细胞操控模块实现全自动化细胞分选；一方面，其自动化的检测过程，节省了人力资源，同时减小了人为的误差以得到准确、重复、可信的结果；另一方面，这种非标记、非直接接触的检测方式避免了二次感染的隐患，这对生存条件要求高的靶细胞显得尤为重要；
(3)本发明具有通用性强的特点，在同一微液滴控制芯片上不仅适用于多类别悬浊液内的靶细胞进行分选，而且还能后对同一悬浊液内的多种靶细胞同时进行分选；
(4)基于本发明的液滴精确操控的能力，对于分选后的细胞裂解液能够用于免疫分析、移植、核酸提取、单细胞PCR扩增或原位杂交等，并且对细胞裂解后可进一步进行蛋白质组学分析、基因组学分析和转录组学分析；
(5)本发明实现对任意尺寸、形状、密度细胞的自主分选，扩展了该细胞分选系统的应用场景；尤其适合用于尺寸、形状差别不明显且不具备显色和发光性质的细胞样本的检测；
(6)本发明将单细胞操作与后处理(蛋白质组学分析、基因组学分析、转录组学分析等)集成于同一微液滴操控芯片，这将为生命科学的研究提供一种新型的操作及分析工具。
附图说明
图1为本发明的基于微液滴操控技术的自动化细胞分选系统的一个实施例的示意图；
图2为本发明的基于微液滴操控技术的自动化细胞分选系统的一个实施例的微液滴操控芯片的示意图，其中，(a)为下极板的正视图，(b)为微液滴操控芯片的侧视图；
图3为本发明的基于微液滴操控技术的自动化细胞分选系统的一个实施例的细胞识别模块和细胞操控模块的光路图；
图4为本发明的基于微液滴操控技术的自动化细胞分选方法分离细胞悬浊液或细胞培养液的示意图，其中，(a)～(d)为分离过程的流程图；
图5为本发明的基于微液滴操控技术的自动化细胞分选方法的一个实施例的流程图，其中(a)～(e)分别为识别、选中、移动、分离和结果的示意图。
具体实施方式
下面结合附图，通过具体实施例，进一步阐述本发明。
如图1所示，本实施例的基于微液滴操控技术的自动化细胞分选系统包括：微液滴操控芯片1、微液滴驱动平台2、细胞识别模块3、细胞操控模块4、伺服运动控制系统5和上位机6；其中，微液滴驱动平台2、细胞识别模块3、细胞操控模块4和伺服运动控制系统5分别连接至上位机6；细胞识别模块3和细胞操控模块4分别放置在伺服运动控制系统5上；
微液滴操控芯片1包括上极板、下极板和导电垫片21；下极板从下至上依次包括下基底11、电极阵列22、介电层12和下疏水层13；在下基底11上设置电极阵列，电极阵列22包括储液池电极14、驱动电极15、地电极16和接触电极17；八个储液池电极排布成4×2的二维阵列构成二维储液池电极阵列，在二维储液池电极14阵列的每一列的两侧均设置有多个驱动电极，并且每一个储液池电极14的边缘均通过相应的驱动电极连接至位于二维储液池电极14阵列中每列两侧的驱动电极，每一个储液池电极14、驱动电极和地电极16分别连接至一个接触电极17，并通过接触电极17连接至微液滴驱动平台2；地电极16经接触电极17通过驱动平台接地；在电极阵列上覆盖介电层12，在介电层12上覆盖下疏水层13，细胞悬浊液和细胞培养液位于下疏水层13上；上极板依次包括上基底18、导电层19和上疏水层20，上极板倒扣在样品上，上疏水层20朝下对着含有靶细胞的细胞悬浊液0和细胞培养液，导电层19通过导电垫片连接至地电极；细胞悬浊液和细胞培养液能够在下疏水层与上疏水层20之间流动。
如图3所示，细胞识别模块3采用拉曼光学系统；拉曼光学系统包括第一激光器31、第一准直镜32、第一二向色镜43、第二二向色镜44、物镜45、照明光源33、第一分光镜34、第二分光镜35、反光镜36、透镜37、滤光片38、光谱仪39和摄像机30；其中，第一激光器、光谱仪39和摄像机30连接至上位机6；照明光源33发出照明光依次穿过第二分光镜35、第一分光镜34、第二二向色镜44后，由物镜45聚焦，透过上极板聚焦至下极板上，形成一个明场视野；上位机6控制第一激光器发出激光，通过第一准直镜32变成平行光，依次经过第一和第二二向色镜43和44后，通过物镜45聚焦投射至细胞悬浊液，产生拉曼散射，细胞悬浊液的反射光束依次穿过物镜45和第二二向色镜44，抵达第一分光镜34后，部分光线经第一分光镜34后至反光镜36，依次穿过透镜37和滤光片38进入光谱仪39中进行光学信号的分析和识别，得到成像视野中的拉曼信号，并将拉曼信号输出至上位机6；上位机6中预先存储预定的靶细胞的拉曼信号，上位机6将视野中的拉曼信号与预设的靶细胞的拉曼信号进行对比，进而从细胞悬浊液选出一个或多个靶细胞；若成像视野中未发现靶细胞，上位机6对伺服控制器发出驱动信号，控制电机组运动，通过传动系统带动拉曼光学系统移动至下一区域进行靶细胞识别；另一部分光线经第一分光镜34后至第二分光镜35，经第二分光镜35反射后进入摄像机30，摄像机30将被识别的靶细胞的图像传输至上位机6，上位机6对被识别的靶细胞进行定位。
细胞操控模块4采用光镊光学系统；光镊光学系统包括第二激光器41和第二准直镜42，并与细胞识别模块3共用第一二向色镜43、第二二向色镜44和物镜45；其中，第二激光器41发出激光通过第二准直镜42变成平行光，依次经过第一和第二二向色镜43和44至物镜45，物镜45聚焦的激光投射到细胞悬浊液产生光梯度力形成光镊；第二激光器41连接至上位机6；上位机6根据细胞识别模块3获取的靶细胞位置，对伺服控制器发出驱动信号，控制电机组运动，通过传动系统带动细胞操控模块4运动将光镊调整至靶细胞的拾取位置；然后通过控制伺服运动控制系统5带动光镊将靶细胞从细胞悬浊液移入细胞培养液的指定位置。
在本实施例中，下基底11和上基底18采用玻璃；介质层12的材料采用聚对二甲苯；下疏水层和上疏水层20采用特氟龙，通过旋涂和烘烤工艺固结；储液池电极14、驱动电极15、地电极16和接触电极17采用金属铬；储液池电极的尺寸为50mm2；驱动电极的尺寸为4mm2；导电层采用氧化铟锡；导电垫片21采用导电胶带，其厚度为100μm；第一激光器31的激光的波长为785nm；第二激光器41的激光的波长为1064nm。
本实施例的基于微液滴操控技术的自动化细胞分选系统的分选方法，如图5所示，包括以下步骤：
1)将含有靶细胞的细胞悬浊液和细胞培养液分别放置在不同的储液池电极14上；
2)首先上位机6控制微液滴驱动平台2对盛放有细胞悬浊液的储液池电极14通电，产生介电润湿力，如图4(a)所示，然后将连接盛放有细胞悬浊液的储液池电极14两侧的驱动电极15同时通电，两侧的驱动电极15产生介电润湿力，使得向两侧拉扯细胞悬浊液，如图4(b)所示，形成长条状，再对储液池电极14断电，此时细胞悬浊液不受储液池电极14的介电润湿力作用，只受两侧驱动电极15的介电润湿力作用，如图4(c)所示，从而两侧驱动电极15向两侧拉扯细胞悬浊液，最终将细胞悬浊液分成两个独立的悬浊液液滴并分别位于两侧的驱动电极15上，如图4(d)所示；同样，对盛放有细胞培养液的储液池电极14通电然后对连接盛放有细胞培养液的储液池电极14两侧的驱动电极15同时通电，再对储液池电极14断电，最终将细胞培养液分成两个独立的培养液液滴并分别位于两侧的驱动电极15上；按照移动路径，上位机6控制微液滴驱动平台2分别对位于悬浊液液滴和培养液液滴的移动路径上的驱动电极15依次通电，分别驱使被分离出来悬浊液液滴和培养液液滴按照设定的移动路径移动，直至将悬浊液液滴和培养液液滴驱动至相邻的两个驱动电极15上并位于成像视野中，并让悬浊液液滴和培养液液滴融合，即悬浊液液滴和培养液液滴的边界有接触但二者不混合；
3)上位机6控制细胞识别模块3发出激发光照射在位于成像视野中的悬浊液液滴上，并接收产生的信号光，一部分信号光传输至细胞识别模块3的光谱仪39，得到细胞的光学信号，并将光学信号输出至上位机6；上位机6中预先存储预定的靶细胞的信号，上位机6将视野中的光学信号与预设的靶细胞的信号进行对比，进而从悬浊液液滴选出一个或多个靶细胞；若视野中未发现靶细胞，上位机6对伺服运动控制系统5发出驱动信号，控制细胞识别模块3移动至下一区域进行靶细胞识别，直至发现靶细胞；另一部分信号光进入细胞识别模块3的摄像机30，摄像机30将被识别的靶细胞的图像传输至上位机6，上位机6对被识别的靶细胞进行定位，如图5(a)所示；
4)上位机6根据细胞识别模块3获取的靶细胞的位置，对伺服运动控制系统5发出驱动信号，控制伺服运动控制系统5带动细胞操控模块4运动到靶细胞的位置；上位机6控制细胞操控模块4发出的光束聚焦在选定细胞悬浊液中靶细胞的位置，形成光镊，从而拾取靶细胞，如图5(b)所示，并通过控制伺服运动控制系统5带动细胞操控模块4移动，从而控制光镊将靶细胞从细胞悬浊液中移入至细胞培养液中远离悬浊液液滴的边缘位置，如图5(c)所示；同时，在光镊拾取靶细胞并移动至融合的培养液液滴的过程中，通过摄像机30实时观测光镊的拾取过程，确保光镊对靶细胞操作的控制；
5)靶细胞移动至融合的培养液液滴中后，上位机6通过伺服运动控制系统5控制微液滴操控芯片1，对位于培养液液滴两侧的驱动电极15通电，产生介电润湿力，向两侧拉扯培养液液滴，如图5(d)所示，最终从培养液液滴中分离出包含有靶细胞的子培养液液滴，如图5(e)所示；同时，在分离含有靶细胞的子培养液液滴的过程中，上位机6控制细胞操控模块4形成的光镊拾取并移动靶细胞，使得靶细胞始终跟随被分离的子培养液液滴移动，最终获得脱离后的子培养液液滴中只含有靶细胞，由于子培养液液滴中含有靶细胞，因此此时称为仅含有靶细胞的细胞悬浊液。
最后需要注意的是，公布实施例的目的在于帮助进一步理解本发明，但是本领域的技术人员可以理解：在不脱离本发明及所附的权利要求的精神和范围内，各种替换和修改都是可能的。因此，本发明不应局限于实施例所公开的内容，本发明要求保护的范围以权利要求书界定的范围为准。

Claims (10)

1.一种基于微液滴操控技术的自动化细胞分选系统，其特征在于，所述自动化细胞分选系统包括：微液滴操控芯片、微液滴驱动平台、细胞识别模块、细胞操控模块、伺服运动控制系统和上位机；微液滴驱动平台、细胞识别模块、细胞操控模块和伺服运动控制系统分别连接至上位机；细胞识别模块和细胞操控模块分别放置在伺服运动控制系统上；
微液滴操控芯片包括上极板、下极板和导电垫片；下极板从下至上依次包括下基底、电极阵列、介电层和下疏水层；在下基底上设置电极阵列，电极阵列包括储液池电极、驱动电极、地电极和接触电极；多个储液池电极排布成二维阵列构成二维储液池电极阵列，二维储液池电极阵列中有空隙，二维储液池电极阵列的空隙中设置有多个驱动电极，并且每一个储液池电极的边缘均通过相应的驱动电极连接至位于二维储液池电极阵列空隙中的驱动电极，每一个储液池电极、驱动电极和地电极分别连接至一个接触电极，并通过接触电极连接至微液滴驱动平台；地电极接地；在电极阵列上覆盖介电层，在介电层上覆盖下疏水层，细胞悬浊液和培养液位于下疏水层上；上极板依次包括上基底、导电层和上疏水层，上极板倒扣在样品上，上疏水层朝下对着细胞悬浊液和培养液，导电层通过导电垫片连接至地电极；细胞悬浊液和培养液能够在下疏水层与上疏水层之间流动；
将含有靶细胞的细胞悬浊液和细胞培养液分别放置在不同的储液池电极上；首先上位机控制微液滴驱动平台对盛放有细胞悬浊液的储液池电极通电，储液池电极产生介电润湿力，然后将连接盛放有细胞悬浊液的储液池电极两侧的驱动电极同时通电，两侧的驱动电极产生介电润湿力，向两侧拉扯细胞悬浊液，使得细胞悬浊液形成长条状，再对储液池电极断电，此时细胞悬浊液不受储液池电极的介电润湿力作用，只受两侧驱动电极的介电润湿力作用，从而两侧驱动电极向两侧拉扯细胞悬浊液，最终将细胞悬浊液分成两个独立的悬浊液液滴并分别位于两侧的驱动电极上；同样，对盛放有细胞培养液的储液池电极通电然后对连接盛放有细胞培养液的储液池电极两侧的驱动电极同时通电，再对储液池电极断电，最终将细胞培养液分成两个独立的培养液液滴并分别位于两侧的驱动电极上；按照移动路径，上位机控制微液滴驱动平台分别对位于悬浊液液滴和培养液液滴的移动路径上的驱动电极依次通电，分别驱使被分离出来悬浊液液滴和培养液液滴按照设定的移动路径移动，直至将悬浊液液滴和培养液液滴驱动至相邻的两个驱动电极上并位于成像视野中，并让悬浊液液滴和培养液液滴融合，即悬浊液液滴和培养液液滴的边界有接触但二者不混合；
上位机控制细胞识别模块发出激发光照射在位于成像视野中的悬浊液液滴上，并接收产生的信号光，一部分信号光传输至细胞识别模块的光谱仪，得到细胞的光学信号，并将光学信号输出至上位机；上位机中预先存储预定的靶细胞的信号，上位机将视野中的光学信号与预设的靶细胞的信号进行对比，进而从悬浊液液滴选出一个或多个靶细胞；若视野中未发现靶细胞，上位机对伺服运动控制系统发出驱动信号，控制细胞识别模块移动至下一区域进行靶细胞识别，直至发现靶细胞；另一部分信号光进入细胞识别模块的摄像机，摄像机将被识别的靶细胞的图像传输至上位机，上位机对被识别的靶细胞进行定位；
上位机根据细胞识别模块获取的靶细胞的位置，对伺服运动控制系统发出驱动信号，控制伺服运动控制系统带动细胞操控模块运动到靶细胞的位置；上位机控制细胞操控模块发出的光束聚焦在选定细胞悬浊液中靶细胞的位置，形成光镊，从而拾取靶细胞，并通过控制伺服运动控制系统带动细胞操控模块移动，从而控制光镊将靶细胞从细胞悬浊液中移入至细胞培养液中远离悬浊液液滴的边缘位置；同时，在光镊拾取靶细胞并移动至融合的培养液液滴的过程中，通过摄像机实时观测光镊的拾取过程，确保光镊对靶细胞操作的控制；
靶细胞移动至融合的培养液液滴中后，对位于培养液液滴两侧的驱动电极通电，产生介电润湿力，向两侧拉扯培养液液滴，最终从培养液液滴中分离出包含有靶细胞的子培养液液滴；同时，在分离含有靶细胞的子培养液液滴的过程中，上位机控制细胞操控模块形成的光镊拾取并移动靶细胞，使得靶细胞始终跟随被分离的子培养液液滴移动，最终获得脱离后的子培养液液滴中只含有靶细胞。
2.如权利要求1所述的自动化细胞分选系统，其特征在于，所述伺服运动控制系统包括伺服控制器、电机组和传动系统；其中，伺服控制器连接至电机组，电机组连接至传动系统；
伺服控制器连接至上位机；上位机通过伺服控制器控制电机组驱动传动系统移动。
3.如权利要求2所述的自动化细胞分选系统，其特征在于，所述细胞识别模块放置在传动系统上；细胞识别模块采用拉曼光学系统；拉曼光学系统包括第一激光器、第一准直镜、第一二向色镜、第二二向色镜、物镜、照明光源、第一分光镜、第二分光镜、反光镜、透镜、滤光片、光谱仪和摄像机；第一激光器、光谱仪和摄像机连接至上位机；照明光源发出照明光依次穿过第二分光镜、第一分光镜、第二二向色镜后，由物镜聚焦，透过上极板聚焦至下极板上，形成一个明场视野；上位机控制第一激光器发出激光，通过第一准直镜变成平行光，依次经过第一和第二二向色镜后，通过物镜聚焦投射至细胞悬浊液，产生拉曼散射，细胞悬浊液的反射光束依次穿过物镜和第二二向色镜，抵达第一分光镜后，部分光线经第一分光镜后至反光镜，依次穿过透镜和滤光片进入光谱仪中进行光学信号的分析和识别，得到成像视野中的拉曼信号，并将拉曼信号输出至上位机；上位机中预先存储预定的靶细胞的拉曼信号，上位机将视野中的拉曼信号与预设的靶细胞的拉曼信号进行对比，进而从细胞悬浊液选出一个或多个靶细胞；另一部分光线经第一分光镜后至第二分光镜，经第二分光镜后进入摄像机，摄像机将被识别的靶细胞的图像传输至上位机，上位机对被识别的靶细胞进行定位；若成像视野中未发现靶细胞，上位机对伺服控制器发出驱动信号，控制电机组运动，通过传动系统带动拉曼光学系统移动至下一区域进行靶细胞识别。
4.如权利要求3所述的自动化细胞分选系统，其特征在于，所述细胞操控模块放置在传动系统上；细胞操控模块采用光镊光学系统；光镊光学系统包括第二激光器和第二准直镜，并与拉曼光学系统共用第一二向色镜、第二二向色镜和物镜；第二激光器发出激光通过第二准直镜变成平行光，依次经过第一和第二二向色镜至物镜，物镜聚焦的激光投射到细胞悬浊液产生光梯度力形成光镊；第二激光器连接至上位机；上位机根据细胞识别模块获取的靶细胞位置，对伺服控制器发出驱动信号，控制电机组运动，通过传动系统带动细胞操控模块运动将光镊调整至靶细胞的拾取位置；然后通过控制伺服运动控制系统带动光镊将靶细胞从细胞悬浊液移入细胞培养液的指定位置。
5.如权利要求1所述的自动化细胞分选系统，其特征在于，所述下基底采用玻璃、硅、纸、聚脂薄膜及印刷电路板中的一种；上基底为透明的材料玻璃或亚克力板。
6.如权利要求3所述的自动化细胞分选系统，其特征在于，所述第一激光器的激光的波长为266nm～1064nm；第二激光器的激光的波长为700～1300nm。
7.如权利要求1所述的自动化细胞分选系统，其特征在于，所述储液池电极、驱动电极、地电极和接触电极采用多晶硅、金属及其氧化物。
8.如权利要求1所述的自动化细胞分选系统，其特征在于，所述下疏水层和上疏水层采用透明的特氟龙、氟树脂分散液或氟胶。
9.如权利要求1所述的自动化细胞分选系统，其特征在于，所述介电层的材料采用聚对二甲苯、SU-8光刻胶、SiO2、Si3N4、Al2O3、聚二甲基硅氧烷或聚对二甲苯。
10.一种如权利要求1所述的基于微液滴操控技术的自动化细胞分选系统的分选方法，其特征在于，所述分选方法包括以下步骤：
1)将含有靶细胞的细胞悬浊液和细胞培养液分别放置在不同的储液池电极上；
2)首先上位机控制微液滴驱动平台对盛放有细胞悬浊液的储液池电极通电，储液池电极产生介电润湿力，然后将连接盛放有细胞悬浊液的储液池电极两侧的驱动电极同时通电，两侧的驱动电极产生介电润湿力，向两侧拉扯细胞悬浊液，使得细胞悬浊液形成长条状，再对储液池电极断电，此时细胞悬浊液不受储液池电极的介电润湿力作用，只受两侧驱动电极的介电润湿力作用，从而两侧驱动电极向两侧拉扯细胞悬浊液，最终将细胞悬浊液分成两个独立的悬浊液液滴并分别位于两侧的驱动电极上；同样，对盛放有细胞培养液的储液池电极通电然后对连接盛放有细胞培养液的储液池电极两侧的驱动电极同时通电，再对储液池电极断电，最终将细胞培养液分成两个独立的培养液液滴并分别位于两侧的驱动电极上；按照移动路径，上位机控制微液滴驱动平台分别对位于悬浊液液滴和培养液液滴的移动路径上的驱动电极依次通电，分别驱使被分离出来悬浊液液滴和培养液液滴按照设定的移动路径移动，直至将悬浊液液滴和培养液液滴驱动至相邻的两个驱动电极上并位于成像视野中，并让悬浊液液滴和培养液液滴融合，即悬浊液液滴和培养液液滴的边界有接触但二者不混合；
3)上位机控制细胞识别模块发出激发光照射在位于成像视野中的悬浊液液滴上，并接收产生的信号光，一部分信号光传输至细胞识别模块的光谱仪，得到细胞的光学信号，并将光学信号输出至上位机；上位机中预先存储预定的靶细胞的信号，上位机将视野中的光学信号与预设的靶细胞的信号进行对比，进而从悬浊液液滴选出一个或多个靶细胞；若视野中未发现靶细胞，上位机对伺服运动控制系统发出驱动信号，控制细胞识别模块移动至下一区域进行靶细胞识别，直至发现靶细胞；另一部分信号光进入细胞识别模块的摄像机，摄像机将被识别的靶细胞的图像传输至上位机，上位机对被识别的靶细胞进行定位；
4)上位机根据细胞识别模块获取的靶细胞的位置，对伺服运动控制系统发出驱动信号，控制伺服运动控制系统带动细胞操控模块运动到靶细胞的位置；上位机控制细胞操控模块发出的光束聚焦在选定细胞悬浊液中靶细胞的位置，形成光镊，从而拾取靶细胞，并通过控制伺服运动控制系统带动细胞操控模块移动，从而控制光镊将靶细胞从细胞悬浊液中移入至细胞培养液中远离悬浊液液滴的边缘位置；同时，在光镊拾取靶细胞并移动至融合的培养液液滴的过程中，通过摄像机实时观测光镊的拾取过程，确保光镊对靶细胞操作的控制；
5)靶细胞移动至融合的培养液液滴中后，上位机通过伺服运动控制系统控制微液滴操控芯片，对位于培养液液滴两侧的驱动电极通电，产生介电润湿力，向两侧拉扯培养液液滴，最终从培养液液滴中分离出包含有靶细胞的子培养液液滴；同时，在分离含有靶细胞的子培养液液滴的过程中，上位机控制细胞操控模块形成的光镊拾取并移动靶细胞，使得靶细胞始终跟随被分离的子培养液液滴移动，最终获得脱离后的子培养液液滴中只含有靶细胞。
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