CN109943475A - 一种微流控分选芯片及其分选系统 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种微流控分选芯片及其分选系统，属于细胞分选技术领域，该微流控分选芯片包括从上向下依次堆叠的气路控制层、PDMS薄膜层、流体通道层和石英玻璃基底，该分选系统包括激光光镊拉曼光谱系统以及上述细胞微流控分选芯片。本发明提出的“七岔路结构”微流控分选芯片能够实现检测细胞的自动引导、检测与分选，提升了原代胰岛细胞分选的效率和准确性，基于该芯片设计的分选系统采用了图像识别、拉曼光谱检测、微流控技术等，可以高效、自动、无损的纯化原代胰岛α、β、δ、ε以及pp细胞，使原代胰岛在能够在单细胞水平上进行研究，解决了本领域内的重要技术问题。

Description

一种微流控分选芯片及其分选系统

技术领域

本发明属于原代胰岛细胞分选技术领域，具体涉及一种微流控分选芯片及其分选系统。

背景技术

哺乳动物的胰腺分为外分泌部和内分泌部。外分泌部中的腺泡分泌胰液，而内分泌部胰岛分散于外分泌部内。胰岛由四种不同的内分泌细胞组成，它们分别是产生胰高血糖素的α细胞、产生胰岛素的β细胞、产生生长抑素的δ细胞和产生胰多肽的pp细胞。

目前体外研究胰岛细胞的细胞模型主要有α及β细胞肿瘤克隆产生的胰岛细胞瘤细胞系以及动物活体取材获得的原代胰岛细胞。相对于肿瘤细胞而言，原代细胞最接近机体本身的生物学属性，对外界环境的变化也最敏感，更适合生理机制等方面研究。如细胞膜离子通道、细胞胞吐、细胞器的转运、细胞内质网中胰岛素蛋白质折叠等细胞电生理、细胞动力学研究均需要纯化活性良好的胰岛细胞作为研究对象。但因其分离纯化α、β、δ及pp等内分泌细胞极其困难，限制了原代胰岛在单细胞水平上的研究。

现有技术中，早在1981年D.G.Pipele等根据成熟的胰岛β细胞的直径较α细胞略大及它们之间沉降率的差异，利用密度梯度离心法对β细胞进行纯化。由于胰岛中β细胞质直径、沉降率并不是恒定的参数，例如在细胞分裂、增值、成熟等进程中细胞的直径、沉降率均会改变。所以，该方法的结果并不可靠。自1982年Van De Winkel等根据胰岛β细胞自发荧光的特点，利用流式细胞术对其进行纯化。之后M.J.Smelt等又将其方法改进，进而成为目前分离纯化胰岛β细胞的主流方法。近年来，还发展出利用单克隆抗体免疫磁珠、锌离子探针、绿色荧光蛋白标记等技术实现原代β细胞的分离纯化。然而，上述种种方法均无法有效兼顾细胞得率、纯度、细胞活性、引入外来混杂因素等。

对于胰岛α细胞而言，目前主要利用转基因技术建立胰岛素启动子-绿色荧光蛋白(mouse insulin promoter-green fluorescent protein，MIP-GFP)和luCre-ROSA26EYFP(GYY)小鼠，其绿色荧光蛋白分别标记于β细胞及α细胞，在荧光显微镜下发出绿色荧光。Quoix 等报道了一种利用Cre-LoxP重组酶系统建立的诱导性基因敲除小鼠模型GluCre-ROSA26EYFP (GYY) ，该模型中的其Cre重组酶在胰高糖素启动子的调控下合成，当胰高糖素合成时伴随着增强型黄色荧光蛋白（EYFP）表达，从而使α细胞带上荧光标记。因δ和pp细胞在胰岛中含量稀少且难以分离，其单细胞研究较少见。因免疫组织化学或免疫荧光鉴定需要破坏细胞，为保证研究细胞的活性，多数研究者采用先收集数据再免疫组织化学或免疫荧光鉴定的方法来对胰岛δ或pp细胞进行膜片钳等细胞电生理研究。

胰岛ε细胞是胰岛内新近发现的胰岛第五种内分泌细胞，它分泌的饥饿素最近被证明具有增强胰岛β细胞的自噬作用，抗凋亡等作用。因胰岛ε细胞含量仅占胰岛细胞总数1%，含量极少，活细胞下分离困难，目前还尚未见对胰岛ε单细胞研究的报道。

以上种种标记于胰岛细胞的各种抗体、探针、荧光蛋白甚至转染病毒等不仅带入新的混杂因素，还可能影响细胞的活性及功能。而先行收集数据再进行免疫组织化学或免疫荧光鉴定细胞类型的方法固然可靠，倘若研究对象是单个δ、pp细胞，因其含量稀少，研究者无异于在大海捞针。因此，发展一种无损的、不需染色的鉴别及纯化胰岛细胞的方法十分迫切。

拉曼散射现象由印度物理学家拉曼于1928 年首次发现。通过分析入射激发光与拉曼散射光频率的差异能够获得被测物质分子的组成、结构、相对含量等信息。由于拉曼散射效应很弱，最初曾一度备受冷落。而到了60年代后期激光的发明，使得拉曼光谱研究找到了合适的光源，大大提高了拉曼光谱的应用范围。1990年PUPPELS等成功地将拉曼光谱应用于单细胞研究，因其独特的优势，为细胞学研究又增添了一有力工具。目前通过拉曼光谱进行细胞动力学研究和拉曼光谱分选辨别细胞，如区分肿瘤和正常、白血病细胞、变异红细胞等是单细胞拉曼光谱研究两个研究热点。

理论上，通过拉曼光谱可以很好的识别不同胰岛内分泌细胞类型，结合计算机分析可对细胞的种类进行判别。然而，实现细胞分选则需要外加物理操作将目标细胞从空间上与原混杂细胞分离。既往的拉曼光谱分选细胞的研究中大多依靠光镊子的人工操控，将目标细胞移动到特殊的通道或凹槽中收集。而本方案的研究对象胰岛细胞直径、质量较大，光镊不易操控，且光镊操控细胞耗时耗力。

本专利申请基于国家自然科学基金青年科学基金项目（项目批注号31600677）资助，及大学生创新创业项目课题（编号2018060）资助，申请者设计全自动微流控分选芯片，拟将其与拉曼光谱检测、光谱数据实时分析、图像分析等技术结合，实现对胰岛细胞无损、快速、高效纯化，最终建立激光光镊拉曼光谱系统下全自动纯化胰大鼠原代胰岛α、β、δ、ε及pp细胞的体系，该方案的设计必定会极大地推动糖尿病领域基础研究的发展。

发明内容

有鉴于此，本发明提出的“七岔路结构”微流控分选芯片能够实现检测细胞的自动引导、检测与分选，提升了原代胰岛细胞分选的效率和准确性，基于该芯片设计的分选系统采用了图像识别、拉曼光谱检测、微流控技术等，可以高效、自动、无损的纯化原代胰岛 α、β、δ 、ε以及 pp 细胞，使原代胰岛在能够在单细胞水平上进行研究，解决了本领域内的重要技术问题。

为了实现本发明的目的，本发明的微流控分选芯片采用如下技术方案：

一种微流控分选芯片，其特征在于，包括从上向下依次堆叠的气路控制层、PDMS薄膜层、流体通道层和石英玻璃基底，其中：所述气路控制层内设置有第一微阀门和第二微阀门，所述第一微阀门和第二微阀门分别连通气路，气路设置有三通阀，三通阀分别连接气源和排气口，第一微阀门和第二微阀门的充气或排气由气路上的电磁阀控制；

所述流体通道层内设置有主通道，所述主通道的入口与出口之间依次设置有用于控制和驱动细胞单行排列的第一聚焦驱动鞘液组和第二聚焦驱动鞘液组，所述主通道的出口处连通有第一分选通道和第二分选通道，所述鞘液组包括设置在主通道两侧的第一鞘流通道和第二鞘流通道，以及在主通道两侧的第三鞘流通道和第四鞘流通道，鞘液组分别负责驱动处于不同检测阶段的细胞，实现单行聚焦和驱动前行；

所述PDMS薄膜层设置在第一微阀门与第一分选通道之间、以及第二微阀门与第二分选通道的之间，PDMS薄膜层在第一微阀门和第二微阀门的带动下上、下运动以实现第一分选通道和第二分选通道的导通或关断。

进一步优选的，所述主通道的入口处连通细胞样品池，所述第一分选通道和第二分选通道分别连接细胞收集池和废液池，所述第一鞘流通道和第二鞘流通道分别连通第一微泵，所述第三鞘流通道和第四鞘流通道分别连通第二微泵。

进一步优选的，所述第一微阀门交叉布置在第一分选通道的上方，所述第一分选通道的导通或关闭由第一微阀门的排气或充气驱动薄膜层形变实现，所述第二鞘流通道交叉布置在第二分选通道的上方，所述第二分选通道的导通或关闭由第二鞘流通道的排气或充气驱动薄膜层形变实现。

本发明的一种微流控分选芯片具有以下有益效果：

（1）该微流控分选芯片具有四组鞘液通道，能够将检测细胞聚焦成单行排列并驱动其依次进入拉曼检测区，四组鞘液通道分别连接驱动鞘流液的微泵，并由计算机控制其开闭和流量。

（2）该微流控分选芯片的气路控制层内设置有第一微阀门和第二微阀门，第一微阀门和第二微阀门能够独立控制第一分选通道和第二分选通道的关闭和导通，引导检测细胞进入细胞收集池或废液池。

（3）该微流控分选芯片的透明的四层结构，能够与图像采集分析系统、自动控制技术相结合，基于检测细胞的图像和视频，可以由计算机自动进行拉曼检测、信号收集、数据处理。当分析结果判定该细胞为某类细胞时，计算机控制微阀门开闭，从而使其进入相应管道，实现细胞的分选。

为了实现本发明的目的，本发明的微流控分选系统采用如下技术方案：

一种微流控分选系统包括激光光镊拉曼光谱系统以及上述微流控分选芯片，所述激光光镊拉曼光谱系统由激光单元、CCD单元、摄像机单元和观察单元组成，其中：

所述激光单元用于提供激光源、且包括同轴布置的激光器、光频隔离器、干扰滤波器和反射镜，所述反射镜成45°倾斜布置用于将激光引导至微流控分选芯片中的检测细胞；

所述CCD单元用于采集检测细胞的图像信息、且包括同轴布置的第一全息干涉陷波滤波器、第一透镜、第二全息干涉陷波滤波器、第二透镜和CCD，所述第一全息干涉陷波滤波器成45°倾斜布置用于将检测细胞的图像信息引导至CCD；

所述摄像机单元用于实时采集检测细胞的视频信息、且包括同轴布置的光束分离器、分光镜和摄像机，所述光束分离器成45°倾斜布置用于将检测细胞的图像信息引导至摄像机；

所述观察单元包括同轴布置的第二透镜、第二透镜和油镜，所述油镜紧邻微流控分选芯片；

所述反射镜、第一全息干涉陷波滤波器、光束分离器、第二透镜、第二透镜和油镜的中心均在同一直线上。

进一步优选的，上述系统具体包括如下操作步骤：

a1）获得细胞光谱数据：

将原代大鼠分离的胰岛细胞贴壁生长于细胞定位格子培养皿中，收集所有生长于坐标系内细胞的拉曼光谱数据并记录所收集细胞在培养皿中的空间坐标，将该培养皿中的所有细胞进行免疫荧光染色，通过格子的空间位置确定某个细胞的空间坐标，挑选出免疫荧光染色阳性细胞的拉曼光谱数据从而获得单一种类的胰岛内分泌细胞光谱数据集；

a2）建立分选模型：

根据光谱的统计特性，利用主成分分析方法-线性判别分析法进行正交变换，获得对应特征值依次递减的特征向量，将光谱数据降维至多个综合指标，基于所述综合指标进行Fisher 判别分析，并采用PCA-LDA法建立判别函数；

a3）微流检测：

从样品池中流出的检测细胞进入微流控分选芯片的主通道，在第一聚焦驱动鞘液组的控制下，检测细胞成单细胞排列依次通过拉曼检测区，在第一聚焦驱动鞘液组的控制下，当检测细胞通过拉曼焦点时鞘流停止，检测细胞在拉曼检测区静止15秒以通过激光光镊拉曼光谱系统获取拉曼光谱；

a4）微流分选：

检测完毕后，在第二聚焦驱动鞘液组的控制下，检测细胞进入分选区域，基于检测结果，在第一微阀门和第二微阀门的控制下，检测细胞进入第一分选通道或第二分选通道。

进一步优选的，所述建立分选模型还包括如下步骤：对未知的待测细胞，将其拉曼光谱与已知的胰岛细胞数据共计算，根据判别分析结果判定未知细胞的细胞类型。

进一步优选的，所述微流检测还包括异常图像识别与处理步骤：

b1) 检测细胞在拉曼检测区静止15秒以通过摄像机或CCD获取细胞形态；

b2）系统判断细胞形态是否完好，细胞边缘是否光滑；

b3）当检测细胞的细胞形态完好且细胞边缘光滑，检测细胞允许通过第一分选通道或第二分选通道进入收集池；

b4）当检测细胞的细胞形态不完好或细胞边缘不光滑，检测细胞被放。

本发明的一种微流控分选芯片制备方法具有以下有益效果：

1、该系统中的活细胞所处的细胞培养液对可见光吸收很弱，以可见光为激发源的拉曼光谱技术适合生长于培养液中活细胞的研究。

2、该系统中的入射激光被聚焦成直径不足2 μm的探测光点，用其探测细胞甚至可以检测亚细胞结构，具有较高的空间分辨率和灵敏度。

3、该系统中的低能量的近红外波长的激光对于细胞几乎没有损伤，细胞能够耐受较长时间的拉曼检测。

4、该系统中的拉曼光谱基于细胞的物理性质（拉曼散射），检测细胞无需染色和固定，不引人新混杂因素。

5、目前尚无一种方法可以快速、无损的纯化原代胰岛 α、β、δ 及 pp 细胞，尤其是胰岛δ、ε和pp 细胞的单细胞生理学研究罕见，该方案可为糖尿病基础研究提供纯化的胰岛α、β、δ 及 pp 细胞。

6、胰岛ε细胞是胰岛内新近发现的胰岛第五种内分泌细胞，它分泌的饥饿素最近被证明具有增强胰岛β细胞的自噬作用，抗凋亡等作用。因胰岛ε细胞含量仅占胰岛细胞总数1%，想对胰岛ε细胞进行单细胞生理研究，研究胰岛ε细胞的特性，本专利方案是目前无损分选胰岛ε细胞的唯一方法。

附图说明

图1为本发明中微流控分选芯片的结构示意图；

图2为本发明中微流控分选芯片的工作过程示意图；

图3为本发明中PDMS微阀的导通状态示意图；

图4为本发明中PDMS微阀的关闭结构示意图；

图5为本发明中PDMS微阀的整体结构示意图；

图6为本发明中激光光镊拉曼光谱系统的整体结构示意图；

图7为本发明中检测细胞分选原理图；

图8为本发明中细胞分选技术路线图；

图9为本发明中系统控制系统逻辑示意图。

图中，1-气路控制层、101-第一微阀门、102-第二微阀门、2-PDMS薄膜层、3-流体通道层、301-主通道、302-第一鞘流通道、303-第二鞘流通道、304-第三鞘流通道、305-第四鞘流通道、306-第一分选通道、307-第二分选通道、4-石英玻璃基底、5-气路、6-电磁阀、7-气源、8-排气口、9-激光光镊拉曼光谱系统、901-激光器、902-光频隔离器、903-干扰滤波器、904-反射镜、905-第一全息干涉陷波滤波器、906-第一透镜、907-第二全息干涉陷波滤波器、908-第二透镜、909-CCD、910-光束分离器、911-分光镜、912-摄像机、913-第二透镜、914-第二透镜、915-油镜。

具体实施方式

在本发明的描述中，需要理解的是，术语“中心”、“上”、“下”、“前”、“后”、“左”、“右”、“竖直”、“水平”、“顶”、“底”、“内”、“外”等指示的方位或位置关系为基于附图所示的方位或位置关系，仅是为了便于描述本发明和简化描述，而不是指示或暗示所指的装置或元件必须具有特定的方位、以特定的方位构造和操作，因此不能理解为对本发明的限制。术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括一个或者更多个该特征。在本发明的描述中，除非另有说明，“多个”的含义是两个或两个以上。

实施一

如图1所示，一种微流控分选芯片采用采用PDMS微阀技术，具体包括从上向下依次堆叠的气路控制层1、PDMS薄膜层2、流体通道层3和石英玻璃基底4。图1中，气路控制通道和流体通道呈交叉放置，通过外置的气路三通阀控制气路通道内的压力来实现微阀的开启和闭合，施加气压时, 中间层的PDMS薄膜层2发生形变, 向下挤压流体通道层3中通道, 直至通道闭合。 撤销压力时, PDMS薄膜层2在自身弹力的作用下恢复原状, 通道恢复开启状态。

本实施例中，PDMS为polydimethylsiloxane的缩写，中文为聚二甲基硅氧烷，该材料是有机硅的一种，因其成本低，使用简单，同硅片之间具有良好的粘附性，而且具有良好的化学惰性等特点，成为一种广泛应用于微流控等领域的聚合物材料。

其中，分选芯片采用了薄膜微阀结构，如图1所示，气路控制层1内设置有第一微阀门101和第二微阀门102； 流体通道层3内设置有主通道301，主通道301的入口与出口之间依次设置有第一聚焦驱动鞘液组和第二聚焦驱动鞘液组，第一聚焦驱动鞘液组和第二聚焦驱动鞘液组用于控制检测细胞单行排列和向前运动。

具体的，第一聚焦驱动鞘液组和第二聚焦驱动鞘液组的作用即使得细胞排列成行，并且能驱动单行排列的细胞向前移动，即夹流聚焦作用，通过调整细胞的密度，即可实现细胞间距可调，控制细胞逐个排着经过检测区。

图1中，主通道301的出口处连通有第一分选通道306和第二分选通道307，第一聚焦驱动鞘液组包括设置在主通道301两侧的第一鞘流通道302和第二鞘流通道303，第二聚焦驱动鞘液组包括设置在主通道301两侧的第三鞘流通道304和第四鞘流通道305；PDMS薄膜层2设置在第一微阀门101与第一分选通道306之间、以及第二微阀门102与第二分选通道307的之间，PDMS薄膜层2在第一微阀门101和第二微阀门102的带动下上、下运动以实现第一分选通道306和第二分选通道307的导通或关断。

具体的，主通道301的入口处连通细胞样品池，第一分选通道306和第二分选通道307分别连接不同的细胞收集池，第一鞘流通道302和第二鞘流通道303连通第一微泵，第三鞘流通道304和第四鞘流通道305连通第二微泵。

如图2所示，分选芯片包括3个区域：聚焦区域A、拉曼检测区域B和分选区C，自检测细胞从样品池中流出，进入主通道301，自检测细胞通过聚焦区域A，在第一聚焦驱动鞘液组的作用下单行排列，随后，单排检测细胞进入拉曼检测区域B，在第二聚焦驱动鞘液组的作用下停留在激光光镊拉曼光谱系统9的的拉曼焦点上进行检测，激光光镊拉曼光谱系统9获得检测细胞拉曼光谱数据，并进行数据处理分析、结果判定，然后，检测细胞在第二聚焦驱动鞘液组的作用下向前运动进入分选区C，此时，计算机控制第一微阀门101和第二微阀门102的关闭或导通，实现检测细胞进入不同的收集池，分选后落入不同收集池的胰岛细胞为纯化的胰岛细胞，可用继续培养，待特定实验用。

具体的，第一微阀门101交叉布置在第一分选通道306的上方，第一分选通道306的导通或关闭由第一微阀门101的排气缩小或充气膨胀实现，第二鞘流通道303交叉布置在第二分选通道307的上方，第二分选通道307的导通或关闭由第二鞘流通道303的排气缩小或充气膨胀实现。

需要说明的是，如图3和图4所示，薄膜微阀结构是一种常用的微阀门，其采用聚二甲基硅氧烷制作，具体分上中下三层结构：上层为气路控制层1，中层为PDMS薄膜层2，下层为流体流动通道，图3中的微阀门未充气，此时，聚合物膜未发生形变，流动通道未被阻隔，图4中的微阀门充气，此时，聚合物膜发生形变，流动通道被阻隔。

本实施例中的微阀门控制原理如图5所示，第一微阀门101和第二微阀门102通过气路5中的三通阀分别连接气源7和排气口8，第一微阀门101和第二微阀门102的充气或排气由气路5上的电磁阀6控制。

实施二

一种微流控分选系统，包括激光光镊拉曼光谱系统9以及上述微流控分选芯片，激光光镊拉曼光谱系统9设置在微流控分选芯片的一侧，其中：激光光镊拉曼光谱系统由激光单元、CCD单元、摄像机单元和观察单元组成。

如图6所示，激光光镊拉曼光谱系统9中，一束波长为785 nm 的半导体激光由激光器901 ，激光器901 采用Hitachi的HL-7851G型号，发出 780 nm、15 mW的激光，经过滤波后被导入一台尼康倒置生物显微镜（Nikon TE2000-U)，本实施例中显微镜物镜是数值孔径为1.30 , 放大倍数为100 倍的油镜915。激光束到达物镜前的光斑直径大约6 mm , 发散角是2 mrad。半导体激光器901通过恒温电路控制以避免波长漂移，样品池由石英材质的微流控芯片构成。培养液缓里的单个细胞可以被聚焦的激光束产生的辐射压力固定在焦点附近, 同时这束激光也用来激发被囚禁细胞的拉曼散射。在收集光路里, 物镜也作为收集透镜收集来自细胞的背向散射光, 一个200 μm 的针孔用来去除离轴的散射光。光谱仪耦合到电荷耦合器件CCD 909上, 为了获得极低的暗电流, CCD 909被冷却到-120 ℃。

图6中，激光单元用于提供激光源、且包括同轴布置的激光器901、光频隔离器902、干扰滤波器903和反射镜904，反射镜904成45°倾斜布置用于将激光引导至微流控分选芯片中的检测细胞；激光器901发射的激光经过光频隔离器902、干扰滤波器903滤波后通过反射镜904被导入倒置生物显微镜，激光束经第二透镜913和第二透镜914聚焦后在焦点附近形成了光束光势陷阱，细胞被固定于焦点当中。

CCD单元包括同轴布置的第一全息干涉陷波滤波器905、第一透镜906、第二全息干涉陷波滤波器907、第二透镜908和CCD909，第一全息干涉陷波滤波器905成45°倾斜布置用于将检测细胞的图像信息引导至CCD909，两个全息干涉陷波滤波器被用来滤除波长与激发波长相同的弹性散射光，而细胞的拉曼散射光聚焦到被冷却到-120℃的电荷耦合器件CCD上。

摄像机单元用于实时采集检测细胞的视频信息、且包括同轴布置的光束分离器910、分光镜911和摄像机912，光束分离器910成45°倾斜布置用于将检测细胞的图像信息引导至摄像机912；光束分离器910可以提供目镜下观察显微视野，同时可以通过一个摄像机912进行连续监视。细胞被检测时浸泡在培养基中，整个实验过程在自动加温台中进行，全程保持37 ℃。

需要说明的是，观察单元包括同轴布置的第二透镜913、第二透镜914和油镜915，油镜915紧邻微流控分选芯片；反射镜904、第一全息干涉陷波滤波器905、光束分离器910、第二透镜913、第二透镜914和油镜915的中心均在同一直线上。

具体工作过程如下：

本实施例中的细胞图像识别使用图像采集卡（Image Capture Card）获取数字化视频图像信息。当细胞流过拉曼检测区时，图像中的像素点被累加，通过计算可设定相应的阈值来判断。此时程序输出断流信号，所有鞘流均停止，使细胞停留。因胰岛细胞直径约10μm，在焦点附近的胰岛细胞会被光镊的光势陷阱力捕获并停留在焦点上。程序会驱动 Winspec32软件对光谱进行收集和保存，拉曼光谱积分时间15秒。光谱收集完成后，测得的每个胰岛细胞光谱减去来自鞘流液、毛细管和光学部件的背景光谱，并对光谱进行基线矫正、归一化处理后与原有的胰岛光谱细胞库进行对比和判别分析。

最后由计算机输出判别信号并控制第一微阀门101和第二微阀门102的开闭。一般将第一微阀门101控制的通道设为收集池，第二微阀门102控制的通道设为废液池。在一般过程中第一微阀门101闭合，第二微阀门102打开。仅当计算机判别为目标细胞类型时，第一鞘流通道302打开，第二鞘流通道303关闭，同时第三鞘流通道304、第四鞘流通道305工作，驱动被检测的细胞进入第一鞘流通道302细胞收集池。以上自动化控制都是用 VisualBasic 和 Visual C++软件编程通过计算机来实现。

实施例三

一种微流控分选系统，其中，细胞分选原理图的如图7所示，细胞分选技术路线图如图8所示，控制系统的逻辑如图9所示，该系统具体包括如下操作步骤：

a1）获得细胞光谱数据：

为了获得单纯某种胰岛内分泌的拉曼光谱作为训练样本，申请者先行收集细胞拉曼光谱数据再进行免疫荧光鉴定细胞类型。将原代大鼠分离的胰岛细胞贴壁生长于细胞定位格子培养皿中，收集所有生长于坐标系内细胞的拉曼光谱数据并记录所收集细胞在培养皿中的空间坐标，之后将该培养皿中的所有细胞进行免疫荧光染色，因其格子可以确定某个细胞的空间坐标，将免疫荧光染色阳性细胞的拉曼光谱数据被挑选出来从而获得单一种类的胰岛内分泌细胞光谱数据集。目前该数据库已建立，初步分选效率和结果已于学术论文发表，并持续收集细胞扩充细胞数据库。

由于，大鼠原代胰岛α、β、δ及pp细胞之间的拉曼光谱3具有显著差别，其拉曼“分子指纹”相异是利用拉曼光谱能鉴别分选胰岛细胞的理论基础。

需要说明的是，样本制备制作过程中，胰岛的分离采用逆行胆管灌注胶原酶消化，密度梯度离心法分离。分离后的胰岛用胰蛋白酶消化成单细胞，放入培养箱过夜培养，过程如下：

大鼠隔夜禁食后，颈椎脱臼处死，以75 %酒精浸泡。无菌操作解剖大鼠，打开腹腔，暴露胰腺及胆总管，在近十二指肠的胆总管开口处结扎。于胆总管近肝门段下穿一根丝线，用4.5号头皮针顺行穿入胆总管，并结扎防止针头滑出。以每分钟6 ml的速度注入浓度为1mg/ml的胶原酶溶液，使其充分膨胀。

迅速完整地摘除胰腺，剪掉多余的脂肪组织、淋巴结和血管。放入含有10ml浓度为1mg/ml胶原酶溶液的消化瓶中，38℃水浴静止消化10min。10min后取出用振荡器震荡15-30s，肉眼观察消化程度，待呈“细沙状”后终止消化。

将消化物吹打后移入50ml离心管并加入40mlD-Hanks液稀释胶原酶，反复吹打，洗涤，离心2-3次。将消化物均匀分配至两个15ml离心管当中，加入密度分离液5mlHistopaque1077，将消化物与分离液充分吹打混匀，分别缓慢加入D-Hanks液5ml，形成两个密度梯度。以2000rpm离心20min，胰岛即被压缩在两个密度中间。吸出液体界面中的胰岛，用D-Hanks液反复洗涤2-3次。在显微镜下计数，并取其中一小部分做双硫腙染色鉴定纯度。其余的胰岛放入培养箱培养。

培养后的胰岛用0.05%的胰蛋白酶在37℃环境消化10min并镜下观察，当80%胰岛分散成单细胞时即用胎牛血清终止消化。用完全培养基洗涤细胞2次，放入培养箱过夜培养。进行微流控系统前将单细胞悬液调整到合适的细胞密度。

a2）建立分选模型：

主成分分析方法-线性判别分析法（PCA-LDA），是处理多元光谱数据，区分判别细胞类型的有力方法。利用它先根据光谱的统计特性进行正交变换，以消除原有向量各个分量间的相关性。变换得到对应特征值依次递减的特征向量，可把光谱数据降维将复杂冗长的光谱数据转换为少数几个综合指标。再利用这些综合指标进行Fisher 判别分析，建立判别函数，从而将检测的样本分开。本实施例中采用PCA-LDA法建立判别函数。对未知的待测细胞，将其拉曼光谱与已知的胰岛细胞数据共计算，根据其判别分析结果判定未知细胞的细胞类型。

a3）微流检测：

从样品池中流出的检测细胞进入微流控分选芯片的主通道301，在第一聚焦驱动鞘液组的控制下，检测细胞成单细胞排列依次通过拉曼检测区，在第二聚焦驱动鞘液组的控制下，当检测细胞通过拉曼焦点时鞘流停止，检测细胞在拉曼检测区静止15秒以通过激光光镊拉曼光谱系统获取拉曼光谱。

具体的，微流检测还包括异常图像识别与处理步骤：

b1）检测细胞在拉曼检测区静止15秒以通过摄像机912或CCD909获取细胞形态；

b2）系统判断细胞形态是否完好，细胞边缘是否光滑；

b3）当检测细胞的细胞形态完好且细胞边缘光滑，检测细胞允许通过第一分选通道306或第二分选通道307进入收集池；

b4）当检测细胞的细胞形态不完好或细胞边缘不光滑，检测细胞被放。

需要说明的是，在实际操作中，胰蛋白酶消化时间过长会使细胞活性下降，而胰酶消化时间过短则细胞会发生粘连。因此，在图像识别中通过调节阈值和机器学习算法，仅当细胞形态完好，边缘光滑的细胞才被允许进入收集池，其余不符合要求的细胞会被放弃。

正常形态的胰岛细胞，其边缘光滑，细胞核细胞质清晰可见。非正常形态的胰岛细胞包括粘连细胞、凋亡细胞，其中，粘连细胞为两个细胞相互粘连，影响拉曼信号的准确性，凋亡细胞的细胞边缘不整，细胞皱缩，上述细胞均不能进入收集池，以保证收集池中细胞状态良好，有利于无损分选的实现。

a4）微流分选：

检测完毕后，在第二聚焦驱动鞘液组的控制下，检测细胞进入分选区域，基于检测结果，在第一微阀门101和第二微阀门102的控制下，检测细胞进入第一分选通道306或第二分选通道307。

本专利申请基于国家自然科学基金青年科学基金项目（项目批注号31600677）资助，及大学生创新创业项目课题（编号2018060）资助，申请者设计了全自动微流控分选芯片的方案，将其与拉曼光谱检测、光谱数据实时分析、图像分析等技术结合，实现对胰岛β细胞无损、快速、高效纯化。建立激光光镊拉曼光谱系统下全自动纯化胰大鼠原代胰岛α、β、δ及pp细胞的体系。并对其纯化细胞进行进一步鉴定和培养研究。该发明申请因拉曼光谱检测不损伤细胞，无需染色剂和抗体，不引入新的混杂物质，探检测后细胞能直接作为研究对象继续实验等众多优点。将其应用于原代胰岛细胞分选，可为糖尿病研究提供可靠的纯化原代胰岛α、β、δ或pp细胞模型。这将极大地推动糖尿病领域基础研究的发展。

最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。

Claims (7)

1.一种微流控分选芯片，其特征在于，包括从上向下依次堆叠的气路控制层（1）、PDMS薄膜层（2）、流体通道层（3）和石英玻璃基底（4）、其中：

所述气路控制层（1）内设置有第一微阀门（101）和第二微阀门（102），所述第一微阀门（101）通过气路（5）中的三通阀分别连接气源（7）和排气口（8）, 所述第二微阀门（102）通过气路（5）中的三通阀分别连接气源（7）和排气口（8），第一微阀门（101）和第二微阀门（102）的充气或排气由气路（5）上的电磁阀（6）控制；

所述流体通道层（3）内设置有主通道（301），所述主通道（301）的入口与出口之间依次设置有第一聚焦驱动鞘液组和第二聚焦驱动鞘液组，所述第一聚焦驱动鞘液组和第二聚焦驱动鞘液组用于控制检测细胞单行排列和运动，所述主通道（301）的出口处连通有第一分选通道（306）和第二分选通道（307），所述第一聚焦驱动鞘液组包括对称设置在主通道（301）两侧的第一鞘流通道（302）和第二鞘流通道（303），所述第二聚焦驱动鞘液组包括对称设置在主通道（301）两侧的第三鞘流通道（304）和第四鞘流通道（305）；

所述PDMS薄膜层（2）设置在第一微阀门（101）与第一分选通道（306）之间、以及第二微阀门（102）与第二分选通道（307）的之间，PDMS薄膜层（2）在第一微阀门（101）和第二微阀门（102）的带动下上、下运动以实现第一分选通道（306）和第二分选通道（307）的导通或关断。

2.根据权利要求1所述的微流控分选芯片，其特征在于，所述主通道（301）的入口处连通细胞样品池，所述第一分选通道（306）和第二分选通道（307）分别连接细胞收集池和废液池，所述第一鞘流通道（302）和第二鞘流通道（303）分别连通第一微泵，所述第三鞘流通道（304）和第四鞘流通道（305）分别连通第二微泵。

3.根据权利要求1所述的微流控分选芯片，其特征在于，所述第一微阀门（101）交叉布置在第一分选通道（306）的上方，所述第一分选通道（306）的导通或关闭由第一微阀门（101）的排气或充气驱动PDMS薄膜层（2）形变实现，所述第二鞘流通道（303）交叉布置在第二分选通道（307）的上方，所述第二分选通道（307）的导通或关闭由第二鞘流通道（303）的排气或充气驱动PDMS薄膜层（2）形变实现。

4.一种微流控分选系统，其特征在于，包括激光光镊拉曼光谱系统以及如权利要求1至3任意一项所述的微流控分选芯片，所述激光光镊拉曼光谱系统由激光单元、CCD单元、摄像机单元和观察单元组成，其中：

所述激光单元用于提供激光源、且包括同轴布置的激光器（901）、光频隔离器（902）、干扰滤波器（903）和反射镜（904），所述反射镜（904）成45°倾斜布置用于将激光引导至微流控分选芯片中的检测细胞；

所述CCD单元用于采集检测细胞的图像信息、且包括同轴布置的第一全息干涉陷波滤波器（905）、第一透镜（906）、第二全息干涉陷波滤波器（907）、第二透镜（908）和CCD（909），所述第一全息干涉陷波滤波器（905）成45°倾斜布置用于将检测细胞的图像信息引导至CCD（909）；

所述摄像机单元用于实时采集检测细胞的视频信息、且包括同轴布置的光束分离器（910）、分光镜（911）和摄像机（912），所述光束分离器（910）成45°倾斜布置用于将检测细胞的图像信息引导至摄像机（912）；

所述观察单元包括同轴布置的第二透镜（913）、第二透镜（914）和油镜（915），所述油镜（915）紧邻微流控分选芯片；

所述反射镜（904）、第一全息干涉陷波滤波器（905）、光束分离器（910）、第二透镜（913）、第二透镜（914）和油镜（915）的中心均在同一直线上。

5.根据权利要求4所述的微流控分选系统，其特征在于，具体包括如下操作步骤：

a1）获得细胞光谱数据：

将原代大鼠分离的胰岛细胞贴壁生长于细胞定位格子培养皿中，收集所有生长于坐标系内细胞的拉曼光谱数据并记录所收集细胞在培养皿中的空间坐标，将该培养皿中的所有细胞进行免疫荧光染色，通过格子的空间位置确定某个细胞的空间坐标，挑选出免疫荧光染色阳性细胞的拉曼光谱数据从而获得单一种类的胰岛内分泌细胞光谱数据集；

a2）建立分选模型：

根据光谱的统计特性，利用主成分分析方法-线性判别分析（PCA-LDA）法进行正交变换，获得对应特征值依次递减的特征向量，将光谱数据降维至多个综合指标，基于所述综合指标进行Fisher 判别分析，并采用PCA-LDA法建立判别函数；

a3）微流检测：

从样品池中流出的检测细胞进入微流控分选芯片的主通道（301），在第一聚焦驱动鞘液组的控制下，检测细胞成单细胞排列依次通过拉曼检测区，在第一聚焦驱动鞘液组的控制下，当检测细胞通过拉曼焦点时鞘流停止，检测细胞在拉曼检测区静止15秒以通过激光光镊拉曼光谱系统获取拉曼光谱；

a4）微流分选：

检测完毕后，在第二聚焦驱动鞘液组的控制下，检测细胞进入分选区域，基于检测结果，在第一微阀门（101）和第二微阀门（102）的控制下，检测细胞进入第一分选通道（306）或第二分选通道（307）。

6.根据权利要求5所述的微流控分选系统，其特征在于，所述建立分选模型还包括如下步骤：对未知的待测细胞，将其拉曼光谱与已知的胰岛细胞数据共计算，根据判别分析结果判定未知细胞的细胞类型。

7.根据权利要求5所述的微流控分选系统，其特征在于，所述微流检测还包括异常图像识别与处理步骤：

b1) 检测细胞在拉曼检测区静止15秒以通过摄像机（912）或CCD（909）获取细胞形态；

b2）系统判断细胞形态是否完好，细胞边缘是否光滑；

b3）当检测细胞的细胞形态完好且细胞边缘光滑，检测细胞允许通过第一分选通道（306）进入收集池；

b4）当检测细胞的细胞形态不完好或细胞边缘不光滑，检测细胞进入第二分选通道（307）进入废液池。