JP3311757B2 - レーザー照射を用いる平坦に配置される生物学的対象への非接触顕微注射、分別及び採取方法並びに装置 - Google Patents
レーザー照射を用いる平坦に配置される生物学的対象への非接触顕微注射、分別及び採取方法並びに装置Info
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Description
【発明の詳細な説明】 本発明は、単一の生物学的対象（single biological
object）を顕微注射（microinjection）、分別及び採取
するためのプロセス並びに装置に関する、対象は、固定
された平坦なキャリヤ上に並列に配置されている。この
プロセスは、例えば、細胞のような個々の生物学的対象
の中に特定の物質を顕微注射し、続いてそれらを分別す
るために好適である。更に、このプロセスを用いること
により、単一の対象を非常に多くの対象（例えば、105
ないし109）から空間的に分離し、選出すことができ
る。堆積細胞／細胞塊を単位とする分離もまた可能であ
る。このプロセスは、組織試料から特定の細胞を分離す
るために使用することもできる。この分別プロセスの必
須条件は、特定の性質に基づいて（例えば、色、蛍光標
識により、又は放射能標識により）、関連する対象を予
め認識主び選択することである。本出願の文脈において
「生物学的対象」との用語は、主に生きた又はトラップ
（trap）した生物学的細胞又は細胞の部分を意味する。
object）を顕微注射（microinjection）、分別及び採取
するためのプロセス並びに装置に関する、対象は、固定
された平坦なキャリヤ上に並列に配置されている。この
プロセスは、例えば、細胞のような個々の生物学的対象
の中に特定の物質を顕微注射し、続いてそれらを分別す
るために好適である。更に、このプロセスを用いること
により、単一の対象を非常に多くの対象（例えば、105
ないし109）から空間的に分離し、選出すことができ
る。堆積細胞／細胞塊を単位とする分離もまた可能であ
る。このプロセスは、組織試料から特定の細胞を分離す
るために使用することもできる。この分別プロセスの必
須条件は、特定の性質に基づいて（例えば、色、蛍光標
識により、又は放射能標識により）、関連する対象を予
め認識主び選択することである。本出願の文脈において
「生物学的対象」との用語は、主に生きた又はトラップ
（trap）した生物学的細胞又は細胞の部分を意味する。
生きた細胞内に物質を注射するためには、通常、水又
は水力により駆動し得るマニピュレーターにより通常制
御されるミクロ毛細管が使用されていた。大きな機械的
圧力下に、所望の物質が個々の細胞内に注射される。滅
菌ミクロ毛細管の製造は、時間を消費し、高価である。
は水力により駆動し得るマニピュレーターにより通常制
御されるミクロ毛細管が使用されていた。大きな機械的
圧力下に、所望の物質が個々の細胞内に注射される。滅
菌ミクロ毛細管の製造は、時間を消費し、高価である。
Tsukakoshiら（1974）及びTaoら（1987）は、細胞膜
に機械的に接触することなく小さい自己治癒孔を穿孔す
るために集束レーザービームを用いた。短い開口時間
は、周囲の流体に溶解する物質が細胞内に浸透するため
に十分である。遺伝物質のレーザー顕微注射は、レーザ
ーが細胞内に直接孔を設ける場合に、より有効であっ
た。
に機械的に接触することなく小さい自己治癒孔を穿孔す
るために集束レーザービームを用いた。短い開口時間
は、周囲の流体に溶解する物質が細胞内に浸透するため
に十分である。遺伝物質のレーザー顕微注射は、レーザ
ーが細胞内に直接孔を設ける場合に、より有効であっ
た。
この方法の問題点は、サブミクロン領域内に正確にレ
ーザー顕微注射するために、横、すなわちX/Y方向に、
及び垂直、すなわちＺ方向にもナノメーターのオーダー
の精度を伴って目標とする対象に接近しなければならな
いことである。自動化された顕微注射のために、問題の
目標対象細胞は、イメージ認識プロセスにより認識さ
れ、次いで、レーザーの閃光の線上に配置され、次い
で、最も重要なことには、Ｚ方向に正確に集束されなけ
ればならない。
ーザー顕微注射するために、横、すなわちX/Y方向に、
及び垂直、すなわちＺ方向にもナノメーターのオーダー
の精度を伴って目標とする対象に接近しなければならな
いことである。自動化された顕微注射のために、問題の
目標対象細胞は、イメージ認識プロセスにより認識さ
れ、次いで、レーザーの閃光の線上に配置され、次い
で、最も重要なことには、Ｚ方向に正確に集束されなけ
ればならない。
さらなる問題は、注射された細胞を他の細胞から成功
裏に分離又は調製し、さらなる試験に供することにあ
る。
裏に分離又は調製し、さらなる試験に供することにあ
る。
単一の生物学的対象を分離するための光学ピンセット
（optical tweezer）のような光学方法であって、対象
が水溶液中を動くものがある（K.Schtze,A.Clement−
Sengwald,Nature667（vol.368）1994）。この方法は、
力の移転が非常に小さいので、溶液中で自由に動き得る
対象に限定される。分別又は非分別の対象が同じ溶液内
にあるので、余分の努力を伴ってのみ分離培養すること
ができる。細胞の分離培養のためには、例えば、ミクロ
毛細管を用いるような別の方法により細胞を分離又は吸
出さなければならない。付着して成長する細胞又は切断
された試料上にトラップされた細胞は、ミクロマニピュ
レーターにより駆動される微少針により分離することが
できる。この状況下では、細胞に直接に接触し、それに
より機械的に応力を加える。更に、不所望の細胞物質に
よる汚染の危険がある。両方法は、比較的時間消費的で
あるので、大量の対象の操作には適していない。
（optical tweezer）のような光学方法であって、対象
が水溶液中を動くものがある（K.Schtze,A.Clement−
Sengwald,Nature667（vol.368）1994）。この方法は、
力の移転が非常に小さいので、溶液中で自由に動き得る
対象に限定される。分別又は非分別の対象が同じ溶液内
にあるので、余分の努力を伴ってのみ分離培養すること
ができる。細胞の分離培養のためには、例えば、ミクロ
毛細管を用いるような別の方法により細胞を分離又は吸
出さなければならない。付着して成長する細胞又は切断
された試料上にトラップされた細胞は、ミクロマニピュ
レーターにより駆動される微少針により分離することが
できる。この状況下では、細胞に直接に接触し、それに
より機械的に応力を加える。更に、不所望の細胞物質に
よる汚染の危険がある。両方法は、比較的時間消費的で
あるので、大量の対象の操作には適していない。
流体に分散された大量（＞106）の細胞から単一細胞
を分離するために、生物学的対象を分離及び分別するた
めの商業的に入手可能な装置がある。蛍光活性化細胞ソ
ーター（FACS）においては、静電現象が空間的分離のた
めに用いられる一方で、磁気活性化細胞ソーター（MAC
S）は、磁気力により作動する。しかしながら、これら
のシステムにおいて、細胞は、平坦な担体上に並列に配
置されていない。さらに、これらの方法の両者とも、対
象の多くが限定された程度にしか分離され得ない（FAC
S）か、又は全く分離さえされない（MACS）という不都
合を有する。
を分離するために、生物学的対象を分離及び分別するた
めの商業的に入手可能な装置がある。蛍光活性化細胞ソ
ーター（FACS）においては、静電現象が空間的分離のた
めに用いられる一方で、磁気活性化細胞ソーター（MAC
S）は、磁気力により作動する。しかしながら、これら
のシステムにおいて、細胞は、平坦な担体上に並列に配
置されていない。さらに、これらの方法の両者とも、対
象の多くが限定された程度にしか分離され得ない（FAC
S）か、又は全く分離さえされない（MACS）という不都
合を有する。
上述した方法は、組織のような細胞プラーク／塊から
又は組織学的組織調製物から単一細胞を解放することが
できない。
又は組織学的組織調製物から単一細胞を解放することが
できない。
更に、「融除光分解」（ablative photo decompositi
on）」という名の既知のプロセスであって、具体的には
EczemaレーザーであるパルスUV−レーザーを用いてポリ
マー材料を指向除去することのできるプロセスがある。
このプロセスは、より広い意味には、エッチングプロセ
スとみることができる。しかしながら、連続UV−レーザ
ーを用いる同様のプロセスがUS特許5,211,805に記載さ
れている。このプロセスは、テクニカルポリマーの工業
的処理のため及び生物学的組織の生体臨床医学治療のた
めに好適であると述べられている。高投与量のレーザー
照射により担体上の不所望の生物学的対象を破壊する一
方で、選択された（所望の）対象が後に残されることが
含まれる分別原理が用いられている（US4,624,915）。
この手順は、大量のものから単一の対象を選択するため
には比較的面倒である。
on）」という名の既知のプロセスであって、具体的には
EczemaレーザーであるパルスUV−レーザーを用いてポリ
マー材料を指向除去することのできるプロセスがある。
このプロセスは、より広い意味には、エッチングプロセ
スとみることができる。しかしながら、連続UV−レーザ
ーを用いる同様のプロセスがUS特許5,211,805に記載さ
れている。このプロセスは、テクニカルポリマーの工業
的処理のため及び生物学的組織の生体臨床医学治療のた
めに好適であると述べられている。高投与量のレーザー
照射により担体上の不所望の生物学的対象を破壊する一
方で、選択された（所望の）対象が後に残されることが
含まれる分別原理が用いられている（US4,624,915）。
この手順は、大量のものから単一の対象を選択するため
には比較的面倒である。
本発明の目的は、とりわけ、非接触レーザー顕微注射
により選択的物質を生物学的対象に指向的に載荷し、次
いで、成功裏に注射された対象を分別することである。
生物学的対象は、例えば、ポリマー担体フォイル（poly
mer carrier foil）のような固定された平坦な担体上に
並列に分散させ得る。なお、選択プロセスは、できるだ
け速く（＜10秒）、かつ接触を伴わずに、例えば、別個
の滅菌チャンバ内で行われるべきである。さらに、手順
は、非常に信頼性があり、従って、単純な方法に自動化
し得る必要がある。同時に、生物学的対象は、高い生存
率を有し、概して不変のままであるべきである。対象
は、顕微注射手順及び分離プロセスにより破壊又は破損
されるべきではない。
により選択的物質を生物学的対象に指向的に載荷し、次
いで、成功裏に注射された対象を分別することである。
生物学的対象は、例えば、ポリマー担体フォイル（poly
mer carrier foil）のような固定された平坦な担体上に
並列に分散させ得る。なお、選択プロセスは、できるだ
け速く（＜10秒）、かつ接触を伴わずに、例えば、別個
の滅菌チャンバ内で行われるべきである。さらに、手順
は、非常に信頼性があり、従って、単純な方法に自動化
し得る必要がある。同時に、生物学的対象は、高い生存
率を有し、概して不変のままであるべきである。対象
は、顕微注射手順及び分離プロセスにより破壊又は破損
されるべきではない。
本発明によれば、顕微注射のタスク（task）は、自動
化された方法で行われ、カバーガラス又は担体フォイル
上の対象区域が、動力化コンピューター制御された顕微
鏡キャリヤ（carrier）を用いる曲折形スキャンにより
除去される。このようにして、単一の目標細胞（目標対
象）が、色又はパターン認識を用いるイメージ分析プロ
セスにより選択され、X/Y移動によりレーザー発射の領
域内にもたらされる。次いで、細胞又は所望の細胞構造
体は、（Ｚ方向に）焦点が合わされ、指向レーザーショ
ットにより細胞にはミクロ穿孔が形成される。対象のX/
Y方向の動きは、顕微鏡台の軸及び顕微鏡台の第３の軸
によりＺ方向を経由して設定することも、コンピュータ
ー制御により顕微鏡自体の上にある対象の焦点調整によ
り設定することもできる。その代わりに、目標対象への
調整は、３次元コンピュータ制御されたレーザー焦点動
作により固定された顕微鏡台を用いても行い得る。残っ
ている細胞ローン（lawn）から成功裏にミクロ注射され
た細胞を続けて分別するために、以下に説明する選択プ
ロセスが用いられる。
化された方法で行われ、カバーガラス又は担体フォイル
上の対象区域が、動力化コンピューター制御された顕微
鏡キャリヤ（carrier）を用いる曲折形スキャンにより
除去される。このようにして、単一の目標細胞（目標対
象）が、色又はパターン認識を用いるイメージ分析プロ
セスにより選択され、X/Y移動によりレーザー発射の領
域内にもたらされる。次いで、細胞又は所望の細胞構造
体は、（Ｚ方向に）焦点が合わされ、指向レーザーショ
ットにより細胞にはミクロ穿孔が形成される。対象のX/
Y方向の動きは、顕微鏡台の軸及び顕微鏡台の第３の軸
によりＺ方向を経由して設定することも、コンピュータ
ー制御により顕微鏡自体の上にある対象の焦点調整によ
り設定することもできる。その代わりに、目標対象への
調整は、３次元コンピュータ制御されたレーザー焦点動
作により固定された顕微鏡台を用いても行い得る。残っ
ている細胞ローン（lawn）から成功裏にミクロ注射され
た細胞を続けて分別するために、以下に説明する選択プ
ロセスが用いられる。
本発明に従いえば、選択及び分離のタスクは、選択さ
れた生物学的対象又は組織切片がその上に配置される担
体フォイルの対象区域をレーザービームにより切り出
し、レーザー誘導移動プロセスにより担体フォイルの真
上又は真下にある回収基体へ移動することにより達成さ
れる。本発明によれば、解決手段は、まず、目を用いて
視覚的に、又はイメージ分析プロセスの色もしくはパタ
ーン認識により生物学的対象を確認し、次いで、試料に
適合する周囲を、例えば円形に、レーザー光により、担
体とともに切り出し、次いで、担体フォイルから付近に
配置される回収器上に放出することにある。分離された
対象区域は、常にレーザービームの方向に放出されるこ
とが観察された。このレーザー誘導移動についての物理
的説明は、おそらく、レーザービームから切り出し対象
区域へ移動し、それにより加速の原因となる光運動論イ
ンパルスに基づくであろう。従って、このプロセスにお
いて、生物学的対象を空間的に分離することは、所望の
対象区域を予め選択された対象と共に切り出し、付近に
配置される回収基体へそれを運搬することに起因する。
れた生物学的対象又は組織切片がその上に配置される担
体フォイルの対象区域をレーザービームにより切り出
し、レーザー誘導移動プロセスにより担体フォイルの真
上又は真下にある回収基体へ移動することにより達成さ
れる。本発明によれば、解決手段は、まず、目を用いて
視覚的に、又はイメージ分析プロセスの色もしくはパタ
ーン認識により生物学的対象を確認し、次いで、試料に
適合する周囲を、例えば円形に、レーザー光により、担
体とともに切り出し、次いで、担体フォイルから付近に
配置される回収器上に放出することにある。分離された
対象区域は、常にレーザービームの方向に放出されるこ
とが観察された。このレーザー誘導移動についての物理
的説明は、おそらく、レーザービームから切り出し対象
区域へ移動し、それにより加速の原因となる光運動論イ
ンパルスに基づくであろう。従って、このプロセスにお
いて、生物学的対象を空間的に分離することは、所望の
対象区域を予め選択された対象と共に切り出し、付近に
配置される回収基体へそれを運搬することに起因する。
対象区域の切り出しは、レーザービームと担体フォイ
ルの相対的動きにより対象区域を含む生物学的対象の周
囲を閉じた曲線にレーザービームをガイドすることによ
り有利に達成し得る。その代わりに、対象区域の分離
は、スタンピングプロセスの類推によっても行うことが
でき、対象区域を含む切り取り領域が、レーザービーム
により照射され、及び担体フォイル上に投影されるスリ
ットマスクを通して同時にさらされる。
ルの相対的動きにより対象区域を含む生物学的対象の周
囲を閉じた曲線にレーザービームをガイドすることによ
り有利に達成し得る。その代わりに、対象区域の分離
は、スタンピングプロセスの類推によっても行うことが
でき、対象区域を含む切り取り領域が、レーザービーム
により照射され、及び担体フォイル上に投影されるスリ
ットマスクを通して同時にさらされる。
既に述べたように、回収基体は、分離プロセスの間に
移動される距離が短くなるように、担体フォイルの直近
に配置されるべきである。0.5ないし10mm、好ましくは
１ないし3mmの距離で優れた結果が得られた。
移動される距離が短くなるように、担体フォイルの直近
に配置されるべきである。0.5ないし10mm、好ましくは
１ないし3mmの距離で優れた結果が得られた。
選択された対象をともなう対象区域の直径は、非常に
正確に切り取りプロセスを行うためには、10マイクロメ
ートルないし20マイクロメートルの範囲内に選択するこ
とができる。
正確に切り取りプロセスを行うためには、10マイクロメ
ートルないし20マイクロメートルの範囲内に選択するこ
とができる。
好ましくはUVレーザーが切り出しのために用いられ、
同時に、担体フォイル上のレーザービームの焦点は、そ
の上へのイメージとして再生される。
同時に、担体フォイル上のレーザービームの焦点は、そ
の上へのイメージとして再生される。
担体フォイルは、５マイクロメートルから15マイクロ
メートルの間の厚さを有するUV吸収ポリマーフォイルで
あって、その吸収挙動がUVレーザーの波長とマッチした
又は少なくとも吸収極大値がレーザー波長の領域内にあ
るものから構成される。ポリマーフォイルは、５重量％
の芳香族重縮合物又は部分的芳香族重縮合物を含有する
ものが特に好適であることが証明されている。回収基体
の幾何学形状は、比較的重要ではない。例えば、比較的
薄いフォイル又はプレートであって、担体フィルムの上
方又は下方0.5ないし10mmの距離に、平行に配置される
ものが好ましい。しかしながら、回収基体は、ポット型
支持体の形態に構成され得る。特に、例えば、90ないし
500ウエルを有するマイクロタイタープレートのような
分子生物学で用いられるタイプのマイクロ遠心容器が推
奨される。
メートルの間の厚さを有するUV吸収ポリマーフォイルで
あって、その吸収挙動がUVレーザーの波長とマッチした
又は少なくとも吸収極大値がレーザー波長の領域内にあ
るものから構成される。ポリマーフォイルは、５重量％
の芳香族重縮合物又は部分的芳香族重縮合物を含有する
ものが特に好適であることが証明されている。回収基体
の幾何学形状は、比較的重要ではない。例えば、比較的
薄いフォイル又はプレートであって、担体フィルムの上
方又は下方0.5ないし10mmの距離に、平行に配置される
ものが好ましい。しかしながら、回収基体は、ポット型
支持体の形態に構成され得る。特に、例えば、90ないし
500ウエルを有するマイクロタイタープレートのような
分子生物学で用いられるタイプのマイクロ遠心容器が推
奨される。
特別の態様において、プレート又はフォイルには接着
コーティングが施される。そのような接着コーティング
により、推進力を付与された対象区域は回収基体上に保
持される。
コーティングが施される。そのような接着コーティング
により、推進力を付与された対象区域は回収基体上に保
持される。
担体フォイル上の所望の生物学的対象を認識及び選択
するために、蛍光分光法が好ましく用いられる。
するために、蛍光分光法が好ましく用いられる。
その代わりに、生物学的対象は、認識され、次いで、
視覚的に又はコンピューター上のイメージ分析手法によ
り、既知の組織化学発色反応又は形態学的に認知し得る
変化により選択される。
視覚的に又はコンピューター上のイメージ分析手法によ
り、既知の組織化学発色反応又は形態学的に認知し得る
変化により選択される。
本発明の更なる成果によれば、生物学的対象は、レー
ザー放射に対して透過性の流体栄養物又は緩衝液媒体に
より塗布される。本発明によれば、これらの状況下に、
選択された対象区域は切り出され、解放される。
ザー放射に対して透過性の流体栄養物又は緩衝液媒体に
より塗布される。本発明によれば、これらの状況下に、
選択された対象区域は切り出され、解放される。
本発明の分離プロセスは、閉鎖システム内で有利に行
われる。この目的のために、分別されるべき対象を伴う
担体フォイル及び回収基体も、レーザービームのための
UV透過性窓を有する閉鎖容器内に収容される。
われる。この目的のために、分別されるべき対象を伴う
担体フォイル及び回収基体も、レーザービームのための
UV透過性窓を有する閉鎖容器内に収容される。
以下、本発明を図面及び態様を参照してより詳細に説
明する。
明する。
図面の簡単な説明 図１は、バクテリアが接着された担体フォイルの概略
図である。
図である。
図２は、本発明の方法を実施するための装置の基礎的
な構造を示す図である。
な構造を示す図である。
図3/4は、基本的な分別原理を示す図である。
図5/6は、直立／倒立顕微鏡の構成を示す図である。
図７は、容器内へ収容する対象を示す図である。
図１は、例えば、５マイクロメートルの厚さのポリア
クリレートのフォイル２（担体フォイル）上に平坦に分
布したバクテリア１の個体群を示している。分別プロセ
スのために、担体フォイル２は、可動台３に配置され、
機械的に保持される。図２に示すこの台は、倒立顕微鏡
４内の対物台であり、例えば、X/Y方向（水平平面）に
コンピュータ制御されたステッピングモーターにより移
動することができる。可動台３内であって、担体フォイ
ル２の反対側、1.8mmの距離にプレート型回収基体５が
備えられ、可動台３が移動すると、担体フォイル２及び
回収基体５が、顕微鏡内で照射の進路に対して直角に
（Ｚ方向）一緒に移動する。可動台３並びにその上に配
置される担体フォイル２及び生物学的対象１、並びに回
収基体５は、レーザービームのための紫外線に対して透
過性の窓を備えた密閉容器（図示せず）により包囲され
ている。このように、本発明の方法は、密閉シールシス
テム内で実施することができる。
クリレートのフォイル２（担体フォイル）上に平坦に分
布したバクテリア１の個体群を示している。分別プロセ
スのために、担体フォイル２は、可動台３に配置され、
機械的に保持される。図２に示すこの台は、倒立顕微鏡
４内の対物台であり、例えば、X/Y方向（水平平面）に
コンピュータ制御されたステッピングモーターにより移
動することができる。可動台３内であって、担体フォイ
ル２の反対側、1.8mmの距離にプレート型回収基体５が
備えられ、可動台３が移動すると、担体フォイル２及び
回収基体５が、顕微鏡内で照射の進路に対して直角に
（Ｚ方向）一緒に移動する。可動台３並びにその上に配
置される担体フォイル２及び生物学的対象１、並びに回
収基体５は、レーザービームのための紫外線に対して透
過性の窓を備えた密閉容器（図示せず）により包囲され
ている。このように、本発明の方法は、密閉シールシス
テム内で実施することができる。
生物学的対象のための担体フィルムとしては、厚さ５
マイクロメートルないし15マイクロメートルの紫外線吸
収性ポリマーフィルムであって、少なくとも５重量パー
セントの芳香族重縮合物又は部分的芳香族重縮合物を含
有するもの、例えば、ポリカーボネート、ポリウレタ
ン、ポリアクリレート、コポリエステル（co−polyeste
r）、ポリエステルカーボネート、又はこれらのポリ縮
合物の混合物及び他の熱可塑性材料である。本明細書の
文脈内で他のタイプのフォイルも考慮することができ
る。
マイクロメートルないし15マイクロメートルの紫外線吸
収性ポリマーフィルムであって、少なくとも５重量パー
セントの芳香族重縮合物又は部分的芳香族重縮合物を含
有するもの、例えば、ポリカーボネート、ポリウレタ
ン、ポリアクリレート、コポリエステル（co−polyeste
r）、ポリエステルカーボネート、又はこれらのポリ縮
合物の混合物及び他の熱可塑性材料である。本明細書の
文脈内で他のタイプのフォイルも考慮することができ
る。
例えば、回収した固体群から単一バクテリアの空間的
分離のために、パルスN2−レーザー７の波長337ナノメ
ートルのUV−レーザービーム６が用いられる。レーザー
７は、最大パルス振動数20Hzを有する約300マイクロジ
ュールの放射エネルギーを配達する。他のパルスレーザ
ー又は連続動作レーザー、例えば、193、248もしくは30
8nmの波長を有するEczemaレーザー又は266nmの波長を有
する周波数４倍Nd;YAGレーザー又は244nmもしくは257nm
の波長を有する周波数２倍AR−lonレーザーも好適であ
る。レーザービーム６は、誘電ビームスプリッター８及
び縮小顕微鏡対物レンズ９（縮小63×、開口NA＝0.9又
は他の対物レンズも）を経由して点形に担体フォイル２
上に発射される。この点は、少なくとも１マイクロメー
トルの直径を有する。
分離のために、パルスN2−レーザー７の波長337ナノメ
ートルのUV−レーザービーム６が用いられる。レーザー
７は、最大パルス振動数20Hzを有する約300マイクロジ
ュールの放射エネルギーを配達する。他のパルスレーザ
ー又は連続動作レーザー、例えば、193、248もしくは30
8nmの波長を有するEczemaレーザー又は266nmの波長を有
する周波数４倍Nd;YAGレーザー又は244nmもしくは257nm
の波長を有する周波数２倍AR−lonレーザーも好適であ
る。レーザービーム６は、誘電ビームスプリッター８及
び縮小顕微鏡対物レンズ９（縮小63×、開口NA＝0.9又
は他の対物レンズも）を経由して点形に担体フォイル２
上に発射される。この点は、少なくとも１マイクロメー
トルの直径を有する。
水平面内での可動台３の対応する動きにより、これら
の選択されたバクテリアの周囲に例えば、10マイクロメ
ートルの直径を有する円形又は閉じた切線が生成する。
この場合、切線により規定される領域は、対象領域であ
るレーザービームは、以下に説明する切り取りプロセス
の間、静止したままである。
の選択されたバクテリアの周囲に例えば、10マイクロメ
ートルの直径を有する円形又は閉じた切線が生成する。
この場合、切線により規定される領域は、対象領域であ
るレーザービームは、以下に説明する切り取りプロセス
の間、静止したままである。
この実験において、閉じた領域を切り出すレーザービ
ームの相対動作速度は、１秒当たり５マイクロメートル
であった。鋭角に縁を付け、狭く境界づけられた切線が
生成し、切線の出発点にレーザービームが戻ると、切り
出し領域の分離が起こる。この領域は、まだ詳細に説明
していないが、レーザーにより誘導される物理的応力に
より、担体フォイル２から接着剤をコートされた回収基
体５上に推進される。そこで捕獲されたままでいる。他
に、回収基体として、例えば96ウエルを有する従来のマ
イクロタイタープレートを用いる得る。「ウエル」と
は、薬学研究の分野において、試験のために試料を受容
するための、約4mmの直径及び約6mmの深さを有するマイ
クロタイタープレート内のカット部分又は丸い凹部を意
味することが理解される。
ームの相対動作速度は、１秒当たり５マイクロメートル
であった。鋭角に縁を付け、狭く境界づけられた切線が
生成し、切線の出発点にレーザービームが戻ると、切り
出し領域の分離が起こる。この領域は、まだ詳細に説明
していないが、レーザーにより誘導される物理的応力に
より、担体フォイル２から接着剤をコートされた回収基
体５上に推進される。そこで捕獲されたままでいる。他
に、回収基体として、例えば96ウエルを有する従来のマ
イクロタイタープレートを用いる得る。「ウエル」と
は、薬学研究の分野において、試験のために試料を受容
するための、約4mmの直径及び約6mmの深さを有するマイ
クロタイタープレート内のカット部分又は丸い凹部を意
味することが理解される。
分別プロセスを図３及び図４を参照して再び説明す
る。図３は、担体フォイル２の上に配置される分離され
るべきバクテリア10を示している。切り出しプロセスに
おいて、可動台３の円状動作により約５ないし７マイク
ロメートルの巾の切線11が固定位置レーザービーム６に
より既に画かれている。カットの巾は、フォイルの吸収
特性に依存する。この領域において、フォイル材料は、
完全に除去される。切線11が閉じた円を完成した直後
に、分離されたフォイル片（対象区域）12とその上のバ
クテリア10は、レーザービームの方向に推進され、図４
に示すように接着テープ５（回収基体）上に捕獲され
る。円形穴13が担体フォイル２に残る。
る。図３は、担体フォイル２の上に配置される分離され
るべきバクテリア10を示している。切り出しプロセスに
おいて、可動台３の円状動作により約５ないし７マイク
ロメートルの巾の切線11が固定位置レーザービーム６に
より既に画かれている。カットの巾は、フォイルの吸収
特性に依存する。この領域において、フォイル材料は、
完全に除去される。切線11が閉じた円を完成した直後
に、分離されたフォイル片（対象区域）12とその上のバ
クテリア10は、レーザービームの方向に推進され、図４
に示すように接着テープ５（回収基体）上に捕獲され
る。円形穴13が担体フォイル２に残る。
可動台の代わりに静止対象台を用いることができ、レ
ーザービームに付与される好適な光学偏向エレメントに
より、選択されたバクテリアの周囲に円を画くようにレ
ーザービームを調整することができる。
ーザービームに付与される好適な光学偏向エレメントに
より、選択されたバクテリアの周囲に円を画くようにレ
ーザービームを調整することができる。
レーザー分離のための前提条件は、担体フォイルから
除去されるべき対象区域が、予め認識されかつ選択され
ていることである。特定の細胞構造体の認識及び選択の
ために薬学研究において度々用いられる方法は、蛍光分
光法である。この目的のために、商業的に入手可能な顕
微鏡が用いられる。これは、意図する選択のために、細
胞又はバクテリアは、識別基準として用い得る有意な蛍
光シグナルを発することを前提としている。サーチアル
ゴリズムを備えたスキャンニングプログラムにより、自
動的にかつ順に、選択されたバクテリアを有する領域が
蛍光顕微鏡の視野内に対象区域として中央に配置され、
次いで切り取られ得るように可動台３が制御される。
除去されるべき対象区域が、予め認識されかつ選択され
ていることである。特定の細胞構造体の認識及び選択の
ために薬学研究において度々用いられる方法は、蛍光分
光法である。この目的のために、商業的に入手可能な顕
微鏡が用いられる。これは、意図する選択のために、細
胞又はバクテリアは、識別基準として用い得る有意な蛍
光シグナルを発することを前提としている。サーチアル
ゴリズムを備えたスキャンニングプログラムにより、自
動的にかつ順に、選択されたバクテリアを有する領域が
蛍光顕微鏡の視野内に対象区域として中央に配置され、
次いで切り取られ得るように可動台３が制御される。
組織の切片における生物学的対象の認識のために、既
知の組織学的発色反応又は顕微鏡下に観察し得る形態学
的変化を用いることができる。
知の組織学的発色反応又は顕微鏡下に観察し得る形態学
的変化を用いることができる。
担体フォイル２は、レーザー照射に対して透過性の栄
養物又は例えばPBS緩衝溶液のような緩衝溶液によりコ
ートすることもできる。
養物又は例えばPBS緩衝溶液のような緩衝溶液によりコ
ートすることもできる。
本発明のプロセスの更なる成果によれば、本発明の目
的は、レーザービームの放射圧力を用いることにより、
固定された平坦な担体（対象担体はペトリ皿）の上表面
から直接に所望の小片又は生物学的対象それ自体を射出
し、好適な容器内にそれを捕獲することができる。すな
わち、対象を包囲する担体フォイルの領域の切り出し又
は解放を同時に伴って、又は伴わず、生物学的対象を分
離することができる。これは、更なる成果によれば、添
付の図５ないし図７を参照して次に説明するようにして
起こる。
的は、レーザービームの放射圧力を用いることにより、
固定された平坦な担体（対象担体はペトリ皿）の上表面
から直接に所望の小片又は生物学的対象それ自体を射出
し、好適な容器内にそれを捕獲することができる。すな
わち、対象を包囲する担体フォイルの領域の切り出し又
は解放を同時に伴って、又は伴わず、生物学的対象を分
離することができる。これは、更なる成果によれば、添
付の図５ないし図７を参照して次に説明するようにして
起こる。
図５に示す直立顕微鏡14を用いる場合、好適な対象担
体２（厚さ約170マイクロメートル）を、レーザー微細
操作のために特別に設計された顕微鏡台３の支持体15上
に逆に、すなわち、生物学的対象10を対象担体２の下側
に配置する。対象は、例えば、わずか数マイクロメート
ル厚さの組織学的組織切片又は癒着性染色体もしくはDN
A調整物であり得る。
体２（厚さ約170マイクロメートル）を、レーザー微細
操作のために特別に設計された顕微鏡台３の支持体15上
に逆に、すなわち、生物学的対象10を対象担体２の下側
に配置する。対象は、例えば、わずか数マイクロメート
ル厚さの組織学的組織切片又は癒着性染色体もしくはDN
A調整物であり得る。
顕微鏡台３は、二軸（X/Y動作のために）又は三軸（X
/Y/Z動作のために）内の移動ができるようになってお
り、例えば、対象担体２又はペトリ皿のための支持体15
を備えている。つまり、台３は、例えば、コンピュータ
マウス（又ジョイスティック）のような、既知の方法で
コンピューター制御下に動作され得る好適な駆動手段に
より動力化されている。軸駆動装置のハイブリッドステ
ッピングモーターは、高精度に作動する。最も小さなス
テップは、20nmであり、顕微鏡台３の最大移動距離は、
数cm、例えば10cmに至るまでにすることができる。保存
した点を再発見し得る精度は、400nm未満である。顕微
鏡台の動作速度は、１秒当たり２、３（a few）nmから
数mmまで選択することができる。わわゆる「フレームグ
ラバー（framergrabber）」により、ビデオカメラによ
り撮影された現実の顕微鏡写真がモニター上に表され、
例えば、コマンド機能、制御機能、試験点などのような
コンピュータ機能によりグラフィックにオーバーレイさ
れ得る（ビデオ−オーバーレイ）。
/Y/Z動作のために）内の移動ができるようになってお
り、例えば、対象担体２又はペトリ皿のための支持体15
を備えている。つまり、台３は、例えば、コンピュータ
マウス（又ジョイスティック）のような、既知の方法で
コンピューター制御下に動作され得る好適な駆動手段に
より動力化されている。軸駆動装置のハイブリッドステ
ッピングモーターは、高精度に作動する。最も小さなス
テップは、20nmであり、顕微鏡台３の最大移動距離は、
数cm、例えば10cmに至るまでにすることができる。保存
した点を再発見し得る精度は、400nm未満である。顕微
鏡台の動作速度は、１秒当たり２、３（a few）nmから
数mmまで選択することができる。わわゆる「フレームグ
ラバー（framergrabber）」により、ビデオカメラによ
り撮影された現実の顕微鏡写真がモニター上に表され、
例えば、コマンド機能、制御機能、試験点などのような
コンピュータ機能によりグラフィックにオーバーレイさ
れ得る（ビデオ−オーバーレイ）。
レーザーマイクロマニピュレーションのためには、薄
い対象担体（約170マイクロメートル厚）又は薄い（約2
5マイクロメートル）ガス透過性フォイル（いわゆる
「ペトリ−パーマ（petri−perm）」皿）を有するペト
リ皿が好適である。ナノメートル領域におけるレーザー
マイクロマニピュレーションは、試料の正確な保持及び
移動への要求が非常に高いので、支持体15は、特別に成
形されている。例えば、オイル滲出対象が用いられた場
合、薄い対象担体２にはわずかに曲がる危険があり、そ
れにより、良好な焦点を得ることができない。これを防
止するために、対象担体２は、支持体の少なくとも３つ
の側により支持されなければならない。対象担体２の各
々の２つの狭い側は、バネクリップによりきつく保持さ
れ得る。レーザー顕微鏡試験に特有の更に必要なこと
は、試料支持体（対象担体２又は試料支持体15）を正確
に調整することである。試料は、担体の全移動範囲にわ
たり、常に対物レンズ９の先頭から同じ距離（約５〜10
cm）にあるように設けられなければならない。
い対象担体（約170マイクロメートル厚）又は薄い（約2
5マイクロメートル）ガス透過性フォイル（いわゆる
「ペトリ−パーマ（petri−perm）」皿）を有するペト
リ皿が好適である。ナノメートル領域におけるレーザー
マイクロマニピュレーションは、試料の正確な保持及び
移動への要求が非常に高いので、支持体15は、特別に成
形されている。例えば、オイル滲出対象が用いられた場
合、薄い対象担体２にはわずかに曲がる危険があり、そ
れにより、良好な焦点を得ることができない。これを防
止するために、対象担体２は、支持体の少なくとも３つ
の側により支持されなければならない。対象担体２の各
々の２つの狭い側は、バネクリップによりきつく保持さ
れ得る。レーザー顕微鏡試験に特有の更に必要なこと
は、試料支持体（対象担体２又は試料支持体15）を正確
に調整することである。試料は、担体の全移動範囲にわ
たり、常に対物レンズ９の先頭から同じ距離（約５〜10
cm）にあるように設けられなければならない。
第一に好適な生物学的対象10は、低い倍率で視覚的に
選択される。全ての興味ある対象がコンピュータに保存
されるや否や、より高い倍率の対物レンズが選択され
る。対物レンズの変更によるビームの移動（色彩収差）
は、自動的に全ての保存された点に適用される保存値に
作用する補正機能により相殺される。
選択される。全ての興味ある対象がコンピュータに保存
されるや否や、より高い倍率の対物レンズが選択され
る。対物レンズの変更によるビームの移動（色彩収差）
は、自動的に全ての保存された点に適用される保存値に
作用する補正機能により相殺される。
次いで、コンピュータは第１の対象10へ、ドライブす
る。ビデオカメラにより観察される顕微鏡イメージがコ
ンピュータモニター上に表示されるが、図示していな
い。モニター上の標識がレーザービームの焦点の位置を
示す。顕微鏡スライドは、手（マウス又はジョイスティ
ックにより制御される）により移動されるか又は選択さ
れた対象10の周りに円形もしくはらせん形の予め定めら
れたパターンに従いコンピュータプログラムの制御下に
自動的に動かされる。モニター上の標識は、所望の生物
学的対象のアウトラインを画くポインターとしてみるこ
とができる。もし、15ないし20Hz付近のパルス周波数を
有するレーザーが同時に閃光されたならば、「標識」の
領域内の閃光線内にある全ての物質は、除去されるか又
は破壊される。極度に集束されたレーザービームは、所
望の対象10の周りを約500nm巾の微細線を「画き」、そ
の周囲にあるものからそれを分離する。組織切片の形態
にある細胞の場合、所望の細胞は、この手順によりプラ
ーク／塊から解放され、切線により与えられる対象区域
の形状にある基体から遊離される。上述した選択標的細
胞の周りのらせん形移動により、解放された細胞の周り
の領域は、拡大し得る。
る。ビデオカメラにより観察される顕微鏡イメージがコ
ンピュータモニター上に表示されるが、図示していな
い。モニター上の標識がレーザービームの焦点の位置を
示す。顕微鏡スライドは、手（マウス又はジョイスティ
ックにより制御される）により移動されるか又は選択さ
れた対象10の周りに円形もしくはらせん形の予め定めら
れたパターンに従いコンピュータプログラムの制御下に
自動的に動かされる。モニター上の標識は、所望の生物
学的対象のアウトラインを画くポインターとしてみるこ
とができる。もし、15ないし20Hz付近のパルス周波数を
有するレーザーが同時に閃光されたならば、「標識」の
領域内の閃光線内にある全ての物質は、除去されるか又
は破壊される。極度に集束されたレーザービームは、所
望の対象10の周りを約500nm巾の微細線を「画き」、そ
の周囲にあるものからそれを分離する。組織切片の形態
にある細胞の場合、所望の細胞は、この手順によりプラ
ーク／塊から解放され、切線により与えられる対象区域
の形状にある基体から遊離される。上述した選択標的細
胞の周りのらせん形移動により、解放された細胞の周り
の領域は、拡大し得る。
説明した手順において用いられるレーザーは、例え
ば、高品質ビームを有するパルスコンパクト窒素レーザ
ー（波長:337nm、パルス長3n秒、パルス周波数:10ない
し30Hz）である。用いられるレーザー光の波長が生物学
的材料に悪影響を及ぼさない限り、他のレーザーも考慮
し得る。レーザービームそれ自体、すなわちその源は、
好ましくは静止している。しかしながら、レーザーは、
対象平面に対して数マイクロメートルの半径内にX/Y方
向に動かし得る。すなわち、結局、レーザービーム及び
対象の平面（顕微鏡台）が互いに対して移動し得ること
のみが重要である。
ば、高品質ビームを有するパルスコンパクト窒素レーザ
ー（波長:337nm、パルス長3n秒、パルス周波数:10ない
し30Hz）である。用いられるレーザー光の波長が生物学
的材料に悪影響を及ぼさない限り、他のレーザーも考慮
し得る。レーザービームそれ自体、すなわちその源は、
好ましくは静止している。しかしながら、レーザーは、
対象平面に対して数マイクロメートルの半径内にX/Y方
向に動かし得る。すなわち、結局、レーザービーム及び
対象の平面（顕微鏡台）が互いに対して移動し得ること
のみが重要である。
次いで、このようにして分離された対象は、技術の現
状（例えば、針を用いる）よりも速くかつ安全に、自動
的にかつ最も重要なことには、いずれもの接触をも伴わ
ずに、すなわち、もし必要であれば完全に滅菌状態で、
更なる標的レーザーショットにより試験容器内に射出さ
れる（軌道17）。
状（例えば、針を用いる）よりも速くかつ安全に、自動
的にかつ最も重要なことには、いずれもの接触をも伴わ
ずに、すなわち、もし必要であれば完全に滅菌状態で、
更なる標的レーザーショットにより試験容器内に射出さ
れる（軌道17）。
この目的のために、第２の試料支持体16を第１の支持
体15の下で動かす。第２の試料支持体16は、（例えば、
回収溶液18又はマイクロタイタープレートを保持するた
めのものであり）、２つの動力化されかつコンピュータ
制御された軸により駆動され、レーザーにより分離され
た対象10が、回収容器18の上に正確に配置されるように
動かされる。従って、所望の対象を清潔に回収するため
に必要な条件であるモーター動作は、高い精度を有す
る。単一の照準を定めた（焦点をぼかすこともできる）
レーザーショットが、選択された生物学的対象10及び／
又は細胞をビームの方向（軌道17）に射出する。その
後、新たな対象を切り出すことができ、全てのプロセス
が繰り返される。
体15の下で動かす。第２の試料支持体16は、（例えば、
回収溶液18又はマイクロタイタープレートを保持するた
めのものであり）、２つの動力化されかつコンピュータ
制御された軸により駆動され、レーザーにより分離され
た対象10が、回収容器18の上に正確に配置されるように
動かされる。従って、所望の対象を清潔に回収するため
に必要な条件であるモーター動作は、高い精度を有す
る。単一の照準を定めた（焦点をぼかすこともできる）
レーザーショットが、選択された生物学的対象10及び／
又は細胞をビームの方向（軌道17）に射出する。その
後、新たな対象を切り出すことができ、全てのプロセス
が繰り返される。
回収手順を促進するために、所望の対象全ては、まず
レーザーにより解放され得る。その後、回収容器が顕微
鏡台の下の位置に動かされる。次いで、保存されたレー
ザー微少切片対象の各々を再訪問するために顕微鏡スラ
イドを移動させる。次いで、対象の次の一つを、レーザ
ーの各ショットにより、図５に示す新鮮な（新しい）受
容容器18内に射出する。受容容器18は、顕微鏡スライド
３の動きと同調している。
レーザーにより解放され得る。その後、回収容器が顕微
鏡台の下の位置に動かされる。次いで、保存されたレー
ザー微少切片対象の各々を再訪問するために顕微鏡スラ
イドを移動させる。次いで、対象の次の一つを、レーザ
ーの各ショットにより、図５に示す新鮮な（新しい）受
容容器18内に射出する。受容容器18は、顕微鏡スライド
３の動きと同調している。
倒立顕微鏡（図６）とともに、粘着性プレート接着フ
ォイル、寒天塗布された担体などを用いることができ
る。この顕微鏡は、切り出された対象の真上２、３マイ
クロメートルのみ移動することができ、射出された対象
を捕獲する。これは、例えば、粘着エレメントであり
得、次いで、これは、ロボットアーム20により、図７に
示す好適な容器内に投げられる。次いで、ロボットアー
ム20は、新しい粘着エレメントを取り上げる（図６参
照）。
ォイル、寒天塗布された担体などを用いることができ
る。この顕微鏡は、切り出された対象の真上２、３マイ
クロメートルのみ移動することができ、射出された対象
を捕獲する。これは、例えば、粘着エレメントであり
得、次いで、これは、ロボットアーム20により、図７に
示す好適な容器内に投げられる。次いで、ロボットアー
ム20は、新しい粘着エレメントを取り上げる（図６参
照）。
本発明の細胞のレーザー誘導分離プロセスの利点は、
従来技術に比べて、単一細胞を選択的かつ同時に迅速に
操作することである。単純な原理故に、手順は非常に強
く、使用しやすく、従って、多数の生物学的対象をコン
ピュータにより自動化して分離するために好適である。
安全面を考慮すると、分離プロセスを密封閉鎖システム
内で行い得るので、病原細胞から環境を保護することが
できることが重要な利点である。細胞を環境中の汚染物
質から保護することもできる。
従来技術に比べて、単一細胞を選択的かつ同時に迅速に
操作することである。単純な原理故に、手順は非常に強
く、使用しやすく、従って、多数の生物学的対象をコン
ピュータにより自動化して分離するために好適である。
安全面を考慮すると、分離プロセスを密封閉鎖システム
内で行い得るので、病原細胞から環境を保護することが
できることが重要な利点である。細胞を環境中の汚染物
質から保護することもできる。
本発明のプロセスは、特定の細胞タイプを精製しなけ
ればならないバイオテクノロジー、分子生物学及び病理
学の副分野において主に適している。例えば、移入細胞
をレポーテルゲン（reportergen）として緑蛍光淡白（G
FP）により同定することができる。例えば、Marshallら
（Neuron,Vol.14,211−215（1995））は、イオンチャン
ネルの発現を評価するためにGFP法を用いている。更な
る応用に従えば、例えば、グレア細胞を脳組織試料から
分離し、神経実験に供することができる。このために、
細胞を確認するために蛍光標識された抗体が用いられて
いる。診断のために、例えば、形態学的変化を示す組織
試料からガン細胞を分離することができる。この場合、
組織スライスを容器フォイル上に配置する。次いで、分
離すべき細胞を組織から切り、基体材料を伴い得る細胞
を支持体へ移動するようにフォイル基体を分離する。次
いで、細胞を形態学的に分析する。更に、例えば、クエ
ン酸を産生し得るような特定の特徴を有するバクテリア
の有効性を、好適なインディケータの好適なpH感受性発
色リングにより試験し、次いで分別することができる。
ればならないバイオテクノロジー、分子生物学及び病理
学の副分野において主に適している。例えば、移入細胞
をレポーテルゲン（reportergen）として緑蛍光淡白（G
FP）により同定することができる。例えば、Marshallら
（Neuron,Vol.14,211−215（1995））は、イオンチャン
ネルの発現を評価するためにGFP法を用いている。更な
る応用に従えば、例えば、グレア細胞を脳組織試料から
分離し、神経実験に供することができる。このために、
細胞を確認するために蛍光標識された抗体が用いられて
いる。診断のために、例えば、形態学的変化を示す組織
試料からガン細胞を分離することができる。この場合、
組織スライスを容器フォイル上に配置する。次いで、分
離すべき細胞を組織から切り、基体材料を伴い得る細胞
を支持体へ移動するようにフォイル基体を分離する。次
いで、細胞を形態学的に分析する。更に、例えば、クエ
ン酸を産生し得るような特定の特徴を有するバクテリア
の有効性を、好適なインディケータの好適なpH感受性発
色リングにより試験し、次いで分別することができる。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 シュッツェ、ライムント ドイツ連邦共和国、デー―82515 ヴォ ルフラッツハウゼン、ズデーテンシュト ラーセ 22 (56)参考文献 特開 平３−180170（ＪＰ，Ａ) 特開 平５−264460（ＪＰ，Ａ) 特開 平４−299976（ＪＰ，Ａ) 特開 平２−76574（ＪＰ，Ａ) 特公 平７−28714（ＪＰ，Ｂ２) 特表 平11−507437（ＪＰ，Ａ) 特表2000−500325（ＪＰ，Ａ) 国際公開95／17656（ＷＯ，Ａ１) 国際公開94／16543（ＷＯ，Ａ１) 国際公開95／23960（ＷＯ，Ａ１) Ｇ．Ｉｓｅｎｂｅｒｇ，Ｗ．Ｂｉｅｌ ｓｅｒ，Ｗ．Ｍｅｉｅｒ−Ｒｕｇｅ ａ ｎｄ Ｅ．Ｒｅｍｙ，”Ｃｅｌｌ ｓｕ ｒｇｅｒｙ ｂｙ ｌａｓｅｒ ｍｉｃ ｒｏ−ｄｉｓｓｅｃｔｉｏｎ：ａ ｐｒ ｅｐａｒａｔｉｖｅ ｍｅｔｈｏｄ”, Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｓｃ ｏｐｙ，英国，Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ Ｓ ｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｕｂｌｉｃａｔ ｉｏｎｓ，第107巻Ｐｔ．１，ｐ．19− 24 Ｔ．Ｓｕｇｉｕｒａ ａｎｄ Ｓ Ｋ ａｗａｔａ，”Ｐｈｏｔｏｎ−ｐｒｅｓ ｓｕｒｅ ｅｘｅｒｔｉｏｎ ｏｎ ｔ ｈｉｎ ｆｉｌｍ ａｎｄ ｓｍａｌｌ ｐａｒｔｉｃｌｅｓ ｉｎ ｔｈｅ ｅｖａｎｅｓｃｅｎｔ ｆｉｅｌｄ”, Ｂｉｏｉｍａｇｉｎｇ，英国，ＩＯＰ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｌｔｄ，第１ 巻，ｐ．１−５ Ｋａｎｎ Ｓｃｈｕｔｚｅ ａｎｄ Ａｎｎｅｔｔｅ Ｃｌｅｍｅｎｔ−Ｓｅ ｎｇｅｗａｌｄ，”Ｃａｔｃｈ ａｎｄ ｍｏｖｅ−ｃｕｔ ｏｒ ｆｕｓ ｅ”，Ｎａｔｕｒｅ，英国，1994年４月 14日，第368巻，ｐ．667−669 (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) G01N 1/00 - 1/44 G01N 33/543 C12M 1/00 - 1/42 C12N 13/00 B01J 19/12 ＪＩＣＳＴファイル（ＪＯＩＳ)
Claims (16)
- 【請求項１】平坦な担体（２）上にある生物学的対象を
分別及び回収するための方法であって、選択された生物
学的対象が他の生物学的対象と一緒に前記担体（２）上
に存在する方法において、 選択された生物学的対象（10）を、周囲にある他の生物
学的対象からレーザービーム（６）により分離し、レー
ザーショットにより、前記担体（２）から回収装置
（５、18、19）へ射出することを特徴とする方法。 - 【請求項２】前記選択された生物学的対象（10）を有す
る担体フォイル（２）の対象区域（12）を前記レーザー
ビーム（６）により切り出し、及び前記レーザーショッ
トにより、前記担体フォイル（２）の直上又は直下にあ
る前記回収装置（５、18、19）へ移動することを特徴と
する請求の範囲第１項の方法。 - 【請求項３】前記レーザービーム（６）が、前記生物学
的対象（10）の周囲を閉じた曲線状に誘導されるもので
あって、前記閉じた曲線が、前記対象区域（12）を包囲
することを特徴とする請求の範囲第２項の方法。 - 【請求項４】前記対象区域（12）を含むカット領域が、
前記レーザービーム（６）を照射され、及び前記担体フ
ォイル（２）上に投影されるスリットマスクを通して同
時にさらされることを特徴とする請求の範囲第２項の方
法。 - 【請求項５】前記生物学的対象（10）を有する前記対象
区域（12）が、それが切り出された後に、前記回収装置
（５、18、19）へ0.5ないし10mm、好ましくは、１ない
し3mmの距離を移動することを特徴とする請求の範囲第
２項ないし第４項のいずれか１項の方法。 - 【請求項６】少なくとも５マイクロメートルの直径に前
記対象区域（12）を切り出すことを特徴とする請求の範
囲第２項ないし第５項のいずれか１項の方法。 - 【請求項７】前記対象区域（12）を切り出すために、UV
レーザー（７）を用いることを特徴とする特許請求の範
囲第２項ないし第６項のいずれか１項の方法。 - 【請求項８】前記生物学的対象（10）のための前記担体
フォイル（２）として、厚さ５マイクロメートルないし
15マイクロメートルを有するUV光吸収ポリマーフィルム
を用いることを特徴とする請求の範囲第２項ないし第７
項のいずれか１項の方法。 - 【請求項９】前記ポリマーが、少なくとも５重量％の芳
香族又は部分的芳香族重縮合物を含有することを特徴と
する請求の範囲第８項の方法。 - 【請求項１０】前記回収装置として、接着性上表面を有
するフォイルを用いることを特徴とする請求の範囲第１
項ないし第９項のいずれか１項の方法。 - 【請求項１１】前記回収装置として、90ないし500ウエ
ルを有するマイクロタイタープレートを用いることを特
徴とする請求の範囲第１項ないし第９項のいずれか１項
の方法。 - 【請求項１２】前記生物学的対象（10）を蛍光分光法に
より認識し、次いで選択することを特徴とする請求の範
囲第１項ないし第11項のいずれか１項の方法。 - 【請求項１３】前記生物学的対象（10）が切片組織であ
り、これらを組織化学発色反又は形態的可視変化により
認識し、次いで選択することを特徴とする請求の範囲第
１項ないし第11項のいずれか１項の方法。 - 【請求項１４】前記生物学的対象を有する前記担体
（２）が、前記レーザービーム（６）に対して透過性の
流体栄養物又は緩衝媒体を塗布されている担体フォイル
であることを特徴とする請求の範囲第１項ないし第13項
のいずれか１項の方法。 - 【請求項１５】前記担体（２）が、前記生物学的対象
（10）を有する担体フォイルであり、前記担体フォイル
と前記回収装置（５、18、19）が、前記レーザービーム
（６）のためのUV透過性窓を有する閉鎖容器内に収容さ
れていることを特徴とする請求の範囲第１項ないし第14
項のいずれか１項の方法。 - 【請求項１６】担体（２）上の生物学的対象（10）を観
察するための顕微鏡配置（14）と、 前記担体（２）上の選択された生物学的対象（10）を他
の生物学的対象から選別するための集束レーザービーム
（６）を発生し、前記選択された生物学的対象（10）を
レーザーショットにより前記担体（２）から射出するた
めのレーザー装置と、 前記担体（２）の後方であって、前記レーザービーム
（６）の方向に位置する、前記担体（２）から射出され
た前記選択された生物学的対象（10）を回収するための
回収装置と を具備することを特徴とする請求の範囲第１項ないし第
15項のいずれか１項の方法を実施するための装置。
Applications Claiming Priority (5)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE19603996A DE19603996C2 (de) | 1996-02-05 | 1996-02-05 | Sortierverfahren für planar ausgebrachte biologische Objekte mit Laserstrahlen |
| DE19603996.7 | 1996-02-05 | ||
| DE1996116216 DE19616216A1 (de) | 1996-04-23 | 1996-04-23 | Verfahren und Vorrichtung zur Gewinnung von laserdissektierten Partikeln wie biologische Zellen bzw. Zellorganellen, Chromosomenteilchen etc. |
| DE19616216.5 | 1996-04-23 | ||
| PCT/EP1997/000429 WO1997029355A1 (de) | 1996-02-05 | 1997-01-31 | Verfahren und vorrichtung zur berührungslosen mikroinjektion sowie zum sortieren und zur gewinnung von planar ausgebrachten biologischen objekten mit laserstrahlen |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2000504824A JP2000504824A (ja) | 2000-04-18 |
| JP3311757B2 true JP3311757B2 (ja) | 2002-08-05 |
Family
ID=26022617
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP52811497A Expired - Lifetime JP3311757B2 (ja) | 1996-02-05 | 1997-01-31 | レーザー照射を用いる平坦に配置される生物学的対象への非接触顕微注射、分別及び採取方法並びに装置 |
Country Status (8)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5998129A (ja) |
| EP (1) | EP0879408B1 (ja) |
| JP (1) | JP3311757B2 (ja) |
| AT (1) | ATE196360T1 (ja) |
| CA (1) | CA2245553C (ja) |
| DE (2) | DE59702347D1 (ja) |
| ES (1) | ES2150754T3 (ja) |
| WO (2) | WO1997029354A1 (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2015517669A (ja) * | 2012-05-24 | 2015-06-22 | ライカ ミクロジュステムス ツェーエムエス ゲーエムベーハー | レーザ微小切断部位を回収するための試料回収器 |
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|---|---|---|---|---|
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| US6495195B2 (en) | 1997-02-14 | 2002-12-17 | Arcturus Engineering, Inc. | Broadband absorbing film for laser capture microdissection |
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| US6149867A (en) | 1997-12-31 | 2000-11-21 | Xy, Inc. | Sheath fluids and collection systems for sex-specific cytometer sorting of sperm |
| JP3465613B2 (ja) * | 1999-01-13 | 2003-11-10 | 松下電器産業株式会社 | 微細物体の操作装置 |
| JP3582390B2 (ja) * | 1999-01-13 | 2004-10-27 | 松下電器産業株式会社 | 微細物体の自動探索装置 |
| AU762242B2 (en) * | 1999-03-16 | 2003-06-19 | Proteome Systems Ltd | Method and apparatus for manipulating arrays |
| AUPP924099A0 (en) * | 1999-03-16 | 1999-04-15 | Proteome Systems Ltd | Method and apparatus for manipulating arrays |
| DE19921236C2 (de) * | 1999-05-07 | 2003-10-30 | Evotec Ag | Verfahren und Vorrichtung zur Probenaufnahme an Kryosubstraten |
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