JP5334006B2 - プロテインチップ - Google Patents

Description

本発明は、プローブ生体分子と生体由来のターゲット分子との相互作用を観察することによりターゲット分子の同定や解析等を行う技術に関し、特に、タンパク質をプローブとして少なくとも一部に保持したプロテインチップとそれを製造するための技術に関する。

ヒト・ゲノムシーケンスの解読が終了し、加えてＤＮＡチップ技術（マイクロアレイ法）が普及したことに伴い、ゲノムＤＮＡの発現解析が急速に推し進められ、大量のゲノム情報が蓄積されつつある。

しかし、生体内において、細胞の機能はタンパク質が他のタンパク質や低分子、ＤＮＡなどと相互作用したり、リン酸化などの翻訳後修飾を受けたりすることにより調節・維持されているので、直接的に細胞機能にかかわるタンパク質を解析することが必須である。

４種類の塩基から構成されるＤＮＡとは異なり、タンパク質は２０種類のアミノ酸から構成され、１次構造から４次構造までの高次構造を有するため、高次構造まで含めたその存在種は膨大な数にのぼる。

また、ＤＮＡにおけるＰＣＲのようなタンパク質増幅方法がなく、発現量の少ない制御タンパク質などを高感度に検出するのは難しいため、異なる幾つかの分析手法を組み合わせて用いる必要があり、各手法にも熟練を要する操作が要求されるなど、タンパク質の研究は労力と時間を要するものである。そこで、生体内で発現しているタンパク質を短時間で同定し、または相互作用を解析するハイスループットシステムの開発が切望されている。

このような背景のもと、網羅的解析が可能であるＤＮＡチップ技術の利点を、プロテオーム解析に応用することが試みられている。そのひとつとしてプロテインチップ（プロテインアレイとも呼ばれる）を用いた解析方法がある。

プロテインチップには大きく分けて２つのタイプがある。１番目のタイプは、基板表面に化学処理を施したもの、すなわち基板表面に疎水性やイオン交換性、金属イオンなどを導入して性質の異なる多数のスポットを形成し、これらのスポットへのタンパク質の物理化学的親和性の違いを利用して、タンパク質の発現解析や同定、精製に用いられる、ケミカルチップと呼ばれるものである。２番目のタイプは、タンパク質や抗体、ＤＮＡなど生体分子を基板表面に固定し、タンパク質の生化学的親和性を利用して、相互作用するタンパク質やリガンドを探索するバイオロジカルチップがある。

プロテインチップを用いた解析では、このような化学的もしくは生化学的修飾が施された多数のスポットにタンパク質を反応させた後、親和性を示さないタンパク質やその他の夾雑物を洗浄により取り除き、ＴＯＦ−ＭＳ（Time OF Flight-mass Spectrometer、飛行時間型質量分析計）により、スポットに捕捉されたタンパク質の正確な分子量を測定することができる。

プロテインチップは、多種・大量試料のタンパク質の発現解析や相互作用解析、さらには精製や同定、機能解析などへも応用が可能であり、プロテオーム解析を加速するためのプラットホーム技術として期待されている。また、糖鎖の機能解析や細胞機能解析を目的とした、糖鎖チップや細胞チップの研究も進められており、ポストゲノム研究を支えるチップ技術として注目されている。（非特許文献１）
しかし、ＤＮＡチップ技術をプロテインチップにそのまま転用することはできない。ＤＮＡチップは乾燥した基板上にＤＮＡやＲＮＡを固定したものであるが、大多数のタンパク質は水溶液中でしか機能せず、乾燥した瞬間にその高次構造（立体構造）が損なわれてしまう。しかもタンパク質は一旦乾燥してしまったら水を与えても元に戻らない。このため、タンパク質をその本来の高次構造を保ったまま乾燥させて基板上に固定することはできない。この点がＤＮＡとは大きく異なる。

このような背景から、ペプチドやタンパク質を超分子ヒドロゲルでソフトに包み込んで活性を保ちつつ基板上に固定するセミウエットデバイス技術が開発された。この技術では、まず超分子ヒドロゲル化剤を緩衝溶液に加熱して溶かし、ガラスなどの基板上にスポットして冷やすことにより、ヒドロゲルのアレイを作る。そこにペプチドやタンパク質を打ち込んで、ペプチドやタンパク質のセミウエットアレイとする。この技術によれば、ペプチドやタンパク質が並んだアレイを簡単に作成することができる。（非特許文献２）
川合 知二監修、「ナノテクノロジー大辞典」、工業調査会、２００３年１２月２５日、ｐ８５３−８５４ 浜地 格、他２名、超分子ヒドロゲルを利用したセミウエット型ペプチド／プロテインの開発、「Ｂｉｏベンチャー］、羊土社、２００４年４月２０日、Ｖｏｌ．４Ｎｏ．３、ｐ４２−４３

非特許文献２のセミウエットデバイス技術で使用される超分子ヒドロゲル化剤は、新規に開発された人工合成剤である。

本発明が解決しようとする課題は、超分子ヒドロゲル化剤のような人工合成剤を使用することなく、ペプチドやタンパク質をその活性を保った状態で基板上に固定し得るプロテインチップ技術を提供することにある。

上記課題を解決するために、本発明は以下の手段を採用する。

本発明にかかるプロテインチップの製造方法は、バクテリアセルロース層を基板上に形成する工程と、前記バクテリアセルロース層を整然と並んだアレイ要素からなるバクテリアセルロースアレイに加工する工程と、タンパク質（プローブ生体分子）を含む水溶液を前記アレイ要素に含浸させる（滴下する、スポットする）工程と、を含む。

本発明にかかるプロテインチップの別の製造方法は、バクテリアセルロースのシートを整然と並んだアレイ要素からなるバクテリアセルロースアレイに加工する工程と、前記バクテリアセルロースアレイを基板上に固定する工程と、タンパク質（プローブ生体分子）を含む水溶液を前記アレイ要素に含浸させる工程と、を含む。

本発明にかかるプロテインチップの更に別の製造方法は、バクテリアセルロース層を基板上に形成する工程と、タンパク質（プローブ生体分子）を含む水溶液を前記バクテリアセルロース層上に整然と並べてスポットする工程と、を含む。

本発明にかかるプロテインチップは、タンパク質（プローブ生体分子）を含む水溶液を含浸したバクテリアセルロースからなるプローブセルを基板上に整然と並べて固定してなる。

本発明にかかる別のプロテインチップは、バクテリアセルロース層を基板上に形成するとともに、タンパク質（プローブ生体分子）を含む水溶液を前記バクテリアセルロース層上に整然と並べてスポットしてなる。

本発明にかかるプロテインチップ作成用プレートは、前記水溶液を含ませる前のバクテリアセルロースを基板上に固定してなる。

本発明にかかるタンパク質保持方法は、バクテリアセルロースのフィブリル間に存在する水溶液中にタンパク質を浮遊させた状態で保持するようにしたことを特徴としている。

ここで、「整然と並んだ」とは、ライン状、マトリクス状、ハニカム状といった一定の整列状態に規則正しく並んでいることを表している。バクテリアセルロース層のアレイ要素やプローブセルが一定の整列状態に規則正しく並んでいることにより、プローブセル（アレイ要素）のアドレッシングやプローブ生体分子水溶液の自動スポッティングが可能となる。

本発明で使用するバクテリアセルロースとしてはナタデココが最適である。ナタデココは、食べることができるほど無害な素材である。ナタデココは、高い形状保持性能（強いコシ）を有している。ナタデココは、薄くスライスしたり細かくカットしたりするといった加工が容易である。ナタデココは、無菌状態に保てば長期保存も可能である。ナタデココは、特別な生産設備を必要とせずに常温で簡単に培養できるので、生産コストが安い。ナタデココは、天然セルロースであるので自然環境に優しい。

バクテリアセルロースは、天然のセルロース生産菌によって生産されたセルロースである。セルロース生産菌の例として、アセトバクター アセトサム（Acetobactor acetosum）、アセトバクター キシリナム（Acetobactor xylinum）、アセトバクター パスツリアヌム（Acetobactor pasterianum）、アセトバクター ランセンス（Acetobactor rancens）等の酢酸菌、サルシナ ベントキュリ（Sarcina ventriculi）、バクテリウム キシロイデス（Bacterium xyloides）、シュードモナス（Pseudomonas）属菌、アグロバクテリウム（Agrobacterium）属菌等を挙げることができる。本発明で使用するバクテリアセルロースの生産菌としては、Acetobactor aceti var. xylinumが最も好ましい。Acetobactor aceti var. xylinumは、ナタと呼ばれる繊維質厚膜の生産菌としてフィリピン等で古くから利用されてきたバクテリアである。

バクテリアセルロースは、セルロース成分に対して数倍〜数百倍の重量の水分を保持できる。バクテリアセルロースは、三次元的に複雑に張り巡らされたフィブリルのネットを骨格として持つ。水分を含んだバクテリアセルロースは、その水分の大部分をフィブリルネットの網目内に保持する。タンパク質を含む水溶液をバクテリアセルロースに含浸させると、その水溶液の大部分はフィブリルネットの網目内に保持される。水溶液内のタンパク質は、フィブリルネットの網目内を充たす水溶液中に浮遊しているため、そのタンパク質本来の高次構造を保つ。

したがって、本発明の製造方法によれば、バクテリアセルロース層を基板上に形成し、そのバクテリアセルロース層を整然と並んだアレイ要素からなるバクテリアセルロースアレイに加工し、タンパク質を含む水溶液を各アレイ要素に滴下することにより、タンパク質をその活性を保ちつつ基板上に整然と並べて固定することができる。

また、本発明の別の製造方法によれば、バクテリアセルロース層を基板上に形成し、タンパク質を含む水溶液を前記バクテリアセルロース層上に整然と並べてスポットすることにより、タンパク質をその活性を保ちつつ基板上に整然と並べて固定することができる。

バクテリアセルロース層を基板上に形成する方法は幾つかある。その一例として、培養槽から取り出したバクテリアセルロース（ナタ）をシート状にスライスして基板に貼り付ける方法を挙げることができる。その際、バクテリアセルロース内に存在している生産菌由来のタンパク質やＤＮＡなどは適切な処理剤を使用して除去しておくことが望ましい。バクテリアセルロース・シートは、乾燥させてからガラスなどの基板に貼り付けても、湿った状態のまま基板に貼り付けてもよい。貼り付けた基板上でバクテリアセルロース・シートを乾燥させてもよい。

バクテリアセルロースを乾燥させる場合には、セルロース内のフィブリル同士の癒着を防止することが望ましい。その方法として、バクテリアセルロースの水懸濁液を凍結乾燥や溶剤置換乾燥することによって、乾燥時にフィブリル間に水素結合に由来する結合を生じさせないようにする方法がある。さらに、バクテリアセルロースを含有する水性懸濁液に水以外の第３成分を加えた後に脱水乾燥する方法（特開平０９−１６５４０２）や、撹拌培養により製造されたバクテリアセルロースを緊張下で脱水乾燥し、得られたバクテリアセルロースを離解処理する方法（ＷＯ９７／４８７３０）などもある。

バクテリアセルロース層を基板上に形成する別の方法として、バクテリアセルロースを基板上で直接培養する方法がある。基板にセルロース材料等の生体高分子を用い、その基板表面にセルロース生産菌に対して親和性を持つ物質からなるレールを形成しておけば、セルロース生産菌が当該レールに沿って走行しつつフィブリルを産生するため、配向性の高いセルロース膜を形成することができる。また、基板表面に多数のピット（小さな窪み）を整然と並べて形成しておき、各ピット内でバクテリアセルロースを直接培養してもよい。

バクテリアセルロース層を整然と並んだアレイ要素からなるバクテリアセルロースアレイに加工する方法は幾つかある。たとえば、基板に貼り付けたシート状のバクテリアセルロースをレーザビーム等を使用してアレイ要素に切断・分割する方法を挙げることができる。基板に貼り付けたバクテリアセルロースをレーザビームで切断することにより、微細且つ精密に加工することができる。また、シート状のバクテリアセルロースを基板とは別の場所でアレイ要素に分割してから基板に貼り付けてもよい。

本発明の製造方法によれば、超分子ヒドロゲル化剤のような人工合成剤を使用することなく、タンパク質をその活性を保った状態で基板上に固定したプロテインチップを製造することができる。

本発明のプロテインチップによれば、タンパク質をその活性を保った状態で基板上に保持しているので、基板上のタンパク質と生体由来の分子との相互作用解析やスクリーニング等を正確に且つ効率良く実施することができる。

本発明のプロテインチップ作成用プレートによれば、本発明のプロテインチップを容易に製造することができる。

本発明のタンパク質保持方法によれば、バクテリアセルロースのフィブリル間に存在する水溶液中にタンパク質を浮遊させた状態で保持するようにしたので、タンパク質をその高次構造を壊すことなく活性を保った状態で基板上に保持できる。

本発明を実施するための最良の形態について図面を参照して説明する。複数の図において共通の構成要素もしくは実質的に同一の構成要素については同一の符号を付してその説明を適宜省略する。
［プロテインチップの製造方法］
１．１ 製造方法その１
１．１．１ 構成
図１は本発明にかかるプロテインチップの製造方法の一例を示す製造工程図である。

（１）基板洗浄工程：この工程では、ガラス基板１を洗浄して不純物を除去する。

（２）バクテリアセルロース層形成工程：この工程では、バクテリアセルロース（ＢＣ）のシート２ｓをガラス基板１の表面に貼り付けることにより、バクテリアセルロースのシート２ｓからなるバクテリアセルロース層２をガラス基板１上に形成する。

シート２ｓは、培養槽から取り出したバクテリアセルロース（ナタ）をシート状にスライスした物である。培養中にバクテリアセルロース内に存在していた生産菌の死骸や生産菌由来のタンパク質、ＤＮＡ等は、バクテリアセルロースを清浄な水流中に置くことにより除去してある。水流だけては生産菌の死骸等を除去できない場合は、バクテリアセルロースを適切な処理剤の溶液中に漬け込んだ後、水洗する方法が採られる。また、処理剤としては、タンパク質分解酵素、ＤＮＡ分解酵素、希酸、アルカリ、次亜塩酸ソーダ、過酸化水素、界面活性剤（ラウリル硫酸ソーダ、デオキシコール酸、等）を挙げることができる。また、常温から２００℃の範囲の加熱洗浄も有効である。

（３）バクテリアセルロースアレイ形成工程：この工程では、バクテリアセルロース層２を、レーザビーム４で細かく縦横に切断することにより、マトリクス状に並んだアレイ要素３ａからなるバクテリアセルロースアレイ３に加工する。レーザビーム４の照射ポイントを正確にコントロールできる自動微細加工装置（図示省略）を使用することにより、バクテリアセルロース層２をバクテリアセルロースアレイ３に精密に加工することができる。

（４）クリーニング工程：この工程では、レーザビーム照射によって発生した塵（レーザビーム照射による燃え滓、灰などの粒）を水洗、送風、加振など何らかの方法により除去する。この工程をバクテリアセルロースアレイ形成工程と並行して実施してもよい。生産菌の死骸等の除去をこの工程で実施してもよい。

（５）湿度調節工程：この工程では、バクテリアセルロースアレイ３の湿度（湿潤度、水分量）調節を行う。ここで、湿度調節の態様には、水分除去すなわち乾燥と水分添加とがある。乾燥とは、ほとんど水分を含まない程に乾いた状態だけでなく、生乾きの状態（若干水分が残っている状態）や、水の中から取り出した直後よりも水分含有率が減少した程度の状態をも含む広い概念である。乾燥物に含まれる固形分（主にフィブリル）の重量に対して、水分量が約２５％以下であれば、ほとんど乾いた状態といえる。

バクテリアセルロースアレイ３を乾燥させる場合には、各アレイ要素３ａを構成するセルロース内のフィブリル同士の癒着を防止する対策が講じられる。その方法として、バクテリアセルロースの水懸濁液を凍結乾燥や溶剤置換乾燥することによって、乾燥時にフィブリル間に水素結合に由来する結合を生じさせないようにする方法がある。さらに、バクテリアセルロースを含有する水性懸濁液に水以外の第３成分を加えた後に脱水乾燥する方法（特開平０９−１６５４０２）や、撹拌培養により製造されたバクテリアセルロースを緊張下で脱水乾燥し、得られたバクテリアセルロースを離解処理する方法（ＷＯ９７／４８７３０）などもある。

（６）プローブ生体分子固定工程：この工程では、タンパク質（レセプタ、ホルモン、酵素、抗体、等）を含む水溶液６を湿度調整したバクテリアセルロースアレイ３の各アレイ要素３ａに滴下する。その際、互いに異なるタンパク質を含む複数種類の水溶液６を予め用意しておき、各アレイ要素３ａに各々異なるタンパク質を含む水溶液６を滴下する。各アレイ要素３ａに滴下された水溶液６は、そのアレイ要素３ａを構成するバクテリアセルロースにしみ込む。その結果、滴下された各水溶液６中のタンパク質が各々のアレイ要素３ａ内に保持された状態でガラス基板１上に固定される。

この工程において、各水溶液６の滴下ポイントおよび滴下量を正確にコントロール可能な自動滴下装置を使用することにより、各水溶液６をバクテリアセルロースアレイ３の各アレイ要素３ａに正確に滴下することができる。また、各アレイ要素３ａ内に保持させるタンパク質の量は、各水溶液６中のタンパク質濃度および各アレイ要素３ａへの水溶液滴下量をコントロール沸騰することにより自在に調節できる。自動滴下装置（スポッタ）として、スポット型ＤＮＡチップを製造する際に用いられる公知のアレイヤ（特表平１０−５０３８４１、特表２００２−５０７３８６、特表２００３−５１５１１３、特表２００４−５１２５１４、特開２００３−１５６４９２、特開２００３−３４４０１４、特開２００４−０４５２４１、等参照）を利用することが可能である。バクテリアセルロースアレイ３を損傷しないようにするためには、非接触式スポッタを使用することが望ましい。ピンタイプのスポッタを使用する場合には、Spot-Pin-Over Travel値を最適化する必要がある。

（７）後処理工程：以上の一連の工程により、タンパク質を含む水溶液６を含浸したバクテリアセルロース（アレイ要素３ａ）からなる多数のプローブセル３ｐをガラス基板１上にマトリクス状に配置して固定してなるプロテインチップ７が製造される（図５参照）。製造されたプロテインチップ７は、必要に応じて、合成樹脂製パッケージ（ケーシング）などに収められる。
１．１．２ 作用・効果
バクテリアセルロースは、セルロース成分に対して数倍〜数百倍の重量の水分を保持できる。バクテリアセルロースは、三次元的に複雑に張り巡らされたフィブリル２ｆのネット（フィブリルネット）を骨格として持つ（図２（ａ）参照）。水分を含んだバクテリアセルロースは、その水分の大部分をフィブリルネットの網目内に保持する。タンパク質５を含む水溶液６をバクテリアセルロースに含浸させると、その水溶液６の大部分はフィブリルネットの網目内に保持される（図２（ｂ））。水溶液６内のタンパク質５は、フィブリルネットの網目内を充たす水溶液６中に浮遊しているため、その生体分子本来の立体構造を保つことができる。

したがって、バクテリアセルロース層２をガラス基板１上に形成し、そのバクテリアセルロース層２をマトリクス状に配置されたアレイ要素３ａからなるバクテリアセルロースアレイ３に加工し、タンパク質５を含む水溶液６を各アレイ要素３ａに滴下することにより、タンパク質５をその活性を保ちつつガラス基板１上にマトリクス状に配置して固定することができる。

このようにして製造されたプロテインチップ７を使用することにより、ガラス基板１上のタンパク質５と結合するタンパク質やその他の分子を効率良くスクリーニングすることができる。

上記の例では、マトリクス状に配置されたアレイ要素３ａからなるバクテリアセルロースアレイ３を備えたプロテインチップについて説明したが、ライン状、ハニカム状といったその他の整列状態となるようにアレイ要素３ａを配置することも可能である（図６参照）。
１．２ 製造方法その２
１．２．１ 構成
図３は本発明にかかるプロテインチップの製造方法の別の例を示す製造工程図である。

（１）基板洗浄工程：この工程では、ガラス基板１を洗浄して不純物を除去する。

（２）バクテリアセルロースアレイ形成工程：この工程では、バクテリアセルロース（ＢＣ）のシート２ｓ（図１参照）を、レーザビーム４等を使用して細かく縦横に切断することにより、マトリクス状に並んだアレイ要素３ａからなるバクテリアセルロースアレイ３に加工する。

（３）バクテリアセルロースアレイ固定工程：この工程では、バクテリアセルロースアレイ３を、洗浄したガラス基板１の表面に固定する。

（４）湿度調節工程：この工程では、バクテリアセルロースアレイ３の湿度（湿潤度、水分量）調節を行う。

（５）プローブ生体分子固定工程：この工程では、タンパク質（レセプタ、ホルモン、酵素、抗体、等）を含む水溶液６を湿度調整したバクテリアセルロースアレイ３の各アレイ要素３ａに滴下する。その際、互いに異なるタンパク質を含む複数種類の水溶液６を予め用意しておき、各アレイ要素３ａに各々異なるタンパク質を含む水溶液６を滴下する。各アレイ要素３ａに滴下された水溶液６は、そのアレイ要素３ａを構成するバクテリアセルロースにしみ込む。その結果、滴下された各水溶液６中のタンパク質が各々のアレイ要素３ａ内に保持された状態でガラス基板１上に固定される。

（６）後処理工程：以上の一連の工程により、タンパク質を含む水溶液６を含浸したバクテリアセルロース（アレイ要素３ａ）からなる多数のプローブセル３ｐをガラス基板１上にマトリクス状に配置して固定してなるプロテインチップ７が製造される（図５参照）。製造されたプロテインチップ７は、必要に応じて、合成樹脂製パッケージ（ケーシング）などに収められる。
１．２．２ 作用・効果
バクテリアセルロースは、セルロース成分に対して数倍〜数百倍の重量の水分を保持できる。バクテリアセルロースは、三次元的に複雑に張り巡らされたフィブリル２ｆのネット（フィブリルネット）を骨格として持つ（図２（ａ）参照）。水分を含んだバクテリアセルロースは、その水分の大部分をフィブリルネットの網目内に保持する。タンパク質５を含む水溶液６をバクテリアセルロースに含浸させると、その水溶液６の大部分はフィブリルネットの網目内に保持される（図２（ｂ））。水溶液６内のタンパク質５は、フィブリルネットの網目内を充たす水溶液６中に浮遊しているため、その生体分子本来の立体構造を保つことができる。

したがって、バクテリアセルロースのシートをマトリクス状に配置されたアレイ要素３ａからなるバクテリアセルロースアレイ３に加工してガラス基板１上に固定し、タンパク質５を含む水溶液６を各アレイ要素３ａに滴下することにより、タンパク質５をその活性を保ちつつガラス基板１上にマトリクス状に配置して固定することができる。

このようにして製造されたプロテインチップ７を使用することにより、ガラス基板１上のタンパク質５と結合するタンパク質やその他の分子を効率良くスクリーニングすることができる。

上記の例では、マトリクス状に配置されたアレイ要素３ａからなるバクテリアセルロースアレイ３を備えたプロテインチップについて説明したが、ライン状、ハニカム状といったその他の整列状態となるようにアレイ要素３ａを配置することも可能である（図６参照）。
１．３ 製造方法その３
１．３．１ 構成
図４は本発明にかかるプロテインチップの製造方法の更に別の例を示す製造工程図である。

（１）基板洗浄工程：この工程では、ガラス基板１を洗浄して不純物を除去する。

（２）バクテリアセルロース層形成工程：この工程では、バクテリアセルロース（ＢＣ）のシート２ｓをガラス基板１の表面に貼り付けることにより、バクテリアセルロースのシート２ｓからなるバクテリアセルロース層２をガラス基板１上に形成する。

（３）湿度調節工程：この工程では、バクテリアセルロース層２の湿度（湿潤度、水分量）調節を行う。

（４）プローブ生体分子固定工程：この工程では、タンパク質を含む水溶液６を湿度調整したバクテリアセルロース層２の上にマトリクス状にスポットする。

（５）後処理工程：以上の一連の工程により、タンパク質を含む水溶液６をバクテリアセルロース層２上にマトリクス状にスポットしてなる、多数の検出スポット（プローブセル）２ｓｐを有するプロテインチップ８が製造される（図７参照）。製造されたプロテインチップ８は、必要に応じて、合成樹脂製パッケージ（ケーシング）などに収められる。
１．３．２ 作用・効果
バクテリアセルロースは、セルロース成分に対して数倍〜数百倍の重量の水分を保持できる。バクテリアセルロースは、三次元的に複雑に張り巡らされたフィブリル２ｆのネット（フィブリルネット）を骨格として持つ（図２（ａ）参照）。水分を含んだバクテリアセルロースは、その水分の大部分をフィブリルネットの網目内に保持する。タンパク質５を含む水溶液６をバクテリアセルロースに含浸させると、その水溶液６の大部分はフィブリルネットの網目内に保持される（図２（ｂ））。水溶液６内のタンパク質５は、フィブリルネットの網目内を充たす水溶液６中に浮遊しているため、その生体分子本来の立体構造を保つことができる。

したがって、バクテリアセルロース層２をガラス基板１上に形成し、タンパク質５を含む水溶液６をバクテリアセルロース層２上にマトリクス状にスポットすることにより、タンパク質５をその活性を保ちつつガラス基板１上にマトリクス状に配置して固定することができる。

このようにして製造されたプロテインチップ８を使用することにより、ガラス基板１上のタンパク質５と結合するタンパク質やその他の分子を効率良くスクリーニングすることができる。

上記の例では、検出スポット２ｓｐをマトリクス状に配置してなるプロテインチップについて説明したが、ライン状、ハニカム状といったその他の整列状態となるように検出スポット２ｓｐを配置することも可能である（図８参照）。
［プロテインチップ］
２．１ プロテインチップその１
２．１．１ 構成
図５は本発明にかかるプロテインチップの形態例を示す平面図である。このプロテインチップ７は、タンパク質を含む水溶液６を含浸したバクテリアセルロースからなる多数のプローブセル３ｐをガラス基板１上にマトリクス状に配置して固定してなる。このプロテインチップ７は、図１の一連の工程を経て製造された物である。
２．１．２ 作用・効果
このプロテインチップ７の各プローブセル３ｐ内には、タンパク質５が水溶液６中に浮遊した状態でその活性を保ちつつ保持されている（図２（ａ）、（ｂ）参照）。

したがって、このプロテインチップ７を使用することにより、ガラス基板１上のタンパク質５と結合するタンパク質やその他の分子を効率良くスクリーニングすることができる。

上記の例では、マトリクス状に配置されたプローブセル３ｐからなるバクテリアセルロースアレイ３を備えたプロテインチップ７について説明したが、図６に示すように、ライン状、ハニカム状といったその他の整列状態となるようにプローブセル３ｐ（３ａ）を配置したプロテインチップも本発明のプロテインチップに含まれる。
２．２ プロテインチップその２
２．２．１ 構成
図７は本発明にかかるプロテインチップの形態例を示す平面図である。このプロテインチップ８は、タンパク質を含む水溶液６をバクテリアセルロース層２上にマトリクス状にスポットしてなる多数の検出スポット２ｓｐを有する。このプロテインチップ８は、図４の一連の工程を経て製造された物である。
２．１．２ 作用・効果
このプロテインチップ８の各検出スポット２ｓｐ内には、タンパク質５が水溶液６中に浮遊した状態でその活性を保ちつつ保持されている（図２（ａ）、（ｂ）参照）。

したがって、このプロテインチップ８を使用することにより、ガラス基板１上のタンパク質５と結合するタンパク質やその他の分子を効率良くスクリーニングすることができる。

上記の例では、マトリクス状に配置された検出スポット２ｓｐを有するプロテインチップ８について説明したが、図８に示すように、ライン状、ハニカム状といったその他の整列状態となるように検出スポット２ｓｐを配置したプロテインチップも本発明のプロテインチップに含まれる。
２．３ プロテインチップその３
２．３．１ 構成
図９（ａ）は本発明にかかるプロテインチップの形態例を示す平面図、図９（ｂ）は縦断面図である。このプロテインチップ９は、タンパク質を含む水溶液６を含浸したバクテリアセルロース（ＢＣ）からなる多数のプローブセル３ｐをガラス基板１上にマトリクス状に配置して固定してなる。プロテインチップ９のガラス基板１の表面には半球状の多数のピット１ｐがマトリクス状に形成されている。プロテインチップ９は、各ピット１ｐ内でバクテリアセルロース（ＢＣ）を直接培養した後、各ピット１ｐのバクテリアセルロース（ＢＣ）にタンパク質を含む水溶液６を含浸させることにより製造された物である。すなわち、各ピット１ｐ内の水溶液含有バクテリアセルロース（ＢＣ）がプローブセル３ｐを構成している。
２．３．２ 作用・効果
このプロテインチップ９の各プローブセル３ｐ内には、タンパク質５が水溶液６中に浮遊した状態でその活性を保ちつつ保持されている（図２（ａ）、（ｂ）参照）。

したがって、このプロテインチップ９を使用することにより、ガラス基板１上のタンパク質５と結合するタンパク質やその他の分子を効率良くスクリーニングすることができる。

上記の例では、マトリクス状に配置されたピット１ｐ内にプローブセル３ｐが形成されているが、ライン状、ハニカム状といったその他の整列状態となるように配置されたピット１ｐ内にプローブセル３ｐを形成したプロテインチップも本発明のプロテインチップに含まれる。
［プロテインチップ作成用プレート］
３．１ 基板その１
３．１．１ 構成
図１０は本発明にかかるプロテインチップ作成用プレートの形態例を示す平面図である。このプロテインチップ作成用プレート１１は、ガラス基板１上に、マトリクス状に配置された多数のアレイ要素３ａからなるバクテリアセルロースアレイ３を形成してなる。このプロテインチップ作成用プレート１１は、図１中の基板洗浄工程、バクテリアセルロース層形成工程、バクテリアセルロースアレイ形成工程、クリーニング工程、および湿度調節工程を経ることにより製造された物である。プロテインチップ作成用プレート１１は、必要に応じて、合成樹脂製パッケージ（ケーシング）などに収められる。
３．１．２ 作用・効果
このプロテインチップ作成用プレート１１によれば、そのガラス基板１上に固定されたバクテリアセルロースアレイ３の各アレイ要素３ａに、タンパク質を含む水溶液６を滴下することにより（図１中のプローブ生体分子固定工程に相当）、図５のプロテインチップ７を容易に作成することができる。

上記の例では、マトリクス状に配置されたアレイ要素３ａからなるバクテリアセルロースアレイ３を備えたプロテインチップ作成用プレート１１について説明したが、ライン状、ハニカム状といったその他の整列状態となるようにアレイ要素３ａを配置したプロテインチップ作成用プレートも本発明のプロテインチップ作成用プレートに含まれる。

また、湿度調節工程を省略して製造した物をプロテインチップ作成用プレート１１としてもよい。その場合、タンパク質を含む水溶液６を滴下するに際し、バクテリアセルロースアレイ３の湿度調節を実施することが望ましい。
３．２ 基板その２
３．２．１ 構成
図１１は本発明にかかるプロテインチップ作成用プレートの別の形態例を示す平面図である。このプロテインチップ作成用プレート１２は、ガラス基板１上に、バクテリアセルロース層２を形成してなる。このプロテインチップ作成用プレート１２は、図４中の基板洗浄工程、バクテリアセルロース層形成工程、湿度調節工程を経ることにより製造されたものである。プロテインチップ作成用プレート１２は、必要に応じて、合成樹脂製パッケージ（ケーシング）などに収められる。
３．２．２ 作用・効果
このプロテインチップ作成用プレート１２によれば、バクテリアセルロース層２の上に、タンパク質５を含む水溶液６をマトリクス状にスポットすることにより（図４中のプローブ生体分子固定工程に相当）、図７のプロテインチップ７を容易に作成することができる。

また、バクテリアセルロース層２の上に、タンパク質５を含む水溶液６をライン状、ハニカム状といったその他の整列状態となるようにスポットすることにより、図８のような、ライン状、ハニカム状といったその他の整列状態となるように検出スポット２ｓを配置したプロテインチップを容易に作成することができる。

また、湿度調節工程を省略して製造した物をプロテインチップ作成用プレート１２としてもよい。その場合、タンパク質を含む水溶液６を滴下するに際し、バクテリアセルロースアレイ層２の湿度調節を実施することが望ましい。
３．３ 基板その３
３．３．１ 構成
図１２（ａ）は本発明にかかるプロテインチップ作成用プレートの更に別の形態例を示す平面図、図１２（ｂ）は縦断面図である。このプロテインチップ作成用プレート１３は、ガラス基板１の表面に多数のピット１ｐをマトリクス状に形成し、各ピット１ｐ内でバクテリアセルロース（ＢＣ）を直接培養してなる。このプロテインチップ作成用プレート１３は、基板洗浄工程、バクテリアセルロース層形成工程、湿度調節工程を経ることにより製造されたものである。プロテインチップ作成用プレート１３は、必要に応じて、合成樹脂製パッケージ（ケーシング）などに収められる。
３．３．２ 作用・効果
このプロテインチップ作成用プレート１３によれば、各ピット１ｐのバクテリアセルロース（ＢＣ）にタンパク質を含む水溶液６を含浸させることにより、図９のプロテインチップ９を容易に作成することができる。

湿度調節工程を省略して製造した物をプロテインチップ作成用プレート１３としてもよい。その場合、タンパク質を含む水溶液６を滴下するに際し、ピット１ｐ内のバクテリアセルロース（ＢＣ）の湿度調節を実施することが望ましい。
［補足説明］
以上の説明では、プローブ生体分子としてタンパク質を保持したプローブセルまたは検出スポットのみをガラス基板上に形成したプロテインチップについて説明したが、タンパク質を含むプローブセルと、その他の物質（物体）たとえばペプチド、ＤＮＡ、ＲＮＡ、金属イオン、細胞、等を保持したプローブセルを同一基板上に形成してなるハイブリッド型のプロテインチップも本発明のプロテインチップに含まれる（図１３参照）。

また、上記の例では、プロテインチップおよびチップ作成用プレートの基板として、ガラス基板を使用することとしたが、合成樹脂基板、金属基板、バクテリアセルロース基板、等その他の材質の基板を用いてもよい。

また、バクテリアセルロースアレイの各プローブセル（アレイ要素３ａ）の平面形状は、正方形である必要はない。長方形でも三角形でも五角形でも六角形でも八角形でも円形でも楕円形でもよいが、円形であることが望ましい（図１４参照）。

また、プローブセル（アレイ要素）のセルサイズおよびセル間隔は任意である。セルサイズ（直径）は、好ましくは十数ミクロン〜数ミリメートルの範囲から選ばれる。既製のアレイヤによりスポッティング可能なセルサイズおよびセル間隔とすることが望ましい。

また、バクテリアセルロース層あるいはプローブセル（アレイ要素）の厚さは任意である。好ましくは湿潤状態で十数ミクロン〜十数ミリメートルの範囲から選ばれる。

また、プロテインチップおよびチップ作成用プレートの形状（平面形状）は任意である。正方形、長方形、円形、楕円形、台形、等どのような形状でもよい。

本発明のプロテインチップは、その基板上のバクテリアセルロース内に生体細胞を導入もしくは培養することにより、細胞アレイとして利用することができる。すなわち、発現ベクターに挿入した状態のｃＤＮＡクローンをバクテリアセルロース（たとえば、図１０に示すチップ作成用プレート１１のアレイ要素３ａ、図１１に示すチップ作成用プレート１２のバクテリアセルロース層２、等）上にスポットし、その上で細胞を増殖させ、アレイされた遺伝子を導入することにより、外来遺伝子が発現した状態の細胞アレイを作成することができる。セルアレイ上の細胞に対しては蛍光免疫染色法、ＦＩＳＨ法などの技術を使用することができる。バクテリアセルロースは含水性が極めて高いため、細胞の培養に必要な水分や栄養分を長時間保持することができる。

本発明のプロテインチップは、その基板上のバクテリアセルロース上に生体組織標本（ティッシュ）を載せ置くことにより、ティッシュアレイとして利用することができる。バクテリアセルロースは含水性が極めて高いため、生体組織標本を長時間好適な湿潤状態に保つことができる。

本発明のプロテインチップは、その基板上のバクテリアセルロースに糖鎖を含む水溶液を含浸させることにより、糖鎖アレイとして利用することができる。

本発明にかかるプロテインチップの製造方法の一例を示す製造工程図 （ａ）バクテリアセルロースの内部構造を示す概念図 （ｂ）バクテリアセルロース内においてタンパク質が水溶液中に浮遊した状態で保持されている様子を示す概念図 本発明にかかるプロテインチップの製造方法の一例を示す製造工程図 本発明にかかるプロテインチップの製造方法の一例を示す製造工程図 本発明にかかるプロテインチップの形態例を示す平面図 （ａ）プローブセルがライン状に並べて配置されているプロテインチップの形態例を示す平面図 （ｂ）プローブセルがハニカム状に配置されているプロテインチップの形態例を示す平面図 本発明にかかるプロテインチップの形態例を示す平面図 （ａ）検出スポットがライン状に並べて配置されているプロテインチップの形態例を示す平面図 （ｂ）検出スポットがハニカム状に配置されているプロテインチップの形態例を示す平面図 （ａ）本発明にかかるプロテインチップの形態例を示す平面図（ｂ）本発明にかかるプロテインチップの形態例を示す縦断面図 本発明にかかるプロテインチップ作成用プレートの形態例を示す平面図 本発明にかかるプロテインチップ作成用プレートの形態例を示す平面図 （ａ）本発明にかかるプロテインチップ作成用プレートの形態例を示す平面図（ｂ）本発明にかかるプロテインチップ作成用プレートの形態例を示す縦断面図 本発明にかかるプロテインチップの形態例を示す概念図 本発明にかかるプロテインチップまたはチップ作成用プレートの形態例を示す平面図

符号の説明

１ ガラス基板
１ｐ ピット
２ バクテリアセルロース層
２ｆ フィブリル
２ｓ シート
２ｓｐ 検出スポット
３ バクテリアセルロースアレイ
３ａ アレイ要素
３ｐ プローブセル
４ レーザビーム
５ タンパク質
６ 水溶液
７ プロテインチップ
８ プロテインチップ
９ プロテインチップ
１１ プロテインチップ作成用プレート
１２ プロテインチップ作成用プレート
１３ プロテインチップ作成用プレート
ＢＣ バクテリアセルロース

Claims (13)

1. バクテリアセルロースのシートを表面が平らな基板の表面に固定することにより当該基板上に当該バクテリアセルロースのシートからなるバクテリアセルロース層を形成する工程と、
   前記バクテリアセルロース層をレーザビームにより切断することにより整然と並んだアレイ要素からなるバクテリアセルロースアレイに加工する工程と、
   タンパク質を含む水溶液を前記アレイ要素に含浸させる工程と、
   を含むことを特徴とする、プロテインチップの製造方法。
2. バクテリアセルロースのシートをレーザビームにより切断することにより整然と並んだアレイ要素からなるバクテリアセルロースアレイに加工する工程と、
   前記バクテリアセルロースアレイを表面が平らな基板の表面に固定する工程と、
   タンパク質を含む水溶液を前記アレイ要素に含浸させる工程と、
   を含むことを特徴とする、プロテインチップの製造方法。
3. 前記バクテリアセルロースはナタデココである、請求項１または２に記載のプロテイン
   チップの製造方法。
4. タンパク質を含む水溶液を含浸したバクテリアセルロースからなるプローブセルを基板上に整然と並べて固定してなるプロテインチップを作成するためのプレートの製造方法であって、
   バクテリアセルロースのシートを表面が平らな基板の表面に固定することにより当該基板上に当該バクテリアセルロースのシートからなるバクテリアセルロース層を形成する工程と、
   前記バクテリアセルロース層をレーザビームにより切断することにより整然と並んだアレイ要素からなるバクテリアセルロースアレイに加工する工程と、
   を含むことを特徴とする、プロテインチップ作成用プレートの製造方法。
5. タンパク質を含む水溶液を含浸したバクテリアセルロースからなるプローブセルを基板上に整然と並べて固定してなるプロテインチップを作成するためのプレートの製造方法であって、
   バクテリアセルロースのシートをレーザビームにより切断することにより整然と並んだアレイ要素からなるバクテリアセルロースアレイに加工する工程と、
   前記バクテリアセルロースアレイを表面が平らな基板の表面に固定する工程と、
   を含むことを特徴とする、プロテインチップ作成用プレートの製造方法。
6. 前記バクテリアセルロースはナタデココである、請求項４または５に記載のプロテインチップ作成用プレートの製造方法。
7. バクテリアセルロースのシートを表面が平らな基板の表面に固定することにより当該基板上に当該バクテリアセルロースのシートからなるバクテリアセルロース層を形成する工程と、
   前記バクテリアセルロース層をレーザビームにより切断することにより整然と並んだアレイ要素からなるバクテリアセルロースアレイに加工する工程と、
   前記アレイ要素上で生体細胞を培養する工程と、
   を含むことを特徴とする、バイオロジカルチップの製造方法。
8. バクテリアセルロースのシートをレーザビームにより切断することにより整然と並んだアレイ要素からなるバクテリアセルロースアレイに加工する工程と、
   前記バクテリアセルロースアレイを表面が平らな基板の表面に固定する工程と、
   前記アレイ要素上で生体細胞を培養する工程と、
   を含むことを特徴とする、バイオロジカルチップの製造方法。
9. バクテリアセルロースのシートを表面が平らな基板の表面に固定することにより当該基板上に当該バクテリアセルロースのシートからなるバクテリアセルロース層を形成する工程と、
   前記バクテリアセルロース層をレーザビームにより切断することにより整然と並んだアレイ要素からなるバクテリアセルロースアレイに加工する工程と、
   前記アレイ要素上に生体組織標本（ティッシュ）を載せ置く工程と、
   を含むことを特徴とする、バイオロジカルチップの製造方法。
10. バクテリアセルロースのシートをレーザビームにより切断することにより整然と並んだアレイ要素からなるバクテリアセルロースアレイに加工する工程と、
    前記バクテリアセルロースアレイを表面が平らな基板の表面に固定する工程と、
    前記アレイ要素上に生体組織標本（ティッシュ）を載せ置く工程と、
    を含むことを特徴とする、バイオロジカルチップの製造方法。
11. バクテリアセルロースのシートを表面が平らな基板の表面に固定することにより当該基板上に当該バクテリアセルロースのシートからなるバクテリアセルロース層を形成する工程と、
    前記バクテリアセルロース層をレーザビームにより切断することにより整然と並んだアレイ要素からなるバクテリアセルロースアレイに加工する工程と、
    糖鎖を含む水溶液を前記アレイ要素に含浸させる工程と、
    を含むことを特徴とする、バイオロジカルチップの製造方法。
12. バクテリアセルロースのシートをレーザビームにより切断することにより整然と並んだアレイ要素からなるバクテリアセルロースアレイに加工する工程と、
    前記バクテリアセルロースアレイを表面が平らな基板の表面に固定する工程と、
    糖鎖を含む水溶液を前記アレイ要素に含浸させる工程と、
    を含むことを特徴とする、バイオロジカルチップの製造方法。
13. 前記バクテリアセルロースはナタデココである、請求項７〜１２のいずれか１項に記載のバイオロジカルチップの製造方法。

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