JP2004115616A

JP2004115616A - 固定化糖鎖

Info

Publication number: JP2004115616A
Application number: JP2002279319A
Authority: JP
Inventors: Masamori Mizuno; 水野　真盛; Midori Noguchi; 野口　緑; Toshiyuki Inazu; 稲津　敏行
Original assignee: Noguchi Institute
Current assignee: Noguchi Institute
Priority date: 2002-09-25
Filing date: 2002-09-25
Publication date: 2004-04-15

Abstract

【課題】単糖やオリゴ糖のみならず、天然糖鎖あるいはそれと同等の人工糖鎖を用いた固定化糖鎖を提供する。
【解決手段】糖鎖アミノ酸のような三官能性スペーサーと糖鎖の複合体を用いると、糖鎖全体を固定化でき、しかも、糖鎖チップや糖鎖アレイとして利用する際に有用な発色団を結合できる優れた固定化糖鎖が得られることを見出した。すなわち本発明は、三官能性スペーサーの第１の官能基に糖鎖を結合し、第２の官能基が固相担体と結合し、第３の官能基が発色団と結合可能であることを特徴とする固定化糖鎖である。
【選択図】なし

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は固定化された糖鎖に関する。
【０００２】
【従来の技術】
近年、糖鎖が生体内の第３の鎖として注目を浴びるようになってきている。特に、細胞分化やガン化、免疫反応や受精などとの関わりが研究され、新しい事実が明らかにされている。そうした事実から新たな医薬や医療材料を創製しようとする試みが続けられている。このような創薬目的にはハイスループットな解析技術が要求され、固定化糖鎖の有用性が期待されている。たとえば、ビオチンとアビジンの結合を利用する方法が報告されている（特許文献１、非特許文献１参照）。しかし、いずれも糖鎖は単糖からオリゴ糖レベルまでで実際の糖鎖とはほど遠い誘導体である。
また、特許文献１は、糖と固相担体に結合可能なリンカーを利用した糖鎖アレイを開示しているが、糖鎖ビオチン複合体を調製する段階では原料となるグリコモノマーを実質的に化学合成する必要があり、天然糖鎖を扱うのは明らかに不適当で現実的ではない。また、結合状態の検出や固定化糖鎖の定量のために発色団を導入することは出来ない。天然糖鎖を固定化する例では、還元末端をシッフ塩基型で固定し、その還元体を用いる方法が知られている（非特許文献２参照）。しかし、これらの方法では還元末端は糖鎖構造を保持しておらず、真の糖鎖の固定化とは言い難い。
【０００３】
【特許文献１】
国際公開　０１／４０７９６号パンフレット
【非特許文献１】
Ｘ．−Ｌ．　Ｓｕｎら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．誌、１２４巻、７２５８頁、２００２年。
【非特許文献２】
Ａ．　Ｓａｔｏｈら、Ａｎａｌ．　Ｂｉｏｃｈｅｍ．誌、２６０巻、９６頁、１９９８年。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、単糖やオリゴ糖のみならず、天然糖鎖あるいはそれと同等の人工糖鎖を用いた固定化糖鎖を提供するものである。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、天然糖鎖を基盤にした固定化技術を鋭意検討した結果、糖鎖アミノ酸のような三官能性スペーサーと糖鎖の複合体を用いると、糖鎖全体を固定化でき、しかも、糖鎖チップや糖鎖アレイとして利用する際に有用な発色団を結合できる優れた固定化糖鎖が得られることを見出し、本発明に到達した。すなわち、本発明は、三官能性スペーサーの第１の官能基に糖鎖を結合し、第２の官能基が固相担体と結合し、第３の官能基が発色団と結合可能であることを特徴とする固定化糖鎖である。
【０００６】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を詳細に説明する。
【０００７】
まず、原料となる三官能性スペーサーについて述べる。三官能性スペーサーの３つの官能基としては、アミノ基、イミノ基、水酸基、カルボキシル基、カルボニル基、アジド基、アルデヒド基、メルカプト基、ジスルフィド基、チオエーテル基、アミド基などを挙げることができる。また、３つの官能基はそれぞれ同一であっても、１つだけもしくは３つすべてが異なっていても構わない。固定化糖鎖を製造する目的には異なる官能基を有する誘導体の方が、反応性の差を利用しやすい利点がある。
【０００８】
３つの官能基をどのように結合させるかは、問わない。たとえば、分岐した炭素骨格で結合させる方法や、芳香族誘導体、ケイ素誘導体として結合する方法などがあげられる。具体的には、＝ＣＨ−ＣＨ_２−、−ＣＨ_２−ＣＨ（−）−ＣＨ_２−、−Ｃ_６Ｈ_３＝、−Ｓｉ（Ｍｅ）＝、などを示すことが出来る。
【０００９】
三官能性スペーサーとして、容易に利用できる誘導体としてグリセリン誘導体や側鎖官能基を有するアミノ酸があげられる。たとえば、グルタミン酸、アスパラギン酸、グルタミン、アスパラギン、セリン、スレオニン、チロシン、リジン、グリセリン酸などである。後述する天然糖タンパク質糖鎖を利用する点から、アスパラギン、セリン、スレオニンが好ましい。また、３つの官能基のいずれかがさらに置換された新たな三官能性スペーサーを利用できることは言うまでもない。この場合、スペーサー中に、糖鎖、固相担体、必要に応じて発色団と結合する３つの官能基以外に、不活性な官能基を含むことになる。たとえば、側鎖官能基を有するアミノ酸とグリシンのペプチド誘導体や、側鎖水酸基をヒドロキシメチル基で置換されたセリン誘導体など、アミド基やエーテル基などを含む誘導体を挙げることができる。
【００１０】
三官能性スペーサーと糖鎖の結合は、周知の結合を利用できる。具体的には、Ｎ−グリコシド結合、Ｏ−グリコシド結合、エステル結合、アミド結合、エーテル結合などを挙げることができる。糖鎖の結合位置や結合様式は問わない。すなわち、糖鎖に複数有する水酸基のいずれと結合しても構わないし、また、アミノ基やカルボキシル基などの他の官能基でも利用できる。しかし、天然糖鎖の多くはＮ−グリコシド結合やＯ−グリコシド結合した誘導体で存在していることから、実際の糖鎖の機能解明には、Ｎ−グリコシド結合やＯ−グリコシド結合などアノマー位の水酸基との結合が好ましい。三官能性スペーサーと糖鎖を結合する方法は、周知の方法を利用できる。グリコシル化反応やエステル化反応、アミド形成反応など周知の方法を適用できる。
【００１１】
糖鎖としては、周知の誘導体を使用できる。具体的には、マンノース、グルコース、ガラクトースなどのヘキソース類、アラビノースやキシロースなどのペントース類、Ｎ−アセチルグルコサミンやＮ−アセチルガラクトサミンなどのアミノ糖類、グルクロン酸などの酸性糖類、シアル酸に代表される高級糖類、フルクトースなどのケトース類、２−デオキシグルコースなどのデオキシ糖類など周知の単糖からなるオリゴ糖や多糖を示すことが出来る。構成する単糖も最も短い糖鎖として利用できる。天然糖鎖としては、糖タンパク質糖鎖あるいは糖脂質糖鎖など周知の糖鎖を挙げることができる。糖タンパク質糖鎖としては、アスパラギン結合型糖鎖やムチン型糖鎖などを挙げることができる。
【００１２】
特に、本発明においては従来技術と異なり、天然糖タンパク質糖鎖を利用する方法が推奨される。すなわち、天然糖タンパク質にタンパク質分解酵素を働かせ、タンパク質部分を加水分解すると、容易に天然糖鎖を有するアミノ酸が得られる（Ｔ．　Ｔａｉら、　Ｊ．　Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ．　誌、２５０巻、８５６９頁、１９７５年参照）。この方法を応用すれば、糖鎖アスパラギン、糖鎖セリン、糖鎖スレオニンが得られる。得られた糖鎖アミノ酸のアミノ基に発色団、たとえば、９−フルオレニルメチルオキシカルボニル基やダンシル基などを導入すれば、固定化糖鎖合成原料になるばかりか、糖鎖アミノ酸の単離、精製が容易になる（特開平１０−０８２８８２号公報参照）。天然糖鎖は、化学的にも、あるいは酵素的にも製造することが現在なお困難であるが、この方法によれば、容易に天然糖鎖を固定化することが出来る。具体的には、高マンノース型糖鎖や複合型糖鎖、あるいは、ムチン型糖鎖などを例示できる。得られた天然糖鎖を有するアミノ酸の糖鎖部分を酵素的に、あるいは化学的に修飾して得られる新たな糖鎖アミノ酸を利用できることは言うまでもない。
【００１３】
次に、固定化担体について述べる。
【００１４】
固定化担体としては周知の担体を利用できる。ポリスチレン、ポリエステル、ポリアクリルアミドなどの高分子担体、紙を含むセルロース、キチン、キトサンなどの天然高分子担体、あるいは、ガラスやシリカゲルなどの無機担体、あるいは金などの金属類などを挙げることができるが、これらに限定されない。さらに、これらの組み合わせによる担体などを使用できることは言うまでもない。これらの担体には何らかの官能基が必須であり、たとえばヒドロキシメチル化やクロルメチル化したポリスチレンや共重合することで官能基を付与した高分子担体が通常用いられる。天然高分子の多くは水酸基やアミノ基を有する誘導体が多く、直接利用できる。また、ガラスや金属には、ケイ素誘導体の反応や金属メルカプチドの生成により官能基を付与される。このようにして使用できる官能基は、特に制限はなく、水酸基、アミノ基、イミノ基、カルボニル基、カルボキシル基、チオール基など周知の官能基を利用できる。固定化担体の形状も何ら制限はなく、プレート状、ウエル状、ビーズ状、繊維状、棒状、粉末状などの周知の担体を使用できる。また、表面プラズモン共鳴装置のキュベットなど周知の測定装置の部品に直接組み込むことが出来ることも言うまでもない。
【００１５】
三官能性スペーサーと固相担体との結合様式は、何ら制限はない。アミド結合、エステル結合、エーテル結合、スルフィド結合、ジスルフィド結合など結合させる官能基同士の組み合わせにより周知の結合を利用できる。二価性試薬などで固定化する周知の方法も利用できるため、固相担体と三官能性スペーサーの間に、新たなリンカーを挟む結合様式も含むことができる。二価性試薬としては、たとえば、ＢＳ３試薬などを挙げることができる。
【００１６】
次に、第３の官能基に必要に応じて結合させることが可能な発色団について述べる。
【００１７】
ある種のタンパク質やウイルスなどと結合する糖鎖を探索する目的で本発明の固定化糖鎖を使用する場合には、その結合状態を何らかの形で検出する必要がある。たとえば、表面プラズモン共鳴法などの方法を用いる方法やＥＬＩＳＡ法などの方法が考えられる。固定化糖鎖に、何らかの発色団を結合させることが出来れば、糖鎖との結合状態を直接検出できる。たとえば、蛍光強度の変化を捉える方法や、紫外部吸収の変化を検出する方法があげられる。また、固定化した糖鎖を定量する目的としても発色団の導入は有用である。この目的には、発色団の切り出しが容易なことから、保護基として利用されている発色団が有用である。
【００１８】
発色団として何ら制限はない。たとえば、周知の可視部吸収性発色団、紫外部吸収性発色団や蛍光性発色団を利用できる。実際には、紫外部吸収性発色団や蛍光性発色団が好ましい。具体的には、ｐ−ニトロフェノール誘導体、ローダミンＢ誘導体、ダンシル基誘導体、９−フルオレニルメチルオキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）基、９−フルオレニルメチル基などを挙げることができる。導入糖鎖量を定量する目的や糖鎖アミノ酸の単離精製には、Ｆｍｏｃ基などの保護基として有用な発色団が好ましい。また、糖鎖の結合状態を検出するためには、ダンシル基などの蛍光性発色団が好ましい。これら発色団と三官能性スペーサーとの結合様式も何ら制限はなく、アミド結合、エステル結合、エーテル結合、スルフィド結合、ジスルフィド結合などを挙げることができる。スペーサーを挟んだ誘導体が含まれることも言うまでもない。
【００１９】
三官能性スペーサーと、糖鎖、固相担体、必要に応じ発色団の三者を結合させる順番に制限はない。しかし、天然糖鎖を有する糖鎖アミノ酸を利用する場合には、最後に固相担体と結合させる方が好ましい。それぞれの結合を形成する方法も何ら制限はなく、周知の方法を使用できる。
【００２０】
こうして得られる固定化糖鎖の発色団を加水分解などの手法により切り離し、新たに別の発色団を結合させることも出来る。また、糖鎖を化学的、酵素的に加水分解し、糖鎖構造を縮小した新たな構造の固定化糖鎖にすることや、逆に糖転移酵素や糖加水分解酵素などを用いた酵素法を適用し、糖鎖を伸長させることが出来ることは、言うまでもない。加えて、化学的あるいは酵素的に、糖鎖を修飾し新たな固定化糖鎖を製造することも出来る。
【００２１】
得られた固定化糖鎖は整列させることで糖鎖アレイとして有用で、たとえば、９６穴マイクロタイタープレートなどへ応用可能である。また、ビーズ状、プレート状の固定化糖鎖は糖鎖ビーズ、糖鎖プレートとして利用できる。これらの利用に際しては、通常同一の糖鎖と発色団を持つ固定化糖鎖を使用するが、糖鎖の種類や発色団の種類が、異なる種類の固定化糖鎖であっても構わない。最近、医薬分野の創薬目的に利用されるハイスループット型の解析には、複数の構造を有する固定化糖鎖が有用であることは、容易に推測できる。
【００２２】
糖鎖チップ、糖鎖ビーズ、糖鎖プレートなどの固定化糖鎖は、糖鎖と結合するあるいは相互作用する医薬やそのリード化合物などの化学物質、タンパク質、糖鎖、核酸、脂質などの生体分子、あるいは、ウイルス、バクテリア、原虫などの病原性生物、あるいは、細胞などの特定や、捕集さらには培養などに利用できる。糖鎖と相互作用する化学物質、生体分子、病原性生物、細胞としては、何ら制限はない。それらの具体例を示すと、たとえば、ウイルスでは、インフルエンザウイルス、後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）ウイルスなどを挙げることができる。バクテリアとしては、病原性大腸菌Ｏ−１５７や周知の感染症原因バクテリアを例示できる。原虫としては、マラリア原虫を具体例として示すことが出来る。糖鎖との相互作用を特定する方法には、ＥＬＩＳＡ法などの免疫学的方法や表面プラズモン共鳴法、原子間力顕微鏡など周知の方法を利用できる。こうした方法を応用すれば、本発明の固定化糖鎖による疾病の新規診断法も創出出来る。さらに、糖鎖と細胞の接着性を利用した細胞培養の基材として利用できる。細胞としては、正常細胞だけでなくガン細胞や胚性幹細胞などを挙げることができる。
【００２３】
ビーズ状、繊維状、棒状、粉末状などの固定化糖鎖は、ウイルス吸着性材料やバクテリア吸着性材料として、またはそれらの原料としても有用である。
【００２４】
以下に実施例を挙げて本発明をさらに具体的に説明するが、その要旨を超えない限り、何ら制限を受けるものではない。
【００２５】
【実施例１】
Ｎａｌｇｅ　Ｎｕｎｃ社製ＮＨ基を有するポリスチレン製モジュールプレートを使用した。１つのウエルに、９−フルオレニルメチルオキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）−Ｌ−アスパラギン（Ａｓｎ）の側鎖アミド基にマンノース（Ｍａｎ）６残基、Ｎ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）２残基からなる天然糖鎖がＮ−グリコシル結合している式（Ｉ）（式中、ＭａｎはＤ−マンノースを、ＧｌｃＮＡｃは、Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミンを、Ｆｍｏｃは、９−フルオレニルメチルオキシカルボニル基を、ＡｓｎはＬ−アスパラギンを表す。）に示したＦｍｏｃ糖鎖アスパラギン誘導体０．１ｍｇ（５７ｐｍｏｌ）を水１００μｌに溶解して加えた。次に、ＤＭＴ−ＭＭ（塩化　４−（４，６−ジメトキシ−１，３，５−トリアジン−２−イル）−４−メチルモルホリニウム）試薬０．１Ｍ水溶液２．８μｌ（５ｅｑ）を加え、室温で１時間ウエルごと攪拌した。ウエルを０．０１％Ｔｗｅｅｎ２０（ＩＣＩ社）試薬を含むリン酸緩衝生理食塩水（アルドリッチ社）で３回洗浄し、固定化糖鎖を調製した。
【化１】

次に、固定化糖鎖をＥＬＩＳＡ分析に供した。３％牛血清アルブミンを含むリン酸緩衝生理食塩水４２０μｌを加え、０℃で一夜放置した。ウエルを０．０１％Ｔｗｅｅｎ２０試薬（ＩＣＩ社）リン酸緩衝生理食塩水で３回洗浄し、ワサビパーオキシダーゼを結合した高マンノース型糖鎖と結合するＣｏｎ−Ａ（コンカナバリンＡ）レクチン（ホーネンコーポレーション）６１　ｐｇを含むリン酸緩衝生理食塩水１００μｌを加え、室温に４５分ウエルごと攪拌した。再び、ウエルを０．０１％Ｔｗｅｅｎ２０試薬（ＩＣＩ社）リン酸緩衝生理食塩水で３回洗浄し、Ｐｒｏｍｅｇａ社製ＥＬＩＳＡ発色試薬「ＴＭＢ　Ｏｎｅ　Ｓｏｌｕｔｉｏｎ」１００μｌを加えた。
１規定の塩酸１００μｌを加え、このウエルを４５０ｎｍで吸光度測定した。その結果は、０．６８８であり、糖鎖を固定化していないウエルで同様の操作を行ったコントロール値は、０．０１４であった。
【００２６】
【発明の効果】
本発明の固定化糖鎖は、生体内での糖鎖の機能解析や新薬創出を指向したハイスループット解析技術、ウイルスやバクテリア吸着性新規材料などとして、工業的価値やその波及効果は極めて大である。

Claims

三官能性スペーサーの第１の官能基に糖鎖が結合し、第２の官能基が固相担体と結合することを特徴とする固定化糖鎖。
三官能性スペーサーが側鎖官能基を有するアミノ酸であることを特徴とする請求項１記載の固定化糖鎖。
三官能性スペーサーと糖鎖の結合様式がＯ−グリコシド結合であることを特徴とする請求項１あるいは請求項２記載の固定化糖鎖。
三官能性スペーサーと糖鎖の結合様式がＮ−グリコシド結合であることを特徴とする１請求項あるいは請求項２記載の固定化糖鎖。
第３の官能基に発色団が結合した請求項１から請求項４までのいずれかに記載の固定化糖鎖。
糖鎖が天然糖鎖であることを特徴とする請求項１から請求項５までのいずれかに記載の固定化糖鎖。
固相担体が高分子化合物であることを特徴とする請求項１から請求項６までのいずれかに記載の固定化糖鎖。
固相担体が金属であることを特徴とする請求項１から請求項６までのいずれかに記載の固定化糖鎖。
糖鎖が同一または異なる種類の請求項１記載の固定化糖鎖を整列させることを特徴とする糖鎖アレイ。
ビーズ状形態を有することを特徴とする請求項１記載の固定化糖鎖。
プレート状形態を有することを特徴とする請求項１記載の固定化糖鎖。
請求項１記載の固定化糖鎖を用い、糖鎖と結合あるいは相互作用する化学物質、タンパク質、糖鎖、核酸、脂質、ウイルス、バクテリア、原虫、細胞を特定、あるいは捕集する方法。
請求項１記載の固定化糖鎖を用い、糖鎖と結合あるいは相互作用するウイルス、バクテリア、原虫、細胞を培養する方法。
請求項１記載の固定化糖鎖を用いるウイルス吸着性材料。
請求項１記載の固定化糖鎖を用いるバクテリア吸着性材料。