-
Beschreibung
-
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zum Bearbeiten von
biologischem Material unterschiedlicher Form und Herkunft durch Laserimpulse, die
mit einem Lasersystem, bestehend aus einem Pump- und einem Farbstofflaser erzeugt
und in einem Mikroskop bis an die theoretisch mögliche Grenze fokussiert werden.
-
Es ist bekannt, daß Laserlicht, insbesondere das von Farbstofflasern,
eine sehr geringe Strahldivergenz hat und daher sehr gut fokussierbar ist. Hierzu
genügt es im Prinzip, den Laserstrahl durch eine Linse oder ein System von Linsen
auf eine Brennebene abzubilden. Bei der Verwendung von Linsen mit langer Brennweite
erhält man einen Fokus, der in seiner Tiefe (in Ausbreitungsrichtung des Lichts)
nicht sehr gut definiert ist.
-
Durch Einkopplung in ein Mikroskop kann man dagegen die sehr kurze
Brennweite des Mikroskopobjektivs nutzen, um einen Brennfleck geringer Tiefe zu
erzeugen, dessen Querschnitt der Wellenlänge des Lichts entspricht.
-
Eine Vorrichtung der eingangs genannten Art ist aus Science 213 (198t),
Seite 505 bis 513, bekannt, wobei durch einen Nd-YAG Laser ein Farbstofflaser gepumpt
wurde, desen Pulse in ein Mikroskop eingekoppelt wurden. Dieses System war bei Pulslängen
von 15 ns abstimmbar zwischen 217 und 800 nm. Aus den angegebenen Spitzenleistungen
von 105 W errechnet sich bei Annahme eines rechteckigen zeitlichen Pulsverlaufs
eine Pulsenergie von 1,5 mJ; tatsächlich dürfte wegen der für solche Laser typischen
unregelmäßigen Pulsform die Pulsenergie zwischen 0,5 und 0,7 mJ gelegen haben. Neben
abstimmbaren Pulsen von 15 ns Länge ließ sich die bekannte Vorrichtung bei drei
festen Wellenlängen~ 266, 532 und 1064 nm - auch mit Pikosekundenpulsen (25 ps)
betreiben.
-
Diese Vorrichtung wurde eingesetzt, um in Chromosomen, subzellulären
Organellen und Nervenzellen punktförmige Läsionen zu erzeugen. Aus den dadurch bewirkten
Ausfallerscheinungen wurden Rückschlüsse gezogen auf die Funktion der bestrahlten
Teile.
-
Der vorliegenden Erfindung lag nun die Aufgabe zugrunde, sehr feine
Läsionen, Löcher und äquidistante Schnitte an elongierten biologischen Materialien
anzubringen. Generelle Meinung war dabei, daß diese Aufgabe durch quantitativ genau
definiertes Absenken der Pulsenergie - verglichen mit den oben angegebenen Pulsenergien
- zu lösen sei. Damit wären Schwelleneffekte so nutzbar, daß Läsionen kleiner als
die der Wellenlänge des verwendeten Lichtes erzeugbar wären.
-
Überraschenderweise ließ sich die gestellte Aufgabe durch einen Schritt
in die entgegengesetzte Richtung mit den Merkmalen der Patentansprüche lösen.
-
Durch Einsatz eines leistungsstarken Excimerlasers und eines ebenfalls
leistungsstarken Farbstofflasers konnte die Pulsenergie um eine weitere Größenordnung
auf 15 mJ pro Puls gesteigert werden. Dadurch wurden Beugungserscheinungen, die
theoretisch bei Einkopplung eines Lasers in ein Mikroskop immer zu erwarten sind,
und die in der Regel als unerwünschte Nebeneffekte angesehen werden, so stark, daß
diese Beugungserscheinungen selbst zum Anbringen von Läsionen benutzt werden konnten.
-
Das erfindungsgemäße Verfahren basiert also im Wesentlichen auf folgenden
Voraussetzungen: 1. Einsatz eines leistungsstarken Pumplasers (z.B.
-
eines Excimer-Lasers).
-
2. Abstimmbarkeit durch einen nachgeschalteten Farbstofflaser.
-
3. Einkopplung der Laserstrahlung in ein Mikroskop.
-
4. Ausnutzung von Beugungserscheinungen.
-
Diese Erfindungselemente werden im Folgenden genauer beschrieben.
-
1. Es wird ein Excimer-Laser als Energiequelle verwendet, dessen
Wellenlänge im Ultravioletten (UV, 248 und 308 nm) liegt. Damit lassen sich alle
verfügbaren Farbstoffe mit hoher Pulsenergie pumpen.
-
2. Durch Nachschalten eines Farbstofflasers wird das Lasersystem
in seiner Wellenlänge abstimmbar.
-
Eine solche Abstimmbarkeit ist für das erfindungsgemäße Verfahren
erforderlich a) aus physikalischen Gründen, da die Dimensionen des fokussierten
Lichts von der Wellenlänge abhängig sind; b) aus biologischen Gründen, da unerwünschte
Nebeneffekte bei der Bearbeitung von biologischem Material (z.B. Schädigung von
genetischem Material) stark von der Wellenlänge abhängig sind.
-
Da der Farbstofflaser von einem leistungsstarken Excimerlaser gepumpt
wird, ist eine kontinuierliche Abstimmbarkeit über einen Wellenlängenbereich von
100 bis 1500 nm gewährleistet. Neben der direkten Anregung von Farbstoffen erlauben
die hohen Pumpenergien Frequenzverdopplung, Ramanverschiebung und Frequenzvermischung
der Farbstofflaserimpulse.
-
3. Die vom Farbstofflaser ausgehende Laserstrahlung weist eine sehr
geringe Strahldivergenz auf und kann daher bis zur phyikalisch möglichen Grenze
fokussiert werden. In dem erfindungsgemäßen Verfahren wird die Fokussierung dadurch
erreicht, daß das Licht über den Auflicht-Beleuchtungskanal in ein Mikroskop eingekoppelt
und durch das Mikroskop-Objektiv auf den Objektträger des Mikroskops fokussiert
wird. Der so entstehende Brennfleck hat wegen der sehr kurzen Brennweite des Objektivs
eine sehr geringe Tiefe (Ausdehnung in Strahlrichtung). Somit läßt sich
durch
Einsatz eines beweglichen Objekttisches und durch Variation der Fokus-Ebene der
Brennfleck relativ zum Objekt in drei Dimensionen bewegen.
-
Dies kann z.B. genutzt werden, um mikrochirurgische Eingriffe in
biologische Zellen auch in tieferen Zellschichten durchzuführen.
-
4. Aufgrund von Beugungserscheinungen an den Blendenöffnungen erscheint
der Brennfleck in der Brennebene nicht als einfache kreisförmige Scheibe, sondern
ist von einem System von Beugungsringen umgeben, deren Abstand voneinander genau
der Wellenlänge des verwendeten Lichts entspricht, und die einige Prozente der Gesamtenergie
des fokussierten Lichts enthalten. Bei den durch die Kombination von Punkt 1 bis
3 erzielten Pulsen sind die Beugungsringe so stark, daß etwa 5 bis 10 dieser Ringe
genutzt werden können, um biologisches Material (wie z.B. Chromosomen) zu schneiden.
Da der Abstand der Beugungsringe durch die Wellenlänge des Lichts gegeben ist, lassen
sich an länglichen biologischen Objekten exakte Schnitte anbringen. Aufgrund der
Abstimmbarkeit des Lasersystems läßt sich der Schnittabstand innerhalb des verfügbaren
Wellenlängenbereichs frei wählen.
-
Insbesondere lassen sich wegen der Möglichkeit, auch in UV mit starken
Pulsen zu arbeiten, sehr kleine Schnittabstände wählen. Da beim Schneiden mittels
Beugungsringen Schwelleneffekte eine Rolle spielen sind die Schnitte sehr fein,
mit Schnittstärken wesentlich unterhalb der Wellenlänge des verwendeten Lichts.
-
Mit der Erfindung wurde es erstmals möglich, feine äquidistante Schnitte
an elongiertem biologischen Material anzubringen (s. Abb.), deren Abstand durch
die Wahl der Pulsenergie vorgegeben werden kann. Da mehrere Schnitte gleichzeitig
gesetzt werden können, und da durch den Einsatz eines berührungsempfindlichen Bildschirms
in Verbindung mit einem computergesteuerten Scanning-Tisch schnell neue Objekte
in den Strahl geführt werden können, ist zudem die Verarbeitung einer großen Zahl
von biologischen Objekten möglich.
-
Nutzungsbeispiele 1. Zerschneiden von im Lichtmikroskop sichtbaren
Chromosomen für Mikrocloning Experimente.
-
Hierdurch läßt sich die Lage bestimmter Gene auf bestimmten Chromosomenabschnitten
in einer einfacheren Weise als mit den gängigen molekularbiologischen Verfahren
bestimmen.
-
2. Zerschneiden von Chromosomen aus gesunden Zellen an typischen
Bruchstellen, die bei Krebserkrankungen, zum Beispiel beim Burkitt -Lymphom auftreten
(in diesem Fall wird lediglich ein Beugungsring genutzt). Solche Experimente können
Aufschluß darüber geben, ob Chromosomenbrüche Ursache oder Folge von Erkrankungen
sind.
-
3. Produktion von annähernd monodispersen Oligonukleosomen. Nukleosomen,
annähernd scheibenförmige Protein-DNS Komplexe mit einem MW=204 000, sind die sich
vielfach wiederholenden Bausteine von Chromatin, dem Genmaterial höherer Organismen,
das sich während der Zellteilung zum Chromosom zusammenfaltet. Für das Studium solcher
Faltungsprozesse, die auch für die Ablesbarkeit von einzelnen Genen von Bedeutung
sind, werden idealerweise Chromatinbruchstücke (= Oliginukleosomen) von klar definierter
Länge benötigt. Bei derzeit benutzten molekularbiologisch/biochemischen Herstellungsverfahren
gelten beispielsweise Bruchstücke mit 40 i 10 Nukleosomen als ~homogen". Bei Einsatz
des erfindungsgemäßen Verfahren läßt sich bei einem mittleren Nukleosomabstand von
14 nm bei einer Wellenlänge von 560 nm eine deutlich bessere Homogenität (40 i 1)
erreichen.
-
4. Ähnlich lassen sich intermediäre Filamente, Mikrotubuli oder filamentöse
Bakterienphagen zerschneiden mit dem Ziel, die erhaltenen kurzen Stükke dieser grob
zylindrischen Strukturen zur Herstellung von Kristallen für Röntgenbeugungsexperimente
zu nutzen. Bisher waren für solche elongierten Objekte nur Röntgenbeugunsexperimente
an Fasern möglich, die eine wesentlich geringere Information boten. Da bei den in
Punkt 3 und 4 beschriebenen Anwendungen die zu bearbeitenden Objekte nicht sichtbar
sind, müssen sie in einer Strömung oder in einem elektrischen Felo ausgerichtet
und "blind» geschnitten werden.
-
5. Die Abbildung zeigt Chromosomen aus menschlichen Lymphozyten. Einige
Chromosomen (kleine Pfeile) sind mit dem gesamten Strahl bearbeitet, so daß sich
das gesamte Beugungsmuster in den Läsionen bemerkbar macht. Bei dem durch den großen
Pfeil markierten Chromosom wurde das zentrale Beugungsscheibchen außerhalb des Chromosoms
angesetzt, so daß nur das annähernd parallele Schnittmuster zu sehen ist. Die verwendete
Lichtwellenlänge war 570 nm.