DE102014205535A1

DE102014205535A1 - Vorrichtung und in-vitro Verfahren zur markierungsfreien Darstellung und Analyse von Zellen und Kristallen in einer biologischen Probe

Info

Publication number: DE102014205535A1
Application number: DE102014205535.0A
Authority: DE
Inventors: Oliver Hayden; Andreas Kappel; Oliver Schmidt
Original assignee: Siemens AG
Current assignee: Siemens AG
Priority date: 2014-03-25
Filing date: 2014-03-25
Publication date: 2015-10-01
Also published as: WO2015144608A1

Abstract

Die Erfindung betrifft ein in-vitro-Verfahren und eine Zelldarstellungsvorrichtung zur Darstellung von Zellen, insbesondere von Zelltopographien, oder von Kristallen in einer biologischen Probe. Eine biologische Probelösung mit wenigstens einer Zelle oder wenigstens einem Kristall wird in einen mikrofluidischen Kanal geführt. Die Zelle oder der Kristall wird im mikrofluidischen Kanal zum Rotieren gebracht. Es werden dann zwei zeitlich aufeinander folgende Bilder derselben Zelle oder desselben Kristalls aus unterschiedlichen Orientierungen mittels einer Mikroskopiervorrichtung erzeugt.

Description

Die Erfindung betrifft eine Vorrichtung und ein in-vitro Verfahren zur markierungsfreien Darstellung und Analyse von Zelltopographien und Zelltypen unter Verwendung einer Mikroskopiervorrichtung.
Die Darstellung von biologischen Proben, insbesondere von Zellen, Bakterien oder Partikeln in Suspension ist von besonderer Bedeutung, wenn diese Proben identifiziert, klassifiziert und ggf. sortiert werden müssen.
Insbesondere das Bestimmen von Zellen und deren Zuordnung zu einem Zelltyp ist in der Zytologie von großer Bedeutung. In hämatologischen Untersuchungen werden beispielsweise zelluläre Blutkomponenten, wie Erythrozyten, Thrombozyten und weiße Blutzellen bestimmt und quantifiziert. Die weißen Blutzellen werden nach granulären Zellen, wie beispielsweise Neutrophile, Eosinophile und Basophile, und nach nicht granulären Zellen, beispielsweise Lymphozyten oder Monozyten differenziert. Rote Blutkörperchen werden je nach Reife in Reticulozyten und reife Erythrozyten eingeteilt.
Für die Differenzierung von granulären Zellen, insbesondere von Eosinophilen und Basophilen, wird eine Färbung eingesetzt. Die Auswertung der Zellpopulationen erfolgt üblicherweise durch vollautomatisierte Hämatologie-Analysatoren oder durch Mikroskopie. Die Analyse in vollautomatisierten Analysatoren erfolgt nach festgesetzten Algorithmen. Dies führt jedoch dazu, dass in Proben mit pathologischen Populationen Fehlermeldungen angezeigt werden. Daher werden im nächsten Schritt üblicherweise Mikroskopaufnahmen der Zellen als Validierungsmethode ausgewertet. Dieser Schritt ist aufwendig und kostenintensiv, da er in der Probenvorbereitung, Mikroskopie und weiteren Bearbeitungsschritten manuelle Bewertung erfordert.
Eine Analyse von unterschiedlichen Zelltypen ist ebenfalls in der Urinanalyse nötig. Die Urinsedimentanalyse ist eine etablierte in-vitro Diagnostikmethode zur Bestimmung von Nierenstörungen und Störungen des Urogenitaltraktes. Die Urinprobe wird typischerweise zentrifugiert, der Überstand verworfen und das Sediment wieder resuspendiert. Anschließend wird die Probe mittels eines Phasenkontrastmikroskops untersucht. Weiterhin können zelluläre Elemente mittels der Sternheimer-Malvin-Färbung dargestellt werden. Mit polarisiertem Licht ist es möglich, doppelbrechende Elemente, wie beispielsweise Harnsäurekristalle, Lipidtröpfchen oder ovale Fettkörnchen nachzuweisen. Auch hier müssen die Probenvorbereitung, Mikroskopie und weitere Arbeitsschritte inklusive der Auswertung manuell erfolgen. Dies ist aufwendig und kostenintensiv.
Auch in der quantitativen Blutzelldiagnostik kann auf ein Hämatologie-Analysator verzichtet werden und stattdessen jede Einzelzelle mikroskopiert werden. Dann ist es möglich, das Blutbild unabhängig von festen Algorithmen quantitativ zu bestimmen. Von Nachteil ist allerdings, dass der Probendurchsatz deutlich geringer als bei einem Hämatologie-Analysator ist. Weiterhin bleibt der Aufwand, die Zellen auf Objektträgern zu immobilisieren und zu färben weiterhin bestehen.
Die der Erfindung zugrundeliegende Aufgabe ist folglich das Bereitstellen eines effizienten und zeitsparenden Verfahrens zum Darstellen von Zellen und Kristallen in biologischen Proben.
Diese Aufgabe wird von dem erfindungsgemäßen Verfahren und der erfindungsgemäßen Zelldarstellungsvorrichtung gemäß den unabhängigen Patentansprüchen gelöst. Vorteilhafte Weiterbildungen der Erfindung sind durch die Unteransprüche gegeben.
Das erfindungsgemäße in-vitro-Verfahren zur Darstellung von Zellen, insbesondere von Zelltopographien, oder von Kristallen in einer biologischen Probe erfolgt in mehreren Schritten. Eine biologische Probelösung mit wenigstens einer Zelle und/oder wenigstens einem Kristall wird in einen mikrofluidischen Kanal geführt. Die Zelle und/oder der Kristall wird im mikrofluidischen Kanal mittels einer ersten Vorrichtung zum Rotieren gebracht. Es werden dann zwei zeitlich aufeinander folgende Bilder derselben Zelle und/oder des Kristalls mittels einer Mikroskopiervorrichtung erzeugt.
Die Erfindung umfasst weiterhin eine Zelldarstellungsvorrichtung zur Analyse von Zellen und/oder Kristallen in einer biologischen Probe. Diese Zelldarstellungsvorrichtung umfasst einen mikrofluidischen Kanal zum Aufnehmen der biologischen Probe, eine erste Vorrichtung zur Initiierung einer Rotation einer biologischen Zelle und/oder eines Kristalls im mikrofluidischen Kanal, und eine Mikroskopiervorrichtung zum Abbilden der Zelle und/oder des Kristalls. Die Mikroskopiervorrichtung ist derart ausgebildet, dass sie wenigstens zwei Bilder derselben Zelle und/oder desselben Kristalls erzeugen kann.
Vorteilhaft ist es mittels des erfindungsgemäßen Verfahrens und der Zelldarstellungsvorrichtung möglich, die Zelle und/oder Kristalle aus unterschiedlichen Perspektiven darzustellen, insbesondere zu fotografieren. Somit können Kristalle und Zellen, insbesondere pathologisch veränderte Zellen, analysiert und klassifiziert werden. Urinproben umfassen typischerweise Kristalle. Es ist bei Urinproben ebenso möglich, dass sowohl Zellen, wie beispielsweise rote oder weiße Blutkörperchen, als auch Kristalle in einer biologischen Probe auftreten. In Blutproben sind typischerweise ausschließlich Zellen unterschiedlicher Zelltypen enthalten, welche analysiert werden. Ein Zell- oder Kristallnachweis ist ausschließlich aufgrund der morphologischen Beschaffenheit der Zelle oder des Kristalls möglich. Die Rotation insbesondere der Zelle in Kombination mit einer Mikroskopiervorrichtung ermöglicht das Abbilden der Zelle mit dem optischen System aus verschiedenen Orientierungen. Die Zellen sind somit gut differenzierbar, insbesondere nach einer Rekonstruktion. Insbesondere Zellen mit optisch auffälligen dreidimensionalen Strukturen, wie beispielsweise ausgeprägten Organellen, Granulae oder spezielle Zellformen wie Erythrozyten und Megakariozyten, lassen sich aus verschiedenen Winkeln darstellen, wobei die Mikroskopiervorrichtung fixiert ist.
Die Zellen oder Kristalle verbleiben in ihrer nativen Umgebung, wodurch vorteilhaft Artefakte von beispielsweise Trocknung und Färbung verhindert werden. Dies ermöglicht eine schnelle und wenig aufwendige Probenpräparation, die idealerweise für Point-of-Care-Anwendungen einsetzbar ist. Für die Analyse von Urin ist keine Sedimentationsanalyse notwendig. Bereits mit einem geringen Probenvolumen können Zellen und/oder Kristalle im Urin in ihrer nativen Umgebung analysiert werden, da sie aus verschiedenen Richtungen abgebildet werden.
In einer vorteilhaften Ausgestaltung und Weiterbildung der Erfindung wird eine dreidimensionale Abbildung einer Zelloberfläche, d. h. der Zelltopographie der Zelle, oder eine Kristalloberfläche aus den wenigstens zwei Bildern der Zelle mittels einer Prozessoreinheit berechnet. Vorteilhaft ermöglicht das dreidimensionale Modell der Zelle eine Klassifizierung in beispielsweise pathologische und nicht-pathologische Zelltypen. Weiterhin ist die Unterscheidung reifer Erythrozyten und Reticulozyten möglich.
In einer weiteren vorteilhaften Ausgestaltung und Weiterbildung der Erfindung wird die Rotation der Zelle hydrodynamisch mittels einer gezielten Strömung initiiert. Diese gezielte Strömung ist insbesondere eine Wirbelströmung, die die Zelle in Relation zur Mikroskopiervorrichtung rotiert, derart, dass die Mikroskopiervorrichtung die Zelle oder den Kristall aus unterschiedlichen Perspektiven aufnehmen kann ohne ihre eigen Position zu verändern. Die Zellen oder im Fall der Urinanalyse auch die Kristalle, werden berührungslos manipuliert und können somit vorteilhaft in ihrer nativen Umgebung verbleiben. Die Rotation ist insbesondere durch die Strömungsgeschwindigkeit der biologischen Probe durch den mikrofluidischen Kanal einzustellen. Vorteilhaft werden weiterhin Zentrifugationsaggregate, insbesondere von Kristallen, bei der Urinsedimentationsanalyse vermieden. Durch das kontinuierliche Führen von biologischer Probe durch den mikrofluidischen Kanal, kann die Analyse vorteilhafterweise solange dauern, bis eine minimale Anzahl von partikulären Komponenten des Urins oder Bluts analysiert ist. In Abhängigkeit der Durchflussgeschwindigkeit kann anschließend auf insbesondere die Erythrozytenzahl zur Klassifizierung zurückgeschlossen werden.
In einer weiteren vorteilhaften Ausgestaltung der Erfindung wird die Strömung mittels wenigstens eines Strömungshindernisses im mikrofluidischen Kanal erzeugt. Ebenso kann die Strömung mithilfe der Zufuhr einer Trägerflüssigkeit in einem bestimmten Winkel zu der Längsachse des mikrofluidischen Kanals erzeugt werden. Dieser Winkel ist insbesondere ein rechter Winkel.
In einer weiteren vorteilhaften Ausgestaltung und Weiterbildung der Erfindung werden die Zellen ungefärbt analysiert. Sie können somit vorteilhaft in ihrer nativen Umgebung ohne Artefakte von Trocknung und Färbung analysiert werden. Daher ist vorteilhaft eine kontinuierliche Analyse von Probelösung im mikrofluidischen Kanal möglich.
In einer weiteren vorteilhaften Ausgestaltung und Weiterbildung der Erfindung ist die Mikroskopiervorrichtung ein digital-holographisches Mikroskop. Der Einsatz eines digitalholographischen Mikroskops erlaubt es, die Phaseninformation des Objekts quantitativ zu erfassen. Diese Mikroskopie-Methode ermöglicht eine besonders hohe axiale Auflösung. Axial bedeutet in der Richtung der optischen Achse des Mikroskops. Eine digital-holographische Mikroskopie ermöglicht eine Auflösung von bis zu einem Nanometer in z-Richtung. Dies entspricht einer Präzision, die um einen Faktor 100 bis 1000 höher liegt als mit anderen bekannten lichtmikroskopischen Verfahren. Aufgrund der präzisen Ermittlung eines Dickenprofils der Zelle gegenüber dem umgebenden Medium ist eine genauere Bestimmung des Zelltyps möglich. Als umgebendes Medium wird hier insbesondere die Trägerflüssigkeit im mikrofluidischen Kanal bezeichnet.
Der Einsatz des digital-holographischen Mikroskops ist weiterhin besonders für das Fokussieren von sich in Rotation befindlichen Objekten von großem Vorteil. Da die Position der Zelle oder des Kristalls in z-Richtung, d.h. entlang der optischen Achse des Mikroskops, nicht genau bekannt ist, kann die Zelle nachträglich durch Computer-Rekonstruktion des aufgenommenen Hologramms fokussiert werden. Dadurch wird ein aufwändiger Autofokus wie er bei einem herkömmlichen Mikroskop nötig wäre, vermieden. Weiterhin ermöglicht das nachträgliche, digitale Fokussieren das Berechnen unterschiedlicher Foki für unterschiedliche laterale Positionen im Bildfeld. Das bedeutet, es können sich mehrere Zellen und/oder Kristalle gleichzeitig im Bildfeld des Mikroskops befinden und zeitgleich abgebildet werden. Insbesondere können sie auch dann abgebildet werden, wenn sich die Zellen nicht in einer Fokusebene befinden. Der Einsatz eines Konfokal-Mikroskops zur Rekonstruktion der Zellen wird somit vermieden. Ebenso wird vorteilhaft der Einsatz eines Polarisierers vermieden.
Das digital-holographische Mikroskop kann optional mit Leuchtdioden (LEDs) oder Laserdioden verschiedener Wellenlänge ausgerüstet sein. Dann können die Parameter Brechungsindex und physikalische Dicke der Objekte, insbesondere der Zellen, voneinander getrennt werden.
In einer weiteren vorteilhaften Ausgestaltung und Weiterbildung der Erfindung ist das digital-holographische Mikroskop ein linsenfreies Mikroskop. Auf vorteilhafte Weise können dann mehrere mikrofluidische Kanäle auf einer Analyseeinheit, beispielsweise einem Chip, ausgewertet werden. Somit ist ein hoher Durchsatz von biologischen Proben zur Analyse möglich. Diese mehreren Mikrofluid-Kanäle können beispielsweise parallel auf einem Chip angeordnet sein.
In einer weiteren vorteilhaften Ausgestaltung und Weiterbildung der Erfindung umfasst die Zelldarstellungsvorrichtung eine zweite Vorrichtung zum Erfassen von Mie- und/oder Rayleigh-Streuung. Diese Daten können vorteilhaft zusätzlich zur Differenzierung der Objekte, insbesondere der Zellen, herangezogen werden.
In einer weiteren vorteilhaften Ausgestaltung und Weiterbildung der Erfindung sind die Zelle und/oder der Kristall mit einem Farbstoff eingefärbt. Bereits die erste Mikroskopiereinrichtung kann zur Abbildung des Farbstoffs, insbesondere des Fluoreszenzfarbstoffs ausgebildet sein. Alternativ umfasst die Zelldarstellungsvorrichtung eine zweite Mikroskopiervorrichtung als Fluoreszenzmikroskop. Das Einfärben, bzw. Markieren mit spezifischen Markierungen, insbesondere mit Fluorophor oder Streulichtmarkern, insbesondere Gold, und anschließende Analysieren der Zellen ermöglicht ein Differenzieren über die reine Morphologie hinaus. Das Markieren erfolgt insbesondere mittels Antikörpern, welche an spezifische Epitope der Zelle binden. Diese Epitope korrelieren wiederum mit einer Zellfunktionalität. Die Zelldarstellungsvorrichtung mit genau einem ersten Mikroskop zur Abbildung von Farbstoffen kann einen Farbstoff in einer Zelle von verschiedenen Seiten abbilden. Eine Zelldarstellungsvorrichtung mit der ersten und der zweiten Mikroskopiervorrichtung kann insbesondere die Morphologie einer Zelle mit hoher Auflösung in z-Richtung bestimmen und den Farbstoff nachweisen.
Die Erfindung wird nachfolgend anhand eines Ausführungsbeispiels unter Bezugnahme auf die Zeichnungen noch weiter erläutert. Es zeigen schematisch:
1 eine schematische Darstellung des mikrofluidischen Kanals mit Mikroskopiervorrichtung und zwei Schnittbilder des mikrofluidischen Kanals,
2 ein weiteres schematisches Bild des fluidischen Kanals mit Mikroskopiervorrichtung und einen zweiten Querschnitt des Fluidkanals,
3 einen Querschnitt durch den mikrofluidischen Kanal im Bildfeld der mikroskopischen Vorrichtung zum Zeitpunkt t1,
4 einen Querschnitt durch den mikrofluidischen Kanal im Bildfeld der Mikroskopiervorrichtung zum Zeitpunkt t2,
5 zwei Mikroskopaufnahmen zu den Zeitpunkten t1 und t2.
Mithilfe des in-vitro-Verfahrens und der Zelldarstellungsvorrichutng zur Analyse von Zellen und Kristallen kann ein markierungsfreies Bestimmen der biologischen Probe erfolgen. Markierungsfrei bedeutet hier, dass die Zellen nicht durch beispielsweise Fluoreszenzfarbstoffe oder radioaktive Partikel markiert werden müssen. Eine biologische Probe kann daher beispielsweise eine Probe tierischer oder pflanzlicher Zellen, bakterieller Zellen und/oder Einzeller umfassen. Weiterhin kann die biologische Probe tierische oder menschliche Urinproben umfassen. In der Blutanalyse handelt es sich vorzugsweise um Vollblutproben, die beispielsweise Blutzellen wie Leukozyten, eosinophile Granulozyten oder basophile Granulozyten umfasst.
In diesen Ausführungsbeispielen umfasst die biologische Probe 1, hier Blut, einen ersten reifen Erythrozyten 2, einen dysmorphen Erythrozyten 3, einen Leukozyten 4 und einen zweiten Erythrozyten 5. Die biologische Probe 1 wird in den Mikrofluidkanal 7 geführt. Die Zelldarstellungsvorrichtung 18 dieses Beispiels umfasst weiterhin ein digitalholographisches Mikroskop 6. Das Bildfeld 8 des digitalholographischen Mikroskops 6 zeigen die 3 bis 5.
In allen Ausführungsbeispielen wird die biologische Probe 1 mittels des Mikrofluidkanals 7 an dem digitalholographischen Mikroskop 6 vorbeigeführt. Die Zufuhr der biologischen Probe 1 erfolgt somit kontinuierlich in den Mikrofluidkanal 7. Die 1 und 2 zeigen jeweils Vorrichtungen 10, 11, 19, 20, welche die Zellen in Rotation versetzen.
1 zeigt ein erstes Strömungshindernis 10 und ein zweites Strömungshindernis 11. Diese sind in einem definierten Abstand zum Bildfeld 8 des Mikroskops 6 angeordnet. Der Abstand ist derart, dass die Rotation der Zellen 2, 3, 4, 5 im Bildfeld 8 erfolgt. Die Schnittbilder AA‘ und BB‘ zeigen zwei typische Strömungshindernisse 10 und 11 in dem Mikrofluidkanal 7. Sie sind versetzt zueinander im Mikrofluidkanal 7 angeordnet, um die eine Wirbelströmung der biologischen Probe 1 zu erzeugen.
Das erste Strömungshindernis 10, das zweite Strömungshinderniss 11 und der mikrofluidische Kanal 7 werden typischerweise aus demselben Material hergestellt. Insbesondere werden die Hindernisse 10, 11 und der mikrofluidische Kanal 7 in demselben Prozessschritt hergestellt. Die Herstellung erfolgt mittels Heiß-Stempeln ( engl. „hot embossing“) oder alternativ mittels Spritzgießen. Als Materialen werden transparente Polymere verwendet. Diese Polymere sind typischerweise Polymethylmethacrylat (PMMA), Polyethylen, Polyethylenglycol, Polydimethylsiloxan, Polycarbonate, Polyetylenterephthalat (PET), Polystyrol oder Glas.
Die Dimension der Strömungshindernisse 10, 11 wird derart gewählt, dass sie 20%–50% des Querschnitts des Mikrofluidkanals 7 ausfüllen. Die Breite 21 und Höhe 22 der einzelnen Strömungshindernisse 10, 11 beträgt typischerweise wenigstens 10% der Mikrofluidkanalbreite 23. Die typische Mikrofluidkanalbreite 23 beträgt 50 bis 500 µm. In diesem Beispiel beträgt die Mikrofluidkanalbreite 23 100 µm. Der Abstand der beiden Strömungshindernisse 10, 11 zueinander ist abhängig von der Mikrofluidkanalbreite 23 und liegt typischerweise in einem Bereich von halber bis doppelter Mikrofluidkanalbreite 23. Die Anzahl der Strömungshindernisse kann variieren, beträgt aber wenigstens eins.
2 zeigt ein zweites Ausführungsbeispiel für die Initiierung der Rotation der Zellen 2, 3, 4, 5. In diesem Ausführungsbeispiel werden eine erste Trägerflüssigkeit 14 mittels des ersten Zuflusskanals 19 und eine zweite Trägerflüssigkeit 15 mittels des zweiten Zuflusskanals 20 in den Mikrofluidkanal 7 geführt. Die Zuflusskanäle sind dabei orthogonal zur Längsachse des Mikrofluidkanals 7 angeordnet. Das Schnittbild CC' des Fluidkanals 7 zeigt, dass die erste Trägerflüssigkeit unterhalb der zweiten Trägerflüssigkeit zugeführt wird. Hierdurch wird eine Verwirbelung der biologischen Probe 1 im Mikrofluidkanal 7 erzeugt. Wiederum ist diese Vorrichtung zur Rotation der Zellen derart im Mikrofluidkanal 7 angeordnet, dass die Zellen besonders im Bildfeld 8 rotieren. Auch hier erfolgt die Zufuhr der biologischen Probe 1 kontinuierlich.
Als Trägerflüssigkeit wird typischerweise Wasser mit isotonischem Salzgehalt verwendet. Das Verhältnis vom Volumen der ersten oder zweiten Trägerflüssigkeit 14, 15 zu dem Volumen der biologischen Probe beträgt wenigstens eins. Alternativ kann auch die biologische Probe selber als Trägerflüssigkeit 14, 15 fungieren. Typischerweise erfolgt das Verfahren unter physiologischen Bedingungen, das heißt die Temperatur beträgt 37°C. Es können aber ebenso Temperaturen in einem Bereich von 1°C bis 99°C, insbesondere von 20°C bis 40°C, für die Analyse der Zellen gewählt werden. Die Strömungsgeschwindigkeiten der Trägerflüssigkeiten 14, 15 und der biologischen Probe 1 betragen in diesem Beispiel 100 µm/s. Typischerweise betragen die Strömungsgeschwindigkeiten wenigsten 0,1 µm/s und liegen insbesondere in einem Bereich zwischen 10µm/s bis 1000µm/s.
Die 3 und 4 zeigen jeweils das Bildfeld 8 des digitalholographischen Mikroskops 6. Es sind beispielhaft vier Bildebenen 9 des digitalholographischen Mikroskops 6 dargestellt. Eine erste Bildebene 9 soll hier als Beispiel für das Analysieren eines ersten reifen Erythrozyten 2 dienen. Jede beliebige Bildebene ist durch das digitale Fokussieren mit dem digital-holographischen Mikroskop 6 frei wählbar. Dies bedeutet insbesondere, dass eine Zelle 2, 3, 4, 5 nicht in derselben Bildebene bleiben muss. Sie kann durch die rotierende Bewegung zu unterschiedlichen Zeiten in unterschiedlichen Bildebenen 9 positioniert sein. Weiterhin können in demselben Bild unterschiedliche Zellen 2, 3, 4, 5 analysiert werden.
Die Belichtungszeit der einzelnen Bilder ist typischerweise sehr kurz, um Bewegungsunschärfe zu vermeiden. Der Abstand zweier Bilder sollte derart gewählt sein, dass wenigstens zwei Bilder aufgenommen werden, während die Zelle 2, 3, 4, 5 das Bildfeld 8 passiert. In diesem Beispiel beträgt die Strömungsgeschwindigkeit 100µm/s, die Bildfeldgröße beträgt 200µm, typisch für ein 40fach Objektiv.
Die Belichtungszeit ist insbesondere kürzer als 1 ms, damit die Bewegungsunschärfe kleiner 1 µm ist. Der zeitliche Abstand zwischen zwei Bildern beträgt weniger als 100ms, insbesondere weniger als 10ms, um mehr als zwei Bilder, d.h. Mikroskopieaufnahmen machen zu können.
4 zeigt die Position des reifen Erythrozyten 2 zum Zeitpunkt t2 im Bildfeld 8. 5 zeigt beispielhaft eine erste und eine zweite Mikroskopieaufnahme 16, 17 zu den Zeitpunkten t1 und t2 des reifen Erythrozyten 2. Die Bildebene 9 wurde hier also auf den reifen Erythrozyten 2 fokussiert. Mittels einer weiteren Bildebene können in diesem Beispiel auch der dysmorphen Erythrozyt 3 und der Leukozyt 4 abbgebildet werden.

Claims

In-vitro Verfahren zur Darstellung von Zellen (2, 3, 4, 5) oder Kristallen in einer biologischen Probe 1 mit folgenden Schritten: – Führen der biologischen Probe (1) mit wenigstens einer Zelle (2, 3, 4, 5) und/oder einem Kristall in einen mikrofluidischen Kanal (7), – Initiieren einer Rotation der Zelle (2, 3, 4, 5) und/oder des Kristalls im mikrofluidischen Kanal (7) mittels einer ersten Vorrichtung (10, 11, 19, 20), – Erzeugen wenigstens zweier zeitlich aufeinander folgender Bilder (16, 17) derselben Zelle (2, 3, 4, 5) und/oder desselben Kristalls mittels einer Mikroskopiervorrichtung (6).
Verfahren nach Anspruch 1, wobei eine dreidimensionale Abbildung einer Zelloberfläche der Zelle (2, 3, 4, 5) oder einer Kristalloberfläche aus den wenigstens zwei Bildern (16, 17) der Zelle (2) mittels einer Prozessoreinheit berechnet wird.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei anhand der Bilder ein Zelltyp, insbesondere ein dysmorpher Zelltyp, ermittelt wird.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Rotation der Zelle (2, 3, 4, 5) oder des Kristalls hydrodynamisch mittels einer gezielten Strömung, insbesondere Wirbelströmung, der biologischen Probe (1) initiiert wird.
Verfahren nach Anspruch 4, wobei die Strömung mittels wenigstens eines Strömungshindernisses (10, 11) im mikrofluidischen Kanal (7) erzeugt wird.
Verfahren nach Anspruch 4 oder 5, wobei die Strömung mit Hilfe der Zufuhr einer Trägerflüssigkeit (14, 15) in einem bestimmten Winkel, insbesondere rechtwinklig, zu einer Längsachse des mikrofluidischen Kanals (7) erzeugt wird.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Zelle (2, 3, 4, 5) und/oder der Kristall ungefärbt analysiert werden.
Zelldarstellungsvorrichtung (18) zur Analyse von Zellen (2, 3, 4, 5) und Kristallen in einer biologischen Probe (1), umfassend: – einen mikrofluidischen Kanal (7) zum Aufnehmen einer biologischen Probe (1) mit wenigstens einer Zelle (2, 3, 4, 5) und/oder einem Kristall, – eine erste Vorrichtung zur Initiierung einer Rotation (10, 11, 19, 20) der Zelle (2, 3, 4, 5) und/oder des Kristalls im mikrofluidischen Kanal (7), – eine Mikroskopiervorrichtung zum Abbilden der Zelle (2, 3, 4, 5) und/oder des Kristalls, wobei die Mikroskopiervorrichtung (6) derart ausgebildet ist, wenigstens zwei Bilder (16, 17) derselben Zelle (2) zu erzeugen.
Zelldarstellungsvorrichtung (18) nach Anspruch 8 mit einer Prozessoreinheit zum Berechnen einer dreidimensionalen Abbildung einer Zelloberfläche der Zelle (2, 3, 4, 5) oder einer Kristalloberfläche aus den wenigstens zwei Bildern (16, 17) der Zelle (2).
Zelldarstellungsvorrichtung (18) nach Anspruch 8 oder 9, wobei die Mikroskopiervorrichtung ein digitalholographisches Mikroskop (6) ist.
Zelldarstellungsvorrichtung nach Anspruch 10, wobei das digitalholographisches Mikroskop (6) ein linsenfreies Mikroskop ist.
Zelldarstellungsvorrichtung (18) nach einem der Ansprüche 8 bis 11 mit einer zweiten Vorrichtung zum Erfassen von Mie- und /oder Rayleigh-Streuung.
Zelldarstellungsvorrichtung (18) nach einem der Ansprüche 8 bis 12, wobei die Zelle (2, 3, 4, 5) und/oder der Kristall mit einem Farbstoff eingefärbt ist.
Zelldarstellungsvorrichtung (18) nach einem der Ansprüche 8 bis 13 mit einem Fluoreszenzmikroskop als einer zweiten Mikroskopiervorrichtung.