DE4309328A1 - Verfahren zur Unterscheidung von Erythrozyten und Leukozyten im Vollblut mit Methoden der Streulichtmessung in einem Durchflußzytometer zur Zellzählung und Zellsortierung - Google Patents

Description

Die Erfindung gehört in den Bereich der optischen Durchflußzytometrie, bei der Mi­ kropartikel und biologische Zellen optisch gezählt und hinsichtlich ihrer Streu- und Fluoreszenzeigenschaften charakterisiert werden.

Die Durchflußzytometrie wird u. a. zur Konzentrationsbestimmung von Blutzellen in der klinischen Diagnostik angewendet. Die Durchflußzytometrie ist ein Verfahren, bei dem eine große Anzahl von Blutzellen einzeln nacheinander durch einen sensiti­ ven Bereich treten, in dem sie optische oder elektrische Signale erzeugen, die der Zählung und Differenzierung der Zellen dienen (siehe z. B. "Flow Cytometry and Sor­ ting", herausgegeben von Melamed, Lindmo und Mendelson, 1990, Wiley-Liss). In der Hämatologie ist die Konzentrationsbestimmung der Erythrozyten (rote Blutkörperchen), Thrombozyten (Plättchen) und Gesamtleukozyten (weiße Blutkör­ perchen) ein wichtiges diagnostisches Hilfsmittel. Die Konzentrationsbestimmung wird mit Hilfe der oben beschriebenen optischen und elektrischen Durchflußzytome­ ter durchgeführt. Für die hämatologische Praxis sind diese Geräte teil- oder vollau­ tomatisiert, um einen hohen Probendurchsatz zu ermöglichen. In diesen Geräten werden im allgemeinen mehrere Meßverfahren kombiniert.

Bei dem elektrischen Zählverfahren erzeugen die Zellen, deren elektrische Leitfä­ higkeit erheblich kleiner als die der umgebenden Flüssigkeit (isotone NaCl-Lösung) ist, beim Durchtritt durch die Meßöffnung wegen der Erhöhung des elektrischen Wi­ derstandes einen entsprechenden Spannungsimpuls. Dabei ist der Spannungsimpuls proportional zum Volumen der einzelnen Zelle. Optische Durchflußzytometer bein­ halten Laserlichtquellen oder klassische Lichtquellen, deren fokussierter Strahl mit einem Fokusdurchmesser im Mikrometerbereich das sensitive Volumen bildet. Die Zellen erzeugen beim Durchtritt durch dieses Wechselwirkungsvolumen Streu- und Fluoreszenzsignale, die in geeigneter Weise detektiert werden und zur Zählung und Differenzierung der Blutzellen dienen. Andere Geräte messen das gestreute Licht in mehreren Raumwinkelbereichen bzw. den Polarisationsgrad des gestreuten Lichtes relativ zur Linearpolarisation des einfallenden Laserlichtes. Für eine Messung der Leukozyten müssen die Erythrozyten vorher durch Hämolyse zerstört werden. Die Untersuchung und Konzentrationsbestimmung erfolgt u. U. in mehreren, parallelen Meßkanälen für die verschiedenen Blutzelltypen (siehe z. B. "Praktische Blutzelldiagnostik", herausgegeben von Heller und Boll, 1991, Springer-Verlag). Da­ neben gibt es optische Durchflußzytometer, die besonders für Fluoreszenz­ untersuchungen geeignet sind. Eine Konzentrationsbestimmung wie in den oben be­ schriebenen Hämatologieautomaten ist nicht möglich, da diese Geräte für immu­ nologische Anwendungen konzipiert sind. Durch die Anbindung von fluoreszenz­ markierten monoklonalen Antikörpern an Oberflächenantigene der Zellen oder durch die Anbindung von Fluoreszenzfarbstoffen an die Zellkerne ist eine Identifi­ zierung bestimmter Zellpopulationen und deren funktionale Untersuchung möglich (siehe z. B. Flow Cytometry in Hematology, herausgegeben von Laerum und Bjerknes, 1992, Academic Press). Voraussetzung dafür ist, daß die Bindung der monoklonalen Antikörper oder der Kernfarbstoffe spezifisch ist und einen hohen Prozentsatz der Zellpopulation anfärbt. Die Zuordnung zu den einzelnen Zellpopu­ lationen erfolgt durch die Korrelation der Fluoreszenzsignale und der Signale der Lichtstreuung. Das an den Blutzellen gestreute Licht wird dabei in einem Kleinwinkelbereich um die Ausbreitungsrichtung des Laserstrahls (Vorwärtsstreuung) und in einem Raumwinkelbereich senkrecht zur Ausbreitungsrichtung (90°-Streuung) detek­ tiert. Werden die Erythrozyten vorher durch eine Hämolyse zerstört, ermöglicht es die simultane Detektion der Vorwärtsstreuung und der seitlichen 90°-Streuung, neu­ trophile Granulozyten, Lymphozyten und Monozyten anhand ihrer Streulichtintensi­ täten zu unterscheiden. Die relativen Streuintensitäten der Leukozytensub­ populationen hängen von der Streuwellenlänge und den beobachteten Raum­ winkelbereichen ab. In kommerziellen optischen Durchflußzytometern wird übli­ cherweise ein Ar⁺-Laser bei 488.0 nm benutzt, da bei dieser Wellenlänge eine Anre­ gung von vielen kommerziell verwendeten Fluoreszenzfarbstoffen möglich ist.

Eine notwendige Voraussetzung für die Detektion der Streusignale von Leukozyten­ untergruppen ist die vorherige Entfernung oder Zerstörung (Hämolyse) der Erythro­ zyten. Erythrozyten stellen den überwiegenden Teil der Blutzellen dar und erzeugen Streuintensitäten in der Vorwärtsstreuung und in der seitlichen Streuung, die im Be­ reich der Streuintensitäten der Leukozyten liegen. Damit ist eine Identifizierung der Leukozytenimpulse bei der Verwendung von Vollblutproben nicht durchführbar. Dieses Streulichtverfahren in Verbindung mit der vorhergehenden Hämolyse der Erythrozyten entspricht dem Stand der Technik.

Der präparative Schritt der Hämolyse der Erythrozyten hat mehrere Nachteile. Es ist bekannt, daß der Prozeß der Lysierung die anderen Zellarten nachteilig beeinflussen kann. Eine Schädigung oder Zerstörung der Leukozyten ist nicht auszuschließen. Dadurch beinhaltet die Konzentrationsangabe der Leukozytenuntergruppen Fehler, da nach der Lysierung weiße Blutkörperchen verändert oder zerstört worden sind und sich auf diese Weise einer Zählung und Differenzierung entziehen. Auf jeden Fall befinden sich die Leukozyten nach der Lysierung nicht mehr im nativen Zustand. Darüber hinaus werden in kommerziellen Geräten verschiedene Lysiermittel einge­ setzt, die unterschiedliche Auswirkungen auf die Leukozyten haben.

Markierungsmethoden mit Fluoreszenzfarbstoffen, die zur Markierung von weißen Blutkörperchen eingesetzt werden, haben den Nachteil, daß sie nicht vollständig spe­ zifisch sind und einen weiteren Präparationsschritt darstellen, der bei Verwendung von monoklonalen Antikörpern zudem zeit- und kostenintensiv ist.

Das technische Problem, das der Erfindung zugrunde liegt, ist es, ein Verfahren zur Bestimmung der Konzentration von Leukozyten in einer mit isotonischer Kochsalzlö­ sung verdünnten Blutprobe zu finden, bei dem

• - der verfälschende Einfluß der Hämolyse auf die Leukozyten ausgeschlossen wird,
• - als einziger Präparationsschritt die Verdünnung der Blutprobe in isotonischer Kochsalzlösung notwendig ist,
• - Leukozyten aufgrund ihrer optischen Signale in ihrer Gesamtheit von Erythro­ zyten und Thrombozyten unterschieden und in ihren Untergruppen identifiziert werden können,
• - keine Fluoreszenzmarkierung oder Anbindung von Farbstoffen zur Identifizie­ rung der Leukozytenpopulationen notwendig ist,
• - eine Datenerfassung die Aufnahme der optischen Signale mit einer derart kur­ zen Verarbeitungszeit zuläßt, daß die Datenaufnahme der Erythrozytenimpulse durch ihre große Häufigkeit nicht die Datenaufnahme der Leukozytenimpulse beeinträchtigt.

Die Lösung des technischen Problems und der Gegenstand der Erfindung ist das im folgenden beschriebene Streulichtverfahren: Es wird ausgenutzt, daß die Erythrozy­ ten in einem hohen Maße Hämoglobin enthalten. Das Hämoglobin beeinflußt das Lichtstreuverhalten der einzelnen Erythrozyten, wobei im Bereich des Absorptionsmaximums des Hämoglobins im blauen Spektralbereich von 405 nm bis 425 nm die hohe Absorption des Hämoglobins eine verminderte Streuintensität der Erythrozyten bewirkt. Dann ist es möglich, die Streusignale der Erythrozyten von denen der Leukoyzten zu unterscheiden, da die Streuintensitäten der Leukozyten aufgrund des fehlenden Hämoglobins keine ausgeprägte Wellenlängenabhängigkeit der Streuintensität zeigen. Darüber hinaus können Leukozytenuntergruppen durch ihr unterschiedliches Streuverhalten identifiziert werden.

Das Streulichtverfahren wird erfindungsgemäß realisiert, indem man eine Laserwel­ lenlänge verwendet, die im Maximum der spektralen Hämoglobinabsorptionskurve liegt. Dazu bieten sich besonders die drei Wellenlängen eines Krypton-Ionenlasers an, die im Wellenlängenbereich zwischen 406 nm und 415 nm liegen. Das Streulicht der einzelnen Blutzellen, die den Laserfokus passieren, wird in zwei Raumwinkelbe­ reichen aufgenommen. Der erste Raumwinkelbereich liegt in der Vorwärtsrichtung in bezug auf die Ausbreitungsrichtung des direkten Laserstrahls (Vorwärtsstreuung). Der zweite Winkelbereich ist ein Konus rechtwinklig zur Ausbreitungsrichtung des Laserstrahls (90°-Streuung). Die Streusignale in der Vorwärtsrichtung und der seitli­ chen Richtung werden in geeigneter Weise detektiert und dem Datenerfassungssy­ stem zugeführt. Die Datenaufnahme erfolgt erfindungsgemaß korreliert für die Meß­ parameter, damit nach der Messung eine simultane, korrelierte Darstellung beider Streueigenschaften (Vorwärtsstreuung, seitliche 90°-Streuung) möglich ist. Für eine Konzentrationsbestimmung wird das während einer Messung durchsetzte Probenvo­ lumen gemessen. Aus der während eines Meßintervalls detektierten, korrelierten Er­ eignisanzahl für Erythrozyten und Leukozyten ergibt sich mit einer gegebenenfalls notwendigen Korrektur der Zählverluste die Konzentration der Erythrozyten und Leukozyten.

Die Fig. 1 zeigt eine mögliche Ausführungsform des Meßaufbaus. Die Zahlen haben dabei folgende Bedeutung:

1: Teleskop aus sphärischen Linsen
2: Teleskop aus Zylinderlinsen
3: Punktblende
4: Raumfilter
5: Neutralglasfilter
6: Photodetektor.

Das erfindungsgemäße Streulichtverfahren soll im folgenden an einem Ausführungsbeispiel unter Bezugnahme auf die Ausführungsform (Fig. 1) erläutert werden. Als Laserlichtquelle wird beispielsweise ein Krypton-Ionenlaser verwendet, der die La­ serlinie bei λ = 413,1 nm emittiert. Diese Laserwellenlänge liegt im Absorptionsma­ ximum des roten Blutfarbstoffes und ist deswegen aufgrund der vorstehenden Erläu­ terungen sehr gut geeignet. Der Laserstrahl wird durch Linsenteleskope im Strahlen­ gang derart geformt, daß ein elliptischer Laserstrahlquerschnitt entsteht. Der Laser­ strahl wird durch das Mikroskopobjektiv in den Flußkanal der Quarzkapillare fokus­ siert und hat dort die Abmessungen von 10 µm in der Höhe und 50 µm in der Breite. Die Zellen treten senkrecht durch den Laserstrahl (d. h. senkrecht zur Zeichenebene) mit einer Geschwindigkeit von ungefähr 10 m/s hindurch und erzeugen dabei Streu­ lichtimpulse, die in der Vorwärtsrichtung in einem Raumwinkelbereich von 3° bis 17°, gemessen von der Ausbreitungsrichtung des direkten Laserstrahls (0°-Richtung), durch ein Mikroskopobjektiv aufgenommen werden. In der seitlichen Richtung wird der Raumwinkelbereich durch die Apertur des verwendeten Mikroskopobjektivs be­ stimmt, so daß hier ein Winkelbereich von ± 26° um die 90°-Richtung detektiert wird. Der direkte Laserstrahl wird in der Vorwärtsrichtung durch eine Punktblende abgeschattet, da nur das gestreute Licht beobachtet werden soll. Ein Raumfilter, be­ stehend aus einem Mikroskopobjektiv und einer Lochblende von 50 µm Durchmes­ ser, bewirkt, daß unerwünschtes Streulicht, das z. B. an den Innenwänden der Quarz­ küvette entsteht, nicht durch das Raumfilter gelangt. In der Vorwärtsrichtung wird das an den Zellen gestreute Licht mittels einer Photodiode detektiert; für die seitli­ che Streuung wird eine Photomultiplierröhre eingesetzt, da das Streulicht in diesen Raumrichtungen etwa einen Faktor 100 schwächer ist. Die Stromsignale der Photo­ detektoren werden in Strom-Spannungs-Wandlern in Spannungsimpulse um­ gewandelt. Die Bandbreite dieser Module ist mit 1,5 MHz den Anstiegszeiten der op­ tischen Signale im Bereich von einigen hundert Nanosekunden angepaßt. Die opti­ schen Signale der Vorwärtsstreuung und der seitlichen Streuung, die beim Durchgang einer Zelle durch den Laserfokus gleichzeitig auftreten, werden durch das nachge­ schaltete Datenerfassungssystem in ihrer Impulsamplitude detektiert und als simul­ tanes Ereignis abgespeichert.

Die mit isotonischer Kochsalzlösung um einen Faktor von beispielsweise 50 ver­ dünnte Vollblutprobe befindet sich in einer Präzisionsglasspritze mit einem Fas­ sungsvolumen im Milliliterbereich. Der Kolben der Spritze wird kontinuierlich von einem Gleichstrommotor vorgeschoben. Während eines Meßintervalls wird ein Probenvolumen von 50 µl mit einem Fehler von ca. 0,1% durchgesetzt.

Die Fig. 2 zeigt die korrelierte Darstellung der Impulse der Vorwärtsstreuung und der seitlichen Streuung einer in isotonischer Kochsalzlösung verdünnten Vollblutprobe bei einer Meßwellenlänge von λ = 413,1 nm. Jeder Punkt bedeutet mindestens eine Zelle. Die Populationen (1)-(4) stellen die Impulse der neutrophilen Granulo­ zyten (1), Monozyten (2), Lymphozyten (3) und Erythrozyten (4) dar. Durch die Aus­ zählung der Bereiche (1) bis (4) und unter Einbeziehung des während des Meßinter­ valls durchgesetzten Probenvolumens kann somit eine Konzentrationsangabe der Erythrozyten, Gesamtleukozyten (Bereiche (1) bis (3)) und einzelnen Leukozytensubpopulationen (1), (2) und (3) erfolgen. Gegebenenfalls wird eine stati­ stische Korrektur der Zählverluste bei hohen absoluten Zählraten mit einbezogen.

Die mit der Erfindung erzielten Vorteile bestehen insbesondere darin, daß

• - in der korrelierten Darstellung der Vorwärtsstreuung und der 90°-Streuung die Leukozytenimpulse unabhängig von den Erythrozytenimpulsen detektiert wer­ den können,
• - die Probenpräparation nur aus der Verdünnung der Vollblutprobe in isotoni­ scher Kochsalzlösung besteht.

Claims (3)

1. Verfahren zur Differenzierung, Konzentrationsbestimmung und Sortierung von Erythrozyten, Thrombozyten und Leukozyten und verschiedenen Leukozyten­ subpopulationen in einem Durchflußzytometer mit hydrodynamischer Fokus­ sierung, so daß die Blutzellen einzeln das aktive Volumen passieren, dadurch gekennzeichnet, daß

• 1.1 zur Bestimmung der Konzentrationen der Leukozyten und Leukozytensubpo­ pulationen verdünnte Vollblutproben verwendet werden und die Zerstörung der Erythrozyten durch Hämolyse nicht erforderlich ist,
• 1.2 weitere Präparationsschritte außer der Verdünnung der Vollblutprobe nicht er­ forderlich sind,
• 1.3 die Unterscheidung der Leukozyten und Leukozytensubpopulationen von Thrombozyten und Erythrozyten und die Unterscheidung der Leukozytensub­ populationen untereinander durch die gleichzeitige Messung der Intensität des in (mindestens) zwei geeignet gewählten Raumwinkelbereichen gestreuten Lichtes vorgenommen wird,
• 1.4 eine diskrete Wellenlänge oder ein Wellenlängenband zur Lichtstreuung ver­ wendet wird, die im Bereich der starken Absorption des Hämoglobins zwischen λ = 350 nm und λ = 460 nm liegt.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Depolarisation des gestreuten Lichtes zusätzlich gemessen wird, wenn das zur Streuung verwendete Licht polarisiert ist.

3. Verfahren nach Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Vollblutprobe vor der Messung ihrer Streuintensitäten gemäß Anspruch 1 und 2 durch eine Zentrifugation, Färbemethode oder immunologische Me­ thode präpariert worden ist.