WO2003107005A1 - Procede de denombrement et/ou d’identification morphologique de leucocytes en phase solide - Google Patents

Procede de denombrement et/ou d’identification morphologique de leucocytes en phase solide Download PDF

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WO2003107005A1
WO2003107005A1 PCT/FR2003/001865 FR0301865W WO03107005A1 WO 2003107005 A1 WO2003107005 A1 WO 2003107005A1 FR 0301865 W FR0301865 W FR 0301865W WO 03107005 A1 WO03107005 A1 WO 03107005A1
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leukocytes
leukocyte
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membrane
counting
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PCT/FR2003/001865
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Isabelle Besson-Faure
Jean-Pierre Hermet
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Hemosystem
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    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
    • G01N33/56966—Animal cells
    • G01N33/56972—White blood cells

Definitions

  • the present invention relates to a method for detecting and / or counting and / or morphological identification of leukocytes in solid phase.
  • leukoreduction The reduction of residual leukocytes in blood products, in particular in labile blood products (PSL) comprising in particular, plasma and blood cells and their derivatives, hereinafter called leukoreduction, is one of the priorities in the world of blood transfusion and it has become a well-established technology, practiced by blood transfusion centers around the world.
  • PSL labile blood products
  • blood product is intended to mean any preparation resulting from the fractionation of the blood, whether or not comprising cellular components, by way of example, the term “blood product” is intended to mean concentrates of red blood cells or platelets, but also plasma or serum preparations.
  • the organizations responsible for the safety of blood products recommend a significant reduction in the concentrations of these cells in plasmas, by using, for example, screen filters.
  • Acceptable plasma leukocyte concentrations are approximately 10 5 cells per liter, this threshold will certainly be lowered to approximately 10 4 cells per liter, or approximately 10 cells / ml.
  • European standards recommend quality control on 1% of blood products with a minimum of 10 checks / month / blood product. These standards are met if 90% of the sampling units fall within the ranges of values indicated. (Guide for the preparation, use and quality assurance of blood components _7 th edition-2001-Council of Europe editions).
  • the process using CF shows a low variability (yield of 61-70%) for the different levels of white blood cells while the variability with the process using CN is greater (yield of 39-91%). This greater variability prevents the correction of CN counts by a simple factor and illustrates the difficulties of standardizing the technique.
  • the applicant has implemented a process for counting and / or identifying residual leukocytes in biological fluids having increased sensitivity and achievable in shorter periods of time.
  • 1 biological fluid means any fluid from a living organism, such as for example: plasma, milk, saliva, tears, sweat, urine or cerebrospinal fluid, but also the products resulting from the fractionation of the blood, including or not cellular components, as well as the plasma or serum preparations.
  • This method is particularly well suited to counting leukocytes in plasma.
  • the inventive leukocyte counting method comprises solid phase detection of residual leukocytes on a filtration membrane and does not require a step of prior concentration of the cells.
  • leukocyte subpopulations polynuclear, lymphocytes, monocytes
  • morphological basis is achievable by observation with an epifluorescence microscope of the filtration membrane.
  • the subject of the invention is a method for counting leukocytes possibly present in a biological fluid, characterized in that it comprises the following steps: a) incubation of a sample of said biological fluid with a permeabilizing agent for cell membranes, b) incubation of the sample obtained in step (a) with a leukocyte marker, c) filtration of the sample obtained in step (b) on a non-autofluorescent membrane, capable of retaining leukocytes, in order to obtain a solid phase preparation of the labeled leukocytes, optionally present in said sample, d) analysis of the solid phase preparation of said non-autofluorescent membrane of step (c) to count the marked leukocytes possibly present on it.
  • the subject of the invention is also a method of morphological identification of the leukocytes possibly present in a blood product, characterized in that it comprises steps (a) to (c) of the method described above, followed by a step ( e) visual observation under the microscope of the preparations obtained in step
  • membrane permeabilizing agent any compound capable of modifying the structure of cell membranes and thus allowing compounds such as markers, such as fluorescent markers or molecules coupled to a fluorochrome, to pass inside the cell. so that these can reach the cytoplasm and / or the cell nucleus and attach to intracellular elements.
  • permeabilizers of cell membranes there may be mentioned detergents and fixatives.
  • non-autofluorescent membrane any membrane which does not emit fluorescence, either by itself, or in the presence of fluorochromes, or under the effect of the light excitations of the analyzer, so that it does not does not interfere with the fluorescence measurements made by the analyzer.
  • the sample of step (a) is previously diluted with a buffer osmotically compatible with leukocytes, before its incubation with the detergent.
  • This osmotically compatible dilution buffer with leukocytes is chosen from the group comprising: PBS at pH 7.4, TRIS at pH 7.4, Tyrode buffer at pH 7.4 or physiological saline (NaCl at 0.9 %).
  • detergents which can be used, alone or as a mixture, during step (a), mention may be made of those of the group comprising: Triton X-100, saponin, n- octyl-glucopyranoside, T een 20, T een 80, sodium dodecyl sulfate.
  • the detergent, or the mixture of detergents, incubated with the sample in step (a) are used at a final concentration of between 0.05% and 5%, preferably between 0.01% and 2% and most preferably at a concentration of 0.1% for Triton X-100, of 1% for n-octyl glucopyranoside, Tween 20, Tween 80 and sodium dodecyl sulfate, of 0.2% for saponin.
  • the incubation time of the sample with the detergent in step (a) is between 5 minutes and 45 minutes, preferably between 10 and 20 minutes and most preferably it is 15 minutes.
  • the leukocyte marker used in step (b) is chosen from the group comprising: a dye, a fluorochrome, a nucleic acid marker.
  • the leukocyte marker used in step (b) is a nucleic acid marker chosen from the group comprising: acridine orange, Picogreen®, asymmetric cyanine (SYTO), monomeric cyanine
  • the duration of incubation of the sample with the marker in step (b) can be between 5 and 45 minutes, preferably between 10 and 20 minutes and very preferably it is 15 minutes.
  • the non-autofluorescent membrane used in step (c) is a black membrane.
  • said black membrane is a polyester or polycarbonates or polyether sulfone membrane 25 mm in diameter.
  • the size of the pores of the membrane used in step (c) may be between 0.05 ⁇ m and 2 ⁇ m, preferably it is between 0.1 ⁇ m and 1 ⁇ m and preferably it is 0, 4 ⁇ m.
  • the method of the invention may include an additional washing step, after filtration of step (c) by filtration of a volume of buffer. This washing eliminates any background noise on the membrane caused by traces of the marker.
  • the analysis of the membrane in step (d) of the process can be carried out by means of an analyzer capable of detecting marked events and in particular by means of a scanning laser analyzer and / or a microscope. epifluorescence.
  • the process of the invention is particularly useful for the quality control of the preparations of plasmas and derivatives. It can also be used for the quality control of leukocyte filters and in quality control in blood banks for the control of leukoreduction processes.
  • FIG. 1 is a diagram illustrating the steps for the preparation of leukocytes to be analyzed, according to an experimental model to obtain a range of concentrations of leukocytes in plasma and establish the detection limit and the sensitivity of the process.
  • FIG. 2 shows a diagram of the leukocyte counting method of the invention in solid phase cytometry and the validation of the results obtained by reading the analyzed solid phases under a microscope.
  • the non-autofluorescent (black) filter membrane (1) introduced into the analyzer (2) is scanned line by line with an Argon laser (3) and the emission of green fluorescence is translated into a number of fluorescent events whose position on the filter is displayed on the computer screen (4).
  • the laser scanning analyzer is connected with an epifluorescence microscope which allows the confirmation of the results obtained and the morphological identification of the leukocyte subpopulations.
  • FIG. 3 illustrates the linearity of the method. It illustrates the enumeration of leukocytes carried out with the method of the invention for serial dilutions of leukocytes in plasma filtered on a filter with a porosity of 0.22 ⁇ m.
  • FIG. 4 illustrates the enumeration of leukocytes carried out with a cell counter for serial dilutions of leukocytes in plasma filtered with a filter of porosity 0.22 ⁇ m.
  • FIG. 5 illustrates the comparative study between the count of leukocytes obtained with the method of the invention and that obtained with a cell counter.
  • FIG. 6 illustrates the enumeration of leukocytes with the method of the invention, in duplicate, on two different samples A and B, before leucoreduction of fresh frozen plasma for therapeutic use.
  • FIG. 7 illustrates the enumeration of leukocytes with the method of the invention, in duplicate, on two different samples A and B, after leucoreduction of fresh frozen plasma for therapeutic use.
  • Phosphate buffer PBS pH 7.4 • 0.22 ⁇ m filtration units.
  • Black polyester filter membranes with a diameter of 25 mm and a porosity of 0.4 ⁇ m.
  • the preparation is carried out, on the one hand, of a plasma devoid of contaminating leukocytes and, on the other hand, of a buffy coat, also designated “Buffy Coat” or BC, constituted by the thin yellowish layer of leukocytes covering the red cells compacted after centrifuging the blood.
  • a plasma devoid of contaminating leukocytes and, on the other hand, of a buffy coat, also designated “Buffy Coat” or BC, constituted by the thin yellowish layer of leukocytes covering the red cells compacted after centrifuging the blood.
  • a buffy coat also designated “Buffy Coat” or BC
  • the supernatant (plasma) is removed.
  • the buffy coat is transferred to another tube and the pellet of red blood cells is eliminated.
  • a 0.22 ⁇ m filtration unit is positioned on the tip of the syringe •
  • the plasma is passed over the filtration unit by collecting the filtrate in a tube (Filtered plasma).
  • One hundred microliters of the 10 "1 dilution are diluted with 900 ⁇ l of filtered plasma (10 ⁇ 2 dilution), and so on until a 10 " 6 dilution.
  • the said sample is diluted by adding 220 ⁇ l of PBS buffer. - 9 ⁇ l of 5% Triton-X 100 are added to obtain a final 0.1% concentration of Triton-X 100 in the diluted sample.
  • the sample-detergent mixture is incubated for 15 minutes at room temperature.
  • the leukocytes possibly present in the sample are marked by adding 45 ⁇ l of the Orange working solution of acridine.
  • the diluted sample containing the leukocytes and the marker is incubated for 15 minutes at room temperature.
  • 220 ⁇ l of plasma filtered on a filter with a porosity of 0.22 ⁇ m is used in place of the 220 ⁇ l of the initial sample.
  • the principle of the measurement is based on the variation in impedance generated by the passage of the cells through a calibrated micro-orifice.
  • GB white blood cells
  • the principle of the analysis is based on the volumetric study of leukocytes after the action of a lytic reagent. • Each tube corresponding to a dilution of the series is presented at the suction probe.
  • the device draws 10 ⁇ l of cell suspension. • The result is obtained within approximately one minute and the linearity zone is between 0.5 and 80 x 10 6 leukocytes / ml.
  • Table 1 shows the results of the enumeration in solid phase carried out according to the method of the invention, from the 220 ⁇ l of starting sample.
  • the results after validation refer to validation carried out under the microscope on a number of representative fields ( ⁇ 50 fields) to define the number of leukocytes per membrane, that is to say in 220 ⁇ l of preparation. It appears that the leukocyte concentrations are well analyzed by labeling with the acridine orange and that less than 10 leukocytes can be detected from 220 microliters of plasma.
  • the range of leukocyte detection with a cell counter is between 5 x 10 5 cells / ml and 10 8 cells / ml.
  • Table 3 shows the results of this comparative study between the three methods of enumerating leukocytes to measure the number of cells in the buffy coat: in solid phase, using a particle counter (Micros 60) and at using a hemocytometer (Malassez cell).
  • the solid phase counting method is particularly suitable and has better sensitivity compared to the other two methods for low numbers of leukocytes.
  • the volume of the samples is approximately 2 ml (-30 cm of tubing).
  • Acridine Orange prepared at a concentration of 5 mg / ml in DMSO Phosphate aline buffer (PBS) has a concentration of 10 mM and pH 7. 4 prepared in distilled water
  • Non-autofluorescent black polyester filter membranes with a diameter of 25 mm and a porosity of 0.4 ⁇ m.
  • Plasma extracted from the tube and filtered through a filter with a porosity of 0.22 ⁇ m is used as a negative control, as indicated in paragraph 1.2.2 above.
  • a solution of acridine orange is prepared at a final concentration of 50 ⁇ g / ml in PBS, by 1/100 dilution of the mother solution of acridine orange (5 mg / ml in PBS).
  • Triton X100 4 ⁇ l of Triton X100 are added at a concentration of 5% (final concentration: 0.1%) The mixture is incubated for 15 minutes at room temperature.
  • the preparation thus obtained is filtered on a non-autofluorescent (black) filter membrane.
  • the membrane is analyzed with a scanning laser analyzer
  • the concentration of leukocytes before leukoreduction is approximately, 5 ⁇ 10 2 to 8 ⁇ 10 2 cells / ml and it is less than 10 cells / ml after leukoreduction.
  • the detection limit of the process is less than 10 cells / ml. It is approximately 1 leukocyte / ml of plasma (200 leukocytes / pocket) with approximately 5 ml of sample.
  • This method ensures detection of 100% of the residual leukocytes in a plasma sample, when it is compared to the counts obtained with a hemocytometer such as a Malassez cell.
  • the concentration of leukocytes before leukoreduction was approximately 5 ⁇ 10 2 cells / ml (greater than 10 5 cells / bag), whereas after leukoreduction this concentration was less than 10 cells / ml (less than 2 10 3 cells / bag).
  • the inventive leukocyte counting method is safe and the counts obtained are consistent with those described in the literature. (Masse M., Transfus Clin Biol 2001 Jun; 8 (3): 297-302 "Universal leukoreduction of cellular and plasma components: process control and performance of the leukoreduction process. ”)
  • the sensitivity of the method of the invention can be easily optimized by increasing the volume of the sample. A larger sample volume will lead to better recovery of the leukocytes which will be more representative of the sample.

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Abstract

La présente invention a pour objet un procédé de dénombrement de leucocytes en phase solide comprenant le marquage desdits leucocytes avec un marqueur et leur détection, au moyen d’un analyseur, après les avoir déposés sur une membrane. Le procédé est particulièrement utile dans le domaine de la transfusion sanguine, elle permet notamment la détection de leucocytes résiduels dans du plasma frais, après avoir soumis celui-ci à une leucoréduction.

Description

PROCEDE DE DENOMBREMENT ET/OU D'IDENTIFICATION MORPHOLOGIQUE DE LEUCOCYTES EN PHASE SOLIDE.
La présente invention se rapporte à un procédé de détection et/ou de comptage et/ou d'identification morphologique de leucocytes en phase solide.
La réduction des leucocytes résiduels dans les produits sanguins, notamment dans des produits sanguins labiles (PSL) comprenant notamment, le plasma et les cellules sanguines et leurs dérivés, ci-après désignée leucoréduction, est une des priorités dans le monde de la transfusion sanguine et elle est devenue une technologie bien établie, pratiquée par les centres de transfusion sanguine du monde entier.
On entend par produit sanguin, toute préparation issue du fractionnement du sang, comprenant ou non des composants cellulaires, à titre d'exemple, on entend par produit sanguin les concentrés des globules rouges ou de plaquettes, mais aussi les préparations plasmatiques ou sériques .
Dans le domaine de la transfusion sanguine, il a été montré que l'utilisation de dérivés sanguins ayant un taux de leucocytes réduit permet de diminuer la fréquence de complications sévères liées à la transfusion sanguine, incluant l'apparition de réactions fébriles, la formation d'alloanticorps, la transmission de virus ou encore la maladie de Creutzfeldt-Jacob.
On constate dans les modèles expérimentaux d'encéphalite spongifor e transmissible que l'infectiosité sanguine est essentiellement associée (90% des cas) aux leucocytes. (Rapport de Février 2002 de l'Agence Française De Sécurité Sanitaire Des Produits De Santé (AFSSAPS) : « Analyse du risque de transmission de la variante de la maladie de Creutzfeldt-Jakob par les médicaments d'origine humaine et les produits sanguins labiles » ) et que de ce fait la leucoréduction contribue à diminuer les risques potentiels lies à l'agent causal de la BSE.
Ainsi, dans le but de sécuriser le sang les organismes chargés de la sécurité des produits sanguins recommandent une réduction significative des concentrations de ces cellules dans les plasmas, en utilisant, par exemple, des filtres écran.
Les concentrations acceptables de leucocytes dans le plasma sont d'environ 105 cellules par litre, ce seuil sera certainement abaissé à environ 104 cellules par litre, soit environ 10 cellules/ml.
Les normes européennes recommandent un contrôle de qualité sur 1% des produits sanguins avec un minimum de 10 contrôles/mois/produit sanguin. Ces normes sont satisfaites si 90% des unités d'échantillonnage se trouvent dans les fourchettes de valeurs indiquées. (Guide pour la préparation, l'utilisation et l'assurance qualité des composants sanguins _7ème édition-2001-Editions du Conseil de 1 'Europe) .
Il apparaît que la mise à disposition des établissements chargés de contrôler la sécurité des produits sanguins, de procédés fiables et sensibles de détection et comptage de leucocytes résiduels dans lesdits produits sanguins, présente un intérêt certain. A ce jour, deux techniques sont utilisées couramment pour le dénombrement de leucocytes résiduels, toutes les deux sont des techniques en phase liquide, il s'agit du comptage par cytométrie de flux (CF) et du comptage avec un hematocytometre comme par exemple la Chambre de Nageotte.
Des études visant à comparer ces deux techniques, et à mettre en lumière leurs avantages et inconvénients font état d'une meilleure fiabilité pour les procédés de dénombrement mettant en œuvre la CF, car elle présente une variabilité moindre.
Parmi les publications qui mentionnent l'intérêt de la leucoreduction, on peut citer l'article du Pr. Maurice Masse (Transfus Clin Biol 2001 Jun; 8(3) :297-302 « Universal leukoreduction of cell lar and plasma components : process control and performance of the leukoreduction process. » ) Les auteurs font référence au besoin d'optimisation des méthodes de réduction des concentrations leucocytaires, non seulement dans les globules rouges, ou les plaquettes, mais aussi dans les plasmas pour l'amélioration de la sécurité transfusionnelle. Aussi les auteurs font clairement allusion au besoin du développement de techniques élaborées de détection et comptage des leucocytes résiduels. Le but étant d'atteindre des sensibilités élevées, généralement par concentration préalable de l'échantillon. Cette concentration préalable permet d'atteindre des sensibilités élevées avec une limite de détection de l'ordre de 10 cellules leucocytes/ml pour les globules rouges (GR) ou les plaquettes et de 0,5 cellules leucocytes /ml pour le plasma. L'article de Rebulla P, et al. (Transfusion 1993 Feb;33(2) : 128-33 « White cell-reduced red cells prepared by filtration-: a critical évaluation of current filters and methods for counting residual white cells » ) évalue la réduction de globules blancs à partir de préparations de leucocytes, par filtration sur différents filtres commerciaux.
En même temps, les auteurs de cette publication comparent trois procédés de dénombrement de leucocytes résiduels : soit dans une Chambre de Burke (CB), soit dans une chambre de Nageotte (CN), soit par cytométrie de flux (CF). Alors qu'aucun leucocyte n'est détecté avec la CB, les courbes d'étalonnage obtenues avec la CN et par CF avec des échantillons contenant des concentrations connues en globules blancs, allant de 1 à 1000 cellules par microlitre, montrent que les deux derniers procédés détectent en moyenne 67% des globules blancs présents dans les échantillons
Le procédé utilisant la CF montre une faible variabilité, (rendement de 61-70%) pour les différents niveaux de globules blancs alors que la variabilité avec le procédé utilisant la CN est plus importante (rendement de 39-91%). Cette variabilité plus importante empêche la correction des dénombrements en CN par un facteur simple et illustre les difficultés d'une standardisation de la technique .
Il apparaît cependant que les besoins en sécurité dans ce domaine nécessitent des procédés de dénombrement plus fiables, présentent moins de variabilité, et plus sensibles.
Afin de résoudre ce problème de manque de sensibilité des procédés de dénombrement de leucocytes précédemment cités, la demanderesse a mis en œuvre un procédé de dénombrement et/ou d'identification de leucocytes résiduels dans les fluides biologiques présentant une sensibilité accrue et réalisable dans des délais plus courts.
Dans le cadre de la présente invention, 1 entend par fluide biologique tout fluide issu d'un organisme vivant, comme par exemple : le plasma, le lait, la salive, les larmes, la sueur, l'urine ou le liquide céphalorachidien, mais aussi les produits issus du fractionnement du sang, comprenant ou non des composants cellulaires, ainsi que les préparations plasmatiques ou sériques .
Ce procédé est particulièrement bien adapté au dénombrement des leucocytes dans le plasma.
Le procédé de dénombrement de leucocytes de l'invention comprend une détection en phase solide des leucocytes résiduels sur une membrane de filtration et ne nécessite pas d'étape de concentration préalable des cellules.
De plus, l'identification secondaire des sous- populations leucocytaires (polynucléaires, lymphocytes, monocytes) sur une base morphologique est réalisable par observation au microscope à épifluorescence de la membrane de filtration.
Plus précisément, l'invention a pour objet un procédé de dénombrement de leucocytes éventuellement présents dans un fluide biologique caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : a) l'incubation d'un échantillon dudit fluide biologique avec un agent perméabilisant des membranes cellulaires, b) l'incubation de l'échantillon obtenu à l'étape (a) avec un marqueur des leucocytes, c) la filtration de l'échantillon obtenu à l'étape (b) sur une membrane non autofluorescente, susceptible de retenir les leucocytes, pour obtenir une préparation en phase solide des leucocytes marqués, éventuellement présents dans ledit échantillon, d) l'analyse de la préparation en phase solide de ladite membrane non autofluorescente de l'étape (c) pour dénombrer les leucocytes marqués éventuellement présents sur celle-ci.
L ' invention a également pour objet un procédé d ' identi f ic ation morphologique des leucocytes éventuellement présents dans un produit sanguin caractérisé en ce qu ' il comprend les étapes ( a) à ( c ) du procédé précédemment décrit suivies d 'une étape (e) d ' observation visuelle au microscope des préparations obtenues à l ' étape
( c ) .
Cette observation visuelle de la phase solide permet l'identification morphologique de polynucléaires, lymphocytes et/ou monocytes éventuellement présents dans le fluide biologique.
Par agent perméabilisant des membranes, on entend tout composé susceptible de modifier la structure des membranes cellulaires et de laisser ainsi passer vers l'intérieur de la cellule des composés tels que des marqueurs, comme les marqueurs fluorescents ou des molécules couplées à un fluorochrome, de manière à ce que ceux-ci puissent atteindre le cytoplasme et/ou le noyau cellulaire et se fixer à des éléments intracellulaires .
Parmi les agents perméabilisants des membranes cellulaires, on peut citer des produits détergents et des fixateurs.
Par membrane non-autofluorescente on entend toute membrane qui n'émet pas de la fluorescence, ni par elle-même, ni en présence de fluorochromes, ni sous l'effet des excitations lumineuses de l'analyseur, de telle manière qu'elle n'interfère pas avec les mesures de fluorescence effectuées par l'analyseur.
Lors de différents travaux menés par la demanderesse pour la mise en œuvre de l'invention, il a été constaté qu'une détection optimale est obtenue avec des concentrations allant de 1 à 50000 leucocytes par préparation en phase solide.
Ainsi, lorsque la concentration en leucocytes est trop élevée, l'échantillon de l'étape (a) est préalablement dilué avec un tampon osmotiquement compatible avec les leucocytes, avant son incubation avec le détergent.
Ce tampon de dilution osmotiquement compatible avec les leucocytes est choisi parmi le groupe comprenant : du PBS à pH 7,4, du TRIS à pH 7,4, du tampon Tyrode à pH 7,4 ou du sérum physiologique (NaCl à 0,9%) .
Parmi les détergents que l'on peut utiliser, seuls ou en mélange, lors de l'étape (a) on peut mentionner ceux du groupe comprenant : Triton X-100, saponine, n- octyl-glucopyranoside, T een 20, T een 80, sodium dodécyl sulfate.
Le détergent, ou le mélange de détergents, incubé avec l'échantillon à l'étape (a) sont utilisés à une concentration finale comprise entre 0,05% et 5%, de préférence entre 0,01% et 2% et tout préférentiellement a une concentration de 0,1% pour le Triton X-100, de 1% pour le n-octyl glucopyranoside, le Tween 20, le Tween 80 et le sodium dodécyl sulfate, de 0,2% pour la saponine.
La durée d'incubation de l'échantillon avec le détergent à l'étape (a) est comprise entre 5 minutes et 45 minutes, de préférence entre 10 et 20 minutes et tout préférentiellement elle est de 15 minutes.
Selon de modes préférés de mise en œuvre du procédé de l'invention, le marqueur des leucocytes utilisé à l'étape (b) est choisi parmi le groupe comprenant : un colorant, un fluorochrome, un marqueur d'acides nucléiques.
De préférence, le marqueur de leucocytes utilisé à l'étape (b) est un marqueur d'acides nucléiques choisi parmi le groupe comprenant : orange d'acridine, Picogreen®, cyanine asymétrique (SYTO), cyanine monomère
(YOPRO), cyanine dimère, SYBR® et Iodure depropidium.
La durée d'incubation de l'échantillon avec le marqueur à l'étape (b) peut être comprise entre 5 et 45 minutes, de préférence entre 10 et 20 minutes et tout préférentiellement elle est de 15 minutes. Selon un mode particulier de mise en œuvre du procédé de l'invention, la membrane non autofluorescente mise en œuvre à l'étape (c) est une membrane noire.
De préférence ladite membrane noire est une membrane en en polyester ou polycarbonates ou polyether sulfone de diamètre 25 mm.
La taille des pores de la membrane mise en œuvre à l'étape (c) peut-être comprise entre 0,05 μm et 2 μm, de préférence elle est comprise entre 0,1 μm et 1 μm et préférentiellement elle est de 0,4 μm.
Eventuellement, le procédé de l'invention peut comporter une étape supplémentaire de lavage, après la filtration de l'étape (c) par filtration d'un volume de tampon. Ce lavage permet d'éliminer un éventuel bruit de fond sur la membrane provoqué par des traces du marqueur.
L'analyse de la membrane à l'étape (d) du procédé peut être effectuée au moyen d'un analyseur capable de détecter des événements marqués et en particulier au moyen d'un analyseur laser à balayage et/ou d'un microscope à épifluorescence.
Le procédé de l'invention est particulièrement utile pour le contrôle de qualité des préparations de plasmas et dérivés. Il peut également être utilisé pour le contrôle de qualité des filtres de leucocytes et en contrôle qualité dans des banques de sang pour le contrôle des procédés de leucoreduction. D'autres avantages et caractéristiques de l'invention apparaîtront à la lecture des exemples qui suivent et des figures en annexe dans lesquelles
- La figure 1 est un schéma illustrant les étapes pour la préparation des leucocytes à analyser, selon un modèle expérimental pour obtenir une gamme de concentrations de leucocytes dans du plasma et établir la limite de détection et la sensibilité du procédé.
- la figure 2 montre un schéma du procédé de dénombrement de leucocytes de l'invention en cytometrie en phase solide et de la validation des résultats obtenus par lecture au microscope des phases solides analysées.
La membrane filtre non autofluorescente (noire) (1) introduite dans l'analyseur (2) est balayée ligne par ligne avec un laser Argon (3) et l'émission de fluorescence verte est traduite en un nombre d'événements fluorescents dont la position sur le filtre est visualisée sur l'écran de l'ordinateur ( 4 ) . L'analyseur à balayage laser est connecté avec un microscope à épifluorescence qui permet la confirmation des résultats obtenus et l'identification morphologique des sous-populations leucocytaires.
- la figure 3 illustre la linéarité de la méthode. Elle illustre le dénombrement de leucocytes effectué avec le procédé de l'invention pour des dilutions en série de leucocytes dans du plasma filtré sur un filtre de porosité 0,22 μm. la figure 4 illustre le dénombrement de leucocytes effectué avec un compteur de cellules pour des dilutions en série de leucocytes dans du plasma filtré avec un filtre de porosité 0,22 μm.
- la figure 5 illustre l'étude comparative entre le dénombrement de leucocytes obtenu avec le procédé de l'invention et celui obtenu avec un compteur de cellules. la figure 6 illustre le dénombrement de leucocytes avec le procédé de l'invention, en duplicate, sur deux échantillons différents A et B, avant leucoreduction du plasma frais congelé à usage thérapeutique.
- la figure 7 illustre le dénombrement de leucocytes avec le procédé de l'invention, en duplicate, sur deux échantillons différents A et B, après leucoreduction du plasma frais congelé à usage thérapeutique.
PARTIE EXPERIMENTALE- EXEMPLES
I - DETERMINATION DU SEUIL DE DETECTION DES LEUCOCYTES L'objet de cette étude est de déterminer la capacité du procédé de dénombrement de leucocytes en phase solide pour détecter de faibles nombres de leucocytes dans du plasma.
Pour effectuer cette étude, un modèle expérimental a été défini : une série de dilutions en cascade de leucocytes issus de couche leucoplaquettaire a été réalisée dans du plasma, filtré sur un filtre de porosité 0,22 μm, exempt de cellules.
1.1 Matériel
• Produits sanguins :
" Plasma frais congelé, préparé selon les normes en place à l'EFS, (« Guide pour la préparation, l'utilisation et l'assurance de qualité des composants sanguins », recommandation n° R (95) 15, 7ème édition, Janvier 2001,
Editions du conseil de l'Europe)
• Sang total prélevé sur anticoagulant CPD (citrate- phosphate-dextrose)
• Tampon phosphate (PBS pH 7,4) • Unités de filtration de 0.22 μm.
• Membranes filtres noires en polyester de diamètre 25 mm et de porosité 0,4 μm.
• Triton X-100 5%. • Sous membrane noire en ester de cellulose ou polyether sulfone de diamètre 25 mm.
• Acridine orange, solution mère à 5 mg/ml dans du DMSO.
• Analyseur en phase solide à balayeur laser et microscope à épifluorescence.
• Appareil d'hématologie MICRO 60-OT (Abx) de numération /formule des cellules sanguines
• Hémocytomètre de Malassez
1.2 Méthode
1.2.1 Obtention des leucocytes
En premier lieu, on procède à la préparation, d'une part, de plasma dépourvu de leucocytes contaminants et d'autre part d'une couche leucoplaquettaire, également désignée « Buffy Coat » ou BC, constituée par la couche mince jaunâtre de leucocytes recouvrant les cellules rouges compactées après avoir centrifugé le sang.
Préparation de la couche leucoplaquettaire : Dix millilitres de sang total sont centrifugés durant 15 minutes à 4000 tours par minute.
Le surnageant (plasma) est éliminé.
La couche leucoplaquettaire est transférée dans un autre tube et le culot de globules rouges est éliminé.
1.2.2 Préparation du plasma filtré
• On décongèle le plasma frais congelé au
Bain Marie à 37°C. • On aspire le plasma dans une seringue de 5 ml.
• On positionne une unité de filtration de 0,22 μm sur l'embout de la seringue • On fait passer le plasma sur l'unité de filtration en recueillant le filtrat dans un tube (Plasma filtré) .
1.2.3 Préparation de 1 'acridine orange On pipette dans un tube, 15 μl d' acridine orange à 5 mg/mL et on ajoute 1,485 ml de tampon PBS pour obtenir une solution de travail de 50 μg/ml.
1.2.4. Préparation des séries de dilution des leucocytes
Cent microlitres de la couche leucoplaquettaire (BC) sont dilués avec 900 μl de plasma filtré (dilution 10"
Cent microlitres de la dilution 10"1 sont dilués avec 900 μl de plasma filtré (dilution 10~2), et ainsi de suite jusqu'à une dilution 10"6.
1.2.5 Dénombrement des leucocytes a) en phase solide avec l'analyseur à balayage laser.
- On prélève 220 μl de l'échantillon contenant éventuellement les leucocytes.
- On dilue ledit échantillon par addition de 220 μl de tampon PBS. - On additionne 9 μl de Triton-X 100 5% pour obtenir une concentration de 0.1% final en Triton-X 100 dans l'échantillon dilué.
- On incube le mélange échantillon-détergent durant 15 minutes à température ambiante. - On marque les leucocytes éventuellement présents dans l'échantillon par addition de 45μl de la solution de travail d'Orange d' acridine.
- On incube l'échantillon dilué contenant les leucocytes et le marqueur durant 15 minutes à température ambiante .
- On filtre 500 μl de l'échantillon comprenant les leucocytes marqués sur une membrane filtre noire en polyester de 0.4μm de porosité non autofluorescente, - On filtre ensuite 500 μl de tampon PBS pour laver la membrane.
- En tant que témoin, on utilise 220 μl de plasma filtré sur un filtre de porosité 0,22 μm à la place des 220 μl de l'échantillon initial.
b) avec un compteur de cellules
Selon le protocole décrit dans le manuel de procédures de l'appareil Micro 60 de la société Abx.
Le principe de la mesure repose sur la variation d'impédance engendrée par le passage des cellules à travers un micro-orifice calibré.
L'étude de la distribution volu étrique des Globules blancs (GB) permet de dénombrer les trois sous- populations leucocytaires suivantes : lymphocytes, monocytes et granulocytes .
Le principe de l'analyse repose sur l'étude volumétrique des leucocytes après l'action d'un réactif lytique . • On présente chaque tube correspondant à une dilution de la série au niveau de la sonde d'aspiration.
• L'appareil prélève 10 μl de suspension cellulaire. • Le résultat est obtenu dans un délai d'environ une minute et la zone de linéarité est comprise entre 0,5 et 80 x 106 leucocytes/ml.
c) avec un hémocytomètre :
" On effectue une dilution 1/10 de la couche leucoplaquettaire (BC) dans du plasma filtré.
" On distribue 20μl dans 1 'hémocytomètre de Malassez.
" On dénombre les cellules au microscope.
1.3 Résultats
Les résultats des différents dénombrements effectués sont indiqués dans les tableaux 1, 2 ci-dessous.
Le tableau 1 indique les résultats du dénombrement en phase solide effectué selon le procédé de l'invention, à partir des 220 μl d'échantillon de départ.
Tableau 1
Dénombrement de leucocytes en phase solide
Figure imgf000017_0001
( * ) Les résultats après validation se réfèrent à la validation effectuée au microscope sur un nombre de champs représentatifs (≥ 50 champs) pour définir le nombre de leucocytes par membrane c ' est-à-dire dans 220 μl de préparation. Il apparaît que les concentrations en leucocytes sont bien analysées par le marquage avec l'orange d' acridine et que l'on peut détecter moins de 10 leucocytes à partir de 220 microlitres de plasma.
Tableau 2 Dénombrement de leucocytes avec un compteur de cellules
("Micros 60")
Figure imgf000018_0001
La gamme de détection de leucocytes avec un compteur de cellules est comprise entre 5 x 105 cellules/ml et 108 cellules/ml .
Le tableau 3 ci-dessous montre les résultats de cette étude comparative entre les trois procédés de dénombrement de leucocytes pour mesurer le nombre de cellules dans la couche leucoplaquettaire : en phase solide, au moyen d'un compteur de particules (Micros 60 ) et au moyen d'un hémocytomètre (Cellule de Malassez ) . Tableau 3
Concentration estimée de la couche leucoplaquettaire (BC)
Phase solide Compteur de Hémocytomètre Procédé de particules 1 ' invention
4.8 107 cellules /ml 1.1 108 cellules /ml 1 108 cellules /ml
Le procédé de dénombrement en phase solide est particulièrement adapté et présente une meilleure sensibilité par rapport aux deux autres méthodes pour les faibles nombres de leucocytes .
II - VALIDATION DE LA METHODE DE DENOMBREMENT DE LEUCOCYTES EN PHASE SOLIDE .
De manière à valider le procédé de dénombrement de leucocytes de l ' invention, avec des échantillons de plasma à usage thérapeutique , des analyses desdits plasmas ont été effectuées à partir de tubes scellés avant et après avoir effectué une leucoreduction.
II . l Matériel
- Echantillon de plasma (A) sous forme de tubulure prélevée à partir de la poche de plasma avant leucoreduction et après leucoreduction.
- Echantillon de plasma (B) sous forme de tubulure prélevée à partir de la poche de plasma avant leucoreduction et après leucoreduction.
Le volume des échantillons est d'environ 2 ml (-30 cm de tubulure).
Orange d'Acridine, préparé à une concentration de 5 mg/ml dans du DMSO Tampon s alin phosphaté ( PBS ) a une concentration de 10 mM et pH 7 . 4 préparé dans de l ' eau distillée
De s membrane s f i ltres noires non autofluorescentes en polyester de diamètre 25 mm et de porosité 0 , 4 μm.
Sous membrane noire en ester de cellulose ou polyether sulfone de diamètre 25 mm.
- Du détergent Triton X100 Solution à une concentration de 5% dans du PBS .
- Unités de filtration de porosité 0. 22 μm
- Analyseur en phase solide à balayeur laser et microscope à épif luorescence .
II .2 Méthode
- Préparation du contrôle négatif ; Du plasma extrait du tube et filtré à travers un filtre de porosité 0.22μm est utilisé comme contrôle négatif, comme indiqué au paragraphe 1.2.2 ci-dessus.
Préparation de la solution de travail d'orange d'acridine.
On prépare une solution d'Orange d'acridine à une concentration finale de 50μg/ml dans du PBS, par dilution 1/100 de la solution mère d'Orange d'acridine (5 mg/ml dans du PBS).
Procédure de marquage et analyse de 1 'échantillon. On prélève 100 μl d'échantillon (plasma filtré ou échantillon frais)
On ajoute 100 μl de PBS
On ajoute 4 μl de Triton X100 à une concentration de 5% (concentration finale : 0.1%) On incube le mélange 15 minutes à température ambiante .
On ajoute 20 μl de la solution de travail d'Orange d' Acridine.
On incube durant le mélange échantillon— marqueur durant 15 minutes à température ambiante .
On filtre la préparation ainsi obtenue sur une membrane filtre non autofluorescente (noire).
On analyse la membrane avec un analyseur laser à balayage
II. 3 Résultats
Les résultats du dénombrement des leucocytes à la suite de cette procédure de marquage et analyse sont présentés dans le tableau 4 ci-dessus pour chacun des deux échantillon A et B, avant et après leucoreduction.
Tableau 4
Dénombrement de leucocytes en phase solide (à partir de lOOμl d'échantillon)
Figure imgf000021_0001
La concentration en leucocytes avant la leucoreduction est d'environ, 5xl02 à 8xl02 cellules/ml et elle est inférieure à 10 cellules /ml après la leucoreduction.
Ainsi, il apparaît que ce procédé de dénombrement des leucocytes en phase solide, après leur marquage avec un colorant fluorescent, tel que l'orange d'acridine, permet leur détection dans le plasma de manière fiable.
Les différents travaux expérimentaux conduits par la demanderesse ont permis de vérifier que la limite de détection du procédé est inférieure à 10 cellules/ml. Elle est d'environ 1 leucocyte/ml de plasma (200 leucocytes /poche) avec environ 5 ml d'échantillon.
Ce procédé assure une détection de 100% des leucocytes résiduels dans un échantillon de plasma, lorsqu'il est comparé aux dénombrements obtenus avec un hémocytomètre tel qu'une cellule de Malassez.
D'autres expériences ont été conduites dans du plasma préparé pour des usages thérapeutiques. La concentration en leucocytes avant leucoreduction était d'environ 5xl02 cellules/ml (supérieur à 105 cellules/poche), alors qu'après leucoreduction cette concentration est inférieure à 10 cellules/ml (inférieur à 2 103 cellules/poche).
Le procédé de dénombrement de leucocytes de l'invention est sûr et les dénombrements obtenus sont cohérents avec ceux décrits dans la littérature . ( Masse M., Transfus Clin Biol 2001 Jun; 8 ( 3 ) : 297-302 « Universal leukoreduction of cellular and plasma components : process control and performance of the leukoreduction process. » )
Cette étude montre que le procédé de dénombrement de leucocytes de l'invention permet la détection de leucocytes résiduels dans le plasma et, comparé aux procédés conventionnels de dénombrement de leucocytes, il offre une plus grande exactitude.
De plus, la sensibilité du procédé de l'invention peut être optimisée aisément en augmentant le volume de l'échantillon. Un volume d'échantillon plus important conduira à une meilleure récupération des leucocytes qui seront plus représentatifs de l'échantillon.

Claims

REVENDICATIONS
1) Procédé de dénombrement de leucocytes éventuellement présents dans un fluide biologique, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : a) l'incubation d'un échantillon dudit fluide biologique avec un agent perméabilisant des membranes cellulaires, b) l'incubation de l'échantillon obtenu à l'étape (a) avec un marqueur des leucocytes, c) la filtration de l'échantillon obtenu à l'étape (b) sur une membrane non autofluorescente, susceptible de retenir les leucocytes, pour obtenir une préparation en phase solide des leucocytes marqués, éventuellement présents dans ledit échantillon, d) l'analyse de la préparation en phase solide de l'étape (c), pour dénombrer les leucocytes marqués éventuellement présents sur celle-ci.
2) Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'échantillon de l'étape (a) est préalablement dilué avec un tampon osmotiquement compatible avec les leucocytes, avant son incubation avec l'agent perméabilisant des membranes.
3) Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce que le tampon de dilution est choisi parmi le groupe comprenant : du PBS, du TRIS, du tampon de Tyrode ou du sérum physiologique.
4) Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que l'agent perméabilisant des membranes cellulaires est choisi parmi un détergent, et un agent de fixation. 5) Procédé selon la revendication 4, caractérisé en ce que le détergent utilisé à l'étape (a) est choisi parmi le groupe comprenant les détergents : Triton X-100, saponine, n-octyl-glucopyranoside, Tween 20, Tween 80, sodium dodécyl sulfate.
6) Procédé selon l'une quelconque des revendications 4 et 5, caractérisé en ce que le détergent utilisé à l'étape (a) est utilisé à une concentration finale comprise entre 0,05% et 5%, de préférence entre 0,01% et 2 %.
7) Procédé selon l'une quelconque des revendications 4 à 6, caractérisé en ce que le détergent utilisé à l'étape (a) est utilisé à une concentration finale de 0,1% pour le Triton X-100, de 1% pour le n-octyl glucopyranoside, le Tween 20, le Tween 80 et le sodium dodécyl sulfate, de 0,2% pour la saponine.
8) Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes caractérisé en ce que la durée d'incubation entre l'échantillon et l'agent perméabilisant des membranes cellulaires à l'étape (a) est comprise entre 5 et 45 minutes, de préférence entre 10 et 20 minutes et tout préférentiellement elle est de 15 minutes.
9) Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que le marqueur des leucocytes utilisé à l'étape (b) est choisi parmi le groupe comprenant : un colorant, un fluorochrome, un marqueur d'acides nucléiques. 10) Procédé selon la revendication 9, caractérisé en ce que le marqueur de leucocytes utilisé à l'étape (b) est un marqueur d'acides nucléiques choisi parmi le groupe comprenant : orange d'acridine Picogreen®, cyanine asymétrique, cyanine monomère, cyanine dimère, SYBR®
11) Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que la durée d'incubation entre l'échantillon et le marqueur à l'étape (b) est comprise entre 5 et 45 minutes, de préférence entre 10 et 20 minutes et tout préférentiellement elle est de 15 minutes .
12) Procédé selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce que la membrane non-autofluorescente mise en œuvre à l'étape (c) est une membrane noire .
13) Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que la taille des pores de la membrane mise en œuvre à l'étape (c) est comprise entre 0,05 μm et 2 μm, tout préférentiellement entre 0,1 μm et 1 μm et préférentiellement elle est de 0,4 μm.
14 ) Procédé selon l ' une quelconque des revendications précédentes , caractérisé en ce que la membrane est une membrane en polyester, polyether sulfone ou poly carbonate .
15 ) Procédé selon l ' une quelconque des revendications précédentes , caractérisé en ce qu ' après la filtration de l'étape (c) on effectue un lavage de la membrane par filtration d'un volume de tampon.
16) Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que l'analyse de la préparation en phase solide à l'étape (d) est effectuée au moyen d'un analyseur à balayage laser.
17) Procédé d'identification morphologique des leucocytes éventuellement présents dans un produit sanguin, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes (a) à (c) d'un procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 15, suivies d'une étape (e) d'observation visuelle au microscope à épifluorescence des préparations obtenues à l'étape (c) .
18) Utilisation d'un procédé de dénombrement de leucocytes selon l'une quelconque des revendications 1 à 16 ou d'un procédé d'identification morphologique de leucocytes selon la revendication 17 pour le contrôle de qualité des préparations de plasma.
19) Utilisation d'un procédé de dénombrement de leucocytes selon l'une quelconque des revendications 1 à 16 ou d'un procédé d'identification morphologique de leucocytes selon la revendication 17 pour le contrôle de qualité des filtres de leucocytes
20) Utilisation d'un procédé de dénombrement de leucocytes selon l'une quelconque des revendications 1 à 16 ou d'un procédé d'identification morphologique de leucocytes selon la revendication 17, pour le dénombrement des leucocytes dans les fluides biologiques. 21) Utilisation d'un procédé de dénombrement de leucocytes selon l'une quelconque des revendications 1 à 16 ou d'un procédé d'identification morphologique de leucocytes selon la revendication 17 pour l'identification morphologique des différentes populations de leucocytes dans les fluides biologiques
22) Utilisation d'un procédé de dénombrement de leucocytes selon l'une quelconque des revendications 1 à 16 ou d'un procédé d'identification morphologique de leucocytes selon la revendication 17 pour le contrôle des procédés de leucoreduction.
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