JP4087161B2 - リンパ球サブセットの異常を検出する方法 - Google Patents
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【０００１】
【発明の属する技術分野】
この発明は、リンパ球サブセットの異常を検出する方法に関する。より詳細には、蛍光色素などで標識したレクチンを用いて、血液学的試料に含まれるリンパ球サブセットを特異的に弁別し、得られる蛍光などの標識信号を解析することによって、リンパ球サブセットの異常を簡便に検出する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術および発明が解決しようとする課題】
末梢血リンパ球は、種々の疾患や薬剤投与により増減する。リンパ球にはＴ細胞とＢ細胞のサブセットがある。Ｔ細胞とＢ細胞はそれぞれ細胞性免疫と液性免疫を担い、とりわけＴ細胞は免疫応答の中枢として重要である。したがって、血液・免疫性疾患、アレルギー性疾患や感染症において、両者の動向を知ることは診断・治療のうえで不可欠となってきている。
Ｔ細胞は，胸膜由来のリンパ球で，主として遅延型過敏反応，移植片対宿主拒絶反応などに関与している。臨床検査で検索される頻度が高いＴ細胞のサブセットはCD3陽性細胞（成熟Ｔリンパ球総数）、CD4陽性細胞（免疫補助Ｔリンパ球、helper T cell、Th）、CD8陽性細胞（免疫抑制Ｔリンパ球、supressorT cell、Ts）である。
Ｂ細胞は、骨髄由来のリンパ球で形成細胞に分化し、免疫グロブリンを産生する。Ｔ細胞とＢ細胞は相互に連携して、免疫ネットワークを形成する。
【０００３】
疾患に罹ると生体内での免疫反応が亢進し、リンパ球サブセットが増減することが知られている。Ｔ細胞が増加する主な疾患として、伝染性単核球症、T細胞白血病など、Ｔ細胞が減少する主な疾患として、感染症、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、免疫不全症、慢性肝炎などが知られている。さらに、Ｂ細胞が増加する主な疾患として、Ｂ細胞白血病、胸腺無形成症など、Ｂ細胞が減少する主な疾患として、重症複合免疫不全症などが知られている。
【０００４】
これらのリンパ球サブセットの比率を知るためのリンパ球サブセット検査は、現在、フローサイトメトリーを用いた細胞免疫学的な方法が主流である。その方法では、細胞表面抗原を特異的に認識する各種モノクローナル抗体が使用される。Ｔ細胞サブセット検査用抗体として汎用されるモノクローナル抗体は、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１９、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ５６などが挙げられる。フローサイトメトリーを用いる方法では、これらの抗体を蛍光色素などであらかじめ標識したものが使用される。標識され、かつ測定目的のリンパ球サブセットに対応したモノクローナル抗体を試料に加え、該抗体を試料中のリンパ球と結合させる。標識されたリンパ球を含む試料をフローサイトメータで測定する。測定して得られた散乱光や蛍光の情報を用いてスキャッタグラムを作成してリンパ球サブセットの領域を抽出し、計測してリンパ球サブセットを検査する。
この方法の場合、各リンパ球サブセット測定に使用するモノクローナル抗体が高価であるので、検査のコストを下げることは困難である。こういった高価な試薬であるモノクローナル抗体を用いる検査は医療費の削減が叫ばれている環境下では、価格面で大きな課題となっている。さらに、リンパ球サブセット検査は、臨床的に確立されており現在広範囲に行われているが、検査試薬のコスト以外にも、測定にかかる人件費が高かったり、手技が煩雑であるなどの課題もある。
【０００５】
一方、Ｔ細胞サブセット検査として、レクチンを使用した方法がある。
一般的にレクチンとは、植物・動物・微生物等に存在するタンパク質または糖タンパク質のうち、糖に対する特異的結合活性をもった物質の総称として用いられている。臨床への応用としては、赤血球の表面上の糖鎖の識別による血液型の識別や、リンパ球幼若化試験、種々の免疫抑制効果や免疫療法の効果にも使われている。
レクチンによるＴ細胞サブセット検査は、ＷＧＡ（コムギ胚）を用いるＣＤ８およびＣＤ１６細胞の検査法（T. Toge ら、Surgery Today, Jpn J Surg (1993) 23: 765-770）およびＷＧＡを用いる末梢リンパ球のサブクラスの検出（D.H. Boldtら、Cancer (1983) 51: 2083-2089）等が知られている。しかしいずれの方法も、赤血球等が糖鎖を表面上に有するのでWGAと反応するおそれがあり、従ってＴ細胞サブセット検査のためには、血液学的試料から単核球（リンパ球および単球）のみを単離する操作が必須であり、その操作が非常に煩雑である。例えば、市販のリンパ球分離溶液を使用した場合、遠心分離とその後の洗浄を含めると前処理だけでも２時間近く必要とする。従って、価格対効果の面からこれらの方法を臨床検査として応用することは事実上、不可能である。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
われわれは、様々な条件で検討を重ねた結果、血液学的試料から単核球を分離する操作をしなくても、蛍光標識レクチンがリンパ球サブセットと好適に結合しうるような方法を見いだした。具体的には、血液学的試料を赤血球の影響を除去する処理に付すことのみで、蛍光標識レクチンとリンパ球サブセットの選択的な結合が短時間で達成でき、さらにこの結合は安定であることを確認している。この知見を用い、本発明者は、モノクローナル抗体を用いず、かつ血液学的試料から単核球を分離しなくても、簡便にリンパ球サブセットの異常を検査する方法を見出した。
【０００７】
本発明によれば、
(１) 血液学的試料を、該試料から赤血球の影響を除去する処理に付し、
(２) 蛍光標識レクチンを反応させて、該試料中のリンパ球に結合させ、
(３) 該試料をフローサイトメータに供して、少なくとも２つの異なる種類の光強度を測定し、
(４) 測定した光強度からスキャッタグラムを作成し、該スキャッタグラム上の、リンパ球に相当する領域内の情報を抽出し、その情報を蛍光のヒストグラムに展開し、リンパ球の平均蛍光強度およびリンパ球の蛍光強度の変動係数を算出し、所定の各々の閾値と比較することからなる、
リンパ球サブセットの異常を検出する方法が提供される。
【０００８】
【発明の実施の形態】
本発明において、リンパ球サブセットは、Ｔ細胞およびＢ細胞のいずれに限定されるものではないが、Ｔ細胞サブセットが好ましく、ＣＤ４陽性細胞およびＣＤ８陽性細胞がさらに好ましい。
(１) 血液学的試料を、該試料から赤血球の影響を除去する処理に付す工程。
本発明における血液学的試料とは、動物特にヒトの末梢血液または、骨髄穿針液等の主に血液細胞からなる生物学的試料であって、好ましくは抗凝固剤処理のなされた静脈採血血液である。また、抗凝固剤等を含む水溶液で希釈してもよい。抗凝固剤としては、特に限定されないが、例えば、ヘパリン、クエン酸又はクエン酸塩等を使用することができる。水溶液で希釈する場合の希釈倍率は、５〜１００倍程度（容量）が適当であり、好ましくは１０〜５０倍程度である。
【０００９】
レクチンは糖鎖と特異的に結合する活性を有するので、本発明の方法においてはリンパ球以外で糖鎖を細胞表面上に有する赤血球の影響を除去、すなわち赤血球がレクチンと結合しないように処理する必要がある。
血液学的試料から赤血球の影響を除去する処理としては、基本的に白血球を損傷させず、かつ測定時にレクチンと赤血球が反応しないようにできる処理であればよい。一般的に行われている方法としては、塩化アンモニウムを主成分とする白血球にほとんど損傷を与えない溶血剤を使用する処理方法、第一液にpH2〜4程度の酸性低張溶液、第二液に溶液をpH6〜8程度の中性に戻すという酸性低張溶液を用いる方法などが挙げられる。なかでも、塩化アンモニウムを主成分とする白血球にほとんど損傷を与えない溶血剤を使用する処理方法、または酸性低張溶液を用いる方法が好ましい。
塩化アンモニウムを主成分とする溶血剤には、任意にEDTA-4Naのようなキレート剤、炭酸水素カリウムのような電解質等を含むことができる。血液学的試料を塩化アンモニウムを主成分とする溶血剤で処理する際の混合比は、用いる血液学的試料の状態、溶血剤の濃度等により適宜調整することができるが、血液学的試料と溶血剤とが容量比で、例えば、１：１０〜１００程度が挙げられる。この際の反応温度、反応時間は血液学的試料と溶解剤との混合比などにより適宜調整することができるが、例えば、室温で数十秒から10分程度が好ましい。
【００１０】
血液学的試料を上記処理に付した後、該試料を１回以上洗浄するのがさらに好ましい。洗浄は、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、血漿、上記溶血剤等を該試料に加え、攪拌し、遠心分離した後に上清を除去することにより行うことができる。
【００１１】
(２) 蛍光標識レクチンを反応させて、該試料中のリンパ球に結合させる工程。
蛍光標識レクチンのレクチン部分には、コンカナバリンＡ、ＤＳＡ（ヨウシュチョウセンアサガオ）、ＳＳＡ（ニワトコ）、Ｅ−ＰＨＡ、Ｌ−ＰＨＡ、ＷＧＡ（コムギ胚）、ＰＮＡ（ピーナッツ）およびＳＢＡ（大豆）等を用いることができる。ＷＧＡは、リンパ球のＴ細胞のＣＤ４陽性細胞およびＣＤ８陽性細胞と特異的に結合することができる。
蛍光標識レクチンの蛍光部分には、フローサイトメトリーで検出可能なものであればよく、例えばフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、フィコエリスリン（ＰＥ）、アロフィコシアニン、テキサスレッド、PE-CY5、ペリジンクロロフィルプロテイン（PerCP）のような蛍光色素が挙げられる。
蛍光標識レクチンとしては、具体的には、ＦＩＴＣ標識ＷＧＡ、ＰＥ標識ＷＧＡ、ＦＩＴＣ標識ＰＮＡなどが挙げられる。蛍光標識レクチンは、任意にＢＳＡ、デキストラン、ソルビトール等を添加したPBSや生理食塩水などの溶液にして用いるのが好ましい。
赤血球の影響を除去された該試料に、蛍光標識レクチンの溶液を加え、該試料中のリンパ球に蛍光標識レクチンを結合させる。該試料と蛍光標識レクチンの混合比は、用いる血液学的試料の状態、蛍光標識レクチンの種類等により適宜調整することができるが、血液学的試料と蛍光標識レクチンとが容量比で、例えば５０：１〜２：１程度が挙げられる。この際の反応温度、反応時間は血液学的試料と蛍光標識レクチンの混合比などにより適宜調整することができるが、室温で15秒〜40分、冷却下で20秒から１時間、さらに好ましくは、室温で5分〜30分、冷却下で30分〜１時間程度が好ましい。
レクチンは、リンパ球サブセットの種類に応じて、特異的結合の強さが異なる。例えば、WGAはＣＤ８陽性細胞に特異的強く結合し、ＣＤ４陽性細胞には弱く結合する。
【００１２】
(３) 該試料をフローサイトメータに供して、少なくとも２つの異なる種類の光強度を測定する工程。
次に蛍光標識レクチンと結合したリンパ球を含む血液学的試料をフローサイトメータで測定する。フローサイトメータは一般に市販されているものであれば、特に限定されるものではなく、どのようなものでも使用することができる。
フローサイトメーターで検出するパラメータの光強度は、散乱光、例えば前方散乱光（FSC)および側方散乱光（SSC)、ならびに蛍光、たとえば緑蛍光、オレンジ蛍光、赤蛍光などの強度である。前方散乱光および側方散乱光の強度を検出するのが好ましい。
【００１３】
(４) 測定した光強度からスキャッタグラムを作成し、該スキャッタグラム上の、リンパ球に相当する領域内の情報を抽出し、その情報を蛍光のヒストグラムに展開し、リンパ球の平均蛍光強度およびリンパ球の蛍光強度の変動係数を算出し、所定の各々の閾値と比較する工程。
得られた２つの光強度を用いてスキャッタグラムを作成する。例えば、前方散乱および側方散乱の強度を２軸とするスキャッタグラム、あるいは蛍光および側方散乱の強度を２軸とするスキャッタグラムを作成してもよい。
別途、単離精製したリンパ球サブセットの細胞を同条件下で処理し、それぞれについてスキャッタグラムを作成して、リンパ球サブセットの細胞の出現する領域をあらかじめ分画しておく。
そのようにして得た相当するリンパ球サブセットの細胞領域を、前記工程で作成した該試料のスキャッタグラム上に分画して情報を抽出する。
抽出したリンパ球サブセットの細胞領域について、それぞれの蛍光強度と細胞数を２軸とするヒストグラムを作成して、リンパ球サブセットの蛍光強度の変動係数（CV）および平均蛍光強度を求める。
【００１４】
前述のように、レクチンは、リンパ球サブセットの種類に応じて、特異的結合の強さが異なる。例えば、WGAはＣＤ８陽性細胞に特異的強く結合し、ＣＤ４陽性細胞には弱く結合する。従って、ＷＧＡ標識の平均蛍光強度は、ＣＤ８陽性細胞が増加すると著しく増加し、ＣＤ４陽性細胞が増加すると平均蛍光強度は減少する。
健常者の血液学的試料中のリンパ球サブセット比は一定であり、例えば、ＣＤ４陽性細胞、ＣＤ８陽性細胞の総リンパ球に対する比率は、ＣＤ４陽性細胞で２５〜６０％、ＣＤ８陽性細胞で１２〜３６％である。蛍光色素で標識したＷＧＡの蛍光強度のＣＶおよび平均蛍光強度は、ＣＤ４陽性細胞とＣＤ８陽性細胞の比率によって決まるので、健常者については一定の範囲の値をとる。発明者らの実験によると、ＦＩＴＣ標識したＷＧＡの蛍光強度のＣＶ平均は、８５．５％（±１１．９標準偏差）であった。また、その平均蛍光強度の平均は５９．５ｃｈ（±１５．３標準偏差）であった。
【００１５】
ここで、リンパ球サブセットの異常を有する試料、例えばＣＤ４陽性細胞またはＣＤ８陽性細胞の存在比率が変化した試料の場合、蛍光標識レクチンの蛍光強度のＣＶまたは平均蛍光強度が大きく変化することになる。この蛍光標識レクチンの蛍光強度のＣＶあるいは平均蛍光強度について、一定の閾値を設けることにより、その閾値をはずれることが、リンパ球サブセット異常を意味することとなる。従って、本発明の方法により、極めて簡便にリンパ球サブセット異常を検出することができる。
【００１６】
【実施例】
以下、実施例に従って、本発明を説明するが、これにより本発明が限定されるものではない。
実施例１（リンパ球に対するWGA結合能の確認）
健常者の血液１００μｌをファルコンチューブに分注し、塩化アンモニウム溶液（ＫＨＣＯ3：１．０ｇ、ＮＨ4Ｃｌ：８．２６ｇ、ＥＤＴＡ−４Ｎａ：０．０３７ｇを蒸留水で１Ｌにメスアップ）を３〜４ｍｌ添加した。攪拌機（ボルテックス（Ｖｏｌｔｅｘ））で軽く攪拌後、５分間静置した。４℃、１６００ｒｐｍで３分間遠心した。上清を除去し攪拌機で軽く攪拌した。ＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）を２〜３ｍｌ添加し、良く攪拌した。４℃、１６００ｒｐｍで３分間遠心した。上清を除去後、攪拌機で軽く攪拌した。そこへＰＢＳを５００μｌ添加した。
【００１７】
阻害剤としてＮ−アセチル−Ｄ（＋）−グルコサミン保存溶液（ＰＢＳ中Ｎ−アセチル−Ｄ（＋）−グルコサミンの０．１５ｇ／ｍｌ溶液）をそこへ７５μｌ添加し、良く攪拌した。さらにＷＧＡ保存溶液（ＦＩＴＣ標識ＷＧＡ：ＳＩＧＭＡ、Ｌ−４８９５；ＰＢＳ中 Triticum Vulgaris の２ｍｇ／ｍｌ溶液）５μｌを試料に添加して良く攪拌した。その後氷中で３０分間静置した。フローサイトメーター（ＦＡＣＳキャリバー（ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ））を用いて、その試料の散乱光と蛍光を測定した。対照として、阻害剤の代わりにＰＢＳを７５μｌ添加した試料も調製し、同様に処理した。得られた散乱光と蛍光の情報を用い、前方散乱−側方散乱のスキャッタグラムを作成してリンパ球領域を抽出した。 抽出したリンパ球領域を蛍光（ＦＩＴＣの蛍光）のヒストグラムに展開した。阻害剤を添加しないときのリンパ球領域の蛍光ヒストグラムを図１（ａ）に、阻害剤を添加したときのリンパ球の蛍光ヒストグラムを図１（ｂ）に示す。
【００１８】
実施例１の結果より、Ｎ−アセチル−Ｄ（＋）−グルコサミンがＷＧＡとリンパ球の結合を阻害していることが示された。文献などにより、Ｎ−アセチル−Ｄ（＋）−グルコサミンはＷＧＡと特異的に結合することが開示されている。従って、ＷＧＡがリンパ球の細胞膜上のＮ−アセチル−Ｄ（＋）−グルコサミンに結合しうることが間接的に示された。また、血液学的試料を赤血球溶血処理および洗浄処理に付すのみで、レクチンであるＷＧＡとリンパ球が好適に結合することが明らかとなった。
【００１９】
実施例２（ＷＧＡとリンパ球サブセットとの結合関係）
健常者の血液１００μｌに、ＰｅｒＣＰ（ペリジンクロロフィルプロテイン）標識のＣＤ４陽性細胞（Ｌｅｕ−３ａ，日本ベクトン・ディッキンソン社製）を１０μｌ添加した。試料を室温・暗所で15分間放置した後、試料に実施例１に記載した塩化アンモニウム溶液を２〜３ｍｌ添加した。攪拌機で軽く攪拌後、５分間静置した。１６００ｒｐｍ（４℃）で１０分間遠心した。上清を除去し攪拌機で軽く攪拌した。ＷＧＡ保存溶液（ＦＩＴＣ標識ＷＧＡ：ＳＩＧＭＡ，Ｌ−４８９５；ＰＢＳ中 Triticum Vulgaris の２ｍｇ／ｍｌ溶液）を試料に添加して良く攪拌した。その後氷中で３０分間静置した。フローサイトメータ（ＦＡＣＳキャリバー）を用いて、その試料の散乱光と蛍光（ＰｅｒＣＰの蛍光とＦＩＴＣの蛍光の２種類）を測定した。得られた散乱光と蛍光の情報を用い、まず、前方散乱−側方散乱のスキャッタグラムでリンパ球を分画した。分画したリンパ球をＰｅｒＣＰの蛍光ヒストグラムに展開し、ＣＤ４陽性細胞を分画した。さらに、分画したＣＤ４陽性細胞をＦＩＴＣの蛍光（ＷＧＡの蛍光強度）のヒストグラムに展開した。ＦＩＴＣの蛍光はＷＧＡ結合量を反映するものであるから、得られたヒストグラムから、ＣＤ４陽性細胞におけるＷＧＡの結合量を求めることができる。最後に、ＣＤ４陽性細胞のＷＧＡの平均蛍光強度も求めた。
【００２０】
ＰｅｒＣＰ標識のＣＤ４陽性細胞の代わりにＰｅｒＣＰ標識のＣＤ８陽性細胞（Leu-2a，日本ベクトン・ディッキンソン社製）を用いた以外は、上記と同様に操作し、ＣＤ８陽性細胞のＷＧＡの平均蛍光強度を求めた。
さらに、上記のＣＤ４陽性細胞のＷＧＡの平均蛍光強度を求めるのに使用したデータを用い、以下の方法で全リンパ球のＷＧＡの平均蛍光強度を求めた。まず、上記と同様に前方散乱−側方散乱のサイトグラムでリンパ球を分画した。次に、分画したリンパ球（全リンパ球）をＦＩＴＣの蛍光（ＷＧＡの蛍光強度）のヒストグラムに展開した。最後に、全リンパ球のＷＧＡの平均蛍光強度を求めた。使用した試料と取得したデータは同じであるが、解析方法のみが異なる。
【００２１】
健常者の前方散乱−側方散乱のスキャッタグラムを図２（ａ）に示し、全リンパ球の蛍光（ＦＩＴＣ）のヒストグラムを図２（ｂ）に示し、ＣＤ４陽性細胞の蛍光（ＦＩＴＣ）のヒストグラムを図２（ｃ）に示し、ＣＤ８陽性細胞の蛍光（ＦＩＴＣ）のヒストグラムを図２（ｄ）に示す。図２（ｃ）と（ｄ）から得られたＣＤ４陽性細胞とＣＤ８陽性細胞の平均蛍光強度（ＦＩＴＣ）と、図２（ｂ）から得られた全リンパ球の平均蛍光強度（ＦＩＴＣ）を以下の表１に示す。
【００２２】
【表１】
【００２３】
以上の結果により、ＷＧＡがＣＤ４陽性細胞およびＣＤ８陽性細胞に特異的に結合することが明らかとなった。
【００２４】
実施例３（ＷＧＡ蛍光強度ＣＶとリンパ球サブセット比率（CD4/CD8比）の関係について）
健常者および疾患（ＡＴＬ、ＬＧＬＬまたはＡＭＬ）を有する患者の血液100μlをファルコンチューブに分注し、実施例１に記載した塩化アンモニウム溶液を３〜４ml添加した。攪拌機で軽く攪拌後、５分間静置した。1600rpm（４℃）で３分間遠心した。上清を除去し攪拌機で軽く攪拌した。ＰＢＳ（phosphate buffer saline）を２〜３ml添加し、良く攪拌した。1600rpm（４℃）で３分間遠心する。上清を除去後、攪拌機で軽く攪拌した。ＷＧＡ stock sol. （FITC標識WGA：SIGMA，L-4895；Triticum Vulgaris を2mg/ml の濃度で PBSに溶解）５μlを添加し良く攪拌した。氷中で３０分間静置した。ＦＡＣＳキャリバー（FACSCalibur）にて測定した。前方散乱−側方散乱のサイトグラムでリンパ球領域を抽出した。抽出したリンパ球領域をＦＩＴＣの蛍光のヒストグラムに展開した。健常者および各疾患について、ＦＩＴＣの蛍光強度のＣＶ値を求めた。
上記と同じ血液試料を用いて一般的な方法により、ＣＤ４陽性細胞比率、ＣＤ８陽性細胞比率およびＣＤ４／ＣＤ８比率を測定した。これらの測定項目は、すでに既知であり、容易に測定しうる測定項目である。
【００２５】
健常者および疾患（ＡＴＬ、ＬＧＬＬまたはＡＭＬ）を有する患者の血液１００μｌをそれぞれファルコンチューブに分注した。ＰｅｒＣＰ標識のＣＤ４（Ｌｅｕ−３ａ、日本ベクトン・ディッキンソン社製）を１０μｌ添加した。さらにＦＩＴＣ標識のＣＤ８（Ｌｅｕ−２ａ、日本ベクトン・ディッキンソン社製）を添加した。室温・暗所で１５分間放置した。実施例１に記載した塩化アンモニウム溶液を２〜３ｍｌ添加した。攪拌機で軽く攪拌後、５分間静置した。１６００ｒｐｍ（４℃）で１０分間遠心した。上清を除去し攪拌機で軽く攪拌した。約５００μｌの塩化アンモニウム溶液を添加し、フローサイトメータ（ＦＡＣＳキャリバー）を用いてその試料の散乱光と蛍光を測定した。得られた散乱光と蛍光の情報を用い、前方散乱−側方散乱のスキャッタグラムを作成してリンパ球領域（全リンパ球）を分画した。分画したリンパ球をＰｅｒＣＰ（およびＦＩＴＣ）の蛍光ヒストグラムに展開し、ＣＤ４（およびＣＤ８）陽性細胞を分画する。リンパ球の細胞数からＣＤ４（およびＣＤ８）陽性細胞比率を求めた。ＣＤ４陽性細胞比率は、（ＣＤ４陽性細胞数／全リンパ球数）×１００（％）で求められる。
【００２６】
健常者の前方散乱−側方散乱のスキャッタグラムを図３（ａ）と（ｃ）に、対応する全リンパ球領域の蛍光（ＦＩＴＣ）のヒストグラムを図３（ｂ）と（ｄ）に示す。ＡＴＬ患者の前方散乱−側方散乱のスキャッタグラムを図４（ａ）に、対応する全リンパ球領域の蛍光（ＦＩＴＣ）のヒストグラムを図４（ｂ）に示す。ＬＧＬＬ患者の前方散乱−側方散乱のスキャッタグラムを図４（ｃ）に、対応する全リンパ球領域の蛍光（ＦＩＴＣ）のヒストグラムを図４（ｄ）に示す。ＡＭＬ患者の前方散乱−側方散乱のスキャッタグラムを図４（ｅ）に、対応する全リンパ球領域の蛍光（ＦＩＴＣ）のヒストグラムを図４（ｆ）に示す。
図３（ｂ）、（ｄ）および図４（ｂ）、（ｄ）、（ｆ）から得られた全リンパ球領域の蛍光強度のＣＶを下の表２に示す。合わせて、それぞれの血液試料について、別途測定したＣＤ４陽性細胞比率とＣＤ８陽性細胞比率、およびＣＤ４／ＣＤ８比率を表２に示す。
【００２７】
WGA蛍光強度CVとリンパ球サブセット比率（CD4/CD8比）の関係
【表２】
【００２８】
ＡＴＬ、ＣＬＬ、ＡＬＬ、ＭＤＳなどの疾患を有する患者のリンパ球サブセット比は、ほとんどの場合異常値を示す。実施例３のＣＤ４／ＣＤ８比率もＡＴＬ：５８．１、ＬＧＬＬ：１２５．７、ＡＭＬ：０．７と顕著な異常値を示した。健常者１、２のＣＤ４／ＣＤ８比率はそれぞれ、２．７、２．１と正常範囲内であった。本発明者らの実験から、健常者のＷＧＡ蛍光強度ＣＶの平均は、８５．５％（±１１．９標準偏差）であった。実施例３のＡＴＬ、ＬＧＬＬ、ＡＭＬのＷＧＡ蛍光強度ＣＶは、それぞれ、５４％、４８％、５７％となり、健常者のＷＧＡ蛍光強度ＣＶの平均から大きく乖離していた。従って、ＷＧＡ蛍光強度のＣＶ値が８５．５％という閾値から外れる試料については、リンパ球サブセット異常が生じていることが簡便に検出できることが示された。
【００２９】
【発明の効果】
上記のように、血液学的試料を赤血球の影響を除去する処理に付す本発明の方法により、モノクローナル抗体を用いず、かつ血液学的試料から単核球を分離しなくても、簡便にリンパ球サブセットの異常を検査することが可能となった。
【図面の簡単な説明】
【図１】（ａ）阻害剤不在下の全リンパ球領域の蛍光（ＷＧＡ）ヒストグラム、（ｂ）阻害剤存在下の全リンパ球領域の蛍光（ＷＧＡ）ヒストグラムを示す。
【図２】（ａ）健常者の前方散乱−側方散乱のスキャッタグラム、（ｂ）全リンパ球のＦＩＴＣ蛍光（ＷＧＡ）のヒストグラム、（ｃ）ＣＤ４陽性細胞のＦＩＴＣ蛍光（ＷＧＡ）ヒストグラム、（ｄ）ＣＤ８陽性細胞のＦＩＴＣ蛍光（ＷＧＡ）ヒストグラムを示す。
【図３】（ａ）健常者の前方散乱−側方散乱のスキャッタグラム、（ｂ）（ａ）から抽出した全リンパ球領域のＦＩＴＣ蛍光（ＷＧＡ）のヒストグラム、（ｃ）健常者の前方散乱−側方散乱のスキャッタグラム、（ｄ）（ｃ）から抽出した全リンパ球領域のＦＩＴＣ蛍光（ＷＧＡ）のヒストグラムを示す。
【図４】（ａ）ＡＴＬ患者の前方散乱−側方散乱のスキャッタグラム、（ｂ）（ａ）から抽出した全リンパ球領域のＦＩＴＣ蛍光（ＷＧＡ）のヒストグラム、（ｃ）ＬＧＬＬ患者の前方散乱−側方散乱のスキャッタグラム、（ｄ）（ｃ）から抽出した全リンパ球領域のＦＩＴＣ蛍光（ＷＧＡ）のヒストグラム、（ｅ）ＡＭＬ患者の前方散乱−側方散乱のスキャッタグラム、（ｆ）（ｃ）から抽出した全リンパ球領域のＦＩＴＣ蛍光（ＷＧＡ）のヒストグラムを示す。
【発明の属する技術分野】
この発明は、リンパ球サブセットの異常を検出する方法に関する。より詳細には、蛍光色素などで標識したレクチンを用いて、血液学的試料に含まれるリンパ球サブセットを特異的に弁別し、得られる蛍光などの標識信号を解析することによって、リンパ球サブセットの異常を簡便に検出する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術および発明が解決しようとする課題】
末梢血リンパ球は、種々の疾患や薬剤投与により増減する。リンパ球にはＴ細胞とＢ細胞のサブセットがある。Ｔ細胞とＢ細胞はそれぞれ細胞性免疫と液性免疫を担い、とりわけＴ細胞は免疫応答の中枢として重要である。したがって、血液・免疫性疾患、アレルギー性疾患や感染症において、両者の動向を知ることは診断・治療のうえで不可欠となってきている。
Ｔ細胞は，胸膜由来のリンパ球で，主として遅延型過敏反応，移植片対宿主拒絶反応などに関与している。臨床検査で検索される頻度が高いＴ細胞のサブセットはCD3陽性細胞（成熟Ｔリンパ球総数）、CD4陽性細胞（免疫補助Ｔリンパ球、helper T cell、Th）、CD8陽性細胞（免疫抑制Ｔリンパ球、supressorT cell、Ts）である。
Ｂ細胞は、骨髄由来のリンパ球で形成細胞に分化し、免疫グロブリンを産生する。Ｔ細胞とＢ細胞は相互に連携して、免疫ネットワークを形成する。
【０００３】
疾患に罹ると生体内での免疫反応が亢進し、リンパ球サブセットが増減することが知られている。Ｔ細胞が増加する主な疾患として、伝染性単核球症、T細胞白血病など、Ｔ細胞が減少する主な疾患として、感染症、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、免疫不全症、慢性肝炎などが知られている。さらに、Ｂ細胞が増加する主な疾患として、Ｂ細胞白血病、胸腺無形成症など、Ｂ細胞が減少する主な疾患として、重症複合免疫不全症などが知られている。
【０００４】
これらのリンパ球サブセットの比率を知るためのリンパ球サブセット検査は、現在、フローサイトメトリーを用いた細胞免疫学的な方法が主流である。その方法では、細胞表面抗原を特異的に認識する各種モノクローナル抗体が使用される。Ｔ細胞サブセット検査用抗体として汎用されるモノクローナル抗体は、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１９、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ５６などが挙げられる。フローサイトメトリーを用いる方法では、これらの抗体を蛍光色素などであらかじめ標識したものが使用される。標識され、かつ測定目的のリンパ球サブセットに対応したモノクローナル抗体を試料に加え、該抗体を試料中のリンパ球と結合させる。標識されたリンパ球を含む試料をフローサイトメータで測定する。測定して得られた散乱光や蛍光の情報を用いてスキャッタグラムを作成してリンパ球サブセットの領域を抽出し、計測してリンパ球サブセットを検査する。
この方法の場合、各リンパ球サブセット測定に使用するモノクローナル抗体が高価であるので、検査のコストを下げることは困難である。こういった高価な試薬であるモノクローナル抗体を用いる検査は医療費の削減が叫ばれている環境下では、価格面で大きな課題となっている。さらに、リンパ球サブセット検査は、臨床的に確立されており現在広範囲に行われているが、検査試薬のコスト以外にも、測定にかかる人件費が高かったり、手技が煩雑であるなどの課題もある。
【０００５】
一方、Ｔ細胞サブセット検査として、レクチンを使用した方法がある。
一般的にレクチンとは、植物・動物・微生物等に存在するタンパク質または糖タンパク質のうち、糖に対する特異的結合活性をもった物質の総称として用いられている。臨床への応用としては、赤血球の表面上の糖鎖の識別による血液型の識別や、リンパ球幼若化試験、種々の免疫抑制効果や免疫療法の効果にも使われている。
レクチンによるＴ細胞サブセット検査は、ＷＧＡ（コムギ胚）を用いるＣＤ８およびＣＤ１６細胞の検査法（T. Toge ら、Surgery Today, Jpn J Surg (1993) 23: 765-770）およびＷＧＡを用いる末梢リンパ球のサブクラスの検出（D.H. Boldtら、Cancer (1983) 51: 2083-2089）等が知られている。しかしいずれの方法も、赤血球等が糖鎖を表面上に有するのでWGAと反応するおそれがあり、従ってＴ細胞サブセット検査のためには、血液学的試料から単核球（リンパ球および単球）のみを単離する操作が必須であり、その操作が非常に煩雑である。例えば、市販のリンパ球分離溶液を使用した場合、遠心分離とその後の洗浄を含めると前処理だけでも２時間近く必要とする。従って、価格対効果の面からこれらの方法を臨床検査として応用することは事実上、不可能である。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
われわれは、様々な条件で検討を重ねた結果、血液学的試料から単核球を分離する操作をしなくても、蛍光標識レクチンがリンパ球サブセットと好適に結合しうるような方法を見いだした。具体的には、血液学的試料を赤血球の影響を除去する処理に付すことのみで、蛍光標識レクチンとリンパ球サブセットの選択的な結合が短時間で達成でき、さらにこの結合は安定であることを確認している。この知見を用い、本発明者は、モノクローナル抗体を用いず、かつ血液学的試料から単核球を分離しなくても、簡便にリンパ球サブセットの異常を検査する方法を見出した。
【０００７】
本発明によれば、
(１) 血液学的試料を、該試料から赤血球の影響を除去する処理に付し、
(２) 蛍光標識レクチンを反応させて、該試料中のリンパ球に結合させ、
(３) 該試料をフローサイトメータに供して、少なくとも２つの異なる種類の光強度を測定し、
(４) 測定した光強度からスキャッタグラムを作成し、該スキャッタグラム上の、リンパ球に相当する領域内の情報を抽出し、その情報を蛍光のヒストグラムに展開し、リンパ球の平均蛍光強度およびリンパ球の蛍光強度の変動係数を算出し、所定の各々の閾値と比較することからなる、
リンパ球サブセットの異常を検出する方法が提供される。
【０００８】
【発明の実施の形態】
本発明において、リンパ球サブセットは、Ｔ細胞およびＢ細胞のいずれに限定されるものではないが、Ｔ細胞サブセットが好ましく、ＣＤ４陽性細胞およびＣＤ８陽性細胞がさらに好ましい。
(１) 血液学的試料を、該試料から赤血球の影響を除去する処理に付す工程。
本発明における血液学的試料とは、動物特にヒトの末梢血液または、骨髄穿針液等の主に血液細胞からなる生物学的試料であって、好ましくは抗凝固剤処理のなされた静脈採血血液である。また、抗凝固剤等を含む水溶液で希釈してもよい。抗凝固剤としては、特に限定されないが、例えば、ヘパリン、クエン酸又はクエン酸塩等を使用することができる。水溶液で希釈する場合の希釈倍率は、５〜１００倍程度（容量）が適当であり、好ましくは１０〜５０倍程度である。
【０００９】
レクチンは糖鎖と特異的に結合する活性を有するので、本発明の方法においてはリンパ球以外で糖鎖を細胞表面上に有する赤血球の影響を除去、すなわち赤血球がレクチンと結合しないように処理する必要がある。
血液学的試料から赤血球の影響を除去する処理としては、基本的に白血球を損傷させず、かつ測定時にレクチンと赤血球が反応しないようにできる処理であればよい。一般的に行われている方法としては、塩化アンモニウムを主成分とする白血球にほとんど損傷を与えない溶血剤を使用する処理方法、第一液にpH2〜4程度の酸性低張溶液、第二液に溶液をpH6〜8程度の中性に戻すという酸性低張溶液を用いる方法などが挙げられる。なかでも、塩化アンモニウムを主成分とする白血球にほとんど損傷を与えない溶血剤を使用する処理方法、または酸性低張溶液を用いる方法が好ましい。
塩化アンモニウムを主成分とする溶血剤には、任意にEDTA-4Naのようなキレート剤、炭酸水素カリウムのような電解質等を含むことができる。血液学的試料を塩化アンモニウムを主成分とする溶血剤で処理する際の混合比は、用いる血液学的試料の状態、溶血剤の濃度等により適宜調整することができるが、血液学的試料と溶血剤とが容量比で、例えば、１：１０〜１００程度が挙げられる。この際の反応温度、反応時間は血液学的試料と溶解剤との混合比などにより適宜調整することができるが、例えば、室温で数十秒から10分程度が好ましい。
【００１０】
血液学的試料を上記処理に付した後、該試料を１回以上洗浄するのがさらに好ましい。洗浄は、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、血漿、上記溶血剤等を該試料に加え、攪拌し、遠心分離した後に上清を除去することにより行うことができる。
【００１１】
(２) 蛍光標識レクチンを反応させて、該試料中のリンパ球に結合させる工程。
蛍光標識レクチンのレクチン部分には、コンカナバリンＡ、ＤＳＡ（ヨウシュチョウセンアサガオ）、ＳＳＡ（ニワトコ）、Ｅ−ＰＨＡ、Ｌ−ＰＨＡ、ＷＧＡ（コムギ胚）、ＰＮＡ（ピーナッツ）およびＳＢＡ（大豆）等を用いることができる。ＷＧＡは、リンパ球のＴ細胞のＣＤ４陽性細胞およびＣＤ８陽性細胞と特異的に結合することができる。
蛍光標識レクチンの蛍光部分には、フローサイトメトリーで検出可能なものであればよく、例えばフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、フィコエリスリン（ＰＥ）、アロフィコシアニン、テキサスレッド、PE-CY5、ペリジンクロロフィルプロテイン（PerCP）のような蛍光色素が挙げられる。
蛍光標識レクチンとしては、具体的には、ＦＩＴＣ標識ＷＧＡ、ＰＥ標識ＷＧＡ、ＦＩＴＣ標識ＰＮＡなどが挙げられる。蛍光標識レクチンは、任意にＢＳＡ、デキストラン、ソルビトール等を添加したPBSや生理食塩水などの溶液にして用いるのが好ましい。
赤血球の影響を除去された該試料に、蛍光標識レクチンの溶液を加え、該試料中のリンパ球に蛍光標識レクチンを結合させる。該試料と蛍光標識レクチンの混合比は、用いる血液学的試料の状態、蛍光標識レクチンの種類等により適宜調整することができるが、血液学的試料と蛍光標識レクチンとが容量比で、例えば５０：１〜２：１程度が挙げられる。この際の反応温度、反応時間は血液学的試料と蛍光標識レクチンの混合比などにより適宜調整することができるが、室温で15秒〜40分、冷却下で20秒から１時間、さらに好ましくは、室温で5分〜30分、冷却下で30分〜１時間程度が好ましい。
レクチンは、リンパ球サブセットの種類に応じて、特異的結合の強さが異なる。例えば、WGAはＣＤ８陽性細胞に特異的強く結合し、ＣＤ４陽性細胞には弱く結合する。
【００１２】
(３) 該試料をフローサイトメータに供して、少なくとも２つの異なる種類の光強度を測定する工程。
次に蛍光標識レクチンと結合したリンパ球を含む血液学的試料をフローサイトメータで測定する。フローサイトメータは一般に市販されているものであれば、特に限定されるものではなく、どのようなものでも使用することができる。
フローサイトメーターで検出するパラメータの光強度は、散乱光、例えば前方散乱光（FSC)および側方散乱光（SSC)、ならびに蛍光、たとえば緑蛍光、オレンジ蛍光、赤蛍光などの強度である。前方散乱光および側方散乱光の強度を検出するのが好ましい。
【００１３】
(４) 測定した光強度からスキャッタグラムを作成し、該スキャッタグラム上の、リンパ球に相当する領域内の情報を抽出し、その情報を蛍光のヒストグラムに展開し、リンパ球の平均蛍光強度およびリンパ球の蛍光強度の変動係数を算出し、所定の各々の閾値と比較する工程。
得られた２つの光強度を用いてスキャッタグラムを作成する。例えば、前方散乱および側方散乱の強度を２軸とするスキャッタグラム、あるいは蛍光および側方散乱の強度を２軸とするスキャッタグラムを作成してもよい。
別途、単離精製したリンパ球サブセットの細胞を同条件下で処理し、それぞれについてスキャッタグラムを作成して、リンパ球サブセットの細胞の出現する領域をあらかじめ分画しておく。
そのようにして得た相当するリンパ球サブセットの細胞領域を、前記工程で作成した該試料のスキャッタグラム上に分画して情報を抽出する。
抽出したリンパ球サブセットの細胞領域について、それぞれの蛍光強度と細胞数を２軸とするヒストグラムを作成して、リンパ球サブセットの蛍光強度の変動係数（CV）および平均蛍光強度を求める。
【００１４】
前述のように、レクチンは、リンパ球サブセットの種類に応じて、特異的結合の強さが異なる。例えば、WGAはＣＤ８陽性細胞に特異的強く結合し、ＣＤ４陽性細胞には弱く結合する。従って、ＷＧＡ標識の平均蛍光強度は、ＣＤ８陽性細胞が増加すると著しく増加し、ＣＤ４陽性細胞が増加すると平均蛍光強度は減少する。
健常者の血液学的試料中のリンパ球サブセット比は一定であり、例えば、ＣＤ４陽性細胞、ＣＤ８陽性細胞の総リンパ球に対する比率は、ＣＤ４陽性細胞で２５〜６０％、ＣＤ８陽性細胞で１２〜３６％である。蛍光色素で標識したＷＧＡの蛍光強度のＣＶおよび平均蛍光強度は、ＣＤ４陽性細胞とＣＤ８陽性細胞の比率によって決まるので、健常者については一定の範囲の値をとる。発明者らの実験によると、ＦＩＴＣ標識したＷＧＡの蛍光強度のＣＶ平均は、８５．５％（±１１．９標準偏差）であった。また、その平均蛍光強度の平均は５９．５ｃｈ（±１５．３標準偏差）であった。
【００１５】
ここで、リンパ球サブセットの異常を有する試料、例えばＣＤ４陽性細胞またはＣＤ８陽性細胞の存在比率が変化した試料の場合、蛍光標識レクチンの蛍光強度のＣＶまたは平均蛍光強度が大きく変化することになる。この蛍光標識レクチンの蛍光強度のＣＶあるいは平均蛍光強度について、一定の閾値を設けることにより、その閾値をはずれることが、リンパ球サブセット異常を意味することとなる。従って、本発明の方法により、極めて簡便にリンパ球サブセット異常を検出することができる。
【００１６】
【実施例】
以下、実施例に従って、本発明を説明するが、これにより本発明が限定されるものではない。
実施例１（リンパ球に対するWGA結合能の確認）
健常者の血液１００μｌをファルコンチューブに分注し、塩化アンモニウム溶液（ＫＨＣＯ3：１．０ｇ、ＮＨ4Ｃｌ：８．２６ｇ、ＥＤＴＡ−４Ｎａ：０．０３７ｇを蒸留水で１Ｌにメスアップ）を３〜４ｍｌ添加した。攪拌機（ボルテックス（Ｖｏｌｔｅｘ））で軽く攪拌後、５分間静置した。４℃、１６００ｒｐｍで３分間遠心した。上清を除去し攪拌機で軽く攪拌した。ＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）を２〜３ｍｌ添加し、良く攪拌した。４℃、１６００ｒｐｍで３分間遠心した。上清を除去後、攪拌機で軽く攪拌した。そこへＰＢＳを５００μｌ添加した。
【００１７】
阻害剤としてＮ−アセチル−Ｄ（＋）−グルコサミン保存溶液（ＰＢＳ中Ｎ−アセチル−Ｄ（＋）−グルコサミンの０．１５ｇ／ｍｌ溶液）をそこへ７５μｌ添加し、良く攪拌した。さらにＷＧＡ保存溶液（ＦＩＴＣ標識ＷＧＡ：ＳＩＧＭＡ、Ｌ−４８９５；ＰＢＳ中 Triticum Vulgaris の２ｍｇ／ｍｌ溶液）５μｌを試料に添加して良く攪拌した。その後氷中で３０分間静置した。フローサイトメーター（ＦＡＣＳキャリバー（ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ））を用いて、その試料の散乱光と蛍光を測定した。対照として、阻害剤の代わりにＰＢＳを７５μｌ添加した試料も調製し、同様に処理した。得られた散乱光と蛍光の情報を用い、前方散乱−側方散乱のスキャッタグラムを作成してリンパ球領域を抽出した。 抽出したリンパ球領域を蛍光（ＦＩＴＣの蛍光）のヒストグラムに展開した。阻害剤を添加しないときのリンパ球領域の蛍光ヒストグラムを図１（ａ）に、阻害剤を添加したときのリンパ球の蛍光ヒストグラムを図１（ｂ）に示す。
【００１８】
実施例１の結果より、Ｎ−アセチル−Ｄ（＋）−グルコサミンがＷＧＡとリンパ球の結合を阻害していることが示された。文献などにより、Ｎ−アセチル−Ｄ（＋）−グルコサミンはＷＧＡと特異的に結合することが開示されている。従って、ＷＧＡがリンパ球の細胞膜上のＮ−アセチル−Ｄ（＋）−グルコサミンに結合しうることが間接的に示された。また、血液学的試料を赤血球溶血処理および洗浄処理に付すのみで、レクチンであるＷＧＡとリンパ球が好適に結合することが明らかとなった。
【００１９】
実施例２（ＷＧＡとリンパ球サブセットとの結合関係）
健常者の血液１００μｌに、ＰｅｒＣＰ（ペリジンクロロフィルプロテイン）標識のＣＤ４陽性細胞（Ｌｅｕ−３ａ，日本ベクトン・ディッキンソン社製）を１０μｌ添加した。試料を室温・暗所で15分間放置した後、試料に実施例１に記載した塩化アンモニウム溶液を２〜３ｍｌ添加した。攪拌機で軽く攪拌後、５分間静置した。１６００ｒｐｍ（４℃）で１０分間遠心した。上清を除去し攪拌機で軽く攪拌した。ＷＧＡ保存溶液（ＦＩＴＣ標識ＷＧＡ：ＳＩＧＭＡ，Ｌ−４８９５；ＰＢＳ中 Triticum Vulgaris の２ｍｇ／ｍｌ溶液）を試料に添加して良く攪拌した。その後氷中で３０分間静置した。フローサイトメータ（ＦＡＣＳキャリバー）を用いて、その試料の散乱光と蛍光（ＰｅｒＣＰの蛍光とＦＩＴＣの蛍光の２種類）を測定した。得られた散乱光と蛍光の情報を用い、まず、前方散乱−側方散乱のスキャッタグラムでリンパ球を分画した。分画したリンパ球をＰｅｒＣＰの蛍光ヒストグラムに展開し、ＣＤ４陽性細胞を分画した。さらに、分画したＣＤ４陽性細胞をＦＩＴＣの蛍光（ＷＧＡの蛍光強度）のヒストグラムに展開した。ＦＩＴＣの蛍光はＷＧＡ結合量を反映するものであるから、得られたヒストグラムから、ＣＤ４陽性細胞におけるＷＧＡの結合量を求めることができる。最後に、ＣＤ４陽性細胞のＷＧＡの平均蛍光強度も求めた。
【００２０】
ＰｅｒＣＰ標識のＣＤ４陽性細胞の代わりにＰｅｒＣＰ標識のＣＤ８陽性細胞（Leu-2a，日本ベクトン・ディッキンソン社製）を用いた以外は、上記と同様に操作し、ＣＤ８陽性細胞のＷＧＡの平均蛍光強度を求めた。
さらに、上記のＣＤ４陽性細胞のＷＧＡの平均蛍光強度を求めるのに使用したデータを用い、以下の方法で全リンパ球のＷＧＡの平均蛍光強度を求めた。まず、上記と同様に前方散乱−側方散乱のサイトグラムでリンパ球を分画した。次に、分画したリンパ球（全リンパ球）をＦＩＴＣの蛍光（ＷＧＡの蛍光強度）のヒストグラムに展開した。最後に、全リンパ球のＷＧＡの平均蛍光強度を求めた。使用した試料と取得したデータは同じであるが、解析方法のみが異なる。
【００２１】
健常者の前方散乱−側方散乱のスキャッタグラムを図２（ａ）に示し、全リンパ球の蛍光（ＦＩＴＣ）のヒストグラムを図２（ｂ）に示し、ＣＤ４陽性細胞の蛍光（ＦＩＴＣ）のヒストグラムを図２（ｃ）に示し、ＣＤ８陽性細胞の蛍光（ＦＩＴＣ）のヒストグラムを図２（ｄ）に示す。図２（ｃ）と（ｄ）から得られたＣＤ４陽性細胞とＣＤ８陽性細胞の平均蛍光強度（ＦＩＴＣ）と、図２（ｂ）から得られた全リンパ球の平均蛍光強度（ＦＩＴＣ）を以下の表１に示す。
【００２２】
【表１】
以上の結果により、ＷＧＡがＣＤ４陽性細胞およびＣＤ８陽性細胞に特異的に結合することが明らかとなった。
【００２４】
実施例３（ＷＧＡ蛍光強度ＣＶとリンパ球サブセット比率（CD4/CD8比）の関係について）
健常者および疾患（ＡＴＬ、ＬＧＬＬまたはＡＭＬ）を有する患者の血液100μlをファルコンチューブに分注し、実施例１に記載した塩化アンモニウム溶液を３〜４ml添加した。攪拌機で軽く攪拌後、５分間静置した。1600rpm（４℃）で３分間遠心した。上清を除去し攪拌機で軽く攪拌した。ＰＢＳ（phosphate buffer saline）を２〜３ml添加し、良く攪拌した。1600rpm（４℃）で３分間遠心する。上清を除去後、攪拌機で軽く攪拌した。ＷＧＡ stock sol. （FITC標識WGA：SIGMA，L-4895；Triticum Vulgaris を2mg/ml の濃度で PBSに溶解）５μlを添加し良く攪拌した。氷中で３０分間静置した。ＦＡＣＳキャリバー（FACSCalibur）にて測定した。前方散乱−側方散乱のサイトグラムでリンパ球領域を抽出した。抽出したリンパ球領域をＦＩＴＣの蛍光のヒストグラムに展開した。健常者および各疾患について、ＦＩＴＣの蛍光強度のＣＶ値を求めた。
上記と同じ血液試料を用いて一般的な方法により、ＣＤ４陽性細胞比率、ＣＤ８陽性細胞比率およびＣＤ４／ＣＤ８比率を測定した。これらの測定項目は、すでに既知であり、容易に測定しうる測定項目である。
【００２５】
健常者および疾患（ＡＴＬ、ＬＧＬＬまたはＡＭＬ）を有する患者の血液１００μｌをそれぞれファルコンチューブに分注した。ＰｅｒＣＰ標識のＣＤ４（Ｌｅｕ−３ａ、日本ベクトン・ディッキンソン社製）を１０μｌ添加した。さらにＦＩＴＣ標識のＣＤ８（Ｌｅｕ−２ａ、日本ベクトン・ディッキンソン社製）を添加した。室温・暗所で１５分間放置した。実施例１に記載した塩化アンモニウム溶液を２〜３ｍｌ添加した。攪拌機で軽く攪拌後、５分間静置した。１６００ｒｐｍ（４℃）で１０分間遠心した。上清を除去し攪拌機で軽く攪拌した。約５００μｌの塩化アンモニウム溶液を添加し、フローサイトメータ（ＦＡＣＳキャリバー）を用いてその試料の散乱光と蛍光を測定した。得られた散乱光と蛍光の情報を用い、前方散乱−側方散乱のスキャッタグラムを作成してリンパ球領域（全リンパ球）を分画した。分画したリンパ球をＰｅｒＣＰ（およびＦＩＴＣ）の蛍光ヒストグラムに展開し、ＣＤ４（およびＣＤ８）陽性細胞を分画する。リンパ球の細胞数からＣＤ４（およびＣＤ８）陽性細胞比率を求めた。ＣＤ４陽性細胞比率は、（ＣＤ４陽性細胞数／全リンパ球数）×１００（％）で求められる。
【００２６】
健常者の前方散乱−側方散乱のスキャッタグラムを図３（ａ）と（ｃ）に、対応する全リンパ球領域の蛍光（ＦＩＴＣ）のヒストグラムを図３（ｂ）と（ｄ）に示す。ＡＴＬ患者の前方散乱−側方散乱のスキャッタグラムを図４（ａ）に、対応する全リンパ球領域の蛍光（ＦＩＴＣ）のヒストグラムを図４（ｂ）に示す。ＬＧＬＬ患者の前方散乱−側方散乱のスキャッタグラムを図４（ｃ）に、対応する全リンパ球領域の蛍光（ＦＩＴＣ）のヒストグラムを図４（ｄ）に示す。ＡＭＬ患者の前方散乱−側方散乱のスキャッタグラムを図４（ｅ）に、対応する全リンパ球領域の蛍光（ＦＩＴＣ）のヒストグラムを図４（ｆ）に示す。
図３（ｂ）、（ｄ）および図４（ｂ）、（ｄ）、（ｆ）から得られた全リンパ球領域の蛍光強度のＣＶを下の表２に示す。合わせて、それぞれの血液試料について、別途測定したＣＤ４陽性細胞比率とＣＤ８陽性細胞比率、およびＣＤ４／ＣＤ８比率を表２に示す。
【００２７】
WGA蛍光強度CVとリンパ球サブセット比率（CD4/CD8比）の関係
【表２】
ＡＴＬ、ＣＬＬ、ＡＬＬ、ＭＤＳなどの疾患を有する患者のリンパ球サブセット比は、ほとんどの場合異常値を示す。実施例３のＣＤ４／ＣＤ８比率もＡＴＬ：５８．１、ＬＧＬＬ：１２５．７、ＡＭＬ：０．７と顕著な異常値を示した。健常者１、２のＣＤ４／ＣＤ８比率はそれぞれ、２．７、２．１と正常範囲内であった。本発明者らの実験から、健常者のＷＧＡ蛍光強度ＣＶの平均は、８５．５％（±１１．９標準偏差）であった。実施例３のＡＴＬ、ＬＧＬＬ、ＡＭＬのＷＧＡ蛍光強度ＣＶは、それぞれ、５４％、４８％、５７％となり、健常者のＷＧＡ蛍光強度ＣＶの平均から大きく乖離していた。従って、ＷＧＡ蛍光強度のＣＶ値が８５．５％という閾値から外れる試料については、リンパ球サブセット異常が生じていることが簡便に検出できることが示された。
【００２９】
【発明の効果】
上記のように、血液学的試料を赤血球の影響を除去する処理に付す本発明の方法により、モノクローナル抗体を用いず、かつ血液学的試料から単核球を分離しなくても、簡便にリンパ球サブセットの異常を検査することが可能となった。
【図面の簡単な説明】
【図１】（ａ）阻害剤不在下の全リンパ球領域の蛍光（ＷＧＡ）ヒストグラム、（ｂ）阻害剤存在下の全リンパ球領域の蛍光（ＷＧＡ）ヒストグラムを示す。
【図２】（ａ）健常者の前方散乱−側方散乱のスキャッタグラム、（ｂ）全リンパ球のＦＩＴＣ蛍光（ＷＧＡ）のヒストグラム、（ｃ）ＣＤ４陽性細胞のＦＩＴＣ蛍光（ＷＧＡ）ヒストグラム、（ｄ）ＣＤ８陽性細胞のＦＩＴＣ蛍光（ＷＧＡ）ヒストグラムを示す。
【図３】（ａ）健常者の前方散乱−側方散乱のスキャッタグラム、（ｂ）（ａ）から抽出した全リンパ球領域のＦＩＴＣ蛍光（ＷＧＡ）のヒストグラム、（ｃ）健常者の前方散乱−側方散乱のスキャッタグラム、（ｄ）（ｃ）から抽出した全リンパ球領域のＦＩＴＣ蛍光（ＷＧＡ）のヒストグラムを示す。
【図４】（ａ）ＡＴＬ患者の前方散乱−側方散乱のスキャッタグラム、（ｂ）（ａ）から抽出した全リンパ球領域のＦＩＴＣ蛍光（ＷＧＡ）のヒストグラム、（ｃ）ＬＧＬＬ患者の前方散乱−側方散乱のスキャッタグラム、（ｄ）（ｃ）から抽出した全リンパ球領域のＦＩＴＣ蛍光（ＷＧＡ）のヒストグラム、（ｅ）ＡＭＬ患者の前方散乱−側方散乱のスキャッタグラム、（ｆ）（ｃ）から抽出した全リンパ球領域のＦＩＴＣ蛍光（ＷＧＡ）のヒストグラムを示す。
Claims (6)
- 血液学的試料を、赤血球とレクチンが実質的に反応しないように、該試料から赤血球の影響を除去する処理に付す工程、
赤血球の影響を除去する処理が行われた血液学的試料に蛍光標識レクチンを添加し、該試料中のリンパ球に蛍光標識レクチンを結合させる工程、
蛍光標識レクチンが添加された血液学的試料をフローサイトメータに供して、少なくとも２つの異なる種類の光強度を測定する工程、
測定した２つの異なる種類の光強度からリンパ球に相当する情報を抽出し、その情報に基づいてリンパ球の平均蛍光強度またはリンパ球の蛍光強度の変動係数を算出する工程、および
得られたリンパ球の平均蛍光強度またはリンパ球の蛍光強度の変動係数を、リンパ球の平均蛍光強度に対応する閾値またはリンパ球の蛍光強度の変動係数に対応する閾値と比較する工程からなる、リンパ球サブセットの異常を検出する方法。 - 蛍光標識レクチンのレクチン部分が、コンカナバリンＡ、ＤＳＡ（ヨウシュチョウセンアサガオ）、ＳＳＡ（ニワトコ）、Ｅ−ＰＨＡ、Ｌ−ＰＨＡ、ＷＧＡ（コムギ胚）、ＰＮＡ（ピーナッツ）およびＳＢＡ（大豆）からなる群から選択される請求項１に記載の方法。
- 血液学的試料から赤血球の影響を除去する処理が、赤血球溶血剤との処理または酸性低張溶液との処理である請求項１または２に記載の方法。
- 光強度が、蛍光強度と、前方散乱光（FSC)強度又は側方散乱光（SSC)強度と、からなる請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
- リンパ球サブセットが、Ｔ細胞サブセットである請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
- 前記算出工程において、リンパ球の蛍光強度の変動係数を算出し、前記比較工程において、算出された変動係数を、リンパ球の蛍光強度の変動係数に対応する閾値と比較する請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
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Applications Claiming Priority (1)
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