JP5626727B2 - 微量血液からの白血球ポピュレーション解析法 - Google Patents

Description

本発明は、微量の全血から白血球を効率的かつ迅速に分離し、回収した白血球細胞をハイスループットな画像解析に供することで、血液中の白血球のポピュレーション解析を行う方法に関する。

血液は血液細胞と血漿成分からなる。血漿の主成分はその約９０％を占める水であり、他に、塩などの無機質、フィブリノゲン、グロブリン、アルブミンなどのタンパク質を含む。また、血液細胞には赤血球、白血球、血小板がある。

血液の中で最も多く含まれている血液細胞は赤血球であり、健常人の血液中には約４００〜５００万個／μｌ存在する。赤血球は成熟途中で脱核して細胞核を失い、直径が約７．５〜８．５μｍの円板状で中央がくぼんだ形状であり、壊れにくく、かつ変形し易いという特性を持つ。赤血球の中にはヘモグロビンが多量に含まれており、ヘモグロビンは酸素と結合する性質をもつことから、赤血球は血流に乗って酸素を全身に運搬する役割を果たす。

血小板は健常人で血液の中に約１０〜４０万個／μｌ存在する、血液細胞の中で最も小さく、直径２〜３μｍで核を持たない不定形の細胞である。血管が損傷した場合に集合してその傷口をふさぎ（血小板凝集）、出血を止める作用をもつ。

白血球は直径６〜２０μｍ、血液細胞の中で最も大きく唯一核を有する細胞であり、健常人の血液中に約４０００〜８０００個／μｌ存在する。白血球には様々な種類があり、大きく分けて顆粒球と単核球に分類される。顆粒球はさらに好中球、好酸球、好塩基球の３種類に分類され、一方単核球はリンパ球と単球の２種類に分類される。これら種々の白血球はそれぞれ独自の機能を有し、主に細菌・ウイルスなど異物の生体内への侵入防御や感染後の排除、腫瘍細胞や役目を終えた細胞の排除などを役割とすることが知られている。

白血球やその他の細胞は、細胞表面に糖タンパクなど様々な分子を発現しており、これら細胞表面抗原（細胞表面マーカー）によって、さらに機能的亜群や細胞系統、分化成熟段階など、細かい細胞の違いを識別し、分類することができる。これら白血球の詳細な分類は白血球サブセットとも呼ばれる。ヒト白血球分化抗原に関する国際ワークショップ（ＨＬＤＡ）が表面抗原を認識する抗体群を国際的に統一して分類したものがＣＤ（cluster of differentiation）分類であり、２００７年時点でＣＤ１〜３５０まで決定され、白血球サブセットの同定に広く用いられている。ＣＤ分類は、本来は同じ表面抗原を認識するモノクローナル抗体の分類であるが、現在ではモノクローナル抗体が認識する表面抗原の名称としても用いられている。

血液は様々な成分と機能を有し生命維持のために全身を循環し、全身の組織や臓器の状態が血液の成分に反映されるため、血液中の成分を調べることにより、疾患の検査や治療の経過をモニタリングすることができる。そのため血液検査は一般的な検査方法として広く行われており、特にＨＩＶ感染者の免疫状態の評価や白血病、悪性リンパ腫のタイピングなどにおいては、血液中の白血球の詳細な種類やその割合などを分析する、白血球ポピュレーション解析が非常に重要であると考えられている。

白血球など血液細胞の検査は、古くは血液細胞を染色して塗抹標本を作製し、顕微鏡にて観察、計数する目視法で行われていたが、煩雑であり、標本作製、検鏡、判定に個人差があり、またカウント数が少ないため統計学的精度が低い、などの問題があった。そこで、電気抵抗法により血球容積を測定し、光透過度法により白血球の内部構造を分析する、全自動の血球計数機器が開発された（例えば、特許文献１参照）。しかしながら、この血球計数器は多量の細胞を計数でき、血液成分の簡易分類検査は可能であるが、リンパ球のサブセットポピュレーションなどの詳細な情報を得られないこと、細胞の形態も観察できないこと、血液サンプルが１０〜１２０μｌ程度必要であること、などの問題があった。

さらに白血球を詳しく調べる方法として、フローサイトメトリーを用いた方法がある（例えば、特許文献２参照）。この方法は、個々の細胞を散乱光や蛍光を用いて光学的に解析するもので、白血球細胞の表面マーカーを解析することによる、白血球ポピュレーションの詳細な解析が可能である。しかしながら、この方法も、溶血処理が必要であり、細胞の形態も観察できず、血液サンプルが２０〜２００μｌ程度必要であり、大型で高価なフローサイトメトリーの装置が必要である、などの問題があった。そのため、医療機関でのルーチン検査に利用可能な、小型安価で詳細な解析を行うことができる白血球ポピュレーション計測機器の開発が求められていた。

また、マウスなどの小型実験動物を用いた実験では、実験動物の全血液量が少量のために実験が制限される、例えば、経時的に血液を採取して血中成分の詳細な分析を行うような実験が困難であるという問題もあった。そのため、患者の負担軽減という観点からだけでなく、動物実験の設計の制限をなくすという観点からも、少ない血液量でも分析を行うことができる解析方法の開発が期待されていた。

他方、本発明者らは、試料中に含まれる細胞を１細胞レベルで捕捉することができる単一細胞捕捉用のマイクロ流路デバイスや、かかるマイクロ流路デバイスを用いた試料中に含まれる細胞を１細胞レベルで分離・捕捉する方法や、前記マイクロ流路デバイスを利用した単一細胞の遺伝子発現の定量的解析方法（例えば、特許文献３参照）や、サイズ選択マイクロキャビティアレイを利用した単一細胞解析技術（例えば、非特許文献１参照）について提案している。

特公昭５４―２５９８号公報 特公平６−１００５９６号公報 ＷＯ／２００９／０１６８４２

http://jstshingi.jp/abst/p/10/1010/tuat2.pdf

本発明の課題は、微量の全血から簡易かつ迅速に白血球を回収することができ、さらに個々の細胞の表現型をも迅速に同定することができる、小型で安価な装置を用いた、白血球のポピュレーション解析方法を提供することにある。

上記課題を解決するため、本発明者らは鋭意検討し、サイズ選択マイクロキャビティアレイのシステムを利用した、微量血液からの白血球のポピュレーション解析方法（以下、「本発明の白血球ポピュレーションの解析方法」ともいう）を開発するに至った。具体的には、溶血操作の有無や抗凝固剤の種類、マイクロキャビティアレイの孔径や孔数などを検討することにより、サイズ選択マイクロキャビティアレイを用いて微量血液からほぼ１００％の白血球を捕捉できる方法（以下、「本発明の白血球回収方法」ともいう）を見いだし、さらに染色方法を検討することにより、かかるマイクロキャビティアレイに捕捉された白血球を迅速に染色して観察できる方法を見出した。マイクロキャビティアレイに捕捉した細胞の蛍光顕微鏡観察を行うには、これまでは染色・洗浄操作を施した細胞をマイクロキャビティアレイに導入する（特許文献３）、あるいはマイクロキャビティアレイに細胞を捕捉した後に、このデバイスに染色液、洗浄液を順次導入してインキュベートする（特願２０１０−０２４７７４）方法を用いて行っていた。それに対し本発明では、染色液を細胞液に混入して反応させた後、希釈してマイクロキャビティアレイに導入することで、洗浄操作不要で迅速に細胞の染色、捕捉及び蛍光顕微鏡観察を行うことができる方法を見出した。

すなわち、本発明者らは鋭意検討の結果、抗凝固剤として金属キレート剤を用いて採取した、溶血操作を行わない血液を用いることにより、血中のほぼ１００％の白血球を捕捉できる；血液に染色試薬を添加し反応させたサンプル液を希釈して白血球回収用のマイクロ流体デバイスに導入することにより、染色試薬の洗浄操作が不要で手順及び時間を削減できる；という効果を得て、簡易かつ迅速な白血球ポピュレーション解析方法を確立し、本発明を完成するに至った。

すなわち本発明は、〔１〕以下の（ａ）〜（ｅ）の工程を備えたことを特徴とする微量血液からの白血球ポピュレーションの解析方法；
（ａ）孔径３μｍ以上５μｍ未満から選ばれる微細貫通孔を有するサイズ選択マイクロキャビティアレイにより全血試料中に含まれる白血球を選択的に捕捉することができるマイクロ流体デバイスを準備する工程;
（ｂ）全血試料に、血液凝固抑制剤としてカルシウムイオンをキレートする金属キレート剤と、蛍光染色試薬とを混入し、希釈する工程;
（ｃ）工程（ｂ）で調製したサンプル液を、マイクロ流体デバイスに供給する工程;
（ｄ）マイクロ流体デバイスのサイズ選択マイクロキャビティアレイの微細孔に白血球を捕捉する工程;
（ｅ）白血球が集積化された領域内をスキャニングすることで白血球細胞の観察像を取得する工程;
に関する。

また本発明は、〔２〕微量血液が、０．１μｌ〜１０μｌの全血試料であることを特徴とする上記〔１〕記載の白血球ポピュレーションの解析方法や、〔３〕細胞捕捉率が、９９％以上であることを特徴とする上記〔１〕又は〔２〕記載の白血球ポピュレーションの解析方法や、〔４〕カルシウムイオンをキレートする金属キレート剤が、ＥＤＴＡである上記〔１〕〜〔３〕のいずれか記載の白血球ポピュレーションの解析方法や、〔５〕蛍光染色試薬が、ＤＮＡ又は白血球細胞表面抗原を認識して染色することを特徴とする上記〔１〕〜〔４〕のいずれか記載の白血球ポピュレーションの解析方法や、〔６〕サイズ選択マイクロキャビティアレイが、孔径３μｍの微細貫通孔を有し、孔の中心間距離２５μｍ、３２０×３２０の１０２，４００孔をアレイ状に配したマイクロキャビティアレイであることを特徴とする上記〔１〕〜〔５〕のいずれか記載の白血球ポピュレーションの解析方法や、〔７〕サンプル液導入速度を１００〜２０００μｌ／ｍｉｎとすることを特徴とする上記〔１〕〜〔６〕のいずれか記載の白血球ポピュレーションの解析方法や、〔８〕マイクロ流体デバイスに供給するサンプル液に含まれる白血球数：マイクロキャビティアレイの孔数が、１：５０〜１：５とすることを特徴とする上記〔１〕〜〔７〕のいずれか記載の白血球ポピュレーションの解析方法に関する。

本発明によれば、溶血処理を行うことなく微量の血液をそのまま分析できる；白血球を簡易かつ迅速に（約一分以内）ほぼ１００％分離することができる；白血球の詳細なポピュレーション解析を行うことができる；使用する装置自体が小型で安価である；等の特徴を有する白血球のポピュレーション解析を行うことができる。また、本発明によれば、試料が極微量でも十分な捕捉効率が得られるので、マウス等のような比較的小型の実験動物を被検体とする場合でも、サンプル採取に伴う被検体の負荷が少なく、経時的なモニタリングを通して、一個体の血液動態を連続的に把握することが可能になる。

サイズ選択マイクロキャビティアレイにより細胞を捕捉する技術を示す図である。 サイズ選択マイクロキャビティアレイを用いた、全血からの白血球回収方法の原理を示す図である。 本発明の白血球回収デバイス又は血球計算盤を用いた白血球数計測方法の概略を示す図である。 孔径３μｍ、１００，０００孔のマイクロキャビティアレイを用いて全血から白血球を捕捉する場合、サンプルに溶血操作を行わないほうが良好な結果が得られることを示した図である。 全血サンプルを本発明の白血球回収デバイスに導入し、マイクロキャビティアレイを通過したサンプル液を採取することにより、赤血球及び血小板を観察することができることを示す図である。 孔径３μｍ、１００，０００孔のマイクロキャビティアレイを用いて計測した白血球数と、血球計算盤を用いて計測した白血球数の相関を示す図である。 マイクロキャビティアレイに導入する全血サンプルに使用する抗凝固剤は、ヘパリンよりもＥＤＴＡを使用した方が良好な結果が得られることを示した図である。 Hoechst、ＦＩＴＣ標識抗ＣＤ１６β抗体、ＰＥ標識抗ＣＤ３抗体で染色した全血をマイクロキャビティアレイに導入し、捕捉した白血球の蛍光画像を示す図である。 ヒト細胞を移植したマウスから採取した全血を、ＦＩＴＣ標識抗ヒトＣＤ４５抗体及びＰＥ標識抗マウスＣＤ４５抗体を用いて染色し、マイクロキャビティアレイを用いて捕捉して観察した白血球の蛍光画像を示す図である。 ヒト細胞を移植した５匹のマウスから、移植後８週目、１０週目の時点で全血を採取してマイクロキャビティアレイを用いて解析し、ヒト化率がどのように変化するかをモニタリングした結果を示す図である。

本発明の白血球ポピュレーションの解析方法は、数マイクロリットルの微量な全血から白血球を効率的かつ迅速に分離する手法であり、さらに、回収した白血球細胞をハイスループットな画像解析に供することで、血液中の白血球のポピュレーション解析を行う手法である。本発明の白血球ポピュレーションの解析方法は、従来技術の血球計数器やフローサイトメーターと比較して、以下の特徴を有している（表１）。血球計数器やフローサイトメーターと比べて少ない血液量を解析することができ、測定項目が血球計数器より詳細でフローサイトメーターと同等であるにもかかわらず、前処理が不用で簡便であり、使用する装置も小型で安価である。さらに、顕微鏡により形態観察を行うことができ、血球計数器やフローサイトメーターでは得られなかった、白血球の形態に関する情報を得ることができる。

また、白血球回収用のサイズ選択性マイクロキャビティアレイの下に、さらに孔径の小さいサイズ選択性マイクロキャビティアレイを設置することにより、白血球を白血球回収用のサイズ選択性マイクロキャビティアレイで、赤血球をさらに孔径の小さいサイズ選択性マイクロキャビティアレイで、順次、それぞれ捕捉することも可能であるが、本発明の白血球回収方法は全血から白血球を効率よく回収できることから、全血をマイクロ流体デバイスに導入し、マイクロキャビティアレイを通過した後のサンプル液を採取することにより、赤血球及び血小板を選択的に回収することもできる。フローサイトメーターを用いた場合は溶血操作により赤血球を破壊するため赤血球を解析することができず、血球計数器を用いた場合も、赤血球の形態に関する情報は得られない。それに対し、本発明の白血球回収方法を用いた場合は、マイクロキャビティアレイを通過し、白血球が捕捉された後のサンプル液を顕微鏡で観察することにより、貧血の診断と病態解明に不可欠である、赤血球の形態の情報を得ることができる。すなわち、本発明の白血球のポピュレーション解析方法は、小型で安価な装置を用いて微量の全血から簡易かつ迅速に効率よく白血球を回収することができ、白血球の詳細な表現型を迅速に同定できるだけでなく、同じサンプル液から赤血球の形態解析を行うことをも可能にしたものである。以下、本発明の実施の形態についてさらに具体的に説明する。

本発明の微量血液からの白血球ポピュレーションの解析方法としては、
（ａ）サイズ選択マイクロキャビティアレイにより全血試料中に含まれる白血球を選択的に捕捉することができるマイクロ流体デバイスを準備する工程;
（ｂ）全血試料に、血液凝固抑制剤としてカルシウムイオンをキレートする金属キレート剤と、蛍光染色試薬とを混入し、希釈する工程;
（ｃ）工程（ｂ）で調製したサンプル液を、マイクロ流体デバイスに供給する工程;
（ｄ）マイクロ流体デバイスのサイズ選択マイクロキャビティアレイの微細孔に白血球を捕捉する工程;
（ｅ）白血球が集積化された領域内をスキャニングすることで白血球細胞の観察像を取得する工程;
を備えた微量血液からの白血球ポピュレーションの解析方法であれば特に制限されない。

本発明における白血球ポピュレーション解析としては、微量血液中の全白血球の数、及びそのうちの任意のサブセット（免疫表現型）の白血球の数を解析し、かかる白血球サブセットの全白血球中における割合を算出するものであれば特に限定されない。具体的には、ＤＮＡ染色蛍光試薬で全白血球を、また任意のＣＤ分類の蛍光標識抗体により任意のサブセットの白血球を染色した微量血液サンプルをマイクロ流体デバイスに導入し、マイクロキャビティアレイ上に捕捉された白血球の画像を取得して解析することにより、全白血球数に対する、かかる任意のサブセットの白血球数の割合を算出する例を挙げることができる。

本発明における微量血液の量としては、０．００１μｌ〜５０μｌ、好ましくは０．０１μｌ〜３０μｌ、より好ましくは０．１μｌ〜１０μｌを挙げることができる。また、かかる微量血液の量は、本発明のマイクロ流体デバイスに供給するサンプル液に含まれる白血球数：マイクロキャビティアレイの孔数の比が、１：５０〜１：５、好ましくは１：１０となるように上記の範囲内で適宜調整することができる。また血液の由来としては、例えば、ヒト、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウサギ、イヌ、ネコ、サル、モルモット、ハムスター、ラット、マウス等を挙げることができるが、とりわけヒト及びマウスを好適に例示すことができる。

本発明における、サイズ選択マイクロキャビティアレイにより全血試料中に含まれる白血球を選択的に捕捉することができるマイクロ流体デバイスとしては、微細加工技術を用いて直径数ミクロンの微細な貫通孔を高密度加工した白血球回収基板と、試料供給口・試料排出口を連通するマイクロ流路を接合・密封したマイクロ流路に、試料供給口から全血を導入し、試料排出口から血液試料を吸引することで、全血中の白血球のみを選択的に貫通孔上に捕捉回収するデバイスであれば特に制限されない。

上記マイクロ流体デバイスとしては、例えば、特願２０１０−２４７７４や上記非特許文献１に記載されているような、試料供給口と試料排出口、及び試料供給口と試料排出口を連通するマイクロ流路が形成され、マイクロ流路の一部に相当する位置にサイズ選択マイクロキャビティアレイ用開口窓が設けられた上部部材と；前記上部部材の開口窓の下方に相当する位置に、白血球捕捉用の孔径、孔数、配置が制御された微細貫通孔を有するサイズ選択マイクロキャビティアレイと、かかるサイズ選択マイクロキャビティアレイを保持する密封性シールからなるマイクロキャビティアレイ保持部と；前記サイズ選択マイクロキャビティアレイの下方に相当する位置に設けられた吸引用開口窓と、前記吸引用開口窓と吸引口を連通する吸引流路が形成された下部部材と；を備え、サイズ選択マイクロキャビティアレイにより血液試料中に含まれる白血球を捕捉することができる装置を挙げることができ、その一例を図１に示す。

本発明におけるサンプル液としては、血液凝固抑制剤としてカルシウムイオンをキレートする金属キレート剤を含み、溶血操作を行っていない全血試料に蛍光染色試薬を混入して反応させ、希釈したものが好ましい。サンプル液における希釈倍率としては、マイクロ流体デバイスに供給するに十分な液量になるような希釈であれば特に制限されないが、好ましくは全血１μｌにつき、２００μｌになるように希釈する、２００倍希釈を挙げることができる。

本発明におけるカルシウムイオンをキレートする金属キレート剤としては、カルシウムイオンとキレート錯体を形成する物質であればよく、具体的には、ＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）、ＥＧＴＡ（エチレングリコールビス（β−アミノエチルエーテル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−４酢酸）、クエン酸、フィチン酸、シュウ酸、乳酸、酒石酸、グルコン酸、フッ化ナトリウム及びこれらを含む化合物を挙げることができ、中でもＥＤＴＡを好適に例示することができる。ＥＤＴＡの濃度は０．１μＭ〜１００ｍＭであればよく、好ましくは１ｍＭ〜１０ｍＭ、より好ましくは２ｍＭを挙げることができる。

本発明における蛍光染色試薬としては、ＤＮＡ又は白血球細胞を認識して染色することができ、蛍光により検出できる染色試薬であればよく、ＤＮＡを染色する蛍光染色試薬としては、Hoechst 33342、Hoechst 33258、アクリジンオレンジ、ジヒドロエチジウム、ＤＡＰＩ（4',6-diamidino-2-phenylindole）、SYTOX（登録商標） Green（Molecular Probes社製）、TO-PRO（登録商標）-3 iodide（Molecular Probes社製）などを挙げることができる。また、白血球細胞のサブセットを認識して染色することができる蛍光染色試薬としては、ＦＩＴＣ（fluorescein isothiocyanate）、rhodamine 、Ｃｙ３、Ｃｙ５、Alexa（登録商標）Fluor（Molecular Probes社製）、ＰＥ（phycoerythrin）などの蛍光色素によって蛍光標識された白血球細胞表面抗原を認識する抗体を挙げることができ、白血球細胞表面抗原を認識する抗体としてはＣＤ抗体を挙げることができる。したがって、かかる白血球細胞を認識する蛍光染色試薬としては、例えばＰＥ−抗ＣＤ８α抗体やＰＥ−ＣＤ３抗体、ＦＩＴＣ−抗ＣＤ１６β抗体を好適に例示することができる。

本発明における上記サイズ選択マイクロキャビティアレイとしては、ニッケルや石英基板に電鋳技術やレーザー技術を用いて形成された白血球捕捉用の微細貫通孔を有するものを挙げることができ、中でもニッケル製のものを好適に例示することができる。マイクロキャビティアレイの白血球捕捉用の孔径としては、試料供給口から全血を導入し、試料排出口から血液試料を吸引した際に目詰まりを起こさず、全血中の白血球のみを選択的に、９０％以上、好ましくは９５％以上、より好ましくは９９％以上の捕捉率で貫通孔上に捕捉回収することができる孔径であればよく、具体的には孔径２μｍ超５μｍ未満、好ましくは孔径２．５μｍ〜４．５μｍ、さらに好ましくは孔径３μｍ〜孔径４μｍ、特に好ましくは孔径３μｍを挙げることができる。孔数としては１０００個以上、好ましくは３０００個以上、より好ましくは５０００個以上、中でも１００×１００の１０，０００孔から１００，０００孔程度、とりわけ３２０×３２０の１０２，４００孔が特に好ましい。また、孔の配置としては等間隔であることが好ましく、孔の中心間距離は２０μｍ以上、４０μｍ以下とすることが好ましく、例えば、孔径が３μｍで、孔の中心間距離が２５μｍの例を挙げることができる。図２に本発明のマイクロキャビティアレイを用いた全血からの白血球回収原理を示す。

本発明におけるマイクロ流体デバイスへのサンプル液導入速度としては、１００〜２０００μｌ／ｍｉｎであればよく、好ましくは１５０〜１０００μｌ／ｍｉｎ、さらに好ましくは２００μｌ／ｍｉｎである。

白血球が集積化された領域内をスキャニングすることで白血球細胞の観察像を取得する方法としては、蛍光顕微鏡又や光学顕微鏡、走査電子顕微鏡を用いて、マイクロキャビティアレイ上の細胞の観察像を取得することができる。かかる取得画像を解析することより、マイクロキャビティアレイ上の細胞の形態の観察や、細胞数の計測を行うことができる。

以下の実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明は実施例によって限定されるものではない。

［白血球回収デバイスの作製］
マイクロキャビティアレイを加工するための基板として、ニッケル基板（１８×１８ｍｍ、厚さ３５μｍ）を使用した。マイクロキャビティアレイに血液を直接送液し、血中の白血球のみを選択的にマイクロキャビティ上に捕捉するために、血球成分のサイズとフィルトレーションに関する文献等の値から、マイクロキャビティアレイの孔径サイズは２〜３μｍとした。ニッケル基板の加工は、オプトニクス精密株式会社に依頼し、電鋳技術を用いてニッケル基板に孔径３μｍの貫通孔を加工した。孔の中心間距離は２５μｍとし、合計で３２０×３２０の１０２，４００孔をアレイ状に配したものを作製した。このマイクロキャビティアレイを、本明細書においては、孔径３μｍ、１００，０００孔の白血球回収用マイクロキャビティアレイと記すこともある。さらに、ＰＤＭＳ（Poly-dimethylsiloxane）マイクロ流路により、マイクロキャビティアレイ基板を挟み込む形式の白血球回収装置を設計し、アレイ領域の周囲を囲む上部チャンバーと、吸引ラインを配した下部流路を作製した。これらのＰＤＭＳマイクロ流路をマイクロキャビティアレイに対して、in situ PCR slide seal（タカラバイオ社製）により貼り付けた。これらのＰＤＭＳからなる構造体は、ＣＡＤ−ＣＡＭを用いてＰＭＭＡ（Poly(methyl methacrylate)）を切削して作製した構造体から型を作製し、この型にＰＤＭＳを注入し加熱硬化させて作製した。白血球回収装置は、下部流路をぺリスタルティックポンプに接続し、コンピューター制御式電動ステージ、冷却デジタルカメラ（DP70；オリンパス社製）及びＤＡＰＩ、ＦＩＴＣ、ＰＥ由来の蛍光を観察するための蛍光フィルター（ＷＵ、ＮＩＢＡ、Ｃｙ３フィルター）を装備した正立顕微鏡（BX61；オリンパス社製）のステージ上に設置して使用した。

［白血球回収デバイスを用いた微量血液からの白血球の回収及び解析方法］
白血球回収デバイスを用いた白血球の計数は、以下の手順で行った。
１）微量血液（０．１〜１０μｌ）に蛍光染色試薬を反応させて染色した後、ＰＢＳ（２ｍＭ ＥＤＴＡ）を加えて、血液１μｌに対し２００μｌまでサンプルをボリュームアップした。
２）上述の白血球回収用デバイスの上部チャンバーにＰＢＳ（２ｍＭ ＥＤＴＡ）１００μｌを導入し、マイクロキャビティアレイ上をＰＢＳで満たしてから、ぺリスタルティックポンプにより２００μｌ／ｍｉｎで下部流路から吸引することにより、送液を開始した。
３）約３０秒後、２００μｌにボリュームアップした血液サンプルを上部チャンバーに導入し、全血中の血漿、血小板、赤血球はマイクロキャビティアレイを通り抜けさせ、核を有しサイズが大きな白血球のみをマイクロキャビティアレイ上に捕捉した。
４）約３０秒後、血球成分を流しきるために、同デバイスに２００〜４００μｌのＰＢＳ（２ｍＭ ＥＤＴＡ）を導入し、その約３０〜６０秒後、上部チャンバーにカバーグラスをかぶせ、蛍光顕微鏡観察を行った。
５）マイクロキャビティアレイ上に捕捉・回収された全ての細胞を観察するためにアレイ全体の画像を取得し、Lumina Vision（Mitani Corporation社製）を用いて画像取得及び
細胞数を計数する解析を行った。

［白血球回収用デバイスを用いた白血球回収方法の検討］
マイクロキャビティアレイの孔径について検討した。ヒト全血５０μｌをHoechst 33342（Molecular Probes社製）を含む細胞染色液５０μｌと反応させた。VersaLyse溶血試薬（Beckman coulter社製）を含むバッファーもしくはＰＢＳ（２ｍＭ ＥＤＴＡ）を用いて、サンプルを１ｍｌまでボリュームアップし、赤血球を溶血させたサンプルと非溶血サンプルを調製した。全血１μｌ分に相当するサンプル量を、流速２００μｌ／ｍｉｎにて白血球回収デバイスに導入し、サンプル中の白血球数を測定した。また、同サンプル中の白血球数を、血球計算盤を用いてカウントし、血液１μｌ中の白血球細胞数を算出した（図３）。血球計算盤を用いてカウントして得た細胞数を１００として、孔径２μｍ、１０，０００孔のマイクロキャビティアレイ（特許文献３参照）を用いた白血球の回収効率を求めた（表２）。孔径２μｍのマイクロキャビティアレイを用いて、血液を送液した場合は、非溶血サンプルではすぐさま目詰まりが起こった。一方、溶血サンプルでは目詰まりは起こらないが、白血球回収効率は３９±２０％（個別の測定値は５７．５％、１７．７％、４０.８％）であり、白血球回収率は低い上に安定しなかった。

また孔径３μｍ、１００，０００孔の白血球回収用マイクロキャビティアレイを用いた場合では、溶血サンプルおよび非溶血サンプルともにスムーズな送液を行うことができ、血液サンプルを送液した後、バッファーを送液することで、マイクロキャビティアレイ上を綺麗に洗い流すことができた。図４にその一例を示す。白血球回収効率は、溶血サンプルで４５±８％、非溶血サンプルで１００±１０％であった。白血球回収用マイクロキャビティアレイ通過後の非溶血サンプルを顕微鏡観察した結果、赤血球・及び血小板のみが観察され、本デバイスを通過したサンプル中には白血球を除いた血球成分の回収が可能であることが示された（図５）。また、非溶血サンプルの白血球数を、血球計算盤を用いてカウントした値と、孔径３μｍ、１００，０００孔のマイクロキャビティアレイを用いて測定した値との関係を表すグラフ（図６）から、両方法による白血球数の測定値に高い相関性があることが示された。

以上の結果から、１）溶血処理により白血球回収効率が低減すること、２）白血球以外の血球成分の通過には孔径が３μｍ以上の微細貫通孔が必要であることが示唆された。よって、以後の実験では、溶血を行わずに血液を適宜希釈して白血球回収デバイスに導入することとし、デバイスに配するマイクロキャビティアレイの孔径は３μｍとした。

［血液サンプルの調製法の検討］
血液サンプルの状態は、採血時から時間が経つほど悪化していくと考えられ、白血球の回収及び検出に与える影響も懸念される。特に、白血球数の正確な計測には血小板の凝集作用を効果的に抑制することが求められ、血液凝固・血小板凝集を抑制し、血液の流動性を保つことができる抗凝固剤を利用することが必要である。そこで、採血した全血の抗凝固剤としてＥＤＴＡ（ethylene-diamine-tetraacetic acid）及びヘパリンを使用し、孔径１０μｍのマイクロキャビティアレイに回収された血球の状態を、凝集した血球の有無について評価した（図７）。この結果、ＥＤＴＡを抗凝固剤として利用した場合（図７右パネル）には顕著な凝集塊は観察されなかったが、ヘパリンを抗凝固剤として利用した場合（図７左パネル）には大小の凝集塊が多く観察された。このような凝集塊はマイクロキャビティアレイの目詰まりを引き起こすものと考えられ、白血球の計測に不具合を起こすことが懸念される。よって、採血時の抗凝固剤にはＥＤＴＡを利用することとし、血液を希釈するためのＰＢＳバッファーには２ｍＭ ＥＤＴＡを含むものを利用することとした。

［回収白血球数とマイクロキャビティアレイの孔数の関係性の評価］
白血球を効率的に回収し、総白血球数及びポピュレーションを正確に計測するために、測定時にマイクロキャビティアレイに導入する白血球数の最適範囲及び血液の最適希釈比率を検討した。このために、孔径３μｍ、２５，０００孔のマイクロキャビティアレイを用いてマウス血液１μｌ中の白血球数の計測を行った。測定する血液サンプルは予め、上記の方法と同様に、血球計算盤を用いて白血球数を計測した。この結果、マウス血液１μｌ中に２，０００〜１２，０００の血球が存在することが分かった。この結果を受け、マウス血液０．１μｌ（白血球数５００〜１，２００）又は１μｌ（白血球数５，０００〜１２，０００）に相当するサンプルを２００μｌにボリュームアップし、白血球回収用デバイスに導入した。この結果、マウス血液０．１μｌ（白血球数５００〜１，２００）を解析した場合は、マイクロキャビティアレイ上に白血球を回収することができ、算出された総白血球数も血球計算盤での計測結果と一致した。一方で、全血１μｌ（白血球数５，０００〜１２，０００）では白血球がほとんど回収できず、計測不能であった。これは、マイクロキャビティの孔数に対して白血球が過剰に存在するために、細胞捕捉時に細胞に占有される貫通孔が多数生じることで差圧が上昇し、細胞が貫通孔を通過したものと考えられた。これらの結果から、本発明における微量血液の量としては、０．００１μｌ〜５０μｌ、好ましくは０．０１μｌ〜３０μｌ、より好ましくは０．１μｌ〜１０μｌとし、かかる微量血液の量は、本発明のマイクロ流体デバイスに供給するサンプル液に含まれる白血球数：マイクロキャビティアレイの孔数の比が、１：５０〜１：５、好ましくは１：１０となるように適宜調整して使用することとした。

［白血球回収用デバイスを用いた白血球ポピュレーション解析の結果］
採取した血液５０μｌにＦＩＴＣ標識抗ＣＤ１６β抗体（Beckman coulter社製）及びＰＥ標識抗ＣＤ８α（又はＣＤ３）抗体（Beckman coulter社製）各２０μｌを加えて白血球の表面抗原を染色し、Hoechst 33342（Molecular Probes社製）１０μｌを用いて核を染色した。血液１μｌ相当のサンプルをＰＢＳ（２ｍＭ ＥＤＴＡ）で２００μｌにボリュームアップし、全量を白血球回収用デバイスに導入することで白血球回収用マイクロキャビティアレイ微細孔上に白血球を回収した。蛍光顕微鏡を用いて蛍光観察・画像取り込みを行い（図８）、マイクロキャビティアレイ上に捕捉されたHoechst 33342陽性細胞数から総白血球数を算出した。また、ＦＩＴＣ及びＰＥ由来の蛍光顕微鏡写真からＣＤ１６β及びＣＤ８α（又はＣＤ３）陽性細胞数も同様に計測した。その後、各ポピュレーションの比率を以下の計算式より求めた。
ポピュレーション比率＝ＣＤ１６β及びＣＤ８α（又はＣＤ３）陽性細胞数／総白血球数×１００（％）
また、同血液サンプルを溶血後、フローサイトメーター（BD bioscience社製）を用いてＣＤ１６β及びＣＤ８α（又はＣＤ３）陽性細胞のポピュレーションを解析し、白血球回収用デバイスを用いたポピュレーション計測結果と比較した（表３）。ただし、フローサイトメーターでは微量血液からの計測が困難であるため、１００μｌ以上の全血を別途採血することで調製と解析を行った。

この結果、ＣＤ１６β及びＣＤ８α陽性細胞の比率を計測したサンプル１では、白血球回収用デバイス（マイクロキャビティアレイ）での計測結果が、ＣＤ１６β陽性細胞は７３．６±２．７％、ＣＤ８α陽性細胞は４．８±０．２％であった。同サンプルのフローサイトメーターでの計測結果では、それぞれ７３．１％、４．２％という値であった。次に、ＣＤ１６β及びＣＤ３陽性細胞の比率を計測したサンプル２では、白血球回収用デバイスでの計測結果が、ＣＤ１６β陽性細胞は５６．８±４．２％、ＣＤ３陽性細胞は１８．８±１．６％と計測された。同サンプルのフローサイトメーターでの計測結果では、それぞれ５７．９％、１９．１％という値であった。このように、白血球回収用デバイスを用いた白血球ポピュレーションの計測結果とフローサイトメーターを用いた白血球ポピュレーションの計測結果には高い相関性が得られており、本発明の白血球ポピュレーションの解析方法により、微量血液から高精度な白血球ポピュレーション解析を行うことができることが示された。

［ヒト細胞定着率の評価］
さらに、本発明の白血球ポピュレーション解析方法は、ヒト細胞定着率の評価にも利用することができる。移植マウスとして、重度免疫不全マウスであるＮＯＤ／Ｓｈｉ−ｓｃｉｄ−ＩＬ２Ｒｙ^ｎｕｌｌマウス（財団法人実験動物中央研究所）を用いた。購入マウスの週齢は、購入可能な最若週齢の６週齢とした。また、性周期がなく安定した生化学値が得られる雄を選択した。また、移植細胞として、ヒト臍帯血由来ＣＤ３４陽性細胞（Lot;081618A、Lonza社製）を使用し、移植まで液体窒素中で凍結保存した。

マウス入荷から２週間の検疫、馴化後、Ｘ線照射行った。検疫、馴化期間中、外傷や脱毛の有無、運動性など外見上の一般状態を観察した。検疫、馴化期間中に健康状態に異常のあったマウスはいなかった。マウスへのＸ線照射はＸ線照射装置（MBR-320R、日立メディコ株式会社製）を用い、移植群のマウスを専用のホルダー内に半固定し、全身照射（２．５Ｇｙ）を行った。照射は、管電圧：３００ｋＶ、管電流：１０ｍＡ、１．０ｍｍ Ａｌ＋０．５ｍｍ Ｃｕフィルターの条件下で行い、Ｘ線管と照射台の間隔は５５０ｍｍとした。被照射体位置の空間線量率は１．５Ｇｙ／ｍｉｎであった。Ｘ線照射マウスへの細胞移植はＸ線照射後３−５時間後に行った。

移植に際し、凍結保存されたヒト臍帯血由来ＣＤ３４陽性細胞を融解し、遠心洗浄後ＭＥＭ（Invitrogen社製）培地（２％ ＢＳＡ含有）中に懸濁した後、細胞数を計測した。細胞数計測は血球計算盤を用いて顕微鏡下で行った。細胞濃度の調整後、シリンジを用いてＸ線照射マウスの尾静脈より細胞懸濁液（２００μｌ／２．２５×１０^４ｃｅｌｌｓ／ｍｏｕｓｅ）を注入し、細胞移植を行った。細胞は、調整から移植まで４℃で維持した。細胞移植の際、マウスはマウス採血ホルダー内に入れることで固定した。非移植群には、ＭＥＭ培地（２％ ＢＳＡ含有）のみを同量、尾静脈より注入した。移植後、各マウスを１〜４ヶ月飼育した。このマウスへのヒト細胞定着率を評価するために、抗凝固剤としてＥＤＴＡを使用して血液を採取したマウス全血５０μｌにＦＩＴＣ標識抗ヒトＣＤ４５抗体（Beckman coulter社製）及びＰＥ標識抗マウスＣＤ４５抗体（Beckman coulter社製）各２０μｌを加えて白血球の表面抗原を染色し、Hoechst 33342（Molecular Probes社製）１０μｌを用いて核を染色した。血液１μｌ相当のサンプルをＰＢＳ（２ｍＭ ＥＤＴＡ）を用いて２００μｌにボリュームアップし、全量を白血球回収用デバイスに導入することで白血球回収用マイクロキャビティアレイ微細孔上に白血球を回収した。蛍光顕微鏡を用いて蛍光観察・画像取り込みを行い（図９下のパネルに一例を示す）、マイクロキャビティアレイ上に捕捉されたHoechst 33342陽性細胞数を総白血球数として、ＦＩＴＣ及びＰＥ由来の蛍光顕微鏡写真から測定したヒトＣＤ４５及びマウスＣＤ４５陽性細胞数から、各ポピュレーションの比率を求めた（表４）。また、同血液サンプルを溶血後、フローサイトメーター（BD bioscience社製）を用いてヒトＣＤ４５及びマウスＣＤ４５陽性細胞のポピュレーションを解析し（図９右上のパネルに一例を示す）、白血球回収用デバイスでのポピュレーション計測結果と比較した（表４）。ただし、フローサイトメーターでは微量血液からの計測が困難であるため、１００μｌ以上の全血を別途採血することで調製と解析を行った。

その結果、白血球回収用デバイス（マイクロキャビティアレイ）を用いて測定した細胞移植群マウスの白血球のヒト化率は６４．７％、同サンプルのフローサイトメーターで測定したヒト化率は６４．９％であった。それに対し、非移植群マウスの白血球では、いずれの方法でもヒト化率は０％であった。このように、マイクロキャビティアレイを用いた方法により算出されたヒト化率はフローサイトメトリーにより算出されたヒト化率の結果とよく一致しており、本発明のマイクロキャビティアレイを用いた白血球ポピュレーションの解析方法は、ヒト細胞定着率評価にも利用できることが示された。この結果をもとに、移植からの経過週間が８週目、１０週目の時点で５匹の移植群マウスについてヒト化率がどのように変化するかをモニタリングした。この結果、８週目の時点での５匹の移植群マウスのヒト化率は５３．５〜８０．１％であったのに対し、１０週目には６１．７〜９０．４％となった（図１０）。ヒト化率が増加している個体と減少している個体が存在していることがこの結果から示され、本発明による白血球回収デバイスを用いることで、マウス個体におけるヒト化率の変動を微量血液から連続的に追跡可能であることが示唆された。

本発明は、微量血液の解析の分野や、白血球ポピュレーションの解析の分野や、医療・診断分野における白血球簡易検査装置の分野に好適に利用することができる。

Claims (8)

1. 以下の（ａ）〜（ｅ）の工程を備えたことを特徴とする微量血液からの白血球ポピュレーションの解析方法。
   （ａ）孔径３μｍ以上５μｍ未満から選ばれる微細貫通孔を有するサイズ選択マイクロキャビティアレイにより全血試料中に含まれる白血球を選択的に捕捉することができるマイクロ流体デバイスを準備する工程；
   （ｂ）全血試料に、血液凝固抑制剤としてカルシウムイオンをキレートする金属キレート剤と、蛍光染色試薬とを混入し、希釈する工程；
   （ｃ）工程（ｂ）で調製したサンプル液を、マイクロ流体デバイスに供給する工程；
   （ｄ）マイクロ流体デバイスのサイズ選択マイクロキャビティアレイの微細孔に白血球を捕捉する工程；
   （ｅ）白血球が集積化された領域内をスキャニングすることで白血球細胞の観察像を取得する工程；
2. 微量血液が、０．１μｌ〜１０μｌの全血試料であることを特徴とする請求項１記載の白血球ポピュレーションの解析方法。
3. 細胞捕捉率が、９９％以上であることを特徴とする請求項１又は２記載の白血球ポピュレーションの解析方法。
4. カルシウムイオンをキレートする金属キレート剤が、ＥＤＴＡである請求項１〜３のいずれか記載の白血球ポピュレーションの解析方法。
5. 蛍光染色試薬が、ＤＮＡ又は白血球細胞表面抗原を認識して染色することを特徴とする請求項１〜４のいずれか記載の白血球ポピュレーションの解析方法。
6. サイズ選択マイクロキャビティアレイが、孔径３μｍの微細貫通孔を有し、孔の中心間距離２５μｍ、３２０×３２０の１０２，４００孔をアレイ状に配したマイクロキャビティアレイであることを特徴とする請求項１〜５のいずれか記載の白血球ポピュレーションの解析方法。
7. サンプル液導入速度を１００〜２０００μｌ／ｍｉｎとすることを特徴とする請求項１〜６のいずれか記載の白血球ポピュレーションの解析方法。
8. マイクロ流体デバイスに供給するサンプル液に含まれる白血球数：マイクロキャビティアレイの孔数が、１：５０〜１：５とすることを特徴とする請求項１〜７のいずれか記載の白血球ポピュレーションの解析方法。