JP2000241427A - 細胞表面抗原発現量を用いた白血病細胞の検出方法 - Google Patents
細胞表面抗原発現量を用いた白血病細胞の検出方法Info
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- JP2000241427A JP2000241427A JP11038391A JP3839199A JP2000241427A JP 2000241427 A JP2000241427 A JP 2000241427A JP 11038391 A JP11038391 A JP 11038391A JP 3839199 A JP3839199 A JP 3839199A JP 2000241427 A JP2000241427 A JP 2000241427A
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Abstract
(57)【要約】
【解決手段】 骨髄血又は末梢血から４種以上の細胞表
面抗原を検出し、得られた発現強度のパターンと、予め
作成された正常未熟細胞の４種以上の抗原発現強度のパ
ターンとを対比する白血病細胞の検出方法。 【効果】 白血病細胞を迅速に検出することができる。
面抗原を検出し、得られた発現強度のパターンと、予め
作成された正常未熟細胞の４種以上の抗原発現強度のパ
ターンとを対比する白血病細胞の検出方法。 【効果】 白血病細胞を迅速に検出することができる。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、白血病の病型診断
に有用な白血病細胞の検出方法に関する。
に有用な白血病細胞の検出方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】ヒト細胞表面抗原に対する多数のモノク
ローナル抗体の開発と、これらを用いたフローサイトメ
トリー（flow cytometry:ＦＣＭ）法による白血病細胞
表面抗原の解析技術の進歩は、白血病細胞の極めて精緻
な分類を可能としてきた。ＦＣＭ法による白血病細胞解
析は、多量の細胞を簡便かつ迅速に測定できるという利
点があり、病型診断に非常に有用な方法である。
ローナル抗体の開発と、これらを用いたフローサイトメ
トリー（flow cytometry:ＦＣＭ）法による白血病細胞
表面抗原の解析技術の進歩は、白血病細胞の極めて精緻
な分類を可能としてきた。ＦＣＭ法による白血病細胞解
析は、多量の細胞を簡便かつ迅速に測定できるという利
点があり、病型診断に非常に有用な方法である。
【０００３】従来、白血病細胞解析のゲート設定は前方
散乱光（forward scatter:ＦＳＣ）と側方散乱光（side
scatter：ＳＳＣ）による２パラメーター ドット−プ
ロット（２parameter dot-plot）を用いて行われてき
た。ほとんどの症例では、白血病細胞はＦＳＣ−ＳＳＣ
パラメーター上、正常細胞とは異なった位置に出現する
ことが多いので経験的に検出可能であった。しかしなが
ら、白血病細胞集団と正常細胞集団の分布領域の境界が
不明瞭な場合や、白血病細胞集団と正常細胞集団の分布
領域が重なってしまう場合も見られ、また、解析対象が
純粋に白血病細胞ではなく、白血病細胞と正常細胞が混
在するゲートで解析が行われたために、データの精度が
低くなる場合があった。特に、白血病細胞比率の小さい
症例においては、ゲート設定位置の判断が不可能な場合
や、症例と表面抗原の解析結果が異なる場合が多く見ら
れた。
散乱光（forward scatter:ＦＳＣ）と側方散乱光（side
scatter：ＳＳＣ）による２パラメーター ドット−プ
ロット（２parameter dot-plot）を用いて行われてき
た。ほとんどの症例では、白血病細胞はＦＳＣ−ＳＳＣ
パラメーター上、正常細胞とは異なった位置に出現する
ことが多いので経験的に検出可能であった。しかしなが
ら、白血病細胞集団と正常細胞集団の分布領域の境界が
不明瞭な場合や、白血病細胞集団と正常細胞集団の分布
領域が重なってしまう場合も見られ、また、解析対象が
純粋に白血病細胞ではなく、白血病細胞と正常細胞が混
在するゲートで解析が行われたために、データの精度が
低くなる場合があった。特に、白血病細胞比率の小さい
症例においては、ゲート設定位置の判断が不可能な場合
や、症例と表面抗原の解析結果が異なる場合が多く見ら
れた。
【０００４】これに対し、近年、急性白血病細胞が正常
成熟細胞と比較して白血球共通抗原であるＣＤ４５抗原
の発現が弱いという特徴を利用した、ＣＤ４５−ＳＳＣ
パラメーターdot-plotを用いたゲート設定法（ＣＤ４５
blast gating法）が普及してきている。ＣＤ４５blast
gating法は、ＣＤ４５抗原が弱発現である分化レベルの
未熟な急性白血病細胞と、ＣＤ４５抗原が強発現である
正常成熟細胞とを明確に分離することができるため、精
度の高い白血病細胞表面抗原解析を行うことができる
（Borowitzら, Am. J. Clin. Pathol 100, 534-540, 19
93；宮崎ら，臨床血液37, 214〜220, 1996）。
成熟細胞と比較して白血球共通抗原であるＣＤ４５抗原
の発現が弱いという特徴を利用した、ＣＤ４５−ＳＳＣ
パラメーターdot-plotを用いたゲート設定法（ＣＤ４５
blast gating法）が普及してきている。ＣＤ４５blast
gating法は、ＣＤ４５抗原が弱発現である分化レベルの
未熟な急性白血病細胞と、ＣＤ４５抗原が強発現である
正常成熟細胞とを明確に分離することができるため、精
度の高い白血病細胞表面抗原解析を行うことができる
（Borowitzら, Am. J. Clin. Pathol 100, 534-540, 19
93；宮崎ら，臨床血液37, 214〜220, 1996）。
【０００５】ＣＤ４５blast gating法は、白血病細胞比
率が少ない検体においては特に有用で、治療後の微小残
存病変（minimal residual disease:ＭＲＤ）解析にも
用いられるようになってきた。
率が少ない検体においては特に有用で、治療後の微小残
存病変（minimal residual disease:ＭＲＤ）解析にも
用いられるようになってきた。
【０００６】しかし、骨髄血や末梢血中に存在している
正常未熟細胞には、急性白血病細胞と同様の表面抗原パ
ターンを示す細胞も存在している（Lokenら，Blood 70,
1316-1324, 1987; Stelzerら, Ann. NY Acad. Sci. 67
7, 265-280, 1993 ））。この様な場合、ＣＤ４５弱陽
性細胞のみを解析対象としても、それらの細胞がＭＲＤ
なのか正常未熟細胞なのかを判断することは不可能であ
る。
正常未熟細胞には、急性白血病細胞と同様の表面抗原パ
ターンを示す細胞も存在している（Lokenら，Blood 70,
1316-1324, 1987; Stelzerら, Ann. NY Acad. Sci. 67
7, 265-280, 1993 ））。この様な場合、ＣＤ４５弱陽
性細胞のみを解析対象としても、それらの細胞がＭＲＤ
なのか正常未熟細胞なのかを判断することは不可能であ
る。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】従って、本発明の目的
は、検体中の細胞が白血病細胞であるか正常未熟細胞で
あるかを判定する方法を提供することにある。
は、検体中の細胞が白血病細胞であるか正常未熟細胞で
あるかを判定する方法を提供することにある。
【０００８】
【課題を解決するための手段】斯かる実情に鑑み本発明
者は、白血病細胞の表面抗原発現強度の異常に着目し鋭
意研究を行った結果、予め作成した正常未熟細胞の４種
以上の表面抗原発現強度パターンと検体中の４種以上の
細胞表面抗原発現強度パターンがすべて一致するか否か
により、検体中の細胞が白血病細胞であるのか正常未熟
細胞であるのかが判断できることを見出し、本発明を完
成した。
者は、白血病細胞の表面抗原発現強度の異常に着目し鋭
意研究を行った結果、予め作成した正常未熟細胞の４種
以上の表面抗原発現強度パターンと検体中の４種以上の
細胞表面抗原発現強度パターンがすべて一致するか否か
により、検体中の細胞が白血病細胞であるのか正常未熟
細胞であるのかが判断できることを見出し、本発明を完
成した。
【０００９】すなわち、本発明は、骨髄血又は末梢血か
ら４種以上の細胞表面抗原を検出し、得られた発現強度
のパターンと、予め作成された正常未熟細胞の４種以上
の抗原発現強度のパターンとを対比することを特徴とす
る白血病細胞の検出方法を提供するものである。
ら４種以上の細胞表面抗原を検出し、得られた発現強度
のパターンと、予め作成された正常未熟細胞の４種以上
の抗原発現強度のパターンとを対比することを特徴とす
る白血病細胞の検出方法を提供するものである。
【００１０】
【発明の実施の形態】本発明方法においては、まず正常
未熟細胞表面抗原発現強度パターンのグラフ化を行う。
ここで、細胞としては骨髄血又は末梢血が挙げられる。
また、細胞表面抗原としては、例えばＣＤ２、ＣＤ３、
ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ７、ＣＤ８、ＣＤ１０、ＣＤ１
３、ＣＤ１４、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ３３、ＣＤ３
４、ＣＤ５６、ＨＬＡ−ＤＲ等が例示できる。
未熟細胞表面抗原発現強度パターンのグラフ化を行う。
ここで、細胞としては骨髄血又は末梢血が挙げられる。
また、細胞表面抗原としては、例えばＣＤ２、ＣＤ３、
ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ７、ＣＤ８、ＣＤ１０、ＣＤ１
３、ＣＤ１４、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ３３、ＣＤ３
４、ＣＤ５６、ＨＬＡ−ＤＲ等が例示できる。
【００１１】抗原発現強度パターンのグラフ化は、検出
された正常未熟細胞の表面抗原の発現強度を解析し、２
種の抗原の発現強度を組み合せたドット−プロット（do
t-plot）を作成することにより行うことが好ましい。こ
の組み合せのパターンとしては、種々考えられるがＣＤ
４５とこれ以外の４種以上の細胞表面抗原のそれぞれと
の組み合せパターンが好ましい。具体的には、例えばＣ
Ｄ４５−ＣＤ３４、ＣＤ４５−ＣＤ１０、ＣＤ４５−Ｃ
Ｄ１９、ＣＤ４５−ＣＤ２０等が挙げられる。これらの
発現強度には個人差は認められず（後述）、dot-plot上
で集約した集団として表示されるため、正常範囲を設定
することができる。
された正常未熟細胞の表面抗原の発現強度を解析し、２
種の抗原の発現強度を組み合せたドット−プロット（do
t-plot）を作成することにより行うことが好ましい。こ
の組み合せのパターンとしては、種々考えられるがＣＤ
４５とこれ以外の４種以上の細胞表面抗原のそれぞれと
の組み合せパターンが好ましい。具体的には、例えばＣ
Ｄ４５−ＣＤ３４、ＣＤ４５−ＣＤ１０、ＣＤ４５−Ｃ
Ｄ１９、ＣＤ４５−ＣＤ２０等が挙げられる。これらの
発現強度には個人差は認められず（後述）、dot-plot上
で集約した集団として表示されるため、正常範囲を設定
することができる。
【００１２】次に、白血病細胞を検出することを目的と
した抗体を反応させ、検出された細胞の表面抗原発現強
度を解析し、上記のdot-plotに照らし合わせると、検出
された細胞が白血病である場合には、正常範囲からはず
れたdotが認められるのに対して、検出された細胞が正
常未熟細胞である場合には、すべてのdotが正常範囲内
に表示される。
した抗体を反応させ、検出された細胞の表面抗原発現強
度を解析し、上記のdot-plotに照らし合わせると、検出
された細胞が白血病である場合には、正常範囲からはず
れたdotが認められるのに対して、検出された細胞が正
常未熟細胞である場合には、すべてのdotが正常範囲内
に表示される。
【００１３】細胞表面抗原の検出は、細胞に細胞表面抗
原に対する抗体を反応させ、反応した細胞をフローサイ
トメトリーにより検出することにより行うことが好まし
い。
原に対する抗体を反応させ、反応した細胞をフローサイ
トメトリーにより検出することにより行うことが好まし
い。
【００１４】本発明で使用される細胞膜表面抗原に対す
る抗体としては、種々の白血病細胞膜表面マーカー解析
用として用いられる抗体であれば特に制限されないが、
モノクローナル抗体が望ましい。使用する抗体は、同じ
モノクローナル抗体であっても、抗体の種類や蛍光物質
によって、陽性細胞群の乖離に差がみられる。若干の差
であれば、陽性細胞率に有意な差を認めることはない
が、蛍光強度が弱く陽性細胞群の乖離が不明瞭になるよ
うなこともある。また、抗体の添加量は、陽性細胞が著
しく増加している検体においては、規定の添加量では抗
体量が不足するため陽性細胞群が弱蛍光を示し、陽性細
胞率の低下を示す場合が有り得るので、使用する抗体
と、その抗体量については予め検討することが望まし
い。
る抗体としては、種々の白血病細胞膜表面マーカー解析
用として用いられる抗体であれば特に制限されないが、
モノクローナル抗体が望ましい。使用する抗体は、同じ
モノクローナル抗体であっても、抗体の種類や蛍光物質
によって、陽性細胞群の乖離に差がみられる。若干の差
であれば、陽性細胞率に有意な差を認めることはない
が、蛍光強度が弱く陽性細胞群の乖離が不明瞭になるよ
うなこともある。また、抗体の添加量は、陽性細胞が著
しく増加している検体においては、規定の添加量では抗
体量が不足するため陽性細胞群が弱蛍光を示し、陽性細
胞率の低下を示す場合が有り得るので、使用する抗体
と、その抗体量については予め検討することが望まし
い。
【００１５】測定時の細胞数は、検体の状態に合わせて
それぞれ調整するが、例えば、１万〜２０万細胞数で測
定することが望ましい。
それぞれ調整するが、例えば、１万〜２０万細胞数で測
定することが望ましい。
【００１６】本発明で使用する標識モノクローナル抗体
としては、フルオレセインイソチオチアナート（ＦＩＴ
Ｃ）標識マウスＩｇＧ１、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ５、Ｃ
Ｄ８、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ３４、ＣＤ６１、ＨＬ
Ａ−ＤＲ、フィコエリスリン（ＰＥ）標識マウスＩｇＧ
１、ＣＤ４、ＣＤ１０、ＣＤ１３、ＣＤ１４、ＣＤ１
９、ＣＤ２０、ＣＤ３３、ＣＤ３４、ＣＤ３８、ＣＤ４
１、ＣＤ５６、ＨＬＡ−ＤＲ及びピリジンクロロフィル
プロテイン（ＰｅｒＣＰ）標識ＣＤ４５、ＦＩＴＣ標識
ＣＤ４１ａ、ＰＥ標識ＣＤ１０、ＰＥ標識ＫＯＲ−ＳＡ
３５４４等が例示できる。
としては、フルオレセインイソチオチアナート（ＦＩＴ
Ｃ）標識マウスＩｇＧ１、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ５、Ｃ
Ｄ８、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ３４、ＣＤ６１、ＨＬ
Ａ−ＤＲ、フィコエリスリン（ＰＥ）標識マウスＩｇＧ
１、ＣＤ４、ＣＤ１０、ＣＤ１３、ＣＤ１４、ＣＤ１
９、ＣＤ２０、ＣＤ３３、ＣＤ３４、ＣＤ３８、ＣＤ４
１、ＣＤ５６、ＨＬＡ−ＤＲ及びピリジンクロロフィル
プロテイン（ＰｅｒＣＰ）標識ＣＤ４５、ＦＩＴＣ標識
ＣＤ４１ａ、ＰＥ標識ＣＤ１０、ＰＥ標識ＫＯＲ−ＳＡ
３５４４等が例示できる。
【００１７】より具体的には、次の様に行うことが好ま
しい。骨髄血又は末梢血を溶血剤を加えて室温にて５分
間程度反応を行い、混入赤血球の溶血操作を行った後リ
ン酸緩衝生理食塩水にて細胞濃度を１×１０6cells／mL
程度に調整する。調整した細胞浮遊液をサンプリングし
た後、それぞれの試験管に抗体を添加する。その後４
℃、遮光下にて約３０分間反応させる。反応後、ＰＢＳ
で洗浄後、フローサイトメーターを用いて測定する。
しい。骨髄血又は末梢血を溶血剤を加えて室温にて５分
間程度反応を行い、混入赤血球の溶血操作を行った後リ
ン酸緩衝生理食塩水にて細胞濃度を１×１０6cells／mL
程度に調整する。調整した細胞浮遊液をサンプリングし
た後、それぞれの試験管に抗体を添加する。その後４
℃、遮光下にて約３０分間反応させる。反応後、ＰＢＳ
で洗浄後、フローサイトメーターを用いて測定する。
【００１８】フローサイトメーターは白血病細胞を正確
に測定するために、ＦＬ−ＳＳＣ表示法による解析を行
うのが望ましい。
に測定するために、ＦＬ−ＳＳＣ表示法による解析を行
うのが望ましい。
【００１９】このように、白血病細胞を検出することを
目的とした抗体を反応させ、検出された細胞の表面抗原
発現強度を解析し、正常未熟細胞のdot-plotに照らし合
わせると、検出された細胞が白血病である場合には、正
常範囲からはずれたdotが認められるのに対して、検出
された細胞が正常未熟細胞である場合には、すべてのdo
tが正常範囲内に表示され、白血病細胞が検出できる。
目的とした抗体を反応させ、検出された細胞の表面抗原
発現強度を解析し、正常未熟細胞のdot-plotに照らし合
わせると、検出された細胞が白血病である場合には、正
常範囲からはずれたdotが認められるのに対して、検出
された細胞が正常未熟細胞である場合には、すべてのdo
tが正常範囲内に表示され、白血病細胞が検出できる。
【００２０】
【実施例】次に実施例を挙げて本発明を更に詳細に説明
するが、本発明はこれにより何ら制限されるものではな
い。
するが、本発明はこれにより何ら制限されるものではな
い。
【００２１】実施例１ ＜方法＞ （１）対象 正常骨髄血中の未熟細胞表面抗原の解析には、インフォ
ームド・コンセントを行った後の同種骨髄移植ドナーよ
り採取された骨髄血を用いた。骨髄提供者は小児（１〜
９歳）１６名、成人（２２〜５４歳）１６名であった。
急性白血病細胞表面抗原の解析には、形態学的検査と細
胞表面抗原解析によってＡＬＬと診断された患者の抗癌
治療前に採取された骨髄血（ｎ＝６５）を用いた。骨髄
血は採取後、１０％ＦＣＳ加ＲＰＭＩ−１６４０に浮遊
させ、４℃にて保存し、２４時間以内に細胞表面抗原の
解析を行った。
ームド・コンセントを行った後の同種骨髄移植ドナーよ
り採取された骨髄血を用いた。骨髄提供者は小児（１〜
９歳）１６名、成人（２２〜５４歳）１６名であった。
急性白血病細胞表面抗原の解析には、形態学的検査と細
胞表面抗原解析によってＡＬＬと診断された患者の抗癌
治療前に採取された骨髄血（ｎ＝６５）を用いた。骨髄
血は採取後、１０％ＦＣＳ加ＲＰＭＩ−１６４０に浮遊
させ、４℃にて保存し、２４時間以内に細胞表面抗原の
解析を行った。
【００２２】（２）モノクローナル抗体 Becton Dickinson Immunocytometry Systems（BDIS：Sa
n Jose, CA）社のフルオレセインイソチオシアネート
（ＦＩＴＣ）標識ＣＤ１９抗体とフィコエリスリン（Ｐ
Ｅ）標識ＣＤ１９、ＣＤ２０抗体、及びピリジンクロロ
フィルプロテイン（PerCP）標識ＣＤ４５、Coulter(Hia
leah,FL）社のＰＥ標識ＣＤ１０抗体を用いた。
n Jose, CA）社のフルオレセインイソチオシアネート
（ＦＩＴＣ）標識ＣＤ１９抗体とフィコエリスリン（Ｐ
Ｅ）標識ＣＤ１９、ＣＤ２０抗体、及びピリジンクロロ
フィルプロテイン（PerCP）標識ＣＤ４５、Coulter(Hia
leah,FL）社のＰＥ標識ＣＤ１０抗体を用いた。
【００２３】（３）染色及び測定 検体を溶血剤（８．２６ｇ ＮＨ4Ｃｌ，１．００ｇ
ＫＨＣＯ3，０．０４ｇＥＤＴＡ−４Ｎａ／ＬＤＷ）を
用いて室温にて５分間インキュベーションを行い、混入
赤血球の溶血操作を行った後、リン酸緩衝生理食塩水
（ＰＢＳ：０．１％ＢＳＡ，０．１％ sodium azide）
にて細胞濃度を１×１０6cells／mLに調整した。調整し
た細胞浮遊液を１００μＬずつそれぞれのtubeにサンプ
リングした後、抗体を添加した。４℃、遮光にて３０分
間インキュベーションを行い、ＰＢＳにて２回洗浄を行
った後、１％パラホルムアルデヒド（CellFIX：BDIS）
を用いて固定した。
ＫＨＣＯ3，０．０４ｇＥＤＴＡ−４Ｎａ／ＬＤＷ）を
用いて室温にて５分間インキュベーションを行い、混入
赤血球の溶血操作を行った後、リン酸緩衝生理食塩水
（ＰＢＳ：０．１％ＢＳＡ，０．１％ sodium azide）
にて細胞濃度を１×１０6cells／mLに調整した。調整し
た細胞浮遊液を１００μＬずつそれぞれのtubeにサンプ
リングした後、抗体を添加した。４℃、遮光にて３０分
間インキュベーションを行い、ＰＢＳにて２回洗浄を行
った後、１％パラホルムアルデヒド（CellFIX：BDIS）
を用いて固定した。
【００２４】（４）測定方法 測定はFACSCalibur(BDIS) を用いて行った。機器の設定
はCaliBRITEbeads(BDIS)を用いて、FACSComp software
のLyse-Wash modeにて行った。機器の安定性の確認は、
Lineear Flow Flow Cytometry Intensity Calibration
Kit(MolecularProbe:Eugene,OR ）を用いて測定毎に行
った。細胞の取り込みはCellQuest softwareを用いて行
い、１万細胞を測定した。
はCaliBRITEbeads(BDIS)を用いて、FACSComp software
のLyse-Wash modeにて行った。機器の安定性の確認は、
Lineear Flow Flow Cytometry Intensity Calibration
Kit(MolecularProbe:Eugene,OR ）を用いて測定毎に行
った。細胞の取り込みはCellQuest softwareを用いて行
い、１万細胞を測定した。
【００２５】（５）正常骨髄血中の未熟細胞表面抗原の
発現強度の解析 １）ＣＤ４５−ＳＳＣ表示に展開したところ、ＳＳＣ低
レベル領域に、全例において成熟リンパ球以外にＣＤ４
５の発現強度が非常に弱い細胞（ＣＤ４５ weakweak：
ＣＤ４５ＷＷ）とＣＤ４５の発現強度が弱い細胞（ＣＤ
４５weak：ＣＤ４５Ｗ）が認められた（図１）。 ２）ＣＤ４５ＷＷとＣＤ４５Ｗにゲートを設定し、それ
ぞれの細胞集団のＣＤ４５、ＣＤ３４、ＣＤ１０、ＣＤ
１９、ＣＤ２０の平均蛍光強度（mean ch）を解析した
（図２）。 ３）Microsoft社のExcel softwearを用いて、横軸にＣ
Ｄ４５mean chを縦軸にそれぞれＣＤ３４、ＣＤ１０、
ＣＤ１９、ＣＤ２０のmean chをplotしたグラフを作成
した。 ４）１６名の骨髄血中のＣＤ４５ＷＷ及びＣＤ４５Ｗ細
胞は、集約された単一の集団として表示され、個人差を
認めなかった（図３）。 ５）すなわち、検出されたＣＤ４５弱陽性細胞が正常未
熟細胞である場合には、ＣＤ３４、ＣＤ１０、ＣＤ１
９、ＣＤ２０の４つのplot全てが正常範囲内に表示され
ることになる（図４、５）。
発現強度の解析 １）ＣＤ４５−ＳＳＣ表示に展開したところ、ＳＳＣ低
レベル領域に、全例において成熟リンパ球以外にＣＤ４
５の発現強度が非常に弱い細胞（ＣＤ４５ weakweak：
ＣＤ４５ＷＷ）とＣＤ４５の発現強度が弱い細胞（ＣＤ
４５weak：ＣＤ４５Ｗ）が認められた（図１）。 ２）ＣＤ４５ＷＷとＣＤ４５Ｗにゲートを設定し、それ
ぞれの細胞集団のＣＤ４５、ＣＤ３４、ＣＤ１０、ＣＤ
１９、ＣＤ２０の平均蛍光強度（mean ch）を解析した
（図２）。 ３）Microsoft社のExcel softwearを用いて、横軸にＣ
Ｄ４５mean chを縦軸にそれぞれＣＤ３４、ＣＤ１０、
ＣＤ１９、ＣＤ２０のmean chをplotしたグラフを作成
した。 ４）１６名の骨髄血中のＣＤ４５ＷＷ及びＣＤ４５Ｗ細
胞は、集約された単一の集団として表示され、個人差を
認めなかった（図３）。 ５）すなわち、検出されたＣＤ４５弱陽性細胞が正常未
熟細胞である場合には、ＣＤ３４、ＣＤ１０、ＣＤ１
９、ＣＤ２０の４つのplot全てが正常範囲内に表示され
ることになる（図４、５）。
【００２６】（６）ＡＬＬ細胞表面抗原の発現強度の解
析方法 １）ＣＤ４５−ＳＳＣ表示を用いて、ＡＬＬ細胞にゲー
トを設定し、ＣＤ４５、ＣＤ３４、ＣＤ１０、ＣＤ１
９、ＣＤ２０のmean chを解析した（図６）。 ２）検体ごとのmean chを、上記正常骨髄血細胞にて作
成したExcelのdot-plot上に展開し、正常範囲内にplot
されるかどうかを解析した（図７）。 ３）６５名のＡＬＬ細胞において、ＣＤ３４、ＣＤ１
０、ＣＤ１９、ＣＤ２０の４つのplot全てが正常範囲内
に表示された症例は認められなかった（表１）。 ４）すなわち、検出されたＣＤ４５弱陽性細胞がＡＬＬ
細胞である場合には、ＣＤ３４、ＣＤ１０、ＣＤ１９、
ＣＤ２０の４つのplotの内、かならず１つ以上のplotが
正常範囲外に表示されることになる。
析方法 １）ＣＤ４５−ＳＳＣ表示を用いて、ＡＬＬ細胞にゲー
トを設定し、ＣＤ４５、ＣＤ３４、ＣＤ１０、ＣＤ１
９、ＣＤ２０のmean chを解析した（図６）。 ２）検体ごとのmean chを、上記正常骨髄血細胞にて作
成したExcelのdot-plot上に展開し、正常範囲内にplot
されるかどうかを解析した（図７）。 ３）６５名のＡＬＬ細胞において、ＣＤ３４、ＣＤ１
０、ＣＤ１９、ＣＤ２０の４つのplot全てが正常範囲内
に表示された症例は認められなかった（表１）。 ４）すなわち、検出されたＣＤ４５弱陽性細胞がＡＬＬ
細胞である場合には、ＣＤ３４、ＣＤ１０、ＣＤ１９、
ＣＤ２０の４つのplotの内、かならず１つ以上のplotが
正常範囲外に表示されることになる。
【００２７】
【表１】
【００２８】実施例２ （１）対象 対象は、寛解導入後の骨髄血を用いた。同患者は、治療
前の細胞表面抗原解析より、ＡＬＬであることが判明し
ている。骨髄血は採取後、１０％ＦＣＳ加ＲＰＭＩ−１
６４０に浮遊させ、４℃にて保存し、２４時間以内に細
胞表面抗原の解析を行った。 （２）モノクローナル抗体 実施例１と同じものを用いた。 （３）染色及び測定 実施例１と同様に行った。 （４）測定方法 実施例１と同様にして行った。 （５）ＡＬＬ細胞表面抗原の発現強度の解析方法 １）ＣＤ４５−ＳＳＣ表示を用いて、ＣＤ４５ＷＷ細胞
にゲートを設定し、ＣＤ４５ＷＷ細胞のＣＤ４５、ＣＤ
３４、ＣＤ１０、ＣＤ１９、ＣＤ２０mean chを解析し
た（図８）。 ２）検体ごとのmean chを、正常骨髄血細胞にて作成し
たExcelのdot-plot上に展開し、正常範囲内にplotされ
るかどうかを解析した。 ３）ＣＤ１０は正常範囲内に表示されたが、ＣＤ３４、
ＣＤ１９、ＣＤ２０の３つのplotは正常範囲外に表示さ
れた（図９）。 ４）すなわち、検出されたＣＤ４５弱陽性細胞は、ＣＤ
３４、ＣＤ１９、ＣＤ２０の発現強度に異常を起こして
いるＡＬＬ細胞であると判断でき、本患者の骨髄血中に
はＭＲＤが存在していることが明らかとなった。
前の細胞表面抗原解析より、ＡＬＬであることが判明し
ている。骨髄血は採取後、１０％ＦＣＳ加ＲＰＭＩ−１
６４０に浮遊させ、４℃にて保存し、２４時間以内に細
胞表面抗原の解析を行った。 （２）モノクローナル抗体 実施例１と同じものを用いた。 （３）染色及び測定 実施例１と同様に行った。 （４）測定方法 実施例１と同様にして行った。 （５）ＡＬＬ細胞表面抗原の発現強度の解析方法 １）ＣＤ４５−ＳＳＣ表示を用いて、ＣＤ４５ＷＷ細胞
にゲートを設定し、ＣＤ４５ＷＷ細胞のＣＤ４５、ＣＤ
３４、ＣＤ１０、ＣＤ１９、ＣＤ２０mean chを解析し
た（図８）。 ２）検体ごとのmean chを、正常骨髄血細胞にて作成し
たExcelのdot-plot上に展開し、正常範囲内にplotされ
るかどうかを解析した。 ３）ＣＤ１０は正常範囲内に表示されたが、ＣＤ３４、
ＣＤ１９、ＣＤ２０の３つのplotは正常範囲外に表示さ
れた（図９）。 ４）すなわち、検出されたＣＤ４５弱陽性細胞は、ＣＤ
３４、ＣＤ１９、ＣＤ２０の発現強度に異常を起こして
いるＡＬＬ細胞であると判断でき、本患者の骨髄血中に
はＭＲＤが存在していることが明らかとなった。
【００２９】
【発明の効果】本発明方法によれば、白血病細胞が簡単
かつ迅速に検出でき、白血病の診断が容易になる。
かつ迅速に検出でき、白血病の診断が容易になる。
【図１】正常骨髄血中のＣＤ４５ＷＷ及びＣＤ４５Ｗ細
胞集団を示す図である。
胞集団を示す図である。
【図２】ＣＤ４５ＷＷ及びＣＤ４５Ｗ細胞の各抗原の平
均蛍光強度を示す図である。
均蛍光強度を示す図である。
【図３】正常骨髄血中のＣＤ４５ＷＷ、ＣＤ４５Ｗ細胞
における各抗原の発現強度を示す図である。
における各抗原の発現強度を示す図である。
【図４】ＣＤ４５ＷＷ細胞の各抗原発現強度の正常パタ
ーンを示す図である。
ーンを示す図である。
【図５】ＣＤ４５Ｗ細胞の各抗原発現強度の正常パター
ンを示す図である。
ンを示す図である。
【図６】ＡＬＬ細胞の各抗原の発現強度を示す図であ
る。
る。
【図７】ＡＬＬ細胞の解析を示す図である。
【図８】寛解導入後のＡＬＬ患者骨髄血中のＣＤ４５Ｗ
Ｗ細胞表面抗原発現強度の解析を示す図である。
Ｗ細胞表面抗原発現強度の解析を示す図である。
【図９】寛解導入後のＡＬＬ患者骨髄血中のＣＤ４５Ｗ
Ｗ細胞表面抗原発現強度の解析を示す図である。
Ｗ細胞表面抗原発現強度の解析を示す図である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き Ｆターム(参考） 2G045 BB01 BB14 BB39 BB50 CA01 CA11 FB07 FB12 GC15 4B063 QA01 QA14 QA19 QQ03 QQ79 QQ91 QR66 QX02
Claims (2)
- 【請求項１】 骨髄血又は末梢血から４種以上の細胞表
面抗原を検出し、得られた発現強度のパターンと、予め
作成された正常未熟細胞の４種以上の抗原発現強度のパ
ターンとを対比することを特徴とする白血病細胞の検出
方法。 - 【請求項２】 細胞表面抗原の検出が、細胞に細胞表面
抗原に対する抗体を反応させ、反応した細胞をフローサ
イトメトリーにより検出することにより行われるもので
ある請求項１記載の検出方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP11038391A JP2000241427A (ja) | 1999-02-17 | 1999-02-17 | 細胞表面抗原発現量を用いた白血病細胞の検出方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP11038391A JP2000241427A (ja) | 1999-02-17 | 1999-02-17 | 細胞表面抗原発現量を用いた白血病細胞の検出方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2000241427A true JP2000241427A (ja) | 2000-09-08 |
Family
ID=12523994
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP11038391A Pending JP2000241427A (ja) | 1999-02-17 | 1999-02-17 | 細胞表面抗原発現量を用いた白血病細胞の検出方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2000241427A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2008500558A (ja) * | 2004-05-21 | 2008-01-10 | ベックマン コールター，インコーポレイティド | 完全自動化したモノクローナル抗体による広範な識別法 |
-
1999
- 1999-02-17 JP JP11038391A patent/JP2000241427A/ja active Pending
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2008500558A (ja) * | 2004-05-21 | 2008-01-10 | ベックマン コールター，インコーポレイティド | 完全自動化したモノクローナル抗体による広範な識別法 |
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