KR20120028361A - 다중 주파수 임피던스 방법 및 특이적인 마커를 표시하는 입자들을 판별하고 계수하기 위한 장치 - Google Patents

다중 주파수 임피던스 방법 및 특이적인 마커를 표시하는 입자들을 판별하고 계수하기 위한 장치 Download PDF

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하이웰 몰간
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코닌클리케 필립스 일렉트로닉스 엔.브이.
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Abstract

특이적인 항원 마커를 표시하는 입자들을 식별하고 계수하기 위한 분석 방법이 제안된다. 하나의 예(그러나 한정되지 않는다)는 혈액 내의 CD4 + T- 림프구 분석이다. 상기 방법은 현탁액 내의 입자들을 포함하는 샘플을 획득하는 단계, 특이적인 마커를 나타내는 입자들을 임피던스 라벨로 라벨링하는 단계, 및 듀얼 주파수 시스템을 이용하여 라벨링된 샘플들을 측정하여 적어도 특이적인 마커를 표시하는 라벨링된 입자들을 판별하는 단계를 포함한다. 상기 방법에 의해 입자들, 예를 들어 혈류 내의 CD4 + T - 림프구들의 수의 정확한 계수가 가능하다. 대응하는 디바이스가 또한 제공된다.

Description

다중 주파수 임피던스 방법 및 특이적인 마커를 표시하는 입자들을 판별하고 계수하기 위한 장치{MULTI-FREQUENCY IMPEDANCE METHOD AND APPARATUS FOR DISCRIMINATING AND COUNTING PARTICLES EXPRESSING A SPECIFIC MARKER}
본 발명은 의료용 디바이스들, 의료용 진단들, 및 입자 계수의 분야에 관한 것으로, 특히 박테리아, 바이러스들, 비-생물학적 입자들 및 세포들을 포함하는, 상이한 입자들을 판별하고, 식별하고 계수하는 방법 및 디바이스에 관한 것이다. 하나의 예는, 예를 들어 인간의 혈액 내의 CD4+ T-림프구(lymphocyte)들을 판별하고, 식별하고 계수하기 위해, 예를 들어 특이적인 마커(specific marker)를 표시하는 혈구(blood cell)들일 수 있다. 다른 예는 상이한 표면 마커들을 표시하는 박테리아 또는 바이러스들일 수 있다. 다른 예는 항체, 또는 DNA 또는 펩타이드(peptide)의 피스(piece)일 수 있는, 표면 마커를 구비하는 고체 입자일 수 있다.
마이크로플루이딕 시스템(microfluidic system)들은 세포 기능, 세포 및 조직 엔지니어링, 질병 진단, 혈액 샘플 표본, 및 약 개발을 연구하는데 고유의 장래성을 드러내고 있다. 매우 최근에 전혈로부터 백혈구(leukocyte) 즉 백 혈액 세포(white blood cell) 서브세트들의 순 집단들을 분리하기 위하여 마이크로플루이딕스를 이용하는 것이 현장 진료(point of care) 진단에 대하여 많은 흥미를 끌고 있다.
예를 들어, 면역결핍 질병, 주로 HIV의 진단은 혈액 분석을 이용하여 수행된다. 혈액 내의 T-헬퍼(T-helper) 림프구들의 농도를 결정하는 것은 HIV 감염의 진행을 모니터링하는데 중요하다. 그러므로, CD4+ 및 CD8+ T-림프구들의 존재를 검출하고 이 림프구들을 계수하는 것이 중요하다. WHO 가이드라인들에 따르면, 혈액의 200 cell/㎕ 미만의 CD4+ T-세포 계수는 AIDS 진단이 양성임을 설정하고, 대부분의 세팅들에서 항레트로바이러스(antiretroviral) 요법을 적용할 필요가 있다는 것에 대한 표시로 이용된다. CD4+ 계수가 예를 들어 350 cell/㎕의 임계로부터 200 cell/㎕ 미만으로 떨어지기 전에 항레트로바이러스 요법을 개시하는 것이 권장되고, 환자들의 임상 모니터링의 빈도수를 증가시키기 의해 500 cell/㎕의 CD4+ 계수 임계치가 널리 이용된다.
형광 기반 유동 세포 분석법(fluorescence based flow cytometry : FACS)에 의한 CD4+ 림프구 레벨들의 정량화는 현재 가장 훌륭한 표준이다. 형광 기반 유동세포 분석기들은 복잡하고 복잡하고 값비싼 부품들의 장비이고, 그와 같으므로, 사하라 사막 남부 아프리카 같이, 자원이 빈약한 장소들로는 보급되지 않았다. 단순하게 이용하는, 예를 들어 개발 도상국에서 이용할 현장 진료 CD4+ T-세포 계수 시스템이 필요하다.
임피던스 분광법(impedence spectroscopy : IS)은 세포들의 유전체 특성(dielectric property)들을 측정하여, 멤브레인(membrane) 캐패시턴스, 멤브레인 저항, 세포질 도전율 및 유전율(cytoplasmic conductivity and permittivity)에 대한 값들을 제공하는데 널리 이용되어 왔다. 이것은 또한 분석의 "라벨-프리(label-free)" 방법으로 고려될 수 있다. 일반적으로 세포들은 현탁액(suspension) 내에서 측정되고, 데이터는 집단에 대한 평균을 나타낸다. 단일 세포들의 전기적 특성들에 대한 제 1 고속 측정들은 Coulter에 의해 1950년대에 수행되었다. 개별 혈구들이 계수될 수 있고 단일 저-주파수(또는 DC) 전기 신호로 수행되는 "전기 볼륨 측정"을 이용하여 판별될 수 있다는 것이 밝혀졌다. 1970년대에 Hoffman 및 Britt은 플로우 채널(flow channel) 내에 배치되는 전극들을 가진 미니어처 유동 세포를 이용하여 단일 세포들의 동시 작용의 저 및 고 주파수 임피던스 분석에 대한 매크로 시스템을 개발하였다.
2007년 7월 Lab Chip에서의 X. Chenng 등의 "Cell detection and counting through cell lysate impedance spectroscopy in microfluidic devices"에서의 746 내지 755에는 마이크로플루이딕 채널 내에서 표면 고정된(surface immobilized) 세포들로부터 방출되는 이온들로 인한 주변 배지(medium)의 도전율의 변화들을 측정하는 것에 기초하여 세포들을 계수하는 전기 방법이 기술된다. 고정화된 세포들은 도전율이 낮은 저장성(hypotonic) 배지를 이용하여 용해되고 그 결과에 따른 임피던스의 변화는 세포들을 검출하고 그 세포들의 수를 정량화하기 위하여 표면이 패터닝(patterning)된 전극들을 이용하여 측정된다. 기술된 바와 같은 세포 용해물(cell lysate)에 대한 방법은 20 cell/㎕를 검출하는데 충분히 민감하고, 자원이 제한된 환경들에 있는 HIV 환자들 내의 CD4 세포 계수들의 측정을 포함하는 많은 응용예들을 위해 마이크로플루이딕 디바이스들 내에서 세포들을 검출하고 계산하기(enumerate) 위한 단순하고 효율적인 방법을 제공한다.
임피던스 분광법은 일반적으로, 통상적으로 혼합된 유형의 대규모의 세포들의 집단에 대해 수행된다. 그러므로 다른 세포들의 현탁액 내에서의 CD4+ 세포들의 분석은 이 방법을 이용하면 가능하지 않다. CD4+ 세포들은 기질(substrate) 상에서 고정화되고 현미경에 의해 계수되지만, 이것이 매우 신뢰성이 있지는 않다.
세포 분리 방식 배경 원리는 넓은 범위의 임상 응용예들에 용이하게 적응될 수 있을지라도, 이 분리된 세포들을 검출하는 것은 처리해야할 기술적 난제로 남아있다.
본 발명의 실시예들의 목적은 특이적인 마커를 표시하는, 박테리아, 바이러스들, 비-생물학적 입자들 또는 세포들, 예를 들어 혈구들과 같은 입자들을 식별하고 계수하기 위한 양호한 방법 및 디바이스를 제공하는 것이다. 본 발명의 실시예들에 따른 양호한 방법 및 디바이스는 특이적인 마커를 표시하는 식별된 입자들의 수가 정확하게 결정될 수 있으므로 정확하다. 더욱이, 본 발명의 실시예들에 따른 양호한 방법 및 디바이스는 또한 자원이 빈약한 환경들에서 이용될 수 있으나, 이로 제한되지 않는다. 응용예의 다른 영역들은 상이한 마커들을 표시하는 상이한 세포들의 포괄적인 분석 및 식별을 위한 PoC 디바이스들을 포함한다.
상기 목적은 본 발명에 따른 방법 및 디바이스에 의해 달성된다.
본 발명은 특이적인 마커들, 예를 특이적인 항원 마커(antigenic marker)를 표시하는 입자들, 특정한 실시예들에서는 혈구들을 판별하고, 식별하고 계수하기 위한 포괄적인 방법 및 디바이스를 제공한다. 이것은, 선택적으로 질병의 진단을 위해, 복수의 주파수(둘 이상의 주파수들) 임피던스 세포 분석과 결합하는 임피던스 라벨링을 이용함으로써 달성된다.
제 1 양태에서, 본 발명은 특이적인 마커 또는 다른 항체를 표시하는 입자들, 예를 들어 박테리아, 바이러스들, 비-생물학적 입자들 또는 예를 들어 혈구들과 같은 세포들을 식별하고 계수하기 위한 분석 방법을 제공한다. 단지 예로서, 상기 방법은 혈액 네의 CD4+ T-림프구를 식별하고 계수하는데 적용될 수 있다. 상기 방법은:
현탁액 내의 입자들, 예를 들어 혈구들(blood cells)을 포함하는 혈액 내의 입자들의 샘플을 획득하는 단계,
특이적인 마커를 표시하는 입자들, 예를 들어 혈구들을 임피던스 라벨로 라벨링하는 단계, 및
적어도 특이적인 마커를 표시하는 라벨링된 입자들을 판별하기 위해 복수의 주파수 시스템을 이용하여 라벨링된 샘플을 측정하는 단계를 포함한다.
본 발명의 실시예들에 따른 방법의 장점은 이것이 빠르고, 저렴하며, 간단한 분석이 가능한, 예를 들어 전 혈구 분석(전혈 계수(full blood count)가 수 분 내에 수행될 수 있다는 점이다. 본 발명의 실시예들에 따른 방법은 임상 실습에서 일상적으로 이용될 수 있다. 단지 제한된 양의 샘플, 예를 들어 혈액만이 요구되는데, 왜냐하면 이 분석은 입자들의 큰 집단 대신, 개별 입자들(또는 개별 입자/라벨 집합체들)에 대해서 수행되기 때문이다. 미리 결정된 수의 계수 이벤트들을 달성하기 위해, 소정의 양의 샘플, 예를 들어 혈액이 이용되어야만 한다. 본 발명의 실시예들에 따른 방법은 한 방울의 샘플 내의 입자들의 수, 예를 들어 한 방울의 혈액 내의 세포들의 수를 변경시키지 않는다. 그러나, 최신 시스템들은 4ml 튜브들 내의 정맥천자(venipuncture) 혈액을 이용하는데, 왜냐하면 이 시스템들은 큰 중앙 연구소들에서 이용되고 4ml 튜브들은 샘플들이 연구소로 보내지는 방식이기 때문이다. 본 발명의 실시예들에 따르면, 상기 방법은 마이크로플루이딕 디바이스에 응용될 수 있고, 마이크로플루이딕 포맷은 통합 샘플 제제(sample preparation)를 가능하게 하고 이 제제는 결과적으로 현장 사용을 가능하게 함으로써, 샘플의 어떠한 저장도 요구하지 않고 샘플에 대한 즉각 사용이 가능하다.계수가 통계적으로 중요해지도록 하는데 손가락 따는(finger prick) 정도의 혈액이 충분한 세포들을 포함하는 사실로 인해, 4ml 튜브보다는 오히려 손가락을 단 한 번 따는 정도의 혈액만을 이용하는 것이 가능하다.
본 발명의 실시예들에 따른 분석 방법에서, 특이적인 마커를 표시하는 입자들을 라벨링하는 단계는 마이크로플루이딕 시스템 내에서 수행될 수 있다. 특정한 실시예들에서, 상기 방법은 예를 들어 마이크로플루이딕 시스템 내의 혈구들에 적용될 수 있다. 세포들은 단지 마이크로플루이딕 시스템 내에 추가될 필요가 있으며, 용해 및 라벨링은 순차적으로 행해질 수 있다.
본 발명의 실시예들에 따른 분석 방법에서, 적어도 특이적인 마커를 표현하는 라벨링된 입자들을 분별하기 위해 라벨링된 샘플을 측정하는 단계는 라벨링된 샘플을 단일 입자를 포함하는 액적(droplet)들로 분리하는 단계, 적어도 제 1 주파수 및 제 2 주파수에서, 선택적으로 둘보다 많은 주파수들에서 단일 입자의 임피던스를 결정하는 단계로서, 제 1 주파수는 제 2 주파수보다 낮은, 상기 결정 단계, 제 1의, 더 낮은 주파수에서의 임피던스를 불투명도(opacity)에 상관시키는 단계로서, 상기 불투명도는 제 2의, 더 높은 주파수 임피던스 대 제 1의 더 낮은 주파수 임피던스의 비로 규정되는, 상기 상관 단계, 및 이러한 상관으로부터 적어도 특이적인 마커를 표시하는 라벨링된 입자들을 판별하는 단계를 포함할 수 있다.
본 발명의 실시예들에 따른 분석 방법에서, 샘플을 라벨링하는 단계는 특이적인 마커에 대한 항체 코팅형 비드(bead)들을 가지는 샘플들을 배양하는 단계를 포함할 수 있다.
더욱이 본 발명의 실시예들에 따른 방법은 라벨링된 샘플을 측정하는 단계 전에, 용해 단계를 실행하는 단계를 포함할 수 있다. 그와 같은 용해 단계는 특이적인 마커를 표시하는 세포들을 더욱 용이하게 분별하는 것을 가능하게 한다. 용해 단계는 마이크로플루이딕 디바이스에서 수행될 수 있는 것이 특히 유용하다. 샘플이 혈액인 경우, 용해 단계는 적혈구 용해 단계를 포함할 수 있다. 그와 같은 적혈구 용해 단계는 유기산(organic acid) 내의 사포닌(saponins)에 상기 혈액 샘플을 노출시키는 단계를 포함할 수 있다.
본 발명의 실시예들에서, 라벨링된 샘플을 측정하는 단계는 예를 들어 마이크로플루이딕 디바이스 내의 샘플 플로우에서 수행될 수 있다.
제 2 양태에서, 본 발명은 샘플 내의 입자들을 식별하고 계수하기 위하여 본 발명의 실시예들에 따른 방법의 이용을 제공한다. 제 2 양태의 특정한 실시예에서, 본 발명은 CD4+ T-림프구들의 검출 및 계수를 위해 본 발명의 실시예들에 따른 방법의 이용을 제공한다. 그와 같은 계수는 그것이 HIV를 진단하는데 도움을 주기 때문에 유용하다. 본 발명의 실시예들에서, 개별 CD4+ 세포들의 수는 단일 세포들의 임피던스 신호로부터 추정된다.
제 3 양태에서, 본 발명은 특이적인 마커를 표시하는 입자들을 식별하고 계수하기 위한 디바이스를 제공하고, 상기 디바이스는, 특이적인 마커를 표시하는 라벨링된 입자들을 포함하는 샘플 플로우, 예를 들어 현탁액 내의 입자들을 포함하기 위한 마이크로-채널, 적어도 한 쌍의 전극들, 적어도 제 1 주파수에서의 제 1 AC 신호 및 제 2 주파수에서의 제 2 AC 신호를 적어도 한 쌍의 전극들에 인가하기 위해 예를 들어 함수 발생기와 같은 전자 회로소자로서, 제 1 주파수는 제 2 주파수보다 더 낮은, 상기 전자 회로소자, 및 상기 한 쌍의 전극들 사이에 존재하는 입자의 임피던스를 결정하기 위한 계산 유닛을 포함하고, 상기 계산 유닛은 적어도 제 1의, 더 낮은 주파수 및 제 2의, 더 높은 주파수에서의 입자의 임피던스를 결정하기 위해, 제 1의, 더 낮은 주파수에서의 임피던스를 제 2의, 더 높은 주파수 임피던스 대 제 1의, 더 낮은 주파수 임피던스의 비로 규정되는 불투명도에 상관시키기 위해, 그리고, 이 상관으로부터 적어도 특이적인 마커를 표시하는 라벨링된 입자들을 판별하기 위해 적응된다.
본 발명의 실시예들에 따른 그와 같은 디바이스는, 특이적인 마커를 표시하는 입자들, 예를 들어 혈구들이 고정된 기질 상에서 고정화되므로, 마이크로-채널이 샘플의 플로우를 포함하지 않는 종래 기술과는 상이하다.
본 발명의 실시예들에 따른 디바이스는 더욱이 기준 전극들로서 기능을 하도록 적응되는 제 2 전극들의 쌍을 포함할 수 있다.
본 발명의 실시예들에 따른 디바이스는 더욱이 상기 전극들의 쌍들 중 하나의 쌍 사이에 존재하는 입자에 대한 감별 측정(differential measurement)을 행하도록 적응되는 증폭 회로를 포함할 수 있다. 이 방식에서, 감별 계수(differential count), 예를 들어 샘플이 혈액 샘플인 경우, 백혈구 감별 계수를 수행할 수 있는 마이크로플루이딕 단일-세포 임피던스 분석기가 제공된다.
본 발명의 실시예들에 따른 디바이스에서, 마이크로-채널은 현탁액 내의 입자들의 플로우를 수용하고, 현탁액 내의 입자들의 플로우 내에 특이적인 마커를 표시하는 그러한 입자들을 식별하고 계수하기 위하여 현탁액 내의 입자들의 플로우를 적어도 한 쌍의 전극들 사이로 지향시키도록 적응될 수 있다.
본 발명의 실시예들에 따른 디바이스에서, 저 주파수 측정 케이퍼빌리티(capability)들은, 입자들을 라벨링하도록 이용되는 기능화된 비드의 임피던스 특성들의 수정을 통해, 예를 들어 DNA, 바이러스, 단백질과 같은 생물학적 입자가 샘플 내에 존재하는지를 검출하는 것이 가능하도록 확장될 수 있다.
본 발명의 실시예들에 따르면, 마이크로플루이딕 디바이스는 생물학적 입자들, 예를 들어 DNA, 바이러스, 단백질 등을 기능화된 나노 규모 비드들에 결합한 것을 검출하는 것이 가능하도록 축소될 수 있다.
본 발명의 실시예들의 장점은 상기 실시예들이 CD4+ T-림프구 계수(counting)에 이용될 수 있는 점이다. 본 발명의 실시예들의 장점은 이용이 간단하고, 빠르고, 정확하고, 비싸지 않다는 것이다.
본 발명의 특정 및 바람직한 양태들은 첨부 독립 및 종속 청구항들에서 진술된다. 종속 청구항들로부터의 특징들은 종속 청구항들의 특징들과 결합될 수 있고 다른 종속 청구항들의 특징들과 적절하게 결합될 수 있으나, 단지 청구항들에서 명시적으로 진술된 바 그대로 결합되는 것은 아니다.
본 발명의 상기 및 다른 양태들은 이후에 기술되는 실시예(들)를 참조하여 분명할 것이고 명확해질 것이다.
도 1은 듀얼(dual) 주파수 임피던스 측정을 구현하는, 본 발명의 실시예들에 따른 마이크로 임피던스 세포 분석 시스템의 개략도.
도 2a는 분화 검출(differential detection) 시스템을 도시하는, 본 발명의 실시예들에 따른 임피던스 검출 시스템의 개략도. 좌측에 있는 전극 쌍은 전극들 사이에 세포가 없는 등가 회로 모델(equivalent circuit model : ECM)을 도시하고, 우측에 있는 전극 쌍은 전극들 사이에 있는 세포를 가진다.
도 2b는 고분자 비드에 대한 그리고 유사한 크기에 대한 전형적인 주파수-의존 임피던스 크기 신호의 비교를 도시하는 도면.
도 3은 (a) 5.62㎛ 직경 라텍스 비드(latex bead)들, 및 (b) T-림프구들, 단핵구(monocyte)들, 호중구(neutrophil)들의 MACS 정제된 집단들에 대한 임피던스 대 주파수의 크기를 도시하는 실험 데이터를 제공하는 도면. 각각의 지점은 약 1500 이벤트들을 포함하고 측정 데이터의 평균 및 표준 편자를 나타낸다. 점선들은 세포(또는 비드)를 포함하는 검출 영역에 대한 등가 회로 모델 및 차동 증폭 일렉트로닉스를 통합한 PSpice 회로 시뮬레이션을 나타낸다.
도 4a는 T-림프구들, 단핵 세포들, 호중성 백혈구들의 혼합 및 5.62㎛ 직경 라텍스 비드들의 집단에 대한, 저 주파수(503 kHz) 임피던스 크기 대비 플롯팅(plotting)된 불투명도(｜z｜@1707 kHz/｜z｜@503kHz)를 도시하는 산점도.
도 4b는 저 주파수 임피던스 크기의 히스토그램을 도시하는 도면.
도 4c는 불투명도의 히스토그램을 도시하는 도면.
도 4d는 세포들(비드들이 없는)의 전방 및 측방 산포 특성들을 도시하는 동일한 샘플의 FACS 분석을 도시하는 도면.
도 5a 내지 도 5c는 형광 라벨링된(항-CD14-FITC 및 항-CD16-Alexa700) 사포닌/포름 산 처리 전혈의 형광성 및 전방 광 산포 특성들을 도시하는 FACS 산점도들. 모든 이벤트들은 FSC 신호, 자체의 형광 신호에 따라 식별되는 세포 집단들에 대해서 트리거(trigger)되었다.
도 5d 내지 도 5f는 마이크로 임피던스 세포 분석기를 이용하는 측정되는 형광 및 저 주파수(503 kHz) 임피던스 크기 특성들을 (동일한 샘플들로부터) 도시하는 산점도들. 이 데이터는 양 시스템들이 세 세포 집단들의 호중성 백혈구들, 단핵 세포들 및 림프구들을 명확하게 분해할 수 있음을 나타낸다.
도 6a는 사포닌/포름 산 처리 전혈 및 7.18㎛ 직경 라텍스 비드들의 집단에 대한 불투명도(｜z｜@1707 kHz/｜z｜@503kHz) 대 저 주파수(503 kHz)를 도시하는 산점도.
도 6b는 저 주파수 임피던스 크기의 히스토그램을 도시하는 도면. 개별 집단들에 대한 데이터는 가우시안 분포들(회색 곡선들)에 피팅된다.
도 6c는 불투명도의 히스토그램을 도시하는 도면. 개별 집단들에 대한 데이터는 가우시안 분포들(회색 곡선들)에 피팅된다.
도 6d는 세포들(비드들이 없는)의 전방 및 측방 산포 특성들을 도시하는 동일한 샘플의 FACS 분석도.
도 7은 사포닌/포름 산 용해액으로 처리된 이후에 백혈구들에 대한 전형적인 분화 산점도(differential scatter plot). 도면에서의 다원들은 2차원 가우시안 확률 프로파일들을 도시하고 상대적인 림프구, 단핵구 및 과립구(granulocyte) 집단들은 이 확률 분포들로부터 획득되었다. 이 분화 산점도에서의 데이터는 도 8에 대해서와 같이 분석되었다.
도 8은 기준 전 혈액 분석기로부터 획득되는 측정들의 함수로서 상대적인 WBC 분포들의 상관을 도시하는 도면. 본 발명의 실시예들에 따른 임피던스 세포 분석기 및 기준 디바이스로부터 획득되는 결과들 사이의 공분산 인수들(covariance factors)이 기호표로 도시된다. 하나의 샘플에 대해, 동일한 실험이 5회 반복되었고, 각각의 회차는 새로운 용해물 및 완전 세정된 칩을 준비하였다.
도 9는 항체 코팅형 비드들로의 라벨링으로 인해 CD4+ 집단들이 식별되는 방법을 도시한 도면. 림프구들 및 단핵구들은 임피던스 플롯에서 명백하게 판별된다.
도 10 및 도 11은 실험으로부터의 데이터의 예를 도시하는 도면. 도 10은 라벨링 이전의 림프구들 및 호중성 백혈구들의 플롯을 도시한다. 도 11은 CD4 항체 기능화된 비드들로 라벨링된 이후에 혈구들의 플롯을 도시한다.
도 12는 용해된 전혈 및 CD4 비드들로 배양되는 용해된 전혈에 대한 FACS 산점도들. 타원들은 첨가된 라텍스 비드들에 의한 CD4+ T-림프구 집단의 위치를 도시한다.
도 13은 둘 모두가 형광 항체들(CD4 및 CD14에 대한)로 라벨링되고 CD4 비드들로 배양되었던 용해된 전혈의 샘플로부터의 FACS 데이터를 도시하는 도면.
도 14는 다양한 집단들을 도시하는 불투명도(｜Z｜@10007 kHz/｜Z｜@503kHz) 대 저 주파수 크기(503 kHz)의 IS 산점도.
도 15는 본 발명의 실시예들에 따른 임피던스 마이크로-세포 분석기에 대한 교정 데이터를 도시하는 도면.
도면들은 단지 개략도이며 비제한적이다. 도면들에서, 요소들의 일부의 크기는 설명을 목적들을 위해 과장되고 축적에 따라 도시되지 않을 수 있다.
청구항들 내의 참조 부호들은 범위를 제한하는 것으로 해석되어서는 안 된다.
여러 도면들에서, 동일한 참조 부호들은 동일하거나 유사한 요소들을 나타낸다.
하나의 양태에서, 저비용의 간단한 임피던스 플로우 세포 측정 분석 방법을 특이적인 마커를 표시하는 세포들, 예를 들어 혈구들을 식별하고 계수하기 위한, 예를 들어 인간의 신체 내의 CD4+ T-림프구들을 식별하고 계수하기 위한 임피던스 라벨링과 결합하여 이용하는 것을 제공한다.
이후의 상세한 설명은 혈액 내의 CD4+ T-임파구들을 식별하고 계수하는 특정한 실시예들에 대해 제공된다; 그러나, 본 발명은 이로 제한되지 않고 일반적으로 박테리아, 바이러스들, 비-생물학적 입자들, 세포들, 분리 조직(dissociated tissue)들, 바이러스들이 첨가되어 있는 나노 비드들(철저하지 않은 목록)을 포함할 수 있는 입자들의 식별, 판별, 및 계수를 포함한다.
일반적인 혈액, 및 특히 인간의 혈액은 다음 세 카테고리들 중 임의의 하나에 해당하는 혈구들을 포함한다: 산소를 신체 조직들로 전달하는 적 혈액 세포들, 즉 적혈구들, 감염들 및 외부 물질들에 대항하여 신체를 방어하는 항체들을 만들기 위한 백 혈액 세포들 즉 백혈구들, 및 혈액 응고를 위한 전구들 즉 혈소판(thrombocyte)들. 혈구들의 이 세 카테고리들은 혈장(plasma) 내에서 현탁된다. 혈장은 90%가 물이고, 혈액 체적의 약 55%를 구성하고 다양한 단백질들(예를 들어 알부민, 피브리노젠, 글로불린, 및 다른 응고 단백질들)을 함유한다.
5개의 상이하고 다양한 유형들의 백혈구들이 존재한다: 호중성 백혈구들(백혈구들의 40 내지 75%), 호산구(eosinophil)들(백혈구들의 0 내지 7%), 호염기성 세포(basophil)들(백혈구들의 0 내지 1%)(이들 셋은 과립구들이라는 명칭 하에서 그룹화된다), 림프구들(백혈구들의 20 내지 45%) 및 단핵 세포들(백혈구들의 3 내지 11%). 혈액 내의 백혈구들의 수는 흔히 질병의 표시자이다. 통상적으로 1리터의 혈액 내에는 4x109 및 1.1x1010의 사이의 백혈구들이 존재한다.
림프구들은 자연 살해 세포들(natural killer cells: NKs), 즉 T 세포들 및 B 세포들을 포함한다. T 세포들 및 B 세포들의 기능은 항원 제공(antigen presentation)으로 공지되어 있는 프로세스 동안, 특정한 "비-자기(non-self)" 항원들(박테리아 내의 항원들)을 인지하는 것이다. 일단 T 세포들 및 B 세포들이 침입자를 식별하였다면, 이들은 특정한 병원체(pathogen)들 또는 병원체 감염 세포들을 최대로 제거하도록 적응된 특정 응답들을 발생시킨다. B 세포들은 다량의 항체들을 산출하고 이때 이 항체들이 박테리아 및 바이러스와 같은 외부 물체들을 중성화시킴으로써 병원체들에 응답한다. 병원체들에 대한 응답에서, 헬퍼 T(helper T)라 칭해지는 일부 T 세포들은 세포 독성(cytotoxic) T 세포들로 칭해지는 다른 T 세포들이 병원체 감염 세포들의 사망을 유도하는 독성 과립들을 생성하는 동안 면역 응답을 지시하는 사이토카인(cytokine)들을 발생시킨다.
또한 지정 클러스터 및 종종 줄여서 CD로 칭해지는 분화 클러스트(cluster of differentiation)는 백혈구들에 존재하는 세포 표면 분자들의 식별 및 조사를 위해 이용되는 프로토콜이다. 약 250개의 상이한 CD 단백질들이 존재한다. CD 시스템은 통상적으로 세포 마커들로 이용되어, 무슨 분자들이 자체의 표면에 존재하는지에 기초하여 세포들이 규정되는 것이 가능해진다. 이 마커들은 흔히 세포들을 특정한 면역 기능들과 연관시키는데 이용된다.
CD 분자들은 플로우 세포 분석법을 포함하는 다양한 방법들을 이용하는 세포 분류에 이용된다. 세포 집단들은 통상적으로 어떤 세포 분절이 CD 분자를 표시하거나 부족하다는 것을 나타내기 위해 '+'(양) 또는 '-'(음) 심볼을 이용해서 규정된다. 2개의 공통적으로 이용되는 CD 분자들은 CD4 및 CD8이며, 이들은 일반적으로 각각 헬퍼 및 세포 독성 T 세포들로 이용된다. 인간 면역결핍 바이러스(human immunodeficiency virus: HIV)는 T 헬퍼 세포의 표면에 있는 CD4 및 케모카인 수용체(chemokine receptor)를 묶어서 엔트리를 얻는다. 혈액 내의 CD4 및 CD8 T 세포들의 수는 흔히 HIV 감염의 진행을 모니터링하는데 이용된다.
HIV 감염으로 인해 CD4 수용체들을 처리하는 T 세포들의 수는 점진적으로 감소한다. 그러므로, 의료 전문가들은 HIV 감염 환자들에 대한 치료를 언제 시작할지에 대한 결정을 위해 CD 4 계수를 참조한다. CD4 테스트들은 세포들 표면의 CD4 수용체를 표시하는 T 세포들의 수를 측정한다. 정상 혈액 값들은 1x109/L 이상이다. 결과들은 통상적으로 혈액의 마이크로리터당 세포들의 수로 표시된다. 환자들은 CD4 계수가 저점, 마이크로리터당 약 200 내지 350 세포들에 도달할 때 치료를 받는다.
플로우 세포 분석은 마이크로스코픽 입자들, 예를 들어 유체 스트림 내에 현탁되어 있는 세포들의 화학적 그리고/또는 물리적 특성들을 연구, 예를 들어 계수하고, 분류하고 조사하기 위한 기술이다.
본 발명의 실시예들은 임피던스 스테레오스코피(stereoscopy)를 수행하기 위하여 플로우 세포 분석을 이용한다.
도 1은 본 발명의 실시예들에 따른 단일 세포 분석 시스템(10)의 도면을 도시한다. 현탁액에 현탁되어 있는 세포들(13)이 통과하여 흐르는 마이크로-채널(12)을 포함하는 마이크로플루이딕 디바이스(11)가 제공된다. 이것은 계수되기 위해 고정 기질 상에 세포들이 고정화되는 종래 기술의 분석 시스템들과는 상이하다. 마이크로-전극들(14)의 제 1 쌍은 채널(12) 내에서 조립되고, 이것들은 함수 발생기(15)에 의해 발생되는 소 신호 AC 전압에 접속된다. 이 인가되는 전압 대 마이크로-전극들(14) 사이의 마이크로-채널(12)을 통해 흐르는 측정 전류의 비는 마이크로-전극(14) 사이에서 지나가는 단일 세포(13)의 전기 임피던스를 결정하는데 이용된다.
도 1 및 도 2에 도시되는 바와 같이, 마이크로-전극들(14, 16)의 두 쌍들은 2개의 근접하게 위치되는 검출 볼륨들을 규정하는데 이용되고, 이 두 볼륨들 모두는 감별 측정이 개별 세포들(13)에 대해 행해지도록, 동일한 함수 발생기(15)에 접속됨으로써 동일한 AC 전압을 수신한다. 전극들의 제 1 쌍(14)은 세포(13)로부터의 전기 신호를 측정하고 반면에 전극들의 제 2 쌍(16)은 기준 역할을 하고 현탁액을 가지지만 세포(13)가 존재하지 않는 마이크로-채널(12)로부터의 신호를 측정한다. 전기 신호들은 주문형 일렉트로닉스들을 이용하여 측정될 수 있다. 이 이중 측정 방법은 현탁액의 온도 또는 조성의 변동들로부터 발생할 수 있는 측정 잡음 및 드리프트(drift)를 현저하게 감소시킨다.
이용 시에, 현탁액 내의 세포들(13)은, 주사기 펌프(syringe pump)(도시되지 않음)를 이용하여, 미리 결정된 비율로, 예를 들어 초당 약 100 세포들(13)의 비율로, 마이크로플루이딕 디바이스(11)의 마이크로플루이딕 채널(12)을 통과하도록 펌핑(pumping)된다. 세포들(13)이 채널(12)을 통과하면서 이 세포들은 검출 체적들 내의 전기장을 섭동시켜서, 양 신호(세포(13)가 제 1의 전극들의 쌍(14)을 통과할 때) 및 음 신호(세포(13)가 제 2의 전극들의 쌍(16)을 통과할 때)를 순차적으로 발생시키고; 이 신호들은 임피던스를 제공하도록 프로세싱된다. 측정된 신호에서의 두 정점(peak)들(양 및 음) 사이의 시간은 전극들(14, 16) 사이의 세포(13)의 통과 시간에 대응한다. 본 발명의 실시예들에 따르면, 고속 임피던스 분석은 2개의 동시 발생 주파수들에서 수행되고 시스템(10)으로부터의 데이터는 분석 디바이스(18)에서 작동 중인 분석 소프트웨어를 이용하여 분석된다. 분석 디바이스(18)는 전극들의 쌍 사이에 존재하는 혈구의 임피던스를 결정하기 위한 계산 유닛을 포함할 수 있고, 계산 유닛은 제 1 주파수 및 제 2 주파수에서 혈구의 임피던스를 결정하고, 제 1 주파수에서의 임피던스를 고 주파수 임피던스 대 저 주파수 임피던스의 비율인 불투명도에 상관시키고, 이러한 상관으로부터 적어도 특이적인 마커를 표시하는 라벨링된 혈구들을 판별하도록 적응된다.
현탁액 내의 세포들(13)의 유전체 특성들은 이종 시스템의 등가의 복소 유전율 및 개별 입자들 및 현탁 배지의 특성들 사이의 관계를 특징으로 하는 맥스웰의 혼합 이론(Maxwell's mixture theory)을 이용하여 기술된다.
배지 내에서 현탁하는 구형 입자들(예를 들어, 세포들(13))의 경우, 혼합의 등가의 복소 유전율은 εmin은,
Figure pct00001
에 의해 제공되고, 여기서 및
Figure pct00003
및
Figure pct00004
은 각각 현탁 배지 및 세포(13)의 복소 유전율이다. Φ는 체적 분율(fraction), 세포들(13)의 체적 대 검출 체적의 비이다. 이 모델은 세포들(13)이 고체의 동종 물체들이라는 가정에 기초한다. 이것은 입자를 얇은 멤브레인에 의해 둘러싸이는 동종 물체로서 처리하는 쉘 모델(shell model)을 이용하는 생물학적 세포의 경우로 확장될 수 있다. 이제
Figure pct00005
는:
Figure pct00006
에 의해 제공되고,
여기서
Figure pct00007
및
Figure pct00008
은 각각 세포 멤브레인 및 세포 내부(세포질)의 복소 유전율이다. R은 세포의 반경이고 d(d << R)은 멤브레인의 두께이다.
혼합 이론은 작은 체적 분율들, Φ < 0.2, 예를 들어 Φ < 0.1에서 세포들의 혼합의 동작을 기술하고, 제 1 측정 전극들의 쌍의 두 측정 전극들(14) 사이에 위치되는 단일 세포(13)의 유전체 특성들을 모델링하는데 이용된다. 시스템의 기하학적 파라미터들이 공지되면(전극 크기, 채널 치수들 등), 시스템의 유전율 및 도전율의 값들은 등가의 전기 부품들에 의해 대체될 수 있다.
현탁액 내의 세포(13)에 대한 간소화된 등가 회로 모델(Equivalent Circuit Model : ECM)은 도 2a에 도시된다. 세포가 없는 배지의 임피던스는 도 2a, 좌측에서와 같이 저항(Rm) 및 커패시터(Cm)의 병렬 결합에 의해 표시된다. 전극들(14) 사이에 세포(13)가 있는 경우, 회로는 도 2a, 우측에서와 같이 수정된다. 세포(13)는 얇은 절연 멤브레인을 가지고 커패시터(Cmem)로서 작동한다. Rcyto는 세포의 세포질의 등가 저항이다. Cdl은 액체 전극 인터페이스에서의 전기 이중 층 캐패시턴스를 나타낸다.
ECN에서의 부품 값들은 세포(13)의 유전체 특성들(멤브레인 캐패시턴스 및 세포질 저항), 현탁액 내의 배지 도전율 및 유전율, 및 체적 분율에 의해 결정된다. 시스템의 작동을 지배하는 식들은 이후에 기술된다.
두 평면 전극들(14) 사이에서 잡혀 있는 세포(13)의 경우, 그리고 저 체적 분율 Φ(예를 들어 <10 %)의 경우, 개별 전기 부품들은 다음과 같이 표현될 수 있다:
Figure pct00009
Figure pct00010
여기서
Figure pct00011
이다.
이 식에서, κ는 임피던스 감지 영역에 대한 기하학적 세포 상수이고, 불균일한 전기장을 고려하는 Schwarz-Christoffel 매핑 방법(mapping method)을 이용하여 풀이된다. h는 마이크로플루이딕 채널(12)의 높이이고, w는 폭이고 l은 전극(14)의 길이이다. K(k)는 제 1 종류의 완전 타원 적분이고, K'(k)는 상보 적분(complementary integral)이고, k는 타원 함수의 계수이다.
이 식들에서, 체널 분율 Φ은:
Figure pct00012
에 의해 제공된다.
또한
Figure pct00013
이고, 여기서 Cmem은 특정 멤브레인 캐패시턴스(단위 영역 당 캐패시턴스)이고, d는 멤브레인의 두께이고,
Figure pct00014
는 무한 주파수(infinite frequency)에서의 유전율이고,
Figure pct00015
및
Figure pct00016
은 각각 세포(13) 및 현탁 배지의 복소 유전율들이다.
시스템의 복소 임피던스,
Figure pct00017
는:
Figure pct00018
현탁 배지 내의 전기장은 또한 전극-전해질 인터페이스에서의 전기 이중 층 때문에 주파수에 따라 변한다. 이 작업에서 이중 층은 단지 이상적인 커패시터(Cdl)로 모델링된다.
회로(이중 층을 포함하는)의 총 임피던스는:
Figure pct00019
이다.
세포(13)에 대한 유전체 파라미터들에 대한 전형적인 값들은:
ε0 = 8.854 ×10-12Fm-1, d = 5nm, εm = 80ε0, σm = 1.6Sm-1, εmen = 11.0ε0, σmen = 10-8Sm-1, εi = 60ε0, σi = 0.6Sm-1이다. 이 시뮬레이션들에서, 세포 파라미터들에 대한 실제 값들은 표 1로부터 취해졌다. 마이크로플루이딕 디바이스(11)에 대한 전형적인 기하학적 크기는 w = h = l = 20㎛이다. 실제 값들은 개별 마이크로플루이딕 디바이스들의 측정으로부터 획득된다.
상기 내용으로부터, 저 주파수들에서의 임피던스는 세포 멤브레인(Cmen)에 의해 지배되는 것이 확인될 수 있다. 인가되는 필드의 주파수가 증가할수록, 이 커패시터는 단락 회로화되고 세포는 저항기(Rcyto)로 동작하고, 값은 세포질 도전율에 비례한다. 세포질의 용량성 리액턴스는 고 주파수들에서 응답에 거의 영향을 미치지 않고 무시된다.
상기 방정식들은 현탁액 내의 단일 세포(13)의 전기 임피던스를 계산하는데 이용되었다. 전체 전기 회로 분석은 PSPICE를 이용하여 수행되었다. 모델은 마이크로플루이딕 디바이스(11), 전기 이중 층, 현탁 배지 내의 세포(13), 및 증폭기 회로(17)의 부품들의 전기 특성들을 포함한다. 도 2b는 임의의 세포(13) 및 라텍스 비드(동일한 크기의)의 임피던스의 크기가 주파수에 따라 변하는 것을 도시한다. 저 주파수들에서 시스템은 전기 이중 층에 의해 지배된다. 주파수 범위 1 MHz 내지10 MHz에서, 세포(13)의 임피던스는 세포 멤브레인의 (Maxwell-Wagner) 계면 이완(interfacial relaxation)(유전체 분광법에서 이것은 β-분산(β-dispersion))으로 인해 급속히 감소한다. 그와 같은 이완은 비드에 대해 측정되고 임피던스는 실질적으로 일정하게 유지된다. 세포(13)의 경우, 고 주파수들에서 회로의 특성들은 세포질 저항 및 또한 전기 회로 내의 기생 캐패시턴스들에 의해 지배된다. 도 2b는 멤브레인 캐패시턴스가 1 내지 3 MHz 영역에서 응답에 가장 크게 영향을 미치는 것을 도시한다.
상이한 백혈구 하부-집단들의 특징을 나타내고 판별을 위한 최적의 주파수들을 결정하기 위해, T-림프구들, 단핵 세포들, 및 호중성 백혈구들의 정제된 주파수-의존 임피던스가 측정된다.
호산구들, 호 염기성 세포들, 및 호중성 백혈구들은 서로 과립구들로 그룹화되는데, 이것들은 하나의 그룹으로 검출되기 때문이다. 이 호산구들 및 호 염기성 세포들은 적은 퍼센티지를 구성하고 개별 식별 및 계수에는 특수 기술들이 요구된다. 각각의 경우, 5.62㎛ 직경 라텍스 비드들의 샘플의 특성들이 또한 기준으로 측정되었다.
세포들(13) 및/또는 라텍스 비드들(생리 식염수(physiological saline), PBS(phosphate buffered saline)에서 현탁되는)의 정제된 집단들은 세포 분석 시스템(10)의 마이크로플루이딕 디바이스(11)를 통과하여 흘렀고 임피던스의 크기는 여러 불연속한 주파수들에 기록되었다. 도 3a는 5.62㎛ 직경 라텍스 구체들에 대한 임피던스 크기를 주파수의 함수로서 도시한다. 데이터는 두 주파수들을 전극들(14, 16)에 동시에 적용함으로써 획득되었다. 제 1 주파수(기준)는 503 kHz에서 유지되었다. 저 주파수는 본질적으로 DC 역할을 한다. 503 kHz가 바람직한 값이고, 100kHz 내지 800kHz가 양호하며 DC 내지 1MHz가 또한 작용하는 반면에 제 2 주파수는 500 kHz 및 50 MHz 사이의 불연속한 단계들에서 변경되었다. 도 3a에서의 각각의 데이터 지점은 제 2 주파수에 대한 상기 특정한 주파수 값에서 측정되는 약 1500개의 개별 이벤트들에 대한 임피던스 신호의 평균 값 및 표준 편차이다. 도 3a에 도시되는 완성 데이터 세트는 5.62㎛ 비드들의 평균 주파수-의존 임피던스이다. 각각의 세트(1500 비드들)의 측정들은 약 2분이 걸린다; 도면에서는 14개의 데이터 세트들이 있고, 완전한 스펙트럼은 30분이 걸려서 기록된다. 비드들에 대한 통과 시간은 약 1ms(60mm/s의 입자 속도)이었다. 각각의 비드가 전극들(14, 16)을 통과했을 때, 바이폴라 전압 신호가 기록되었다. 이 신호는 평균 피크 값을 제공하도록 프로세싱되었고; 추가 신호 프로세싱은 데이터에 적용되지 않았다.
도 2b는, 60pF의 이중 층 캐패시턴스(Ddl)를 이용하고 다양한 증폭기들(제조사들로부터 획득되는)의 전달 함수들을 포함하는, PSPICE 모델로부터의 데이터를 도시한다. 2.5ε0의 비드 유전율, 0.36mS/m의 도전율(표면 도전율 = 1.2nS)로 PBS(phosphate buffered saline) 현탁 배지에 적합한 피트(fit)(점선)가 계산되었다. 데이터는 등가의 회로 모델에 의해 충분히 기술된다.
3개의 백혈구 하부-집단들의 주파수-의존 특성들은 도 3b에 도시된 바와 동일한 방식으로 측정되었다. 또한 표 1에 요약되는 바와 같이, Biophys J. 78:2680 내지 2689에서, Yang J., Huang Y., Wang X-B, Becker FF. 및 Gascoyne, PRC(2000)의 "Differential analysis of human leukocytes by dielectrophoretic field-flow-fractionation"으로부터 취해지는 유전체 파라미터들의 값들을 가지는, 등가 회로를 이용하여 수행되는 PSPICE 시뮬레이션들이 도시된다.
직경
(㎛)		 맴브레인 캐패시턴스(mF/m2) 세포질 도전율
(mS/m)		 세포질 유전율
림프구 6.58±0.7 10.5±3.1 0.65±0.15 154.4±39.9
단핵구 9.26±0.72 15.3±4.3 0.56±0.1 126.8±35.2
과립구 9.42±0.46 11±3.2 0.6±0.13 150.9±39.3
도 3b에서의 데이터는, 특히 저 주파수들(예를 들어, 503 kHz 기준 주파수)에서 세포 크기에 따라 임피던스 크기가 변하는 것을 도시한다. 또한 멤브레인 캐패시턴스에서의 차이들로 인한 변화들은 분명하다. T-림프구들은 단핵 세포들 및 호중성 백혈구들보다 훨씬 더 작고, 단지 크기에 기초하여 판별될 수 있다. 표 1은 단핵 세포들 및 과립구들(호중성 백혈구들, 호산구들 및 호 염기성 세포들을 포함하는)은 유사한 크기로 되어 있고 저 주파수 임피던스의 크기에 기초하여 구분하는 것이 어렵다. 그러나, 이것들의 멤브레인 캐패시턴스는 상이하므로, 분별이 중간-주파수 대역에서 판별이 가능해야만 한다는 것을 의미한다(도 2b 참조). PSPICE 피트(점선들)가 이를 확인하고, 여기서 단핵 세포들 및 호중성 백혈구들 사이의 임피던스의 최대차는 1 내지 3 MHz 윈도 내에 있다. 실험적으로 결정되는 임피던스의 평균 값들은 또한 단핵 세포들 및 호중성 백혈구들 사이의 판별이 이 주파수 윈도 내에서 가능해야만 한다는 것을 나타낸다. 그러나, 이들 세포들에 대한 크기 및 멤브레인 캐패시턴스 이 둘 모두에서 분포가 매우 크므로, 판별은 수월하지 않다.
도 3으로부터, 크기에 기초하는 판별에 대한 최적의 주파수는 약 500 kHz인 것이 분명하다. 범위 1 내지 10 MHz에서는 멤브레인 캐패시턴스의 차이들이 두드러진다. 판별에 대한 가능성을 결정하기 위해, 세포들의 임피던스 분석은 동일한 비율들(0.5% BSA(bovine serum albumin) 및 2mM EDTA(ethylenediaminetetraacetic acid)를 함유하는 PBS와 같은 버퍼 용액 내의)들로 정화한 세포들을 혼합함으로써 수행되었다. 두 프로브(probe) 주파수들, 하위 주파수 및 상위 주파수, 예를 들어 503 kHz 및 1.707 MHz를 동시에 이용함으로써 측정들이 행해졌다.
독립적 검증(independent verification)을 위해, 단핵 세포들 및 호중성 백혈구들은 형광 라벨들, 예를 들어 단핵 세포들을 위한 FIFC 복합 항-CD14 및 호중성 백혈구들을 위한 Alexa 700 복합 항-CD16으로 라벨링되었다. 형광 신호는 각각의 세포를 식별하였고 세포 표현형(phenotype)으로의 측정된 임피던스 신호의 상관을 인에이블(enable)하였다.
도 4는 세 개의 상이한 세포 유형들(T-림프구들, 단핵 세포들 및 호중성 백혈구들)의 혼합 및 5.62㎛ 직경 비드들으로부터의 데이터를 도시한다. 이 플롯에서 임피던스는 불투명도(｜Z｜@1707 kHz/｜Z｜@503kHz) 대 저 주파수 임피던스((｜Z｜@503kHz)의 산점도로서 도시된다. 불투명도는 고 주파수 대 저 주파수 임피던스의 비이고, 세포 크기의 관계 없는 파라미터를 제공하므로, 세포 멤브레인의 변화들을 반영한다. 단핵 세포들 및 호중성 백혈구들 집단들은 형광에 따라 컬러-코딩된다. 그래프에서, 상이한 세포 집단들은 "최적의 타원"에 의해 둘러싸인다. 산점도(도 4a)는 T-림프구들이 크기(저 주파수 임피던스)에 기초하여 단핵 세포들 및 호중성 백혈구들을 포함하는 그룹으로부터 판별될 수 있음을 도시한다. 또한 세포 크기에 대략 비례하는 전방 산란(forward scatter: FSC)에 대한, 과립도의 측정, 측방 산란(side scatter : SSC)으로 플롯팅되는 상업적 플로우 세포 분석기(FACSAria, Becton Dickinson)(도 4d)에서 측정되는 바와 동일한 샘플로부터의 데이터와 함께, 저 주파수 임피던스 크기(도 4b) 및 불투명도 히스토그램들(도 4c)이 도시된다. 양호한 상관은 저 주파수 임피던스 데이터(크기) 및 FSC 사이에서 발견된다(표 2).
T-림프구(%) 단핵구(%) 호중구(%)
MACS 정화, 재혼합
 FACSAria 37.8 32.3 29.9
마이크로-세포 분석기 33.6 36.7 29.6
사포닌 처리된 전혈
 FACSAria 24.0
(B & T -
림프구들)		 6.4 71.2
마이크로-세포 분석기 24.0 4.8 69.6
전혈 내의 전형적인 비율들 20 내지 45(총 림프구들) 3 내지 11 40 내지 75
임피던스 산점도(도 4a) 및 히스토그램들(도 4b 및 도 4c)의 분석은 정화되고 재혼합된 세포 집단들에서 단핵 세포들 및 호중성 백혈구들 사이의 현저한 중첩을 보여주는데, 이는 세포들의 추가 변경 없이 명확한 판별이 가능하지 않다는 것을 암시한다.
전혈에서, 상기 표시된 바와 같은 정화된 집단들과는 대조적으로, 백혈구들의 화학적인 변경은 전기 신호를 강화하고 백혈구 하부-집단들의 판별을 보조하는데 이용될 수 있다. 예를 들어, 선택에 기초하여 복합 혈액 샘플의 하나 이상의 세포 구성요소들을 관심 세포 구성요소들의 후속 격리, 식별 및/또는 분석이 가능할 수 있을 정도로 효과적으로 변경하는 용해제에 전혈을 노출시키는 것이다. 그와 같은 용해제의 예는 예를 들어 유기 산(포름 산) 내의 사포닌일 수 있고, 이 사포닌에 전혈이 짧은 시간 기간(< 10 초) 동안 노출될 수 있어서 백혈구들의 특성들을 변경하여, 세포 체적 및 세포 멤브레인 특성들을 변경한다. 다른 용해제들이 적혈구들의 파괴에 이용될 수 있다. 다른 용해제들은 예를 들어 US-5155044 및 US-4485175에 기술된다. 전혈 내의 백혈구들의 분석을 위한 종래의 기술들은 흔히(그러나 항상은 아니다) 적혈구들을 용해하는데 어떤 형태의 사전 처리를 요구한다. 전혈을 사포닌에 노출시킴으로써 이전에 보고된 바와 같은 적혈구들의 용해, 및 백혈구 집단들의 변경 이 둘 모두가 자체의 판별을 개선하는 것이 가능하다고 본 발명의 실시예로 밝혀졌다.
호중성 백혈구들(예를 들어, 항-CD16-Alexa700) 및 단핵 세포들(예를 들어 항-CD14-FITC)을 형광으로 라벨링한 후에, 전혈(50μl)은 6초 동안 포름산 내 사포닌(0.12% v/v 포름산, 0.05% w/v 사포닌)이 용해된 용액에 노출되었고, 이후에 급냉되어(0.6% w/v 탄산 나트륨(sodium carbonate), 3% w/v 염화 나트륨(sodium chloride)) 본 발명의 실시예에 따른 임피던스 세포 분석기 및 당업계에 공지되어 있는 플로우 세포 분석기(FACS)에서 분석하였다. 도 5a 내지 도 5c에 도시되는 바와 같이, 사포닌/포름산 처리는 모두 적혈구들을 제거하고 단핵 세포들, 호중성 백혈구들, 및 림프구들이 식별되도록 한다. 도 5d 내지 도 5e는 본 발명의 실시예들에 따른 임피던스 세포 분석기로부터의 유사한 데이터를 도시하고, 각각의 이벤트는 저 주파수 신호(503 kHz)의 크기에서 트리거되고 형광 신호에 따라 오-착색된다. 이 데이터 세트에 대한 이벤트들의 수들은 표 2에 요약되고, FACS 데이터와 상관된다.
도 6은 사포닌 처리 전혈(집단들, 및 용이한 도시를 위해 유형마다 "최적의 타원"에 의해 둘러싸인다)에 대한 본 발명의 실시예들에 따른 산란 데이터를 도시하고, 도 6d에서는 종래 기술의 FACS로부터의 SSC 및 FSC 데이터를 도시한다. 도 6a의 임피던스 플롯은 듀얼 주파수 측정에만 기초하여 세 개의 상이한 세포 유형들(림프구들, 단핵 세포들, 호중성 백혈구들)이 명확하게 식별될 수 있음을 도시한다. FACS 및 임피던스 세포 분석기 이 둘 모두에 대한 세포 계수들은 유사하였고 전혈 내에서 발견되는 비율들을 나타낸다(표 2). 이 데이터는 세 개의 상이한 환자 샘플들을 이용하여 3회 반복되었다.
세포들에 대한 사포닌 처리의 정확한 효과는 알려지지 않았지만, 도 4a 및 도 6a를 비교하면 사포닌 처리가 세포 크기(503 kHz에서의 임피던스)의 분포를 감소시키고 있음이 확인된다. 세포 크기의 변경의 추정치는 저 주파수 임피던스로부터 획득될 수 있다. 시스템은 우선 혈구들의 명확한 크기 분석이 가능하도록 교정되었다. 시스템은 라텍스 입자들의 세 상이한 크기들(5.8㎛, 7.18㎛ 및 9.52㎛)을 이용하여 교정되었다. 라텍스 비드들의 세 크기들(도 15에서 검은 사각형들 내에서 플롯팅된 5.82㎛, 7.18㎛, 및 9.52㎛)이 혼합되었고 사포닌/포름산 처리 전혈 내에서 현탁되었다. 샘플은 전혈 실험들과 동일한 조건들 하에서(도 5 및 도 6에 도시된 데이터) 본 발명의 실시예들에 따른 임피던스 마이크로-세포 분석기 시스템에서 작동되었다. 도 15에 데이터가 되시되고, 도 15에서, 비드 집단들의 평균들 및 표준 편차들은 비드 크기들 대 저 주파수(503 kHz) 신호 크기로 플롯팅된다. 비드 데이터에는 교정 곡선으로서 제 2 차수의 다항식이 적합하다. 그리고나서 도 5 및 도 6의 전혈 데이터로부터 획득되는 평균 신호 크기들은 교정 곡선과 함께 이용되어 림프구들, 단핵 세포들 및 호중성 백혈구들에 대한 세포 크기가 추정된다. 이 교정 데이터는 백혈구들의 크기를 정하는데 이용되었고 이 결과가 표 1에 요약된다. 세포들의 평균 크기의 변화는 매우 적지만 단핵구 및 호중구 집단 분포의 변화는 감소되는 것이 확인될 수 있다.
도 4a 및 도 6a의 비교는 또한 단핵구 및 호중구 집단들은 사포닌 처리의 결과로서 서로에 대해 이동하는 것을 도시함으로써, 이 두 집단들의 명확한 판별 및 식별이 인에이블된다. 사포닌 처리 후에, 단핵구 집단의 불명확도는 다른 세포들에 비해 약 5%만큼 감소한다. 단핵 세포들의 멤브레인 캐패시턴스의 등가의 변경이 계산되었고(PSPICE를 이용하여), 약 15mF/m2로부터 19mF/m2로의 증가에 대응한다. 보충 실험들에서, 단핵 세포들의 멤브레인 캐패시턴스(자기적으로 정화된, Miltenyi-Biotec MACS)는 전자회전(electrorotation) 분석을 이용하여 측정되었고 16±2mF/m2으로부터(12개의 처리되지 않은 세포들) 19±3mF/m2로 증가하는 것이 발견되었다. 이 차이는 전혈의 사포닌 처리 이후에 본 발명의 실시예들에 따른 임피던스 세포 분석기들을 이용하여 측정된 단핵 세포들에 대한 변화를 반영한다. 세포들의 평균 반경은 사포닌/포름산 이 둘 중 하나의 경우에 노출된 후에 현저하게 변하지는 않았다; 지배적인 변화는 세포 멤브레인 구조의 변경들로 인한, 불투명도이다.
본 발명의 실시예들에 따른 마이크로플루이딕 디바이스를 분화 혈액 계수에 대한 값을 추가로 구하기 위해, 샘플들이 자원자들로부터 취해졌고 상업적인 혈액 분석 도구들 상에서 그리고 본 발명에 따른 마이크로-임피던스 분석기로 측정되었다. 10일의 기간에 걸쳐, 7개의 개별 정맥 혈 샘플들이 상이한 자원자 실험대상들(n = 7)로부터 체혈되었다. 두 용기의 혈액이 채택되었는데, 하나는 실험들을 위해 이용되었고, 제 2 용기는 Horiba-ABX Pentra DX 120 머신 상에서의 독자적 전 혈 계수 분석을 위해 병원(영국, Guildford의 Mount Alvernia)으로 보내졌다. 도 7은 샘플들 중 하나에 대한 산점도를 도시한다. 세 개의 분포들은 최대 확률법을 이용하여 식별되고 2차원 가우시안 확률 프로파일들에 피팅된다. 도면에서의 타원들은 이 분포들을 도시한다. 상대적인 림프구, 단핵구 및 과립구 집단들은 이 확률 분포들로부터 획득되었다.
도 8은 상대적인 WBC 분포들의 Horiba-ABX Pnetra와의 상관을 도시한다. 단핵 세포들이 가장 적은 세포 종들이며, 비율이 5% 내지 20% 사이에 있다. 과립구들(대부분 호중성 백혈구들)은 40% 내지 80%사이의 비율을 가진다. 상대적인 비율들의 범위는 상당한 부분을 커버하지만, 임상 범위의 모두는 아니다. 예를 들어, 과립구들의 정상적인 임상 범위는 20% 내지 90% 사이에 있다. 임피던스 세포 분석기 및 기준 디바이스로부터 획득되는 결과들 사이에 있는 공분산(CV) 인수들이 기호표로 도시된다. 실험의 변경에 대한 측정을 제공하기 위해, 샘플들 중 하나에 대한 실험이 5회 반복되었고, 각각의 회차는 새로운 용해물 및 세정된 칩을 준비하였다. 이 결과는 도 8에서 가위표들로 도시된다. 도면으로부터 본 발명의 실시예들에 따른 임피던스 세포 분석기 및 상업적인 전혈 분석기 사이의 상관은 95%의 영역 내에 있다.
특이적인 마커를 표시하는 혈구들을 식별하고 계수하기 위한, 예를 들어, 인간의 신체 내의 CD4+ T-림프구들을 식별하고 계수하기 위한 본 발명에 따른 분석 방법은:
혈액의 샘플을 획득하는 단계,
특이적인 마커를 표시하는 혈액의 샘플 내의 이 혈구들을 라벨링, 예를 들어 혈액 내의 샘플 내의 CD4+ T-림프구들을 임피던스 라벨들, 예를 들어 전매질 라벨로 라벨링하는 단계,
복수의, 예를 들어 듀얼 주파수 시스템을 이용하여 라벨링된 혈액의 샘플을 측정하여 적어도 특이적인 마커를 표시하는 라벨링된 혈구들을 판별, 예를 들어, 적어도 라벨링된 CD4+ T-림프구들을 판별하는 단계를 포함할 수 있다.
본 발명의 실시예들에 따라, 라벨링된 샘플을 측정하여 적어도 특이적인 마커를 표시하는 라벨링된 혈구들, 예를 들어 라벨링된 CD4+ T-림프구들을 판별하는 단계는
라벨링된 샘플을 단일 세포를 포함하는 액적들로 분리하는 단계,
제 1 주파수에서 단일 세포의 임피던스를 결정하는 단계, 및
제 2 주파수에서 단일 세포의 임피던스를 결정하는 단계로서, 제 1 주파수는 제 2 주파수보다 더 낮은, 결정하는 단계, 및 제 1, 더 낮은 주파수에서의 임피던스를 제 2, 더 높은 주파수 임피던스 대 제 1 더 낮은 주파수 임피던스의 비율인 불투명도에 상관시키는 단계, 및 이 상관으로부터 적어도 특이적인 마커를 표시하는 라벨링된 입자들을 판별, 예를 들어 적어도 CD+4 T-림프구들을 판별하는 단계를 포함한다.
특이적인 마커를 표시하는 세포들을 라벨링, 예를 들어 CD+4 T-림프구들을 라벨링하는 것은 이 세포들을 항체 코팅형 비드들, 예를 들어 CD4+ 항체 코딩 비드들, 예를 들어 Beckman Coulter, Coulter DC4 Cyto-Spheres Reagent로부터 상업적으로 구입 가능한 키트 메뉴얼 CD4 계수 비드들로 라벨링하는 것을 포함한다. 입자, 예를 들어 세포를 라벨링하는 것은 입자들의 크기의 변화로 인하 판별에 도움을 준다. 시스템 내에 비드들을 포함함으로써 잡음이 적게 증가하게 된다. 잡음의 크기는 혈소판(platelet)들이 존재할 때 드러나는 것과 유사하다. 이 잡음 신호는 3 부분 분화 측정들에 있어서, 용이하게 게이트 아웃(gate out)된다.
본 발명의 실시예들에 따른 방법 및 시스템은 손가락을 따거나 선택적으로 자동화될 수 있는 최소 샘플 제작으로부터 아주 조금의 샘플만을 요구한다. 이것은 예를 들어 2분 동안, 항체 코팅형 비드들, 예를 들어 CD4+ 항체 코딩 비드들(예를 들어 Beckman Couter와 같은 제조자로부터 획득되는)를 지니는 전혈의 배양을 포함한다. 특정한 소정의 예에서, CD4+ 항체는 T-림프구들의 서브세트 및 또한 단핵 세포들의 서브세트 이 둘 모두를 라벨링한다. 적혈구 용해 단계, 예를 들어 세철제(detergent)들을 이용하는, 예를 들어, 사포닌/포름 산 또는 증류수 내의 2% 아세트 산을 이용하는 자동적인 적혈구 용해가 실행될 수 있다. 사포닌/포름 산 용해제는 이것이 RBC 잔유물이 존재하도록 하지 않으므로 현저한 잡음을 발생시키지 않는 장점을 가진다.
그러므로 처리된 샘플은 어떤 다른 준비 단계들도 없이, 세포 분석 시스템(10)의 마이크로-플루이딕 디바이스(11) 내에 직접적으로 도입될 수 있다.
상술한 바와 같이, CD4+ 항체는 T-림프구들의 서브셋 및 또한 단핵 세포들 이둘 모두를 라벨링한다. 그러나, HIV의 진단은 CD4+ T-림프구 서브세트만의 정확학 계수를 요구한다. 이것은 CD+4 라별형 T-림프구들 및 CD4+ 라벨형 단핵 세포들이 모든 다른 세포들과 매우 충분히 분리되고 불투명도 대 저 주파수 임피던스 산점도에서 서로 매우 충분히 분리되기 때문에 본 발명의 실시예들에 따라 용이하게 달성된다. 이 방법의 원리가 도 9에 도시된다. 도 9는 CD4+ 집단들이 항체 코팅형 비드들로의 라벨링으로 인해 어떻게 식별되는지를 도시한다. 림프구들 및 단핵 세포들은 임피던스 플롯에서 명확하게 판별된다.
특이적인 항원 마커를 표시하는 혈구들이 전매질 라벨들로 라벨링되는 혈액 샘플들에, 듀얼 주파수 임피던스 스테레오스코피 방법을 적용함으로써, CD4+ T-림프구들 및 CD4+ 단핵 세포들이 동시에 판별되고 계수되는 것이 본 발명의 장점이다.
본 발명의 실시예들에 따르면, 샘플들의 측정들은 듀얼 주파수 시스템을 이용하여 단핵 세포들, 림프구들 및 호중성 백혈구들을 계수하도록 실행된다. 현재의 진단은 별개의 집단으로 용이하게 식별될 수 있는 CD4+ 세포들을 계수함으로써 실행되는데 왜냐마현 이것들은 전매질로 라벨링되기 때문이다. 본 발명의 실시예들에서, 절대 CD4+ 계수는 총 림프구 계수에 대비하여 참조될 수 있다. 대안의, 덜 정확한 실시예들에서, 절대 CD4+ 계수는 대부분 림프구들 및 호중성 백혈구들의 합인 총 백혈구 계수에 대비하여 참조될 수 있다.
본 발명의 실시예들에 따른 디바이스는 단일 세포들의 유전체 특성들을 측정하는 마이크로플루이딕 임피던스 세포 분석기이다.
본 발명의 실시예들에 따른 듀얼 주파수 측정들은 멤브레인 캐패시턴스 및 크기 이 둘 모두에 따른 세포들의 분별을 인에이블한다. 사포닌/포름 산을 이용하는 전혈의 화학적 사전 처리는 세포 잔해(파열 적혈구(erythrocyte ghost)를 포함하는)로 인한 오염으로부터 벗어난 깨끗한 백혈구 샘플을 제공하는 샘플로부터 적혈구 집단을 제거하는데 이용될 수 있다. 사전 처리는 또한 단핵 세포들 및 호중성 백혈구들의 전기적 특성들을 변경시킴으로써, 판별을 개선한다. 림프구, 단핵구, 및 호중구 집단들은 듀얼 주파수 임피던스 데이터를 이용하여 모두 명확하게 식별될 수 있다. 자원자의 혈액은 마이크로-세포 분석기 및 병원 혈액 분석기 상에서 축정되어 우수한 상관을 나타내었다.
본 발명의 실시예에 따른 마이크로플루이딕 임피던스 세포 분석의 로버스트(robust)한 특성 및 간소화는 무 형광 라벨 기술들을 이용하는 입수 가능 현장 진료(PoC) 진단 시스템을 포함하는, 세포 분석에서의 잠재적인 응용예들을 제공한다. 시스템의 간소화를 통해 이루어지는 절약들 및 시약 비용들의 감소(예를 들어 형광 프로브들 등에 대한 요구가 없다)는 상기 시스템이 개발 도상국과 같은 자원 빈약 환경들에서 적용 가능하게 한다. 더욱이, 세포들의 유전체 특성들이 소량의 약제로의 노출 및 박테리아 및 바이러스 산물들로부터 발생하는 다양한 미토겐(mitogen)들로부터 발생하는 자극에 민감할 수 있으므로, 상기 기술은 세포 주기 분석 및 유독성/생존성 분석들에서의 응용예들을 발견할 수 있다.
시스템은 또한 전매질 태그(tag)들의 개발을 통해 더욱 정밀화되어 유사한 임피던스 특성들을 지니는 세포들이 구분(예를 들어 HIV 진단들에 대한 CD4+ 계수들)되는 것이 인에이블될 수 있다. 다중-컬러 형광과 동일한 것을 행하는 것이 가능하다. 즉, 다수의 CD 마커들을 구비하는 멀티플렉싱된 분석은 각각 상이한 전매질 시그니처(dielectric signature)를 구비하는 비드들의 집단들을 이용하여 검출된다(이것들은 상이한 재료들의 상이한 크기이다).
도 10 및 도 11은 실험으로부터의 데이터의 예들을 도시한다. 건강한 기증자로부터의 인간의 혈액은 상술한 바와 같이 처리되었고 본 발명의 실시예들에 따른 임피던스 세포 측정을 이용하여 측정되었다. 도 10은 혈액 샘플의 라벨링 전에 림프구들 및 과립구들의 듀얼 주파수 임피던스 측정의 결과를 도시한다. 도 11은 본 발명의 실시예들에 따라 CD4+ 항체 코팅형 비드들로 라벨링된 후의 혈액의 듀월 임피던스 측정의 결과를 도시한다. 라벨링된 단핵 세포들 및 T-림프구들 모두가 분별되어, 계수가 용이하게 행해지고 따라서 진단이 용이하게 행해지는 것이 인에이블된다.
진단 및 치료의 관리를 위해 상기 방법이 이용될 수 있다. 항체들에 대한 절대 값들 또는 비들(예를 들어 CD4+/CD8+)이 결정될 수 있다. CD4+ 집단들 대 CD+8 집단들의 비는 양 집단들에 대해 상이한 태그들, 예를 들어 하나는 절연되고, 다른 하나는 전도성인 태그들, 또는 세포들의 상이한 하부-집단들의 식별이 가능한 상이한 크기들을 가지는 태그들을 이용함으로써 결정될 수 있다.
AIDS를 겪고 있는 환자들의 경우 CD+4 T-계수는
- 200/㎕ 미만 : 주폐포자충 폐렴(pneumocystis pneumonia: PCP).
- 100/㎕ 미만 : 톡수플라즈마증(toxoplasmosis) 및 크립토코쿠스 수막염(cryptococcal meningitis).
- 75/㎕ 미만: 조형 결핵군 복합체(mycobacterium avium complex : MAC)
와 같은 추가 정보를 제공하다.
실험 결과들 1:
신선한 인간의 혈액 50㎕가 CD4 및 CD14에 대한 형광 항체들로 라벨링되었다. 이것은 이 표면 항원들을 표시하는 세포 하부-집단들의 식별을 가능하게 한다. CD14는 단핵 세포들 상에 존재하고 CD4는 T-세포들(유도 T-세포들)의 하부-집단의 표면에 그리고 또한 저 레벨들에서 단핵 세포들 상에 존재한다.
세포들은 또한 CD4 코팅형 비드들로 라벨링되었다. 형광 항체 라벨링 및 비드 접합 이 둘 모두는 적혈구 용해 이전에(급냉에 앞서 사포닌/포르 산에 6초) 실행되었다. 그 후에 동일한 샘플들은 당업계에 공지되어 있는 FACS(Fluorescence-activated cell sorter) 및 본 발명의 실시예들에 따른 IS(impedance spectroscopy) 이 둘 모두에 의해 분석되었다.
도 12는 용해된 전혈의 샘플로부터의 FACS 데이터를 도시한다. 도 12a는 CD4 비드들로 라벨링되지 않았던 혈액의 산점도이고 도 12b는 CD4 비드들에 의해 배양되었던 동일한 혈액의 샘플들을 도시한다. (SSC는 모든 집단들의 용이한 시각화가 가능하도록 로그(log) 규모로 플로팅된다).
이 도면들에 의해 도시되는 바와 같이, CD4+ T-세포들은 CD4 비드들(?2.2 um 직경)와 복합체를 이룰 때 개별 집단(도 12b에서 아웃라인됨)을 형성하고, SSC 신호는 과립구들로부터의 신호를 초과하여 증가한다.
도 13은 형광 항체들로 라벨링되고 CD4 비드들로 배양되는, 이 둘 모두가 행해졌던 용해된 전혈의 샘플로부터의 FACS 데이터를 도시한다. CD4+ 세포들 및 CD14+ 세포들은 자체의 형광 신호들(도 13b에서 각각 영역(P1 및 P2))로부터 기초하여 명확하게 식별될 수 있다. 이 형광 집단들을 게이팅온(gating on)하고 FSC 대 SSC를 플롯팅함으로써 CD4 비드들이 부착되어 있는 세포들의 식별이 가능하다 도 13a.
비드들과 복합체를 이루었던 세포들의 수는 집단들의 형광 및 산란 특성들에 기초하여 FACS 데이터로부터 열거될 수 있다. 부착된 비드들을 구비하는 CD4+ T-세포 집단은 비드가 없는 림프구 집단(CD4-T-세포들, B-세포들, NK 등)과는 별개이다. 단핵구 상의 저 레벨의 CD4 표시는 적은 퍼센티지의 단핵 세포들만이 CD4 비드들과 결합하는 것을 의미한다(Beckman Coulter 매뉴얼 CD4 Count Kit data sheet를 참조하라). 두 집단들; (i) "단핵 세포들(비드들 없음)"로 표시되는, 매우 낮은 레벨들에서 CD+4를 표시하는 비드들이 없는 세포들, 및 (ii) 더 높은 SSC을 야기하지만, T-세포와 동일한 레벨에 있지 않은 비드들과 복합체를 이루는 세포들을 형성한다. 이것은 대개 T-세포들에 비해 더 적은 수의 비드들이 단핵 세포들(항원 표시의 레벨을 나타내는)에 부착되기 때문이다- 도 13a를 참고하라.
도 14는 본 발명의 실시예들에 따른 투명도(10MHz/0.5MHz) 대 크기(0.5MHz)로서 플로팅된 IS 데이터를 도시한다. 산점도 상에는 상이한 집단들이 도시된다. CD4 비드들과 복합체를 이루는 세포들은 투명도 및 크기 이 둘이 증가하고 별개의 집단(원으로 그려짐)을 형성한다.
FACS는 세포들이 비드들과 복합체를 이룰 때 FSC의 작은 변화를 도시한다(도 13a).
표 2은 FACS 및 IS를 비교하는, 상이한 하부-집단들에 대한 이 데이터를 도시한다. FACS 및 IS 이 둘 모두에서의 총 계수들이 상이할지라도, 세포들의 비들을 비교하는 것이 가능하다. 총 게이팅된 세포 계수들은 괄호들 내에 도시된다. 이것은 혈액의 하나의 샘플에 대한 표본적인 데이터 세트이다. 유사한 데이터는 세 개의 추가 경우들(상이한 혈액 샘플들)에서 FACS에 대해 획득되었다.
세포 유형 FACS(전체 중의 %) IS(전체 중의 %)
CD4 비드들을 가지는 T-세포들 18.0(11243/62312) 15.6(1215/7789)
림프구들(비드들 없음) 12.7(7914/62312) 12.9(1005/7789)
CD4 비드들을 가지는 단핵 세포들 0.6(328/62312) 0.8(66/7789)
단핵 세포들(비드들 없음) 4.3(2695/62312) 5.4(2695/7789)
과립구들 64.4(40132/62312) 65.4(5095/7789)
CD4+ T-세포 계수는 HIV를 진단하는데 중요한 파라미터이다; FACS 및 IS의 비교는 퍼센티지 계수가 유사하다는 것을 도시한다. 게이팅 파라미터들을 포함하여, 많은 원인들로 인해 둘 사이의 에러가 작을수록, 샘플 크기가 더 작아지거나, 침전으로 인해 IS 시스템 내의 비드-복합체 세포들의 손실이 더 작아진다. 이 실험은 양 기술들이 이 방법론을 이용하여 비교 결과들을 산출하는 것을 나타낸다.
상기 실험의 목적은 본 발명의 실시예들에 따른 임피던스 분광법을 이용하여 측정되는 CD4+ T-림프구들 및 CD4+ 단핵 세포들의 수가 상업적인 FACS에 의해 측정되는 CD4+ 세포들의 수와 유사함을 보여주는 것이다.
실험 결과들 2:
세포 준비
혈액 샘플들은 고지에 입각하여 동의한 건강한 기증자들로부터 획득되었다. 혈액(5ml)은 VacutainerTM 튜브들(EDTA K3E 15%, 0.12ml, Becton Dickinson) 내에 모았다. 모인 이후에 혈액 투뷰들은 롤러 상에 배치되었고 실온에서 계속해서 혼합되었다; 모든 후속 프로세싱 및 실험 작업은 12 시간 내에 실시되었다.
정화된 백혈구 하부-집단들
혈액은 밀도 구배(density gradient) 분리 및 자기적 활성 세포 분류(magnetically activatd cell sorting: MACS, 영국 Bisley, Milternyi Biotech)를 이용하여 처리되었다. 항 혈액 응고된 전혈(5ml)은 5ml의 PolymorphoprepTM(스위스, Zurich, Nycomed)에 대해 주의깊게 층화되었고 실온에서 30분 동안 약 450xg으로 원심 분리되었다. 원심 분리 이후에, 단핵 세포 분획(주로 단핵 세포들 및 림프구들) 및 다형핵 백혈구(polymorphonuclear) 분획(과립구들)을 상기 구배에서 개별 무리들로 나타나서 개별 튜브들 내로 모았다. 세포 분획들은 신선한 PBS(0.5% BSA 및 2mM EDTA를 함유하는) 내에서 번갈아 재 현탁하고 잔여 PolymorphoprepTM, 오염 혈장 및 혈소판들을 제거하도록 원심력에 의해(실온에서 400 x g에서 10 min) 펠릿팅(pelleting)됨으로써 세번 세정되었다.
T-림프구들(CD3+ 세포들), 단핵 세포들(CD14+ 세포들) 및 호중성 백혈구들(CD16+ 세포들)의 정화된 집단들은 자기 활성 세포 분류(MACS)를 이용하여 준비되었다. 단핵 세포 샘플은 두 부분들로 분리되었는데, 한 샘플은 항-CD3 MACS 비드들로 배양되고 다른 샘플은 항-CD14 MACS 비드들로 배양된다. 다형핵 백혈구 세포는 항-CD16 MACS 비드들로 배양되었다. 모든 배양 및 세정 단계들은 제조자의 가이드라인들에 따라 수행되었다. 그 후에 개별의 자기 태그된 세포 샘플들은 AutoMACSTM 분리 시스템(Miltenyi Biotec)을 이용하여 분획되었고 양의 세포 분획이 수집되었다.
집단들의 정화도를 평가하기 위해, 샘플들은 형광으로 결합된 항체들로 라벨링되있다: 항-CD3-FIFC, 항-CD14-APC(모두 Miltenyi Biotec, 영국, Bisley), 및 항-CD16-Alexa700(캘리포니아, San diego, BioLegend). 세포들은 30분 동안 배양되었고, 그 후에 상기와 같이 세정되었다. 모든 경우들에서 매칭된 동일 기준 제어들이 제어들로써 포함되었다. 세포 샘플들은 FACSAria(Becton Dickinson) 상에서 분석되었다.
본 발명의 실시예에 따른 마이크로-세포 분석기 상에서의 분석 이전에, 세포들은 PBS(2mM EDTA 및 0.5% BSA를 함유하는)에서 ml 당 1 x 106 세포들의 최종 밀로도 현탁되었다. 정화된 세포 집단들은 개별적으로 분석되었고 또한 세 세포 유형들의 혼합체들로 분석되었다. 현탁하는 배지는 1.6 Sm-1의 도전율, pH = 7.4 및 삼투질 농도(osmolality) = 290mOs인 등삼투압이었다.
전혈 분석(사포닌/포름 산을 이용하는 적혈구 용해)
전혈은 상술한 바와 같이 항 응고제 내로 모였다. 50㎕의 신선한 전혈은 4℃에 있는 어두운 곳에 15분 동안 CD14(FITC) 및 CD16(Alexa700)에 대하여 지향되는 형광으로 결합된 단세포 항체들로 배양되었다. 600㎕의 적혈구 용액(0.12% v/v 포름 산, 0.05% w/v 사포닌)을 라벨링된 전혈에 추가하여 실행되었다. 샘플은 혈액 및 용해제의 혼합을 강화하도록 연속 교반(agitation)하면서 실온에서 6초 동안 배양되었다. 이 용해 반응은 265㎕의 급냉 용액(0.6% w/v 탄산 나트륨, 3% w/v 염화 나트륨(sodium chloride))을 추가해서 중단되었다. 그리고나서 샘플들은 FACSAria 및 마이크로플루이딕 임피던스 세포 측정기 이 둘 모두를 이용하여 추가 프로세싱 없이 분석되었다.
일치
샘플은 급냉제로의 희석(1: 1.4) 전에 6초 동안 용해액(상술한 바와 같은)으로 1: 13으로 희석되었다. 최종 희석비(전혈에 대한)는 1: 18이었다. 대략 25μL의 용액이 본 발명의 실시예들에 따라 임피던스 세포 측정기 칩을 통해 펌핑되었고 데이터는 500 kHz 및 1.7 MHz에서 동시에 측정되었다.
마이크로칩
칩들은 포토리소그래피(photolithography), 및 전 웨이퍼 열적 결합을 이용하여 제조되었다. 칩과의 전기 및 플루이딕 상호 연결들은 PEEK 고분자로부터 머시닝(machining)된 연결 블록을 이용하여 행해졌다. 플루이딕 및 전기 연결들은 블록들 내에서 칩을 클램핑(clamping)함으로써 행해졌다. 스프링 부하 전기 연결기들은 칩 전극들과의 연결을 행하는데 이용되었고 미니어처 O-링은 블록 및 칩 사이의 플루이딕 연결을 밀봉하는데 이용되었다. 연결기 블록은 전방 종단 임피던스 검출 회로소자를 가지는 PCB 상에 실장되었다. 전체 어셈블리는 맞춤식 마이크로스코프(microscope) 위에 있는 정확한 광학 벤치(optical bench) 상의 x-y-z 스테이지 상에 실장되어, 마이크로플루이딕 채널 내에서의 칩의 정렬 및 광 검출 영역 및 레이저 스팟의 정확한 위치 지정을 가능하게 한다.
칩들은 2% BSA 및 2mM DETA을 함유하는 BAS를 30분 동안 디바이스를 통해 흐르게 함으로써 준비되었다. 이것은 채널을 코팅하고 벽들을 단백질로 튜빙(tubing)하여 세포 접착을 감소시킨다. 세포 현탁액의 샘플들은 칩의 주입부에 있는 저장소 내에 피펫(pipet)되었고 주사기 펌프를 이용하여 일정한 속도로 디바이스를 통해 흡입된다. 분당 5㎕의 체적 흐름률(flow rate)는 모든 실험 작업에 대해 이용되었다. 실험들 중에, 모든 실험은 10% 하이포아 염소산 나트륨 및 4M 수산화 나트륨으로 세정되었다.
임피던스 검출
고정된 주파수들(하나는 503 kHZ로 제 2 주파수는 2.5Vpp에서 0.5 내지 30 MHz로 가변되었다)에서의 두 정현 전압들이 검출 전극들의 양 쌍들에 인가되었다(또한 도 1을 참조하라). 차동 전류는 주문형 일렉트로닉스 및 하나각 각각 주파수에 대응하는 락-인(lock-in) 증폭기들(SR844, 미국 Stanford Research Instruments)들을 이용하여 측정되었다. 락-인으로부터의 출력은 각각의 특정한 주파수에서의 전기 임피던스의 실수 성분(동상) 및 허수 성분(위상이 90°벗어난)으로 구성된다. 출력들은 광 증배기 시호들과 함께, 120 kHz에서 16-비트 A-D 카드(NI6034E, National Instruments)로 샘플링되었고, 데이터는 LabVIEWTM(미국, National Instruments)으로 캡처되고 분석되었다. 저 주파수 동상 임피던스 신호는 데이터의 획득을 트리거하는데 이용되었다. 데이터는 MATLAB(미국, Natick, Mathworks Inc.)에서 후속 분석을 위해 프로세싱되고 플롯팅되었다.
광학 시스템
비교를 위해, 광 측정이 전기 측정을 실행하는 것과 동시에 수행되었다. 488nm(50mW 고체) 및 633nm(20mW HeNe) 레이저로부터의 광은 색 선별 거울(dichroic mirror)(미국, VT, Rockingham, Chroma Technologies)을 이용하여 결합되었다. 빔은 한 쌍의 렌즈들을 이용하여 확장되었고 무한 보정 대물 렌즈(x20, NA = 0.7, Nikon)의 후면으로 통과되었다. 대물의 초점면에 형성되는 스팟은 채널의 중심에 걸쳐 위치되었다. 형광 광은 동일한 대물 렌즈를 통해 모였다. 색 선별 거울 및 대역 통고 필터들(미국, VT, Rockingham, Chroma Technologies)는 렌즈들 및 핀홀(pinhole)들(100㎛, Thorlabs)이 광 증배기 튜브들(H7710-13, Hamamatsu)의 전방에 위치되기 전에 광을 공간적으로 필터링하였다. 전원 공급원(C7169, Hamamatsu)은 PMT들 상의 이득을 조정하는데 이용되었고, 신호들은 조절되어 Hamamatsu 증폭기들(C7319, Hamamatsu)로 증폭되었다. 세 방사 파장들은 동시에, 515nm, 675nm 및 >715nm로 측정되었다.
플로우 세포 분석
세포들에 대한 종래의 플로우 세포 분석은 두 레이저들이 설치된 FACSAria(Becton Dickinson)으로 실시되었다: 488nm 고체(20mW, SapphireTM Coherent？) 및 633 nm HeNe(20mW, JDS UniphaseTM). FACSFlow 외피 유체(sheath fluid)(Becton Dickinson)가 이용되었고 샘플들 플로우는 70㎛ 노들을 통해 70psi의 압력 상태에 있었다. 이 기구는 PC에서 작동하는 FACSDiVaTM 소프트웨어(Becton Dickinson)에 의해 제어되었다.
본 발명이 도면들 및 상기 설명에서 상세하게 설명되고 기술되었을지라도, 그러한 설명 및 기술은 설명 또는 예시적인 것으로 고려되어야지 제한하는 것으로 고려되어서는 안 된다. 본 발명은 개시된 실시예들로 제한되지 않는다.
예를 들어, 본 발멸은 CD3, CD4, CD8, CD14, CD16, DC19, DC21, DC45 또는 임의의 다른 세포면 수용체들, 활성 마커와 같이, 세포 집단들이 검출될 수 있는 환경에서 동작하는 것이 가능하다. 세포들은 인간 및/또는포유류일 수 있다. 본 발명의 실시예들은 또한 비-포유류 세포들, 예를 들어 박테리아 및 효모 세포들에 적용될 수 있다.
다른 예들은 폐혈증 검출에 대한 호중성 백혈구들 상의 DC64, 또는 혈택 내의 종양 세포들을 퍼트리는 검출에 대한 EpCam 또는 줄기 세포들에 대한 CD34이다.
개시된 실시예들에 대한 다른 변형예들은 도면들, 명세서들 및 청구ㅎ아들의 연구로부터, 청구된 발명을 실시하는데 있어서 당업자에 의해 이해되고 달성될 수 있다. 청구항들에서, 단어 "comprising"은 다른 요소들 또는 단계들을 배제하지 않고 부정관사 "a" 또는 "an"은 복수를 배제하지 않는다. 단일 프로세서 또는 다른 유닛은 청구항들에 인용되는 여러 아이템들의 기능들을 완수할 수 있다. 특정 조치들이 상호 상이한 종속 청구항들에서 인용되는 단순한 사실이 이 조치들의 결합이 유용하게 이용될 수 없다는 것을 나타내지 않는다. 컴퓨터 프로그램은 광학 저장 매체 또는 다른 하드웨어와 함께, 또는 일부로서 공급되는 고체 매체와 같은 적절한 매체 상에 저장/분배될 수 있으나, 다른 형태들, 예를 들어 인터넷 또는 다른 유선 또는 무선 전기통신 시스템들을 통해 분배될 수 있다. 청구항들 내의 임의의 참조 부호들은 범위를 제한하는 것으로 해석되어서는 안 된다.
상술한 설명은 본 발명의 특정한 실시예들을 설명한다. 그러나, 텍스트에서 상기 내용이 아무리 자세한 것으로 보일지라도, 본 발명은 많은 방식들로 실행될 수 있고, 따라서 개시된 실시예들로 제한되지 않는다. 본 발명의 특정한 특징들 및 양태들을 기술할 때 특정한 용어를 사용하는 것이 상기 용어가 연관되는 본 발명의 특징들 또는 양상들의 임의의 특정한 특성들을 한정하도록 본원에서 재규정되고 있음을 의미하는 것으로 해석되어서는 안 되는 것이 주목되어야 한다.
10 : 단일 세포 분석 시스템 11 : 마이크로플루이딕 디바이스
14, 16 : 마이크로-전극

Claims (13)

  1. 특이적인 마커(marker)들을 표현하는 입자들을 식별하고 계수하기 위한 분석 방법에 있어서:
    입자들을 포함하는 샘플을 획득하는 단계,
    상기 특이적인 마커를 표시하는 입자들을 임피던스 라벨(impedance label)로 라벨링(labeling)하는 단계, 및
    적어도 상기 특이적인 마커를 표시하는 라벨링된 입자들을 판별하기 위해 복수의 주파수 시스템을 이용하여 상기 라벨링된 샘플을 측정하는 단계를 포함하는, 특이적인 마커들을 표현하는 입자들을 식별하고 계수하기 위한 분석 방법.
  2. 제 1 항에 있어서,
    상기 특이적인 마커를 표시하는 입자들을 라벨링하는 단계는 마이크로플루이딕 시스템(microfluidic system) 내에서 수행되는, 특이적인 마커들을 표현하는 입자들을 식별하고 계수하기 위한 분석 방법.
  3. 제 1 항에 있어서,
    상기 적어도 특이적인 마커를 표시하는 라벨링된 입자들을 판별하기 위해 상기 라벨링된 샘플을 측정하는 단계는:
    상기 라벨링된 샘플을 단일 입자를 포함하는 액적(droplet)들로 분리하는 단계,
    적어도 제 1 주파수 및 제 2 주파수에서, 단일 입자의 임피던스를 결정하는 단계로서, 상기 제 1 주파수는 제 2 주파수보다 더 낮은, 상기 결정 단계;
    상기 제 1 주파수에서의 임피던스를 불투명도(opacity)에 상관시키는 단계로서, 상기 불투명도는 제 2 주파수 임피던스 대 제 1 주파수 임피던스의 비인, 상기 상관 단계, 및
    이러한 상관으로부터 상기 적어도 특이적인 마커를 표시하는 상기 라벨링된 입자들을 판별하는 단계를 포함하는, 특이적인 마커들을 표현하는 입자들을 식별하고 계수하기 위한 분석 방법.
  4. 제 1 항에 있어서,
    샘플을 라벨링하는 것은 상기 특이적인 마커에 대한 항체로 코팅(coating)된 비드들을 구비한 샘플의 배양을 포함하는, 특이적인 마커들을 표현하는 입자들을 식별하고 계수하기 위한 분석 방법.
  5. 제 1 항에 있어서,
    상기 라벨링된 샘플을 측정하는 단계 전에, 용해 단계를 수행하는 단계를 추가로 포함하는, 특이적인 마커들을 표현하는 입자들을 식별하고 계수하기 위한 분석 방법.
  6. 제 5 항에 있어서,
    상기 샘플이 혈액 샘플이고, 상기 용해 단계를 수행하는 단계는 유기산(organic acid) 내의 사포닌(saponins)에 상기 혈액 샘플을 노출시키는 단계를 포함하는 적혈구 용해 단계를 수행하는, 특이적인 마커들을 표현하는 입자들을 식별하고 계수하기 위한 분석 방법.
  7. 제 1 항에 있어서,
    상기 라벨링된 샘플을 측정하는 단계는 샘플 플로우(sample flow)에서 수행되는, 특이적인 마커들을 표현하는 입자들을 식별하고 계수하기 위한 분석 방법.
  8. 제 1 항에 있어서,
    CD4+ T-림프구들을 식별하고 계수하기 위한, 청구항 제 1 항에 따른 방법의 이용.
  9. 특이적인 마커를 표시하는 입자들을 식별하고 계수하기 위한 디바이스에 있어서:
    상기 특이적인 마커를 표시하는 라벨링된 입자들을 포함하는 샘플 플로우를 포함하기 위한 마이크로-채널,
    적어도 한 쌍의 전극들,
    적어도 제 1 주파수에서의 제 1 AC 신호 및 제 2 주파수에서의 제 2 AC 신호를 상기 적어도 한 쌍의 전극들에 인가하기 위한 전자 회로소자로서, 상기 제 1 주파수는 상기 제 2 주파수보다 낮은, 상기 전자 회로소자, 및
    상기 전극들의 쌍 사이에 존재하는 입자의 임피던스를 결정하기 위한 계산 유닛을 포함하고,
    상기 계산 유닛은 적어도 상기 제 1 주파수에서 및 상기 제 2 주파수에서의 상기 입자의 임피던스를 결정하고, 제 2 주파수 임피던스 대 제 1 주파수 임피던스의 비로 규정되는 불투명도에 상기 제 1 주파수에서의 임피던스를 상관시키고, 이러한 상관으로부터 상기 적어도 특이적인 마커를 표시하는 라벨링된 입자들을 판별하도록 적응되는, 특이적인 마커를 표시하는 입자들을 식별하고 계수하기 위한 디바이스.
  10. 제 9 항에 있어서,
    기준 전극들로 기능하도록 적응되는 제 2 쌍의 전극들을 추가로 포함하는, 특이적인 마커를 표시하는 입자들을 식별하고 계수하기 위한 디바이스.
  11. 제 10 항에 있어서,
    상기 쌍의 전극들 중 하나 사이에 존재하는 입자에 대한 감별 측정(differential measurement)을 행하도록 적응되는 증폭기 회로를 추가로 포함하는, 특이적인 마커를 표시하는 입자들을 식별하고 계수하기 위한 디바이스.
  12. 제 9 항에 있어서,
    상기 마이크로-채널은 현탁액 내의 입자들의 플로우를 수용하고 특이적인 마커를 표시하는 상기 입자들을 상기 현탁액 내의 상기 입자들의 플로우 내에서 식별하고 계수하기 위하여 적어도 하나의 전극들의 쌍 사이에 있는 현탁액 내의 입자들의 플로우를 지향시키도록 적응되는, 특이적인 마커를 표시하는 입자들을 식별하고 계수하기 위한 디바이스.
  13. 제 1 항에 있어서,
    샘플들의 임피던스 라벨링이 마이크로플루이딕 디바이스 상에서 실행되는, 특이적인 마커들을 표현하는 입자들을 식별하고 계수하기 위한 분석 방법.
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