ES2856691T3 - Procesador molecular universal para la medicina de precisión - Google Patents

Abstract

Un dispositivo que comprende: un procesador biomolecular, comprendiendo cada procesador biomolecular: una cámara de biorreactor definida por un sustrato sólido; una pluralidad de estructuras de soporte espaciadas dentro de dicha cámara de biorreactor y fijadas al sustrato sólido; una o más moléculas de captura inmovilizadas en algunas de dicha pluralidad de estructuras de soporte espaciadas o en todas ellas, dichas una o más moléculas de captura adaptadas para unirse a una porción de una molécula de ácido nucleico objetivo en una muestra; uno o más nanotubos definidos por el sustrato sólido y acoplados de forma fluida a la cámara de biorreactor, teniendo cada uno de dichos uno o más nanotubos un paso que se extiende entre un extremo de entrada próximo a dicha cámara de biorreactor y un extremo de salida distal a dicha cámara de biorreactor y comprendiendo uno o más nanoporos dentro del paso, en donde un nanoporo es un pequeño agujero dentro del nanotubo que tiene un diámetro que es más pequeño que el diámetro del paso que se extiende a través del nanotubo a cada lado del nanoporo, de modo que el diámetro del paso de los uno o más nanotubos se reduzca en cada nanoporo; y una o más unidades definidas por el sustrato sólido y aguas arriba de dicho procesador biomolecular y uno o más nanotubos, estando configuradas dichas una o más unidades para transportar una preparación de muestra, en donde las una o más unidades se seleccionan de entre una unidad de tipo separador de células, una unidad de tipo aislamiento de plasma de extensión longitudinal, una unidad de tipo extractor, una unidad de tipo sensor, uno o más módulos de reactor y un módulo de purificación de flujo.

Description

DESCRIPCIÓN

Procesador molecular universal para la medicina de precisión

La presente solicitud reivindica el beneficio de la solicitud de patente provisional estadounidense con número de serie 62/137.028, presentada el 23 de marzo de 2015.

La presente invención se realizó con el apoyo del gobierno bajo NIH R21HG006278. El gobierno posee ciertos derechos sobre esta invención.

Campo de la invención

La presente invención se refiere a dispositivos y métodos adecuados para la detección y enumeración de secuencias de ácidos nucleicos.

Antecedentes de la invención

La asistencia sanitaria está evolucionando de diagnósticos "basados en síntomas" a diagnósticos in vitro (DIV) "basados en moléculas". Aunque los DIV representan <1 % del mercado anual de asistencia sanitaria en EE. UU., el 70 % de todas las decisiones clínicas se basan en los resultados de estas pruebas. Su importancia y complejidad están creciendo con los esfuerzos de la medicina cada vez más sofisticados y personalizados.

Los diagnósticos moleculares son un gran contribuyente al mercado mundial de DIV que actualmente representa el 11 % del mercado. Por desgracia, la mayoría de estas pruebas son caras, implican tiempos de respuesta lentos de laboratorios centralizados y requieren equipos altamente especializados con técnicos experimentados para llevar a cabo el ensayo. Por lo tanto, existe una necesidad de plataformas moleculares y ensayos optimizados para facilitar una supervisión más oportuna y frecuente de la salud del paciente para ayudar a realizar Medicina personalizada o de precisión. Los nuevos paradigmas de ensayos no solo desplazarán gradualmente los servicios de laboratorio centralizados a medida que uno se traslada a los ensayos en el punto de atención, sino que los nuevos sistemas ampliarán enormemente la demanda total del mercado de diagnósticos moleculares.

El documento WO2014124365 se refiere a un dispositivo que comprende un procesador biomolecular, en donde cada procesador biomolecular comprende uno o más canales de tiempo de vuelo formados en un sustrato sólido y acoplados de forma fluida a una o más cámaras de biorreactor.

El documento US2012010052 se refiere a microdispositivos para aislar y enumerar eficazmente, con precisión y rapidez las células raras, como las células tumorales circulantes, de líquidos como sangre entera.

El documento WO2012170560 se refiere a un dispositivo de microfluidos para extraer y aislar ADN de células.

El documento US8975095 se refiere a una técnica para el reconocimiento de bases en un dispositivo integrado. La publicación de M Langecker et al "Electrophoretic Time-of-Flight measurements of single DNA molecules with two stacked nanopores" (Nano letters, volumen 11, no 11) se refiere al transporte electroforético a través de un nanodispositivo de estado sólido compuesto por dos sensores de nanoporos apilados para determinar la movilidad en solución libre de las moléculas de ADN en función de su "tiempo de vuelo" entre los dos poros.

La presente invención pretende superar estas y otras deficiencias de la técnica.

Sumario de la divulgación

Un aspecto de la presente divulgación hace referencia a un dispositivo que comprende un procesador biomolecular y uno o más nanotubos. Cada procesador biomolecular comprende una cámara de biorreactor definida por un sustrato sólido, una pluralidad de estructuras de soporte espaciadas dentro de dicha cámara de biorreactor y fijadas al sustrato sólido y una o más moléculas de captura inmovilizadas en algunas o todas de dicha pluralidad de estructuras de soporte espaciadas, dichas una o más moléculas de captura adecuadas para unirse a una porción de una molécula de ácido nucleico objetivo en una muestra. Los uno o más nanotubos del dispositivo están definidos por el sustrato sólido y acoplados de forma fluida a la cámara de biorreactor. Cada uno de los uno o más nanotubos tiene un paso que se extiende entre un extremo de entrada próximo a la cámara de biorreactor y un extremo de salida distal a la cámara de biorreactor, y comprende uno o más nanoporos dentro del paso, teniendo cada nanoporo un diámetro reducido con respecto al paso.

Otro aspecto de la presente divulgación hace referencia a un dispositivo que comprende una unidad de tipo aislamiento de plasma de extensión longitudinal definida por el sustrato sólido y que comprende: un paso de entrada; un paso de descarga más ancho y menos profundo que el paso de entrada; un paso de transición que conecta el paso de entrada y el paso de descarga, haciéndose dicho paso de transición más ancho y menos profundo a medida que los pasos de transición progresan desde el paso de entrada hasta el paso de descarga; canales laterales principales que se extienden lateralmente en sentido opuesto al de entrada, en donde un separador, colocado entre el paso de entrada y cada canal lateral principal, está dimensionado para permitir que el plasma, pero no las células, pase del paso de entrada a los canales laterales principales; y canales laterales secundarios que se extienden lateralmente en sentido opuesto al de descarga, en donde un separador, colocado entre el paso de descarga y cada canal lateral secundario, está dimensionado para permitir que el plasma, pero no las células, pase del paso de entrada a los canales laterales secundarios.

Otro aspecto de la presente divulgación hace referencia a un dispositivo que comprende una unidad de tipo extractor definida por un sustrato sólido y que comprende una entrada, una salida, una pluralidad de cámaras separadas, extendiéndose cada una de las cuales entre la entrada y dicha salida y compartiéndolas. El dispositivo también comprende una pluralidad de pilares sólidos en cada una de las cámaras, en donde los pilares tienen pasos entre medias, y están provistos de un material adecuado para inmovilizar células, ácidos nucleicos o exosomas de una muestra.

Otro aspecto de la presente divulgación hace referencia a un dispositivo que comprende una unidad de tipo sensor definida por un sustrato sólido y que comprende: una entrada; una salida; y un contador de células posicionado para contar las células que pasan desde la entrada a la salida de dicha unidad de tipo sensor.

Otro aspecto de la presente divulgación hace referencia a un método para identificar, en una muestra, una o más secuencias de nucleótidos objetivo que difieren de otras secuencias de nucleótidos en la muestra en uno o más nucleótidos, uno o más números de copia, una o más secuencias de transcripción y/o uno o más residuos metilados. Este método implica proporcionar una muestra que contiene una o más moléculas de ácido nucleico objetivo que contienen la secuencia de nucleótidos objetivo o complementos de la misma y proporcionar un soporte sólido que comprende una o más moléculas de captura inmovilizadas, dichas moléculas de captura adecuadas para unirse a una porción de una o más moléculas de ácido nucleico objetivo. El método implica, además, unir las una o más moléculas de ácido nucleico objetivo a las una o más moléculas de captura inmovilizadas en el soporte sólido inmovilizando así las una o más moléculas de ácido nucleico objetivo en dicho soporte sólido, y sometiendo a las moléculas de ácido nucleico objetivo inmovilizadas o productos de extensión inmovilizados que son complementarios a dicha molécula de ácido nucleico objetivo a una reacción de detección de ligasa para producir productos de ligadura hibridados con dichas moléculas de ácido nucleico objetivo inmovilizadas o productos de extensión inmovilizados de las mismas. Los productos de ligadura se desnaturalizan a partir de las moléculas de ácido nucleico objetivo inmovilizadas o sus productos de extensión inmovilizados para liberar los productos de ligadura del soporte sólido y los productos de ligadura desnaturalizados se introducen a través de uno o más nanoporos capaces de detectar dichos productos de ligadura. El método, además, implica detectar, como resultado de dicha introducción, una firma de identificación de cada producto de ligadura que se genera cuando cada producto pasa a través de uno o más nanoporos, e identificar, en función de dicha detección, la presencia de una o más secuencias de nucleótidos objetivo que difieren de otras secuencias de nucleótidos en la muestra en uno o más nucleótidos, uno o más números de copia, una o más secuencias de transcripción y/o uno o más residuos metilados.

Otro aspecto de la presente divulgación hace referencia a un método para identificar, en una muestra, uno o más nucleótidos en una secuencia de nucleótidos objetivo. Este método implica proporcionar una muestra que contiene una o más moléculas de ácido nucleico objetivo que contienen la secuencia de nucleótidos objetivo o un complemento de la misma, y proporcionar un soporte sólido que comprende una o más moléculas de captura inmovilizadas, dichas moléculas de captura adecuadas para unirse a una porción de una o más moléculas de ácido nucleico objetivo. El método, además, implica unir una o más moléculas de ácido nucleico objetivo a una o más moléculas de captura inmovilizadas en el soporte sólido, inmovilizando así las una o más moléculas de ácido nucleico objetivo en dicho soporte sólido y poniendo en contacto las moléculas de ácido nucleico objetivo inmovilizadas o los productos de extensión inmovilizados que son complementarios a la molécula de ácido nucleico objetivo con una solución para formar una mezcla de reacción de extensión nucleotídica. La solución comprende uno o más cebadores de oligonucleótidos, en donde dichos cebadores de oligonucleótidos son complementarios a una porción de dicha molécula de ácido nucleico objetivo inmovilizada o producto de extensión inmovilizado de la misma, una polimerasa y un grupo de nucleótidos trifosfatos, teniendo cada tipo de nucleótido trifosfato del grupo (i) una fracción generadora de firma de identificación escindible diferente, y (ii) una fracción de bloqueo escindible que inhibe la adición de un nucleótido trifosfato posterior. La mezcla de reacción de extensión nucleotídica se somete a un tratamiento de hibridación en donde los uno o más cebadores de oligonucleótidos se hibridan de una manera específica de una base con sus moléculas de ácido nucleico objetivo inmovilizadas complementarias o productos de extensión inmovilizados de las mismas, y los cebadores de oligonucleótidos hibridados se extienden por una adición específica de base única de un nucleótido trifosfato del grupo de nucleótidos trifosfatos al extremo 3' de los cebadores de oligonucleótidos hibridados. La fracción generadora de firma de identificación y la fracción de bloqueo se escinden de cada nucleótido añadido a los cebadores de oligonucleótidos hibridados después de dicha extensión, y la fracción generadora de firma de identificación escindida se introduce a través de uno o más nanoporos capaces de detectar dicha fracción generadora de firma de identificación. El método, además, implica detectar, como resultado de dicha introducción, una firma de identificación generada por la fracción generadora de firma de identificación escindida cuando dicha fracción escindida pasa a través de los uno o más nanoporos, e identificar, en función de dicha detección, el nucleótido trifosfato del grupo de nucleótidos trifosfatos que se añadió durante dicha extensión, identificando así uno o más nucleótidos en una secuencia de nucleótidos objetivo en la muestra.

Los marcadores circulantes de la sangre representan un emocionante escenario de diagnóstico in vitro debido a la naturaleza mínimamente invasiva de asegurar estos marcadores y la gran cantidad de tipos de marcadores que se encuentran en la sangre, como las células biológicas, moléculas libres de células (proteínas y ADN libre de células) y vesículas (conjuntos nanométricos como exosomas). Por desgracia, muchos de estos marcadores de transmisión sanguínea no se han utilizado de manera eficaz en la práctica clínica para tratar enfermedades desafiantes como el cáncer, enfermedades infecciosas y accidentes cerebrovasculares, por nombrar algunas. Esta deficiencia se debe principalmente al hecho de que los marcadores sanguíneos asociados a enfermedades son una gran minoría en una población mixta, lo que los hace difíciles de encontrar y analizar debido a la falta de plataformas eficientes para su aislamiento y sistemas que puedan determinar las variaciones estructurales moleculares que pueden albergar. Para abordar esta necesidad apremiante, en el presente documento se describe un innovador dispositivo de plataforma de diagnóstico capaz de seleccionar marcadores circulantes de sangre completa y procesar firmas moleculares específicas de la enfermedad. El sistema previsto aprovecha las múltiples escalas de longitud (mm ^ nm) para afectar las capacidades de procesamiento únicas que ofrece el sistema. El sistema procesará sangre completa (>1 ml) y concentrará marcadores clínicamente relevantes a volúmenes de nl (factor de enriquecimiento >106) y buscará una variedad de variaciones de secuencia de moléculas de ADN y ARN utilizando una reacción de detección de ligasa de fase sólida (spLDR) realizada en millones de pilares de polímero fabricados en una sola etapa utilizando tecnologías basadas en la replicación. Los productos spLDR se barren electrocinéticamente en tubos de vuelo nanométricos con su identificación en función de movilidades electroforéticas moleculares dependientes; el procesamiento de una sola molécula se llevará a cabo utilizando tubos de vuelo nanométricos con detección realizada de forma no óptica. El sistema proporcionará la capacidad de seleccionar todos los marcadores clínicamente relevantes (células, ADN libre de células y exosomas) a partir de una única extracción de sangre y asegurar la información pertinente de esos marcadores de forma totalmente automatizada para permitir la transición de la plataforma a la práctica clínica.

Breve descripción de los dibujos

Las figuras 1A-1C son vistas en perspectiva del procesador biomolecular y uno o más nanotubos de un dispositivo tal y como se describe en el presente documento. La figura 1A es una vista en perspectiva de una cámara de nanosensores 30 dentro de un módulo de nanosensores. En esta realización, cada cámara de nanosensores 30 contiene ocho procesadores biomoleculares 1, cada uno acoplado a un solo nanotubo 6. La figura 1B es una vista en perspectiva del procesador biomolecular 1 y el nanotubo 6. La figura 1C es una vista superior de un nanoporo 8 dentro del nanotubo 6 mostrado en la figura 1B.

Las figuras 2A-2C son vistas del procesador biomolecular y uno o más nanotubos orientados verticalmente de un dispositivo tal y como se describe en el presente documento. La figura 2A es una vista en perspectiva de una cámara de nanosensores que contiene ocho procesadores biomoleculares 1 y ocho nanotubos, en donde solo se muestra el extremo de entrada 12 del nanotubo. La figura 2B es una vista en perspectiva que muestra un procesador biomolecular aislado y un nanotubo posicionado verticalmente. La figura 2C es una vista en sección transversal a través del nanotubo posicionado verticalmente.

La figura 3 es una serie de paneles que representan el desplazamiento de una sola molécula a través de un nanotubo. Cada panel muestra una posición diferente de la molécula individual en el nanotubo, con el gráfico en la parte inferior de la figura que sigue el cambio en la corriente a medida que la molécula atraviesa el nanotubo y los nanoporos dentro del nanotubo.

La figura 4 es una vista en perspectiva de un nanotubo que muestra la posición de tres o más nanoporos sintéticos (representados por la rotura del nanotubo) dentro de un solo nanotubo. Esta figura también muestra la cubierta de nanotubos y la ubicación de los electrodos en la cubierta.

La figura 5 muestra un diagrama eléctrico simplificado de una realización del nanotubo descrito en el presente documento.

La figura 6 muestra un diagrama eléctrico simplificado de una realización del nanotubo descrito en el presente documento.

Las figuras 7A-7B muestran una vista superior de un nanotubo (figura 7A) y un diagrama de circuito del nanotubo con electrodos y circuitos de medición (figura 7B). El diagrama de circuito de la figura 7B representa una realización para medir una firma de identificación de una biomolécula cuando pasa a través de un nanoporo del nanotubo. Las figuras 8A-8B muestran una vista superior de un nanotubo (figura 8A) y un diagrama de circuito del nanotubo con electrodos y circuitos de medición (figura 8B). El diagrama de circuito de la figura 8B representa una realización alternativa para medir la firma de identificación de una biomolécula cuando pasa a través de un nanoporo del nanotubo.

Las figuras 9A-9B muestran una vista superior de un nanotubo (figura 9A) y un diagrama de circuito del nanotubo con electrodos y circuitos de medición (figura 9B). El diagrama de circuito de la figura 9B representa una realización alternativa para medir la firma de identificación de una biomolécula cuando pasa a través de un nanoporo del nanotubo.

Las figuras 10A-10B muestran una vista superior de un nanotubo (figura 10A) y un diagrama de circuito del nanotubo con electrodos y circuitos de medición (figura 10B). El diagrama de circuito de la figura 10B representa una realización alternativa para medir la firma de identificación de una biomolécula cuando pasa a través de un nanoporo del nanotubo.

Las figuras 11A-11B muestran una vista superior de un nanotubo (figura 11A) y un diagrama de circuito del nanotubo con electrodos y circuitos de medición (figura 11B). El diagrama de circuito de la figura 11B representa una realización alternativa para medir la firma de identificación de una biomolécula cuando pasa a través de un nanoporo del nanotubo.

Las figuras 12A-12B muestran una vista superior de un nanotubo (figura 12A) y un diagrama de circuito del nanotubo con electrodos y circuitos de medición (figura 12B). El diagrama de circuito de la figura 12B representa una realización alternativa para medir la firma de identificación de una biomolécula cuando pasa a través de un nanoporo del nanotubo.

Las figuras 13A-13B muestran una vista superior de un nanotubo (figura 13A) y un diagrama de circuito del nanotubo con electrodos y circuitos de medición (figura 13B). El diagrama de circuito de la figura 13B representa una realización alternativa para medir la firma de identificación de una biomolécula cuando pasa a través de un nanoporo del nanotubo.

Las figuras 14A-14B muestran una vista superior de un nanotubo (figura 14A) y un diagrama de circuito del nanotubo con electrodos y circuitos de medición (figura 14B). El diagrama de circuito de la figura 14B representa una realización alternativa para medir la firma de identificación de una biomolécula cuando pasa a través de un nanoporo del nanotubo.

Las figuras 15A-15B son diagramas de bloques de sistemas electrónicos que muestran dos métodos para detectar y procesar firmas de identificación biomolecular de un solo nanotubo.

La figura 16A es una vista lateral y la figura 16B es una vista superior de las conexiones eléctricas de alta densidad entre el módulo nanosensor y una placa de circuito impreso (PCS).

Las figuras 17A-17B son vistas en perspectiva y desde arriba, respectivamente, de un dispositivo abarcado por la presente invención. Este dispositivo, que se denomina en el presente documento sistema de procesamiento molecular universal (uMPS), comprende varios módulos de tareas específicas que están interconectados a través de una placa de base fluida.

Las figuras 18A-18B representan el módulo de aislamiento de células del uMPS. La figura 18A es una vista en perspectiva del módulo de aislamiento de células que comprende el lecho de captura de células. La figura 18B (recuadro de la figura 18A) es una vista en perspectiva de los canales sinusoidales que forman el lecho de captura del módulo de aislamiento de células.

La figura 19 es un dibujo esquemático de los anticuerpos de captura inmovilizados en las paredes del canal del módulo de aislamiento de células. Los anticuerpos se inmovilizan usando conectores oligonucleotídicos escindibles.

Las figuras 20A-20D representan el módulo de aislamiento de plasma del uMPS. La figura 20A es una vista en perspectiva del módulo de aislamiento de plasma. La figura 20B es una vista en perspectiva en sección transversal (a través de la línea 20B-20B de la figura 20A) que muestra la primera cámara principal, la primera cámara lateral y el pasaje entre la primera cámara principal y la primera cámara lateral del módulo de aislamiento de plasma. La figura 20C es una vista en perspectiva en sección transversal (a través de la línea 20C-20C de la figura 20A) que muestra la segunda cámara principal, la segunda cámara lateral y el pasaje entre la segunda cámara principal y la segunda cámara lateral del módulo de aislamiento de plasma. La figura 20D es una vista en sección transversal de la unidad de aislamiento de plasma tomada a través de la línea 20D-20D de la figura 20A.

Las figuras 21A-21B representan un módulo de aislamiento de plasma alternativo del uMPS. La figura 21A es una vista en perspectiva de esta unidad de aislamiento de plasma. La figura 21B es una vista en sección transversal de esta unidad de aislamiento de plasma tomada a través de la línea 21B-21B de la figura 21A.

La figura 22 es una vista en perspectiva de un módulo extractor de fase sólida (SPE) del uMPS utilizado para el aislamiento de exosomas o ADN libre circulante.

Las figuras 23A-23B representan el módulo de impedancia del uMPS. La figura 23A es una vista en perspectiva del módulo de impedancia y la figura 23B es una vista en perspectiva despiezada que muestra las tres capas del módulo de impedancia.

La figura 24 muestra el proceso de fabricación del módulo de impedancia representado en las figuras 23A-23B. La figura 25 es una vista en perspectiva de un módulo de aislamiento de ARN/ADN de SPE del uMPS.

Las figuras 26A-26B muestran el módulo de purificación por difusión del uMPS. La figura 26A es una vista en perspectiva del módulo de purificación por difusión, y la figura 26B es una vista superior del recuadro de la figura 26A que muestra el espacio entre obstáculos dentro del lecho de purificación por difusión.

La figura 27 ilustra las válvulas de un dispositivo de la presente invención. Se muestra el moldeo simultáneo frontal y posterior de una válvula y un asiento de válvula mediante estampado.

Las figuras 28A-28C muestran los pasadores de alineación cinemática y las ranuras del sello sin junta. Los pasadores de alineación y las ranuras (figura 28A) se pueden fabricar en la parte trasera del sustrato fluídico utilizando un estampado de doble cara con los pasadores y las ranuras colocados en las dos piezas de acoplamiento. La figura 28B muestra un sello sin juntas ensamblado. La precisión de alineación es de -10 pm. La figura 28C muestra los sellos superhidrófobos alineados entre piezas acopladas.

Las figuras 29A-29B ilustran las etapas de procesamiento para hacer las cámaras y canales de nanofluidos del dispositivo descrito en el presente documento usando impresión. La figura 29A muestra el proceso de fabricación del sello de resina que se utiliza en el proceso de fabricación de las cámaras y canales de nanofluidos tal y como se muestra en la figura 29B.

Las figuras 30A-30B muestran los procesos implicados en el ensamblaje del dispositivo de la presente invención. La figura 30A es un esquema del ensamblaje de los dispositivos fluídicos de base híbrida y el instrumento de prensa térmica. La figura 30B muestra el perfil del proceso de temperatura-presión que muestra las seis etapas del ciclo de unión por fusión térmica.

La figura 31 muestra una simulación de la trayectoria del fluido a través de una cámara de nanosensores que contiene ocho procesadores biomoleculares y ocho nanotubos cuando el flujo se activa mediante bombeo hidrodinámico. La simulación muestra un direccionamiento uniforme de todos los procesadores biomoleculares dentro de una cámara de nanosensores de un dispositivo.

La figura 32A muestra una simulación de la trayectoria del fluido a través de la pluralidad de estructuras de soporte sólidas espaciadas dentro de la cámara de biorreactor de un procesador biomolecular cuando el flujo se activa mediante bombeo electrocinético. La figura 32B muestra las líneas de campo eléctrico correspondientes a través de la cámara de biorreactor del procesador biomolecular representado en la figura 32A.

La figura 33 muestra una simulación para determinar la eficiencia de captura de moléculas de ácido nucleico a medida que se mueven a través de la pluralidad de estructuras de soporte en una única cámara de biorreactor de un procesador biomolecular.

La figura 34 es un gráfico que muestra la distribución del campo eléctrico simulado en un nanotubo del módulo nanosensor del dispositivo de la presente invención.

La figura 35A es un esquema que muestra un analito esférico en un nanoporo, donde Vp = volumen de partícula (analito) y Vd = volumen de detección. La figura 35B es un gráfico que muestra los resultados de la simulación para una partícula cargada que se mueve a través de un nanoporo sintético en función de la concentración de electrolito tampón. La magnitud de la corriente de bloqueo depende de la concentración del electrolito portador (tampón TRIS/borato/EDTA para 0,5X, 1,0X, 1,5X, 2X y 2,5X).

La figura 36A es una simulación del bloqueo de corriente producido por una sola molécula de ADN que se mueve a través de un nanoporo de varias longitudes. La figura 36B es un gráfico que representa la magnitud del evento de bloqueo de corriente (nA) en función del objeto esférico / volumen de detección. El volumen de detección representa el volumen de los poros.

Las figuras 37A-37B muestran eventos de bloqueo de corriente para moléculas de ADN individuales de 500 pares de bases que se desplazan electrocinéticamente a través de nanoporos basados en polímeros de dos tamaños diferentes. La figura 37A es un gráfico que muestra el cambio en la amplitud de la corriente dentro del nanoporo a lo largo del tiempo. La figura 37B muestra las estadísticas para la amplitud de los picos de corriente obtenidos de 156 eventos de translocación a través de los nanoporos de tamaño diferencial.

Las figuras 38A y 38B son imágenes SEM para membranas SU-8 con nanoporos cónicos perforados que tienen diferentes diámetros. La figura 38C es un gráfico que representa la reducción del tamaño de los poros en función del tiempo de reflujo.

Las figuras 39A-39B son imágenes SEM de nanoporos que tienen diferentes longitudes de poro.

Las figuras 40A-40F muestran varios aspectos del transporte electroforético de nanopartículas de plata (AgNP) a través de un nanotubo. La figura 40A es una imagen de intensidad de un único AgNP aparcado en un nanotubo que muestra la intensidad de la resonancia del plasmón superficial localizado de la única nanopartícula. La figura 40B es la representación del transporte electroforético para un solo evento de nanopartículas (AgNP de 60 nm) en un nanotubo. La figura 40C muestra un gráfico de la movilidad electroforética y el número de placa teórico, que mide la varianza de la movilidad, en función de la intensidad del campo.

Las figuras 40D-40F son histogramas de eventos de tiempo de vuelo para nanopartículas de plata en nanotubos. La figura 41 es un gráfico que muestra la capacidad máxima en función del término de selectividad, que está determinada por la diferencia en la movilidad electroforética de dos componentes dividida por la movilidad electroforética promedio. Para R=6,0 y 15650 placas con una diferencia de movilidad de 0,01, la capacidad máxima es 31, que representa el número de biomoléculas que el nanotubo puede distinguir.

La figura 42 muestra las mediciones de impedancia de una sola célula de las células de cáncer de mama (MCF-7) utilizando el módulo sensor del dispositivo como se describe en el presente documento.

La figura 43 es un gráfico de simulaciones que muestra la respuesta de impedancia de células de diferente diámetro para electrodos de diferentes tamaños (es decir, 20, 25 y 75 pm). También se muestran datos experimentales para la amplitud máxima de impedancia para células de 3 tamaños promedio diferentes para un par de electrodos de 75 pm de ancho.

Las figuras 44A y 44B son diagramas que ilustran el origen de una resistencia superior a la de solo tampón registrada para las células intactas (figura 44A) y la caída de la resistencia para las células que contienen membranas que están comprometidas (figura 44B). Rcélula es la resistencia de la célula y Rsol es la resistencia del volumen de solución igual al volumen de la célula. Las figuras 44C y 44D son trazos de impedancia para células vivas Hs578T en tampón IX TG (figura 44C), y células tratadas con paraformaldehído y Triton X-100 en tampón 1XTG (figura 44D).

La figura 45A muestra una simulación de dinámica de fluidos computacional del flujo de plasma a través de un lecho de extracción en fase sólida compuesto por micropilares de diamante con una longitud lateral de 15 pm y un espaciado de 5 pm. La figura 45B muestra una simulación de difusión de Monte Carlo. La figura 45C representa los resultados de la simulación de difusión de Monte Carlo para el transporte (flujo impulsado por presión) a través de un canal de 10 pm de ancho cuyas paredes están recubiertas con un agente de afinidad específico para un exosoma. La "X" marca la ubicación donde el exosoma se ha unido a la superficie a través de la asociación entre el agente de afinidad unido a la superficie y el antígeno de direccionamiento residente en la superficie del exosoma. La figura 46 es un gráfico que muestra los efectos de la velocidad y la longitud del lecho de SPE sobre la recuperación de exosomas usando la simulación representada en las figuras 45A.

La figura 47 es un gráfico de contorno isosuperficial y subyacente en 3D para las condiciones cuya recuperación de exosomas se predice que será del 95 % mediante las simulaciones de Monte Carlo / Chang-Hammer de la figura 45B.

La figura 48 es un gráfico que muestra la recuperación de moléculas de ADN del plasma en el módulo de aislamiento de ADN/ARN de SPE del dispositivo uMPS en función del diámetro del pilar. La recuperación aumenta cuando el diámetro del pilar representa <70 pm de diámetro.

La figura 49 muestra la electroforesis en gel capilar de los fragmentos de ADN recuperados usando el módulo SPE del uMPS. La recuperación fue en función del contenido de PEG/NaCl/EtOH, con recuperación máxima observada al 7 % de PEG, NaCl 0,9 mM y EtOH al 43 %.

La figura 50 es un gráfico que muestra el desplazamiento por difusión de ADN con diferentes números de base en el módulo de purificación por difusión. También se muestra en el desplazamiento de ADN libre circulante a dNTP en función del número de obstáculos.

La figura 51 es un gráfico que muestra el caudal volumétrico frente a la presión de la cabeza de la válvula en una válvula del uMPS.

La figura 52 es un SEM de la superficie superhidrófoba revestida por rotación alrededor del orificio pasante de microfluidos para cada conjunto de sello sin junta para crear el sello.

La figura 53 es un gráfico que muestra que las presiones máximas medidas que los sellos sin juntas podían soportar eran consistentes con las estimadas usando la ecuación de Young-Laplace.

Descripción detallada de la invención

Un aspecto de la presente invención hace referencia a un dispositivo que comprende un procesador biomolecular y uno o más nanotubos. Cada procesador biomolecular comprende una cámara de biorreactor definida por un sustrato sólido, una pluralidad de estructuras de soporte espaciadas dentro de dicha cámara de biorreactor y fijadas al sustrato sólido y una o más moléculas de captura inmovilizadas en algunas o todas de dicha pluralidad de estructuras de soporte espaciadas, dichas una o más moléculas de captura adecuadas para unirse a una porción de una molécula de ácido nucleico objetivo en una muestra. Los uno o más nanotubos del dispositivo están definidos por el sustrato sólido y acoplados de forma fluida a la cámara de biorreactor del procesador biomolecular. Cada uno de los uno o más nanotubos tiene un paso que se extiende entre un extremo de entrada próximo a la cámara de biorreactor y un extremo de salida distal a la cámara de biorreactor, y comprende uno o más nanoporos dentro del paso, teniendo cada nanoporo un diámetro reducido con respecto al paso.

La figura 1A es una vista en perspectiva de una cámara de nanosensores 30 que contiene una serie de procesadores biomoleculares 1 y nanotubos 6 tal y como se describe en el presente documento. Cada procesador biomolecular 1 tiene una cámara de biorreactor 2 que contiene una pluralidad de estructuras 4 de soporte sólido espaciadas fijadas al sustrato sólido. Dos paredes de cada cámara de biorreactor 2 están definidas por separadores 22 que ayudan a dirigir el material dentro de la cámara de biorreactor 2 al nanotubo 6 que está acoplado a la cámara de biorreactor 2. La cámara de biorreactor está definida, además, por una placa de cubierta superior, que no se muestra en la figura 1A. La cámara de nanosensor también comprende un orificio de entrada de fluido 16 y un canal de introducción 18. El canal de introducción 18 acopla de forma fluida el orificio de entrada 16 y la pluralidad de procesadores biomoleculares 1 para entregar una muestra desde el orificio de entrada 16 a la pluralidad de procesadores biomoleculares 1. El canal de introducción contiene opcionalmente uno o más o una pluralidad de deflectores 20 que funcionan para dispersar la muestra que entra por el orificio de entrada 16 a la pluralidad de procesadores biomoleculares 1.

Tal y como se muestra en la figura 1A, cada procesador biomolecular está acoplado a un nanotubo. La vista en perspectiva de la figura 1B muestra una vista ampliada del nanotubo 6 y el procesador biomolecular 1 que contiene la cámara de biorreactor 2. El nanotubo 6 contiene un extremo de entrada 12 que está próximo a la cámara de biorreactor 2 del procesador biomolecular 1, un extremo de salida 14 que está distal a la cámara de biorreactor 2, y un paso 10 que se extiende entre los extremos de entrada 12 y salida 14. El extremo de entrada 12 del nanotubo 6 que se muestra en la figura 1B tiene una entrada cónica para ayudar a cargar eléctricamente las moléculas en el nanotubo 6. El extremo de salida 14 del nanotubo 6 se puede acoplar a una red de microfluidos 24 y depósitos de microescala 26 para la entrada y salida de fluidos y biorreactivos. Dentro del paso 10 del nanotubo 6 hay uno o más nanoporos 8. La realización representada en la figura 1B muestra un nanotubo 6 que tiene dos nanoporos 8; sin embargo, tal y como se describe en el presente documento y se muestra en la figura 4, el nanotubo puede contener más de dos nanoporos. Cada nanoporo 8 tiene un diámetro reducido en relación con el paso restante 10 del nanotubo 6 tal y como se muestra en la figura 1C.

En una realización, los procesadores biomoleculares, uno o más nanotubos, y cualquier otra unidad a la que pertenezcan los procesadores biomoleculares y los nanotubos, directa o indirectamente, acoplados de forma fluida se colocan sobre una placa de base. Se coloca una placa de cubierta en la placa de base para formar un compartimento que sella el procesador biomolecular, los nanotubos y cualquier otra unidad.

Las figuras 2A-2C muestran una disposición alternativa del procesador biomolecular y el nanotubo de un dispositivo de la presente invención. La figura 2A es una vista en perspectiva de una cámara de nanosensores 30 que contiene ocho procesadores biomoleculares 1 y ocho nanotubos, donde solo el extremo de entrada 12 del nanotubo es visible en esta perspectiva. En esta realización, el nanotubo 6 se coloca verticalmente dentro del sustrato sólido 32, mientras que la cámara de biorreactor 2 del procesador biomolecular 1 está ubicada en la superficie del sustrato sólido 34 adyacente al extremo de entrada 12 del nanotubo. La muestra entra en la cámara de biorreactor 2 a través de la entrada de fluido 16, fluye a través del canal de introducción 18 de la cámara de nanosensor 30 donde se distribuye entre las cámaras de biorreactor 2 por los deflectores 20 presentes en el canal de introducción 18. La muestra fluye a través de la pluralidad de estructuras 4 de soporte espaciadas dentro de la cámara de biorreactor 2, donde las moléculas objetivo son capturadas por moléculas de captura que están inmovilizadas en las estructuras de soporte sólido 4. Tras la liberación de las moléculas objetivo u otros productos biomoleculares representativos de las moléculas objetivo de las moléculas de captura, las moléculas objetivo o sus productos biomoleculares se dirigen al extremo de entrada 12 del nanotubo para su detección. La figura 2B muestra una vista en perspectiva ampliada de un procesador biomolecular 1 en la cámara del nanosensor en la superficie 34 del sustrato 32 y adyacente al nanotubo 6 que está colocado verticalmente dentro del sustrato 32. La figura 2C es una sección transversal del nanotubo 6 colocado verticalmente en el sustrato 32, en la que se muestra el pasaje 10 (también conocido como nanocanal) y los nanoporos 8 del nanotubo 6.

El sustrato sólido de la cámara de biorreactor del procesador biomolecular se puede fabricar con una amplia variedad de materiales. El sustrato sólido puede ser biológico, no biológico, orgánico, inorgánico, o una combinación de cualquiera de estos. En una realización, el sustrato sólido es un material polimérico u otro material moldeable. Los materiales poliméricos adecuados incluyen, sin limitación, poli(metilmetacrilato) (PMMA), policarbonatos (PC), resinas a base de epoxi, copolímeros, polisulfonas, elastómeros, copolímero de olefina cíclica (COC) y organosilicones poliméricos. La cámara de biorreactor se puede fabricar de termoplástico mediante, por ejemplo, litografía de nanoimpresión (NIL) como se describe en el presente documento y asentarse sobre un elemento calefactor.

Las estructuras de soporte espaciadas 4 de la cámara de biorreactor 2 abarcan cualquier estructura elevada, como los pilares representados en la figura IB. Las estructuras de soporte del espacio 4 se asientan sobre la superficie del sustrato sólido 34 y tienen expuestas las superficies superior, inferior y lateral. Estas estructuras de soporte espaciadas 4 pueden tener cualquier forma geométrica tridimensional, incluyendo, sin limitación, esférica, cono, cilindro, prisma triangular o tetraedro, cubo, prisma rectangular, dodecaedro, prisma hexagonal, prisma octogonal, etc. Las moléculas de captura se inmovilizan en las superficies de la estructura de soporte (es decir, las superficies superior y lateral de las estructuras). En una realización, las moléculas de captura son oligonucleótidos que comprenden una secuencia de nucleótidos que es complementaria a una secuencia de nucleótidos que forma parte de una molécula objetivo en una muestra o está anexada a ella. Por ejemplo, en una realización, la molécula de captura es un poli-dA³⁰ oligonucleótido que es complementario a una cola de poli-dT unida a una molécula de ácido nucleico objetivo. Las moléculas de captura se inmovilizan en las superficies de la estructura de soporte mediante cualquier molécula conectora adecuada.

Las dimensiones de la cámara de biorreactor varían dependiendo de varios factores, incluyendo, por ejemplo, el dispositivo en el que está alojado y el tipo de muestra que se analiza. La cámara de biorreactor puede tener 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50 |jm de ancho por 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50 |jm de profundidad, con una altura de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50 jm . En una realización, la cámara de biorreactor del procesador biomolecular es de 20 jm x 20 jm . El tamaño de la cámara de biorreactor dicta el número de estructuras de soporte sólidas alojadas en el interior. Cada cámara de biorreactor puede contener 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000 o más estructuras de soporte espaciadas, donde cada estructura de soporte tiene 0,1, 0,5, 1, 1,5, 2, 2,5, 3, 3,5, 4, 4,5, 5, 5,5, 6, 6,5, 7, 7,58, 8,5, 9, 9,5 o 10 jim de diámetro y 0,5, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 jim de altura. Las estructuras de soporte deben estar separadas entre sí dentro de la cámara de biorreactor para permitir el flujo de una muestra fluídica. En una realización, una cámara de biorreactor de un procesador biomolecular contiene 250­ 300 estructuras de soporte espaciadas que tienen 1 jm de diámetro y 5 jm de alto.

El diseño del procesador biomolecular se basa en la capacidad de carga máxima para alojar las moléculas de ácido nucleico objetivo presentes en, por ejemplo, 1 ml de muestra de ensayo, por ejemplo, plasma. Un pilar de 1,0 jm de diámetro y 5,0 jm de altura (relación de aspecto = 5,0) tiene una superficie disponible de 1,57 x 10^-7 cm² Con la densidad superficial conocida de grupos funcionales en copolímero de olefina cíclica (COC) activado por UV (19,0 x 10^-9 moles cm^-2) (Jackson et al., chip de laboratorio 14:106-117 (2014)), hay 1,8 x 10⁹ sitios disponibles en un pilar de estas dimensiones. Al inmovilizar dA³⁰ oligonucleótidos (radio de giro = 3 nm) para capturar objetivos con cola de TdT, la densidad de superficie más alta que se puede lograr para una superficie empaquetada hexagonalmente es 8 x 10^{' 12} moles cm^{' 2} , que es menor que la densidad de los carboxilatos superficiales con activación UV/O³. La exposición a los rayos UV (254 nm) de los pilares de polímero genera ácidos carboxílicos confinados en la superficie solo en los sitios expuestos a la radiación activadora y adecuados para unir NH²- dA³⁰ imprimaciones en presencia de EDC/NHS para generar una unión amida estable de la imprimación a la superficie (Jackson et al., chip de laboratorio 14:106-117 (2014)). Sin embargo, no todas las moléculas de captura capturarán un objetivo. En función de informes de literatura de ~5000 moléculas por 1 jm ², se estima que un pilar dado puede alojar -78500 moléculas (Ma et al., Proc Natl Acad Sci USA 110:14320-14323 (2013)). De este modo, para una carga completa y sin replicación para alojar la captura de -400 mil millones de moléculas de ADN monocatenario, la matriz tendría 5,1 millones de pilares. Para una cámara de biorreactor de 20 x 20 jm que tiene pilares (cada pilar tiene 1 jm de diámetro) espaciados por 0,25 jm con empaquetadura hexagonal, el número de pilares por cámara de biorreactor es 288; el número mínimo de cámaras de biorreactor necesarias es 17674. De este modo, en una realización, un módulo nanosensor tiene -17 700 procesadores biomoleculares.

Tal y como se describirá con mayor detalle en el presente documento, el nanotubo funciona para detectar moléculas individuales generadas y/o procesadas dentro de la cámara de biorreactor del procesador biomolecular. Las moléculas individuales de la cámara de biorreactor entran en el nanotubo por el extremo de entrada y se desplazan electrocinéticamente a través del pasaje del nanotubo que contiene los nanoporos y salen por el extremo de salida. Cuando la molécula atraviesa un nanoporo, se genera una firma de corriente dependiendo de la concentración de sal iónica y el tamaño de la molécula que se detecta. La figura 3 es una ilustración esquemática de este proceso. La serie de paneles en la figura 3 muestra la posición de una biomolécula 28 en el nanotubo 6 a lo largo del tiempo y el transitorio de corriente resultante que se genera cuando la biomolécula 28 se mueve a través del paso de nanotubos 10. El gráfico en la parte inferior de esta figura rastrea el cambio en la corriente como una función del tiempo de desplazamiento de la biomolécula individual a través del tubo de vuelo. Cuando una sola biomolécula 28 entra en el nanotubo 6 en el extremo de entrada 12, se produce un cambio en la corriente transitoria. Cuando la biomolécula 28 entra en un nanoporo 8, se produce un cambio adicional en la corriente transitoria, que volverá al valor anterior cuando la biomolécula 28 salga del nanoporo 8, generando así una caída en la gráfica de corriente frente al tiempo que se muestra en la parte inferior de la figura 3. Al llegar al segundo poro sintético en el plano, se genera otro transitorio de corriente y, a partir de la diferencia de tiempo entre el primer y el segundo transitorio de corriente, el tiempo de vuelo de una sola molécula se puede deducir y utilizar para identificar la única molécula que se desplaza a través del tubo de vuelo. El tiempo de vuelo depende de la estructura molecular y la carga de la molécula individual.

El nanotubo puede tener 10-200 nm de ancho, 10-200 nm de profundidad y 5 a 250 pm de longitud. En una realización, el nanotubo tiene 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190 o 200 nm de ancho. En otra realización, el nanotubo tiene 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190 o 200 nm de profundidad. En otra realización, el nanotubo es 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240 o 250 pm de longitud. En una realización, las dimensiones del pasaje de nanotubos son menores o iguales a 50 nm de ancho y menores o iguales a 50 nm de profundidad. En otra realización de la presente invención, las dimensiones del pasaje de nanotubos son menores o iguales a 25 nm de ancho y menores o iguales a 25 nm de profundidad. En otra realización de la presente invención, las dimensiones del pasaje de nanotubos son menores o iguales a 15 nm de ancho y menores o iguales a 15 nm de profundidad. En otra realización de la presente invención, las dimensiones del pasaje de nanotubos son menores o iguales a 10 nm de ancho y menores o iguales a 10 nm de profundidad. En otra realización de la presente invención, las dimensiones del pasaje de nanotubos son menores o iguales a 5 nm de ancho y menores o iguales a 5 nm de profundidad. El pasaje de nanotubos puede tener una longitud de 1 pm a > 250 pm o de 5 pm a 250 pm, y puede tener cualquier sección transversal geométrica deseada, es decir, semiesférica, triángulo, cuadrado, rectángulo, pentágono, hexágono, heptágono u octágono.

En una realización de la presente invención, el canal de nanotubos comprende un material polimérico, por ejemplo, PMMA, PC, resinas a base de epoxi, copolímeros, polisulfonas, elastómeros y organosilicones poliméricos, o cualquier combinación de estos materiales. El material polimérico puede estar en su estado nativo o, como alternativa, tener una superficie modificada para mejorar la discriminación y detección de biomoléculas. Por ejemplo, una pared de paso polimérico puede comprender una superficie neutra, hidrófoba de hidrocarburo con diferentes grados de orden de cadena. En otro ejemplo, la superficie de la pared del paso de nanotubos puede comprender una superficie hidrófoba de carga neutra. En otro ejemplo más, la superficie de la pared del paso de nanotubos puede comprender una superficie hidrófoba cargada. Tal y como se ha indicado anteriormente, la composición de la pared de paso de nanotubos afectará el tiempo de vuelo de la biomolécula y, por lo tanto, ayuda a definir la firma de identificación de una biomolécula.

La superficie de la pared del pasaje de nanotubos que comprende una superficie neutra, hidrófoba, de hidrocarburo con diferentes grados de orden de cadena se puede formar a partir de monocapas de cadenas de alcanos terminadas en metilo que tienen varias longitudes que se construyen sobre las superficies de nanocanales de polímero (Henry et al., "Surface Modification of Poly(methyl methacrylate) Used in the Fabrication of Microanalytical Devices", Anal. Chem.

72:5331-5337 (2000)). Las monocapas se pueden formar mediante la unión de amino-alcanos a superficies terminadas en ácido carboxílico (McCarley et al., "Resist-Free Patterning of Surface Architectures in Polymer-Based Microanalytical Devices", J. Am. Chem. Soc. 127:842-843 (2005); Wei et al., "Photochemically Patterned Poly(methyl methacrylate) Surfaces Used in the Fabrication of Microanalytical Devices. J. Phys. Chem. B 109:16988-16996 (2005)). Como alternativa, las monocapas se pueden formar a partir de capas de alcano unidas a urea sobre funcionalidades amina unidas al polímero mediante enlaces amida (Henry, A.C., "Surface Modification and Characterization of PMMA Used in the Construction of Microelectromechanical Systems", In Chemistry, págs. 147, Louisiana State University, Baton Rouge (2001); Henry et al., "Surface Modification of Poly(methyl methacrylate) Used in the Fabrication of Microanalytical Devices", Anal. Chem. 72:5331-5337 (2000)). Por ejemplo, se pueden formar monocapas de octadecilo bien ordenadas en superficies de PMMA por reacción de n-octadecilisocianato con superficies de PMMA terminadas en amina (Henry & McCarley, "Selective Deposition of Metals on Plastics Used in the Construction of Microanalytical Devices: Photo-Directed Formation of Metal Features on PMMA", J. Phys. Chem. B 105:8755-8761 (2001)), y estas superficies C18-PMMA son excelentes para separaciones cromatográficas en canales rebajados (Galloway et al., "Contact Conductivity Detection in Poly(methyl methacylate)-Based Microfluidic Devices for Analysis of Mono- and Polyanionic Molecules", Anal. Chem. 74:2407-2415 (2002)). De este modo, varias longitudes de cadena nalquilisocianatos se pueden usar para hacer superficies poliméricas hidrófobas que poseen diferentes grados de orden, lo que afectará el tiempo de vuelo de las moléculas que pasan. Los problemas relacionados con los flujos electroosmóticos (EOF) distintos de cero se pueden abordar limitando los grupos de fundamento sin reaccionar (Henry, A.C., "Surface Modification and Characterization of PMMA Used in the Construction of Microelectromechanical Systems", In Chemistry. Louisiana State University, Baton Rouge (2001); Wei et al., "Photochemically Patterned Poly(methyl methacrylate) Surfaces Used in the Fabrication of Microanalytical Devices. J. Phys. Chem. B 109:16988-16996 (2005)).

Un enfoque para crear superficies hidrófobas de carga neutra implica hacer reaccionar superficies poliméricas terminadas en ácido carboxílico debidamente activadas con etanolamina o amino-tri (etilenglicol) (Wei, S., "Multianalyte Detection of Breast Cancer by Fabrication of Hybridmicroarrays on Polymer-based Microanalytical Devices", In Chemistry. Louisiana State University, Baton Rouge (2005)). Como una alternativa, las superficies de PMMA y PC terminadas en amina se pueden modificar con glicoles que tienen grupos carboxílicos generados en la superficie, tales como ácido glicólico o carboxil-tri (etilenglicol). Las superficies catiónicas se pueden formar utilizando métodos bien establecidos para la producción de polímeros terminados en amina (Henry & McCarley, "Selective Deposition of Metals on Plastics Used in the Construction of Microanalytical Devices: Photo-Directed Formation of Metal Features on PMMA", J. Phys. Chem. B 105:8755-8761 (2001); Henry et al., "Surface Modification of Poly(methyl methacrylate) Used in the Fabrication of Microanalytical Devices", Anal. Chem. 72:5331-5337 (2000); McCarley et al., "Resist-Free Patterning of Surface Architectures in Polymer-Based Microanalytical Devices", J. Am. Chem. Soc.

127:842-843 (2005); Wei et al., "Photochemically Patterned Poly(methyl methacrylate) Surfaces Used in the Fabrication of Microanalytical Devices. J. Phys. Chem. B 109:16988-16996 (2005)). Las superficies aniónicas resultarán de rutas que conducen a superficies terminadas en ácido carboxílico (McCarley et al., "Resist-Free Patterning of Surface Architectures in Polymer-Based Microanalytical Devices", J. Am. Chem. Soc. 127:842-843 (2005); Vaidya et al., "Surface Modification and Characterization of Microfabricated Poly(carbonate) Devices: Manipulation of Electroosmotic Flow", Analyst 127:1289-1292 (2002)) o las de ácidos sulfónicos, teniendo estos últimos una carga superficial casi independiente de pH (Henry, A.C., "Surface Modification and Characterization of PMMA Used in the Construction of Microelectromechanical Systems", In Chemistry, págs. 147, Louisiana State University, Baton Rouge (2001)).

El nanotubo, como se describe en el presente documento, puede comprender un segmento de tiempo de vuelo que está situado entre dos nanoporos dentro de un nanotubo. Como alternativa, tal y como se muestra en la figura 4, el nanotubo puede comprender múltiples, es decir, tres o más, segmentos de tiempo de vuelo acoplados, con cada segmento de tiempo de vuelo situado entre dos nanoporos. En una realización, cada segmento de tiempo de vuelo se caracteriza por una pared de paso que tiene una química única que interactúa diferencialmente con las moléculas que pasan y sus modificadores o generadores de firma de identificación. Los segmentos de tiempo de vuelo pueden tener la misma longitud o diferentes longitudes, teniendo la misma química superficial o diferente. Los canales de tiempo de vuelo tienen las mismas limitaciones dimensionales que el nanotubo en cuanto a ancho y profundidad. En otras palabras, el canal de tiempo de vuelo puede tener entre 10-200 nm de ancho y entre 10-200 nm de profundidad. Con respecto a la longitud, el canal de tiempo de vuelo es la longitud del nanotubo entre dos nanoporos. Por lo tanto, la longitud del canal de tiempo de lucha puede ser <5 pm y > 200 pm o cualquier lugar entre 5-200 pm de longitud. Estos formatos de diseño permiten separaciones multidimensionales para mejorar la identificación y caracterización de moléculas individuales que se mueven a través del nanotubo.

Las dimensiones de los nanoporos del nanotubo son significativamente más pequeñas que el pasaje del nanotubo. Por ejemplo, el nanoporo puede tener 1-150 nm de ancho o profundidad o ambos, y puede tener 5-500 nm de largo. El nanoporo puede tener 1, 2, 3, 4, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140 o 150 nm de ancho o profundidad o ambos, y puede tener 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 310, 320, 330, 340, 350, 360, 370, 380, 390, 400, 410, 420, 430, 440, 450, 460, 470, 480, 490, 500 nm de largo. Cuando dos o más nanoporos están presentes en un nanotubo, cada uno o algunos de los dos o más nanoporos pueden tener las mismas o dimensiones u otras diferentes. En una realización, dos o más nanoporos espaciados son de diferentes dimensiones, de modo que cuando el detector mide cambios en los niveles de corriente en los dos o más nanoporos espaciados para una biomolécula particular, las diferencias de cambio de corriente entre los dos o más nanoporos espaciados establecen que esa biomolécula está pasando a través de los dos o más nanoporos espaciados de manera secuencial y el tiempo entre esos cambios de corriente.

Tal y como se describe en el presente documento, el nanoporo es un pequeño agujero dentro del nanotubo, que tiene un diámetro que es más pequeño que el diámetro del paso que se extiende a través del nanotubo a cada lado del nanoporo. Tal y como se ha indicado anteriormente, un nanotubo puede contener dos o más nanoporos, siendo cada nanoporo igual o diferente. El diámetro del nanoporo es de un tamaño tal que cuando las moléculas de interés pasan a través del nanoporo, el paso de las moléculas es detectado por un cambio en la señal eléctrica, por ejemplo, corriente, a través del nanoporo. En una realización, el nanoporo comprende una proteína, como alfa-hemolisina o MspA, que puede modificarse o no. En otra realización, el nanoporo es un nanoporo sintético, por ejemplo, un nanoporo de estado sólido o nanoporo de grafeno. Los nanoporos de estado sólido se pueden producir tal y como se describe en el presente documento o tal y como se describe en la patente de EE.UU. n.° 7.258.838. Se divulgan ejemplos nanoporos de estado sólido by Storm et al., Nature Mater. 2:537-540 (2003); Venkatesan et al., Adv. Mater.

21:2771-2776 (2009); Kim et al., Adv. Mater. 18:3149-3153 (2006); Nam et al., Nano Lett. 9:2044-2048 (2009) y Healy et al., Nanomedicine 2:875-897 (2007). En otra realización, el nanoporo comprende un nanoporo de estado sólido/proteína híbrida en el que se incorpora una proteína de nanoporo en un nanoporo de estado sólido. Se describen nanoporos adecuados, por ejemplo, en Mager, M. D. & Melosh, N. A, Adv. Mater. 20:4423-4427 (2008); White, R. J. et al., Langmuir 22:10777-10783 (2006); Venkatesan, B. M. et al., Biomed. Microdevices 13:671-682 (2011); Iqbal et al., Nature Nanotech. 2:243-248 (2007); Wanunu et al., Nano Lett. 7:1580-1585 (2007); Siwy et al., Chem. Soc. Rev.

39:1115-1132 (2009); Kowalczy et al. Nature Nanotech. 6:433-438 (2011); y en la publicación de patente estadounidense con n.° US20100331194.

En otra realización, el nanoporo es un nanoporo de grafeno. Los nanoporos de grafeno adecuados se describen en Geim, A. K., Science 324:1530-1534 (2009); Fischbein et al., Appl. Phys. Lett. 93:113107-113103 (2008); Girit et al. Science 323:1705-1708 (2009); Garaj et al., Nature 467:190-193 (2010); Merchant et al., Nano Lett. 10:2915-2921 (2010); Schneider et al., Nano Lett. 10:3163-3167 (2010).

En una realización, el dispositivo de la presente invención comprende 1-100 procesadores biomoleculares y nanotubos, 100-1000 procesadores biomoleculares y nanotubos, 1000-10000 procesadores biomoleculares y nanotubos, 10 000-100000 procesadores biomoleculares y nanotubos, o 100000-1 000000 procesadores biomoleculares y nanotubos. En otra realización, el dispositivo de la presente invención comprende más de 1000000 de procesadores biomoleculares y nanotubos. Una serie de procesadores biomoleculares y nanotubos se pueden alojar juntos en una cámara de nanosensores, con una serie de cámaras de nanosensores alojadas juntas en una unidad o módulo de nanosensores en un dispositivo como se describe con más detalle en el presente documento. Por ejemplo, en una realización, 8 procesadores biomoleculares y 8 nanotubos se alojan juntos para formar una cámara de nanosensores, comprendiendo la unidad de nanosensor ~2500 cámaras de nanosensores. 17524388,2

De conformidad con este aspecto de la presente invención, el dispositivo comprende además electrodos colocados en ubicaciones aguas arriba de la cámara de biorreactor y aguas abajo de uno o más nanotubos, y una fuente de tensión está acoplada eléctricamente a los electrodos para establecer un gradiente de tensión entre la ubicación aguas arriba de la cámara de biorreactor y aguas abajo de los uno o más nanotubos. Este gradiente de tensión hace que las moléculas pasen desde dicha cámara de biorreactor a través de uno o más nanotubos hasta el extremo de salida. Se coloca un detector dentro del dispositivo para medir los cambios en los niveles de corriente a través de los uno o más nanoporos a medida que las biomoléculas pasan a través de dichos uno o más nanotubos.

La serie de esquemas que se muestran en la figura 3 representan el desplazamiento de una sola molécula a través de un tubo de vuelo equipado con dos nanoporos y el cambio en la corriente (AI^b) en función del tiempo de desplazamiento de una sola molécula a través del tubo de vuelo. Como puede verse en el gráfico de la parte inferior de la figura 3, el flujo de corriente está en un estado de canal abierto antes de que la molécula entre en el nanocanal. Cuando la molécula entra en el canal pero antes de entrar en el poro en este ejemplo, AI^b comienza a mostrar una respuesta negativa, lo que indica que el flujo de iones se reduce cuando la partícula entra en este canal. En el poro en el plano, el valor de AI^b cae a un valor más bajo, pero con una naturaleza transitoria que indica que la partícula está dentro del volumen intersticial del poro y cae a su valor de nanocanal cuando la molécula existe en el primer poro. Al llegar al segundo nanoporo en el plano, se genera otro transitorio de corriente. La diferencia de tiempo entre el primer y el segundo transitorio de corriente, se puede deducir el tiempo de vuelo de una sola molécula. La amplitud de AI^b es mayor para el segundo nanoporo en el plano con respecto al primero, porque el diámetro de los poros es menor; la diferencia en el AI^b para el primer y segundo poro se puede deducir alargando el poro o ajustando el diámetro del poro.

También es posible utilizar una serie de tres o más nanoporos dentro del tubo de vuelo. En la figura 4, la ruptura del nanotubo representa la presencia de "n" poros colocados en serie, donde "n" es cualquier número deseado. Esto puede proporcionar muchos beneficios, como la capacidad de generar consenso entre las mediciones del tiempo de vuelo para reducir el error en la determinación. Además, se pueden imponer diferentes tipos de recubrimientos superficiales en las paredes de nanotubos entre un conjunto de poros como se ha descrito anteriormente para mejorar la identificación de una sola molécula aprovechando una técnica llamada cromatografía multidimensional. Este enfoque multidimensional también puede aumentar la capacidad máxima del sistema para permitir mayores capacidades de multiplexación.

La figura 4 también ilustra una cubierta superior 38 del nanotubo 6, y la colocación de los dos electrodos 36 en la cubierta superior 38, donde los electrodos se colocan cerca de los extremos de entrada y salida del nanotubo. En otra realización, la placa de cubierta puede contener un tercer electrodo que se coloca entre los nanoporos. De conformidad con esta realización, un nanotubo que contiene "n" nanoporos, puede contener "n" electrodos colocados en la placa de cubierta.

Las figuras 5 y 6 representan disposiciones alternativas de un solo electrodo para detectar cambios de corriente en los nanotubos.

En la realización representada en la figura 5, un nanocanal adicional se coloca ortogonal al nanotubo que contiene los nanoporos y se sitúa entre los dos nanoporos. Cuando el nanocanal se llena con una solución iónica y se conecta a un electrodo externo, el nanocanal lleno de solución iónica sirve como una base flotante común para mediciones de corrientes transitorias separadas en los dos nanoporos individuales, lo que también permite determinar el tiempo de vuelo de una molécula entre los dos nanoporos. Una estructura similar aparece divulgada en Menard et al., ACS Nano 6 (10): 9087-9094 (2012).

La realización representada en la figura 6 también muestra un electrodo construido ortogonal al nanotubo entre los dos nanoporos. Para no obstaculizar el movimiento de las moléculas que pasan por el pasaje del nanotubo, el electrodo ortogonal está situado para pasar a través de la superficie superior o inferior del tubo de vuelo. Se puede revestir una fina capa aislante sobre la superficie del electrodo. El electrodo ortogonal sirve como una base flotante común para mediciones de corrientes transitorias separadas en los dos nanoporos individuales, lo que también permite determinar el tiempo de vuelo de una molécula entre los dos nanoporos.

Los circuitos de amplificación electrónica son necesarios para detectar cambios en la corriente a medida que las moléculas atraviesan y ocluyen los nanoporos del nanotubo. Los diagramas de circuito de las figuras 7-14 muestran varias realizaciones alternativas de los circuitos electrónicos adecuados para detectar cambios de corriente dentro del nanotubo del dispositivo tal y como se describe en el presente documento.

La figura 7A muestra una vista superior de un nanotubo con un poro de entrada (poro 1) y un poro de salida (poro 2). Por encima del poro de entrada hay una cámara de fluido, o pozo, con el electrodo conductor A en contacto con el contenido de fluido del pozo. De la misma forma, debajo del poro de salida hay otra cámara de fluido con un electrodo. Las biomoléculas o nanopartículas suspendidas en una solución iónica se conducen iontoforéticamente desde el pozo superior al pozo inferior. A medida que la biomolécula se mueve a través del poro y lo obstruye, e produce un cambio en la corriente (corriente de bloqueo).

La figura 7B es un diagrama de circuito del nanotubo con electrodos y circuitos de medición. El diagrama del circuito muestra la tensión (VI), que es la fuente potencial para conducir moléculas o nanopartículas a través del nanotubo. VI se ajusta para proporcionar la velocidad de tránsito deseada de las moléculas a través del nanotubo y sus poros. El diámetro muy pequeño de cada uno de los nanoporos provoca una resistencia al flujo de corriente eléctrica, representado por "Rporo1" y "Rporo2". Cada una de estas resistencias se indica como una resistencia variable, dado que, cuando el poro está bloqueado por una molécula o partícula, la resistencia aumenta proporcionalmente al porcentaje del diámetro del poro que está bloqueado (o, como alternativa, proporcionalmente al tamaño de la molécula o partícula). Este cambio en la corriente es medido luego por el amplificador convertidor de corriente a tensión como se muestra, y su salida es:

V^salida _ I*Rf

Donde: V^salida es la tensión de salida del amplificador

I es la corriente resultante de la tensión de accionamiento aplicada a través de los poros

Rf es el valor de la resistencia de retroalimentación

La tensión de salida es un pulso con una duración que es proporcional a la velocidad de la molécula o partícula y la longitud de los poros. La amplitud del pulso de tensión es proporcional al cambio en la corriente debido al evento de bloqueo en cada poro. Cabe destacar que los circuitos de filtrado o modelado de pulsos, ya sea en forma analógica o digital se pueden utilizar con todos los circuitos mostrados en el presente documento para mejorar la relación S/N o para mejorar la detectabilidad de los eventos de bloqueo.

Las figuras 8A-B repiten muchas de las mismas características mostradas en las figuras 7A-B; sin embargo, la figura 8B muestra la introducción de una fuente de CA. En este caso, la fuente de tensión de CC, VI, todavía suministra el gradiente de tensión necesario para transportar las moléculas o partículas a través del nanocanal y sus poros, pero ahora las medidas de la corriente de bloqueo no dependen de la CC de VI. En este caso, una fuente de señal de CA está acoplada capacitivamente a través del nanocanal superponiendo una señal de CA en la parte superior de la tensión de activación de CC. Los cambios en la corriente de CA ahora se utilizan para detectar los eventos de bloqueo en lugar de la corriente de CC. Esto desacopla la medición de las corrientes de bloqueo de la tensión de accionamiento y cualquier cambio que pueda producirse en la tensión de accionamiento. Durante la operación normal, la tensión de accionamiento, VI, debe mantenerse a potenciales muy bajos para evitar que se produzca cualquier electroquímica en los electrodos. Esto limita la amplitud del cambio de corriente que se puede medir. Con la fuente de Ca , sin embargo, la frecuencia se elegirá para que sea lo suficientemente alta para evitar que se produzca la electroquímica. Además, dado que la señal de CA es simétrica alrededor de cero, no se producirá polarización de iones. Esto permite aplicar tensiones más altas a través del nanotubo sin afectar el tránsito de moléculas o partículas, aumentando así la corriente resultante que mejora la capacidad de medición del evento de bloqueo. Además, un filtrado (es decir, paso bajo, paso de banda, paso alto, o cualquier otra topología de filtro) se puede aplicar eficazmente para eliminar el ruido y la deriva. Es más, el procesamiento de señales se puede implementar para medir la amplitud y la fase de los cambios de corriente de bloqueo, presentando así mediciones adicionales correlacionadas que pueden usarse para mejorar la relación señal/ruido para medir el evento de bloqueo de corriente (por ejemplo, molécula residente dentro del nanoporo). Cabe destacar que en esta realización, y todas las realizaciones posteriores descritas a continuación, la fuente de CA también se puede acoplar a un transformador y se puede usar una toma central secundaria para establecer la tensión de punto medio o común.

Las figuras 9A-B ilustran una realización alternativa para medir la corriente de bloqueo tal y como se muestra en las figuras 7A-B y 8A-B. Este método implica medir el cambio de tensión en lugar del cambio de corriente directamente. Un método similar aparece descrito en Fraikin et al., "A High-throughput Label-free Nanoparticle Analyser", Nature Nanotechnology 6: 308-313 (2011). En esta realización, se coloca un tercer electrodo en el medio del nanotubo entre los poros. Las figuras 9A-B muestran la medición del cambio de tensión a través del segundo poro; sin embargo, el cambio de tensión se puede medir a través de cualquier poro (Rporo1 o Rporo2). Se puede usar un amplificador de tensión estándar con ganancia para realizar esta medición como se muestra. En esta realización, un evento de bloqueo en el Poro 1 hará que aumente la tensión medida a través de Rporo2. Un evento de bloqueo en el Poro 2 hará que la tensión medida disminuya. Esta disposición funciona mejor cuando las resistencias de los nanoporos son idénticas para obtener el mayor cambio de tensión para un evento de bloqueo en cada poro. Sin embargo, cuando las resistencias de los nanoporos difieren mucho, se puede añadir una resistencia física en serie con el poro de resistencia más bajo para igualar las tensiones. Este método de medición ofrece ciertas ventajas sobre el método de medición de corriente de las figuras 7A-B y 8A-B, porque, para ciertos valores de Rporo, la relación señal-ruido y el ancho de banda de un amplificador de tensión puro pueden ser mejores que los de un amplificador de corriente a tensión.

La realización representada en las figuras 10A-B muestra todas las características de las figuras 9A-B, excepto que el amplificador de tensión ahora está acoplado capacitivamente. Este acoplamiento capacitivo puede crearse mediante el uso de un condensador físico en serie con el electrodo, o puede ser de un aislante dieléctrico aplicado al electrodo medio en sí (o debido a otras propiedades físicas del propio electrodo). El primer método de acoplamiento capacitivo crea un filtro de paso alto que puede diseñarse para eliminar el ruido de baja frecuencia y la deriva de la medición. El segundo método de acoplamiento capacitivo debido a la aplicación de un aislante al electrodo puede ayudar a hacer que el electrodo sea químicamente inerte y así reducir o eliminar su efecto sobre los potenciales de campo de CC y sobre las moléculas o partículas a medida que atraviesan el nanotubo. Este acoplamiento capacitivo se puede utilizar porque la firma de tensión de un evento de bloqueo es teóricamente un pulso cuadrado único que se puede reproducir razonablemente bien capturando solo su contenido de alta frecuencia. El valor de C1 se puede ajustar para optimizar la frecuencia de corte del filtro de paso alto que se forma.

Las figuras 11A-B representan el uso de una señal de tensión de CA superpuesta a la tensión de control de CC (VI) que, como las figuras 8A-B anteriores, separa la fuente de tensión de excitación de la fuente de medición y tiene todas las mismas ventajas que las descritas para las figuras 8A-B. A1 puede estar acoplado en CA o CC a través de C2. C2 puede ser un condensador en serie o, como se ha descrito anteriormente, puede ser un dieléctrico asociado con el propio electrodo.

En las figuras 12A-B, se utilizan dos fuentes de tensión de CC dispuestas de forma bipolar para impulsar moléculas o partículas a través del nanotubo. Estas fuentes de tensión se pueden reemplazar por una sola fuente, pero tener una fuente bipolar permite que una conexión de punto medio se use opcionalmente como un común, o referencia, en los circuitos cuando eso pueda proporcionar una ventaja. Este método de accionamiento bipolar también permite aplicar diferentes tensiones de accionamiento a través de los dos poros, permitiendo un control diferencial total de la velocidad a través de los poros individuales. Los amplificadores A1, A2 y A3 están dispuestos en una topología típica de amplificador diferencial o amplificador de instrumentación (InAmp). Esta topología de circuito se puede diseñar a partir de componentes discretos (transistores u OpAmps) o se puede utilizar una de las muchas implementaciones comerciales de amplificadores de instrumentación.

Las realizaciones mostradas en las figuras 13A-B son idénticas a las mostradas en las figuras 12A-B, excepto porque muestran el acoplamiento de CA del electrodo central. Al igual que antes, C1 puede ser un condensador de acoplamiento en serie o puede deberse a un dieléctrico asociado con el propio electrodo.

La realización mostrada en las figuras 14A-B ilustra el uso de una fuente de CA acoplada capacitivamente superpuesta a la tensión de activación de CC. El uso de la fuente de CA tiene las mismas ventajas enumeradas en las realizaciones anteriores descritas anteriormente. Los amplificadores diferenciales pueden estar acoplados en CA o CC como se ha descrito anteriormente mediante el uso de C2. Se puede utilizar filtrado o procesamiento de señales en la salida.

La figura 15 muestra dos métodos para detectar y procesar las señales de eventos de bloqueo generadas por una biomolécula en un solo nanotubo. En ambos casos, el amplificador A junto con el filtrado/procesamiento de la señal pueden representar cualquiera de los métodos de medición mostrados en las figuras 7 a 14. En el método que se muestra en la figura 15A, las señales de pulso de los eventos de bloqueo en cualquiera de los poros se convierten continuamente en un convertidor analógico a digital (CAD) y se presentan a través de un bus al equipo de procesamiento / computación de datos. Esto requiere un alto ancho de banda de conversión para el CAD y presenta una cantidad significativa de datos al equipo de procesamiento a lo largo del tiempo. Además, este método recopila datos a una tasa de conversión alta incluso cuando no hay señales de bloqueo presentes. El equipo de procesamiento de datos debe tomar estos datos y utilizar algoritmos para determinar la altura del pulso y el tiempo de vuelo. Este método funciona bien para experimentos de investigación o análisis de bajo rendimiento, pero, cuando el proceso se escala a miles o millones de nanotubos, el rendimiento de los datos se vuelve insostenible. La figura 15B muestra un método alternativo que permite reducir la cantidad de datos necesarios. En las formas de realización en las que solo se recopilan datos de tiempo de vuelo, las señales de bloqueo pueden enrutarse a un discriminador de fracción constante que proporciona un pulso de tiempo para el evento de bloqueo de entrada y otro pulso de tiempo para el evento de salida. El pulso de entrada inicia el contador de intervalos de tiempo mientras que el pulso de salida detiene el contador. El contador de intervalo de tiempo luego pasa un solo número al equipo de procesamiento de datos que representa el tiempo de vuelo. Esto reduce potencialmente millones de muestras por segundo a solo un valor por cada par de eventos de bloqueo. En realizaciones en las que se mide la magnitud del evento de bloqueo, el discriminador de fracción constante se puede utilizar para activar una muestra/retención y el CAD de modo que solo se conviertan unos pocos valores para cada evento de bloqueo. Esto reduce la cantidad de datos a unos pocos puntos durante cada evento de bloqueo en lugar de ejecutar el c A d continuamente.

Se requieren conexiones eléctricas entre la unidad de nanosensores y los circuitos electrónicos externos para medir los transitorios de corriente generados cuando las moléculas se desplazan a través de los nanoporos sintéticos en el plano. Además, también debe producirse la tensión de activación para producir la electroforesis de los productos generados en fase sólida después de la liberación del espacio de los soportes sólidos de la cámara de biorreactor. La figura 16 es un diagrama que muestra una configuración que permite conexiones eléctricas de alta densidad entre la unidad de nanosensor 50 y una placa de circuito impreso (PCB) 52 típica. Los contactos de oro 54, 56 están chapados en el nanosensor 50 y en la PCB 52 como se describe a continuación. Los conectores elastoméricos ("Zebra") 58 se utilizan para realizar la conexión entre las almohadillas de oro 54, 56. Los conectores elastoméricos 58 son conectores disponibles comercialmente que comprenden capas conductoras y aislantes alternas en un elastómero compresible. Se usan almohadillas de oro 54, 56 con un ancho para aceptar al menos dos capas conductoras en el conector elastomérico 58 para facilitar la alineación de los paneles y el conector. El nanosensor 50 y la PCB 52 se someten a compresión para realizar la conexión. El nanosensor se puede quitar y reemplazar, lo que permite que el nanosensor sea un componente desechable.

Las conexiones eléctricas se pueden fabricar adoptando la estrategia descrita en Kong et al., Electrophoresis 27:2940-2950 (2006). En este caso, la placa de cubierta superior está moldeada por inyección con el plástico apropiado para hacer los agujeros pasantes necesarios. La posición de los cables eléctricos en la placa de plástico se define exponiendo la placa de cubierta de plástico con radiación UV/O³ a través de una máscara óptica que crea los grupos funcionales de ácido carboxílico solo en los lugares donde el plástico estuvo expuesto a la radiación. La placa con fotopatrón se sumerge en una solución de etilendiamina que contiene EDC para la aminación selectiva del área fotolizada. El sustrato aminado selectivamente se sumerge secuencialmente en soluciones acuosas de HAuCU, NaBH⁴ y KSCN para prepararse para el recubrimiento electrolítico. Los microcontactos de oro se platean sin electricidad en el área activada selectivamente de la placa de plástico colocando la placa en un baño de baño de oro que contiene Na³Au (TAN³)², NaSO³ y formaldehído.

Para hacer que un dispositivo de la presente invención sea comercialmente útil, es necesario que las cámaras de nanosensores funcionen en grandes conjuntos. En consecuencia, los componentes electrónicos están integrados en forma de chip como circuitos integrados (CI) con suficientes canales de entrada y salida para manejar la matriz de cámaras de nanosensores. Estos circuitos integrados se pueden encapsular utilizando tecnologías de alta densidad como el empaquetamiento HyperBGA y se pueden montar en una placa de circuito impreso (PCB).

El Sistema de Procesador Molecular Universal (uMPS)

El dispositivo de la presente invención comprende una o más unidades o módulos definidos por el sustrato sólido y aguas arriba de dicho procesador biomolecular y uno o más nanotubos. Los uno o más módulos adicionales están configurados para realizar la preparación y el procesamiento de muestras, es decir, el aislamiento y la preparación de moléculas de ácido nucleico objetivo dentro de una muestra para entrar en el procesador biomolecular y al nanotubo. En las figuras 17A se representa un dispositivo ilustrativo como se describe en el presente documento que contiene una pluralidad de procesadores biomoleculares y nanotubos alojados juntos en una unidad de nanosensores junto con una pluralidad de unidades específicas de tarea diseñadas para preparar una muestra biológica para su procesamiento y detección en el procesador biomolecular y nanotubo y 17B y denominado en el presente documento Sistema Procesador Molecular Universal (uMPS).

El uMPS 100 mostrado en las figuras 17A (vista en perspectiva) y 17B (vista superior) está compuesto por 10 módulos específicos de tareas 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550 y 50, que están conectados a una placa de base de fluido 102 y organizados en 3 subsistemas, que se describen a continuación. Los módulos se fabrican a partir de plásticos utilizando tecnologías como, sin limitación, troquelado en caliente, moldeo por inyección o impresión. El plástico particular seleccionado para cada módulo se basa en optimizar la tarea realizada en ese módulo. Estos módulos se conectan a la placa de base de fluido mediante interconexiones sin fugas que también están diseñadas para reducir al mínimo los volúmenes no barridos, así como las soluciones de desgasificación (eliminar las burbujas de aire) a medida que las soluciones se mueven a través de las interconexiones. Los módulos están alineados con respecto a la placa de base mediante pasadores y ranuras en V grabados en los sustratos. Las superficies de plástico también se modifican mediante procedimientos para evitar artefactos de adsorción no específicos.

El módulo de nanosensor 50, representado como el último módulo en el dispositivo uMPS 100 de la figura 17A, aloja los procesadores biomoleculares y nanotubos tal y como se ha descrito anteriormente. La unidad de nanosensores 50 del uMPS aloja 100-1 000000 cámaras de nanosensores 30, donde cada cámara de nanosensores aloja 8 procesadores biomoleculares y 8 nanotubos (véase figura 1A, 30). En una realización, la unidad de nanosensores aloja 2500 cámaras de nanosensores, teniendo cada cámara de nanosensor una dimensión de ~200 pm x ~410 pm.

A continuación, se muestran los cálculos para la huella de 2500 cámaras de nanosensores para aceptar 400 mil millones de ADN monocatenario.

Cuadrado que contiene 2500 cámaras = 20000 procesadores biomoleculares:

2500 = XY = 2,05Y2; por lo tanto Y = 34,9 = 35

Por tanto, X = 71,6

2500 cámaras caben en una matriz de 14,3 x 14,3 mm = 1,4 x 1,4 cm de tamaño = cuadrado de 1,524 x 1,524 cm (0,6 x 0,6 in).

Cuadrado que contiene 25000 cámaras = 200000 procesadores biomoleculares:

25000 = XY = 2,05Y2; por lo tanto, Y = 110,43

Por tanto, X = 226,38

25 000 cámaras caben en una matriz de 45 x 45 mm, = 4,5 x 4,5 cm de tamaño = cuadrado de 4,572 x 4,572 cm (1,8 x 1,8 in).

Los tamaños calculados de estos números de cámaras de nanosensores colocados en el módulo de nanosensores 50 permitirán que este módulo encaje fácilmente en una oblea de 6 pulgadas que comprende el uMPS 100 y proporcionará suficiente espacio para alojar los otros módulos de procesamiento 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550 como se muestra en las figuras 17A-17B.

Dependiendo de la aplicación del uMPS, puede ser deseable maximizar el número de procesadores biomoleculares por dispositivo uMPS. De este modo, en una realización, la cámara del nanosensor se puede optimizar para exhibir dimensiones de 175 x 175 pm, que contiene 8 procesadores biomoleculares, cada uno en una huella de 25 x 16 pm (cada procesador biomolecular con 288 pilares). Con un espaciado de 5 pm entre procesadores biomoleculares de 16 pm x 8 5 pm de pared = 175 pm de ancho. Área de entrada de 25 pm Deflectores Chevron de 50 pm Procesadores biomoleculares de 25 pm Tubo de vuelo de 50 pm espacio de 20 pm 5 pm para pared = 175 pm. Una oblea de 10,16 x 10,16 cm (4 x 4 pulgadas) = 101,6 mm x 101,6 mm. Eso significa 580 x 580 = 336400 cámaras x 8 procesadores biomoleculares = 2691 200 procesadores biomoleculares. Por lo tanto, en esta realización, una oblea de 10,16 x 10,16 cm (4 x 4 pulgadas) contiene aproximadamente 336000 cámaras y 2600000 procesadores biomoleculares.

Una oblea de 15,24 x 15,24 cm (6 x 6 pulgadas) = 152,4 mm x 152,4 mm, pero usando solo 135 mm (5,3 pulgadas) por lado = 135 mm x 135 mm. Eso significa 771 x 771 = 594441 cámaras x 8 procesadores biomoleculares = 4 755528 procesadores biomoleculares. Por lo tanto, en esta realización, una oblea de 15,24 x 15,24 cm (6 x 6 pulgadas) contiene alrededor de 600000 cámaras y 4700000 procesadores biomoleculares.

El dispositivo de la presente invención puede contener una o más de las unidades específicas de tarea (también denominadas módulos) representadas en el dispositivo uMPS de las figuras 17A y 17B en combinación con la unidad de nanosensor que aloja los procesadores biomoleculares y los nanotubos. La combinación particular de unidades depende de la función deseada del uMPS (es decir, la muestra que se analiza (por ejemplo, exosoma frente a ADN libre circulante frente a RNA) y el punto final que se analiza (por ejemplo, detección de mutaciones, enumeración del número de copia, detección de metilación, secuenciación, etc.)). En una realización de la presente invención, el dispositivo contiene todos los módulos del dispositivo uMPS mostrados en las figuras 17A y 17b . Dependiendo de la aplicación particular del dispositivo, solo se utilizan módulos seleccionados al procesar una muestra en particular, es decir, no es necesario utilizar todos los módulos del dispositivo para el análisis de muestras. Por ejemplo, en una realización, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 o los 9 módulos del dispositivo uMPS se pueden utilizar para cualquier aplicación dada en combinación con el módulo de nanosensor 50. El flujo de la muestra a, a través de y/o en sentido opuesto a varios módulos del dispositivo se conduce a través de la red de microfluidos 134 de la placa de base 102, y se controla mediante una serie de válvulas 132 ubicadas a lo largo de la red de microfluidos. Los depósitos de reactivo 108-114, 118, 120, 124-130, lavado 106, aire 116 y residuos 122 se alinean en los bordes exteriores opuestos de la placa de base, lo que facilita la entrega y extracción de los componentes de reacción a los diversos módulos específicos de la tarea.

Con referencia a la figura 17A, el primer subsistema del dispositivo uMPS está compuesto por 6 módulos y es capaz de manipular una muestra de sangre que entra en el dispositivo en el orificio de entrada de muestra 104 para aislar las células biológicas objetivo (por ejemplo, células tumorales circulantes (CTC), células inmunes, etc.) o patógenos microbianos, a través del módulo de selección de célula 150, separar el plasma de los glóbulos rojos y blancos a través de la unidad de aislamiento de plasma 200 y extraer ADN libre circulante y/o seleccionar exosomas del plasma a través de los módulos de extracción en fase sólida 250 y 300, respectivamente. Los otros dos módulos para este subsistema consisten en un sensor de impedancia 350 que se utiliza para contar las células individuales liberadas del módulo de selección de células, y un módulo de extracción en fase sólida 400 para capturar ADN/ARN liberado de células biológicas lisadas seleccionadas de sangre.

En la figura 18A se muestra una vista en perspectiva del módulo 150 de selección de célula. El módulo consiste en un orificio de entrada 152, un lecho de captura 154 y un orificio de salida 156. En la figura 18B se muestra una vista en perspectiva ampliada del lecho de captura 154. Tal y como se muestra en esta figura, el lecho de captura comprende una multitud de canales paralelos 160, donde los canales tienen una sinusoidal, cuasisinusoidal u otra forma de canal serpenteante utilizada para mejorar el contacto entre las células en la muestra de fluido y las paredes del canal 162. Los canales tienen una relación de aspecto alta (3:1 o más), con un ancho del orden de 1-2 veces el diámetro de la célula objetivo. Las paredes del canal están decoradas con anticuerpos monoclonales, aptámeros u otras moléculas de unión específicas para un tipo de célula objetivo (Kamande et al., Anal. Chem. 85:9092-9100 (2013) y Pullagurla et al., Anal. Chem. 86:4058-4065 (2014)). Siguiendo el flujo de la muestra, las células objetivo unidas a las paredes del canal del módulo de selección 150 se lavan mediante fluido de lavado desde el depósito de lavado 106 (véase la figura 17B).

Para liberar selectivamente las células objetivo después de la captura y el lavado, el anticuerpo monoclonal, aptámero, u otro agente de afinidad utilizado para capturar las células objetivo se une a la superficie de la pared del canal a través de un oligonucleótido con un conector heterobifuncional (SMCC) como se muestra en la figura 19. En una realización, los conectores de oligonucleótidos contienen un nucleótido modificado, por ejemplo, uridina o residuo fotoescindible, que se escinde enzimáticamente para liberar las células objetivo unidas por el anticuerpo o aptámero. El tampón de liberación que contiene la enzima de escisión se aloja en el depósito de liberación 108 adyacente al módulo de aislamiento celular 150 como se muestra en las figuras 17A y 17B. El uso de conectores de oligonucleótidos es atractivo porque son de bajo coste, la eficiencia de liberación es > 93 % y > 90 % de las células liberadas permanecen viables. Además, debido a la acción selectiva del reactivo de resección específico de uracilo USER (Uracil-Specific Excision Reagent en inglés), las células que no se unen específicamente a la superficie de la pared del canal no se liberan. La inmovilización de moléculas de captura por afinidad, por ejemplo, anticuerpos o aptámeros, a las paredes del canal del módulo de selección de célula implica irradiación UV/O³ (254 nm) de un termoplástico para producir ácidos carboxílicos confinados en la superficie para la unión covalente del oligonucleótido a través de un grupo amino 5'; el sulfhidrilo en su extremo 3' reacciona con el conjugado SMMC/afinidad.

Como alternativa, se pueden emplear otros métodos para liberar objetivos celulares seleccionados por afinidad, por ejemplo, la liberación de CTC de superficies sólidas decoradas con agentes de afinidad se puede lograr mediante tripsinización (Dharmasiri et al., Anal. Chem. 83:2301-2309 (2011); Kamande et al., Anal. Chem.85:9092-9100 (2013); Adams et al., J. Am. Chem. Soc. 130:8633-8641 (2008); y Sheng et al., Lab Chip. 14:89-98 (2014)), hydrogels (Hatch et al., Langmuir 27:4257-4264 (2011); Yu et al., Small 9:3895-3901 (2013); y Shah et al., Anal. Chem. 84:3682-3688 (2012)), mediated magnetic release (Yu et al., Small 9:3895-3901 (2013)), exonuclease digestion of aptamers (Chen et al., Adv. Materr 23:4376-4380 (2011) y Shen et al., Adv. Mater. 25:2368-2373 (2013)), or PGLA nanofibers with sections removed via laser-microdissection (Hou et al., Angew Chem. Int. Ed. Engl.52:3379-3383 (2013)).

El módulo de selección de células se fabrica utilizando un plástico y se produce mediante microrreplicación. Los métodos para fabricar y utilizar el módulo de selección de células representado en la figura 18 se describen con más detalle en la publicación de patente de los Estados Unidos n.° 20120100521 de Soper. et al., Dharmasiri et al., Analytical Chem. 83:2301-2309 (2011); and Jackson et al., Lab Chip 14(1): 106-107 (2014). Se conocen en la técnica módulos alternativos de selección de células nanoestructuradas que son adecuados para su uso en el dispositivo uMPS de la figura 17, véase, por ejemplo, (Lim et al., Lab Chip. 12:4388-4396 (2012); Wang et al., Angew Chem. Int. Ed. Engl. 50:3084-3088 (2011); Wang et al., Angew Chem. Int. Ed. Engl. 50:3084-3088 (2010); Stott et al., Proc. Nat'l. Acad. Sci. U.S.A. 107:18392-18397 (2010); Lin et al., Clin. Cancer Res.16:5011-5018 (2010); Hosokawa et al., Anal. Chem.82:6629-6635 (2010); Xu et al., Anal. Chem.81:7436-7442 (2009); y Tan et al., Biomed. Microdev. 11:883-892 (2009)).

El dispositivo de la presente invención puede comprender además una unidad de tipo aislamiento de plasma de extensión longitudinal que está definida por el sustrato sólido y aguas arriba del procesador biomolecular y uno o más nanotubos. La unidad de tipo aislamiento de plasma de extensión longitudinal comprende un paso de entrada, un paso de descarga que es más ancho que el paso de entrada y un paso de transición que conecta el paso de entrada y el paso de descarga. El paso de transición se hace más ancho y menos profundo a medida que el paso de transición progresa desde el paso de entrada al paso de descarga. La unidad de aislamiento de plasma también comprende canales laterales principales que se extienden lateralmente en sentido opuesto al paso de entrada, donde un separador, colocado entre el paso de entrada y cada canal lateral principal, está dimensionado para permitir que el plasma, pero no las células, pase del paso de entrada a los canales laterales principales. La unidad de aislamiento de plasma también comprende canales laterales secundarios que se extienden lateralmente lejos del paso de descarga, donde un separador, colocado entre el paso de descarga y cada canal lateral secundario, está dimensionado para permitir que el plasma, pero no las células, pase del paso de entrada a los canales laterales secundarios.

La unidad de aislamiento de plasma 200 está ubicada adyacente a la unidad de aislamiento de células 150 en el dispositivo uMPS de la figura 17A. En las figuras 20A-20D se representa una unidad de aislamiento de plasma ilustrativa. Tal y como se muestra en la figura 20A, la unidad de aislamiento de plasma comprende un canal de aislamiento cónico primario (es decir, paso de entrada) 204 que se abre a un canal de aislamiento secundario más ancho (es decir, paso de descarga) 208. La sección transversal de la figura 20D, que se toma a través de la línea 20D 20D de la figura 20A, muestra que el canal de aislamiento primario 204 tiene una profundidad de aproximadamente 130 |jm que permite la eliminación de plasma de alta velocidad de flujo. Un canal de transición 206 que sirve como filtro de selección de tamaño conecta el canal de aislamiento primario más profundo 204 al canal secundario 208 que tiene una profundidad de solo aproximadamente 30 jm (véase la figura 20D). Los canales laterales principales 210 se utilizan para recoger y transportar el plasma que se separa de la muestra de sangre que entra en el módulo de aislamiento de plasma a través del orificio de entrada 202. La figura 20B es una sección transversal a través de la línea 20B-20B de la figura 20A, mostrando el orificio lateral del canal primario 228 (-2 jm de altura), que recorre la longitud del canal primario 204 y el canal de transición 206, y se abre al canal lateral primario 210. Con referencia a la figura 20B, el orificio del lado del canal primario 228 está formado por un separador primario 212 que está posicionado entre el canal de aislamiento primario 204 y los canales del lado primario 210. El separador primario 212 está dimensionado para permitir que el plasma, pero no las células, salga del canal primario 204 a través de los orificios laterales del canal primario 228, en los canales laterales principales 210. Los canales laterales principales 210 conducen a los orificios receptores primarios 216 que recogen el plasma y sus constituyentes (por ejemplo, exosomas, ADN libre circulante e iones), mientras que los materiales celulares, como eritrocitos y leucocitos, se transportan a lo largo de la pared de filtración y hacia el orificio de desechos 224. El plasma que ha entrado en el canal de aislamiento secundario (es decir, el conducto de descarga) 208, sale igualmente del canal de aislamiento secundario 208, a través de los orificios 230 laterales del canal secundario y fluye hacia los canales laterales secundarios 218 para su recogida en el orificio del receptor secundario 226. El orificio del lado del canal secundario 230 está formado por un separador secundario 220 que se coloca entre el canal de aislamiento secundario 208 y los canales del lado secundario 218. El separador secundario 220 está dimensionado para permitir que el plasma, pero no las células, salga del canal secundario 208 a través de los orificios laterales del canal secundario 230, en los canales laterales secundarios 218. El material celular que no pasa a través de los orificios del canal lateral secundario 230 se desplaza a lo largo de la pared del canal secundario hacia el orificio de desechos 224. La figura 20C es una sección transversal a través de la línea 20C-20C de la figura 20A que muestra el canal secundario 208, el orificio del canal lateral secundario 230, el separador secundario 220 y el canal lateral secundario 218. El plasma recogido en los orificios del receptor primario y secundario se envía a otros módulos de procesamiento, por ejemplo, las unidades de tipo extractor para el aislamiento de exosomas y ADN libre circulante. La eficacia de eliminación y la tasa de recuperación de plasma se ven afectadas por el ajuste de las tasas de flujo en los orificios del receptor 216, 226.

Los canales primarios, secundarios y laterales se sellan con una placa de cubierta 232 mediante unión por fusión térmica. Dos bombas de jeringa que funcionaban en modo de succión en los orificios receptores laterales primario 216 y secundario 226, y la salida de desechos 224 controlaban de forma fluida el sistema. Los desechos de la unidad de aislamiento de plasma salen de la unidad y se recogen en el depósito de desechos 122 en el uMPS (figura 17A).

En las figuras 21A-21B se muestra un módulo de aislamiento de plasma alternativo. Este dispositivo separa los glóbulos blancos y los glóbulos rojos del plasma que contiene exosomas y ADN libre de células en función de las diferencias en la sedimentación, como describió anteriormente Dimov. et al., Lab on a Chip, 11: 845-850 (2011). La vista en perspectiva de la figura 21A muestra un módulo de aislamiento de plasma alternativo ilustrativo 600 que consiste en un orificio de entrada 602 y un canal de introducción 604. El canal de introducción 604 se cruza con una serie de canales de aislamiento paralelos 606, conteniendo cada canal de aislamiento una trampa de glóbulos sanguíneos 608. La figura 21B, que es una vista en sección transversal a través de la línea 21B-21B de la figura 21A, muestra el orificio de entrada 602, donde una muestra de sangre entera entra en el módulo, y uno de los canales de aislamiento paralelos 606 contiene una trampa 608. Cada trampa tiene -1 cm de profundidad, tiene un diámetro de -0,24 cm y un volumen total de ~0,045 ml. A medida que la muestra se desplaza a través del canal de aislamiento, los glóbulos sanguíneos quedan retenidos en la trampa de glóbulos 608, mientras que el plasma y sus constituyentes (por ejemplo, exosomas, ADN libre circulante e iones) salen del canal de aislamiento que fluye hacia el canal de salida común 610 y salen del módulo a través del orificio de salida 612.

Para aumentar el rendimiento y la cantidad de glóbulos sanguíneos que se pueden recolectar, se colocan diez canales de aislamiento 606, conteniendo cada uno una trampa de glóbulos 608 en una configuración en z, en disposición paralela, tal y como se muestra en la figura 21A. El canal de introducción 604 tiene un área de sección transversal grande que se llena de sangre antes de que la sangre entre en cada canal de aislamiento 606 que contiene la trampa 608 debido a la menor resistencia fluídica en estos canales más grandes. Para un dispositivo que contiene 10 trampas, el volumen de producción es de 0,25 ml/s y el volumen total de glóbulos sanguíneos que pueden contener las trampas es de 0,45 ml.

En una realización, el dispositivo de la presente invención comprende además una o más unidades de extracción. Cada unidad de tipo extractor está definida por el sustrato sólido y ubicada aguas arriba del procesador biomolecular y uno o más nanotubos. La unidad de tipo extractor comprende soportes sólidos con pasos entre ellos, donde los soportes sólidos están provistos de un material adecuado para inmovilizar ácidos nucleicos o exosomas o vesículas.

Las unidades de tipo extractor se representan como módulos 250 y 300 del uMPS mostrado en las figuras 17A y 17B, donde el módulo 250 es adecuado para la extracción de exosomas y el módulo 300 es adecuado para la extracción de ácidos nucleicos. Estructuralmente, estos módulos son los mismos, y en la figura 22 se representa una unidad de tipo extractor 250 ilustrativa. Estos módulos se diferencian en el material sobre los soportes sólidos que se utiliza para inmovilizar el objetivo deseado (es decir, exosoma o ácido nucleico). Siguiendo en referencia a la realización ilustrada en la figura 22, la unidad de tipo extractor 250 comprende un canal de entrada 252 que se cruza con una serie de canales paralelos 254, cada canal contiene al menos un lecho de extracción 256. Mientras que la unidad de tipo extractor 250 de la figura 22 se muestra con una serie de cinco lechos de extracción 256 dispuestos en paralelo, la unidad de tipo extractor 250 puede diseñarse fácilmente para contener más de diez lechos de extracción en la misma configuración paralela. La disposición de los lechos de extracción en paralelo proporciona un direccionamiento uniforme de todos los lechos con una velocidad de flujo constante cuando se estrecha el canal de introducción 254 del lecho extractor y los canales de salida del lecho extractor 260. Además, dentro de un solo lecho de extracción 256, toda la circunferencia del soporte sólido 258 es accesible uniformemente mediante el objetivo (Battle et al., Analyst 139:1355-1363 (2014)). Los soportes sólidos 258 del lecho extractor 256 pueden ser, por ejemplo y sin limitación, pilares (por ejemplo, pilares de policarbonato), perlas (por ejemplo, perlas de sílice) (Breadmore et al., Anal. Chem, 75:1880-1886 (2003)), pilares de silicio grabados con iones reactivos (Christel et al., J. Biomech. Engin. 121:22-27 (1999)), o resinas (Tian et al., Anal. Biochem. 283:175-191 (2000)). Los pasos entre los soportes sólidos pueden tener cualquier configuración deseada, por ejemplo, una configuración sinusoidal. A medida que la muestra fluye a través del lecho de extracción 256, la molécula objetivo, por ejemplo, los exosomas o ADN libre circulante se capturan en el soporte sólido mediante el agente de afinidad inmovilizado apropiado. El resto de la muestra sale del lecho extractor a través del canal de salida 260, y el módulo SPE 250 a través del canal de salida común del módulo SPE 262. Con referencia a las figuras 17A y 17B, las unidades de tipo extractor 250, 300 se introducen con tampón de inmovilización, reactivos de lavado y liberación de los depósitos adyacentes 112, 106 y 108, respectivamente, en la placa de base del dispositivo 100.

En una realización, la unidad de tipo extractor está hecha de policarbonato con lechos de extracción poblados con micropilares tal y como se describe en la publicación de solicitud de patente de Estados Unidos n.° 20040191703 a Soper et al. Los lechos de extracción de policarbonato en fase sólida (SPE) como estos se pueden fabricar utilizando un solo paso de replicación y la preparación del lecho solo requiere irradiación UV/O³ (Witek et al., Nucl. Acids Res.

34(10):e74 (2006)). Los diámetros y el espaciado de los pilares/perlas se varían para optimizar la recuperación de la molécula objetivo.

Para liberar selectivamente moléculas objetivo (por ejemplo, exosoma o ácidos nucleicos), los agentes de afinidad se pueden unir a las superficies de soporte mediante un oligonucleótido y un agente de afinidad modificado con un conector heterobifuncional (SMCC) que contiene nucleótidos escindibles como se ha descrito anteriormente con respecto a la unidad de aislamiento celular y se muestra en la figura 19. Tal y como se ha descrito anteriormente, la inmovilización de los agentes de captura por afinidad implica irradiación UV/O³ (254 nm) de un termoplástico para producir ácidos carboxílicos confinados en la superficie para la unión covalente del oligonucleótido a través de un grupo amino 5'; el sulfhidrilo en su extremo 3' reacciona con el conjugado SMMC/afinidad.

Una unidad de tipo extractor adecuada para extraer exosomas emplea reactivos de selección por afinidad específicos para exosomas circulantes. En este módulo, los pilares están decorados con anticuerpos o aptámeros específicos para exosomas. Por ejemplo, los pilares pueden estar decorados con anticuerpos o aptámeros específicos para las proteínas CD63 o RAP5 que se expresan en la población de exosomas circulantes (Clayton et al., J. Immunol. Methods 247:163-174 (2001); Zhou et al., Methods S1046-2023(15):30130-4 (2015)). Como alternativa, los pilares pueden estar decorados con anticuerpos o aptámeros específicos para EpCAM, Her2/neu, o separasa para seleccionar exosomas relacionados con tumores de una muestra. En una realización, el módulo extractor de exosomas está hecho de COC porque este material puede activarse con rayos UV de manera eficiente para proporcionar altas cargas de grupos funcionales en forma de ácidos carboxílicos confinados en la superficie incluso para estructuras de alta relación de aspecto (Jackson et al., "UV Activation of Polymeric High Aspect Ratio Microstructures: Ramifications in Antibody Surface Loading for Circulating Tumor Cell Selection", Lab on a Chip 14:106-117 (2014)).

Una unidad de tipo extractor ilustrativa adecuada para extraer ADN libre circulante puede comprender un lecho SPE de policarbonato que se ha activado con UV para aislar ADN cortos, similar en tamaño al a Dn libre circulante. La eficacia del aislamiento de ADN libre circulante depende de la composición del tampón de inmovilización. En una realización, un tampón de inmovilización adecuado comprende polietilenglicol (PEG), cloruro de sodio (NaCl) y etanol (EtOH).

En una realización, el dispositivo de la presente invención comprende además una unidad de tipo sensor definida por el sustrato sólido y aguas arriba del procesador biomolecular y el uno o más nanotubos. La unidad de tipo sensor comprende una entrada y una salida y está configurada para contar las células que pasan a través de la unidad de tipo sensor. La unidad de tipo sensor también comprende un par de electrodos y un canal fluídico. El canal fluídico está entre el par de electrodos y acoplado fluídicamente a dicha unidad de tipo separador.

La unidad de tipo sensor del dispositivo se representa como módulo 350 del uMPS tal y como se muestra en las figuras 17A y 17B. Una unidad de tipo sensor ilustrativa, también conocida como unidad de impedancia, se muestra en las figuras 23A y 23B. El módulo de impedancia se utiliza para enumerar las células liberadas de las unidades ascendentes del dispositivo y determinar su viabilidad.

Un módulo de impedancia ilustrativo adecuado para su incorporación en el dispositivo como se describe en el presente documento o como módulo independiente es un módulo de 3 capas que consiste en electrodos en la cara superior e inferior de un canal fluídico. En la figura 23A se representa una vista en perspectiva de este módulo, y la vista en despiece de la figura 23B muestra las capas individuales del dispositivo. Tal y como se muestra en estas figuras, la primera capa o capa superior 364 tiene una superficie superior e inferior, donde los orificios de entrada 352 y salida 358 están ubicados en la superficie superior de la primera capa. La primera capa 364 también tiene microelectrodos 356 en su superficie inferior que se cruzan con el canal de microfluidos 354 de la capa intermedia 366 en el módulo ensamblado. La segunda capa o capa inferior 368 de la unidad de impedancia 350 también tiene superficies superior e inferior. La segunda capa 368 tiene microelectrodos 360 en su superficie superior que se cruzan con el microcanal 354 de la capa intermedia opuesta a los microelectrodos 356 ubicados en la superficie inferior de la primera capa 364 en la unidad ensamblada. La superficie superior de la segunda capa (inferior) también tiene almohadillas de contacto 362 que contactan con los microelectrodos 356 en la superficie inferior de la primera capa (superior) 364 en la unidad ensamblada. La segunda capa también contiene orificios cónicos hembra utilizados para interconectar el módulo de impedancia a la placa de base de fluido. La capa intermedia 366 del módulo comprende una fina capa de plástico que contiene el canal microfluídico 354. La capa intermedia establece el espaciado entre los microelectrodos 356, 360 de la primera y segunda capa, respectivamente. Una sección del canal de microfluidos que sirve como volumen de detección tiene un orificio pasante para permitir el contacto eléctrico de la solución con los electrodos superior 356 e inferior 360.

Durante su uso, el módulo de impedancia enumera las células liberadas desde la superficie de captura aguas arriba del módulo de separación de células y también determina su viabilidad. Una célula que contiene la muestra entra en el módulo de impedancia 350 a través del orificio de entrada 352 y se desplaza a través del microcanal 354 pasando entre los microelectrodos 356, 360. La señal medida por el módulo es proporcional a la resistencia del medio entre los electrodos. Cuando no hay célula entre los electrodos, la señal es proporcional a la resistencia de la solución de tampón y esto define el valor de referencia para las mediciones. Cada célula que pasa entre los electrodos reemplaza un pequeño volumen de la solución de tampón. Las células intactas se consideran no conductoras a la frecuencia de la señal eléctrica (40 kHz) aplicada entre electrodos debido a la alta capacitancia de la membrana celular. De este modo, el pequeño volumen de la solución reemplazada por la célula tiene mayor resistencia que el volumen correspondiente del tampón solo. Esto conduce a un aumento en la resistencia general medida por el sensor de impedancia, que se presenta como picos positivos registrados para una célula que pasa (véase la figura 44A). Cuando la membrana de las células se ve comprometida, la resistencia de la célula se puede aproximar por la resistencia del interior de la célula, que está compuesta principalmente por componentes citoplasmáticos. Si la resistencia del citoplasma celular es menor que la del volumen correspondiente de solución de tampón, la resistencia total medida por las caídas del sensor, que resulta en un pico negativo (véase la figura 44B).

La figura 24 proporciona una descripción esquemática de un método de fabricación ilustrativo empleado para producir el módulo de impedancia representado en las figuras 23A y 23B. Esta modalidad de fabricación no requiere la inserción manual de alambres de platino en canales prefabricados (Adams et al., J. Am. Chem. Soc. 130:8633-8641 (2008) y Galloway et al., Anal. Chem. 74: 2407-2415 (2002). En las etapas 1 y 2, las cubiertas superior e inferior del módulo que comprende copolímero de olefina cíclica (COC) se preparan mediante estampado en caliente o moldeo por inyección. En las etapas 3 y 4, la fotolitografía o deposición no electrolítica se utiliza para modelar el fotorresistente en preparación para la deposición de electrodo de Au de película delgada (200 nm) (Shadpour et al., Anal. Chem. 79:870-878 (2007) y Kong et al., Electrophoresis 27:2940-2950 (2006)), que se lleva a cabo mediante evaporación por haz de electrones (etapa 5) y despegue (etapa 6). En la etapa 7, la litografía se emplea para definir una fotorresistencia Su-8 del microcanal. Se abren los orificios fluídicos de la cubierta superior (etapa 8) y las cubiertas con patrón superior e inferior se alinean para la inyección y curado de pegamento UV (etapa 9).

Otras unidades de impedancia microfluídica que se conocen en la técnica se pueden incluir como alternativa en el dispositivo uMPS de la presente invención tal y como se describe en el presente documento. Los módulos de impedancia adecuados incluyen, sin limitación, sistemas de rejas de microfluidos (véase, por ejemplo, Zhang et al., Microfluid. Nanofluid. 7:739-749 (2009)), sistemas FAC de microfluidos (véase, por ejemplo, Fu et al., Nat. Biotech.

17:1109-1111 (1999)) y sistemas de impedancia de microfluidos (véase, por ejemplo, (Dharmasiri et al., Anal. Chem.

83:2301-2309 (2011); Adams et al., J. Am. Chem. Soc. 130:8633-8641 (2008); Aufforth et al., Annals of Surg. Oncol.

20:S129-S129 (2013); Spegel et al., Electroanalysis 20:680-702 (2008); y la patente de Estados Unidos n.° 8.390.304 a Patterson). Otros módulos de impedancia adecuados para su uso en el dispositivo de la presente invención se revisan en Cheung. et al., Cytometry Parte A 77A:648-666 (2010).

En una realización, el módulo de impedancia alternativo comprende una disposición de un módulo contador Coulter que proporciona enumeración y dimensionamiento de células sin etiquetas. Este módulo está compuesto por dos cámaras llenas de líquido conectadas por un pequeño orificio y dos electrodos colocados a cada lado del orificio. Cuando una célula pasa por el orificio, desplaza el fluido conductor y altera la resistencia del orificio. Cada pulso de señal corresponde al movimiento de una sola célula a través del orificio, cuya magnitud es proporcional a la cantidad de fluido desplazado. La mayor sensibilidad de la medición se logra cuando el tamaño del orificio es similar al tamaño de célula medido. Por ejemplo, un tamaño de orificio de 50 x 50 pm2 lograría una sensibilidad suficiente para detectar células en el intervalo de tamaño de 6-30 pm. Los electrodos de medición colocados a ambos lados del orificio tienen grandes dimensiones (pocos mm2) para reducir los efectos de la capacitancia eléctrica de doble capa y puede producirse mediante serigrafía de tintas conductoras de plata en la superficie del polímero, lo que elimina la necesidad de la litografía. (véase Sun y Morgan, Microfluido. Nanofluido. 8: 423-443 (2010)).

En una realización, el dispositivo de la presente invención comprende además una unidad de separador definida por el sustrato sólido y aguas arriba del procesador biomolecular y uno o más nanotubos. La unidad de separador comprende una cámara de separación que incluye superficies sólidas que definen canales entre ellas con agentes de captura específicos de la célula unidos a las superficies sólidas, una entrada a la cámara y una salida de la cámara.

La unidad de tipo separador se representa como módulo 400 en el dispositivo uMPS de las figuras 17A y 17B. Tal y como se muestra en estas figuras, la unidad de tipo separador 400 recibe la muestra del módulo sensor 350. Una vez que las células enumeradas salen del módulo sensor, se introducen en el tampón de lisis procedente del depósito 110, y la lisis celular se produce dentro de la pequeña red de microfluidos en forma de serpentina 136 aguas arriba de la unidad de tipo separador 400. El contenido de las células lisadas entra en la unidad de separador 400 donde se produce el aislamiento de los componentes de ácido nucleico. La unidad de separador 400 se introduce con tampón de inmovilización, aire, etanol y reactivos de liberación a través de los respectivos depósitos 112, 114, 116 y 108 ubicados en la periferia de la placa de base del uMPS 100 tal y como se muestra en las figuras 17A y 17B.

En la figura 25 se muestra una vista en perspectiva del módulo separador. Tal y como se muestra en esta descripción, la unidad de separador 400 es similar en estructura y función a las unidades de tipo extractor 250 y 300 descritas anteriormente, que se diferencia en que comprende un único lecho de extracción en fase sólida 406, que contiene una pluralidad de soportes sólidos o superficies 408. Un solo lecho de extracción es adecuado, debido a que el volumen de muestra que requiere procesamiento es pequeño (~10 j l) y la cantidad de material objetivo que se extraerá, por ejemplo, ADN/ARN de un pequeño número de células aisladas aguas arriba, es baja también. La muestra entra en el módulo separador 400 a través del orificio de entrada 402 y fluye a través del canal de introducción del lecho 404 para entrar en el lecho de extracción 406. Los componentes de la muestra que no se capturan en los soportes sólidos 408 del lecho de extracción 406 se mueven a través de los canales definidos por los soportes sólidos 408 hasta el canal de salida del lecho de extracción 410 y salen del módulo a través del orificio de salida 412. Una vez que el material de muestra extraído (por ejemplo, el ADN/ARN) se libera de los soportes sólidos 408 del lecho de extracción 406, también fluye fuera de la unidad de separador a través del canal de salida 410 y el orificio de salida 412.

En una realización, el dispositivo de la presente invención tiene una o más unidades de reactor definidas por el sustrato sólido y aguas arriba del procesador biomolecular. Las unidades de reactor comprenden un canal de reacción con un calentador. Las una o más unidades de reactor 450 y 500, que constituyen el segundo subsistema del dispositivo uMPS de las figuras 17A y 17B, son reactores de flujo continuo que se utilizan para reacciones de preprocesamiento molecular, como la transcripción inversa multiplexada de ARN para generar ADNc y la adición de poli-dT a los ADN utilizando desoxinucleotidil transferasa terminal (TdT). Las reacciones alternativas de preprocesamiento molecular que se pueden llevar a cabo en estas unidades incluyen, sin limitación, reacciones de digestión enzimática, por ejemplo, digestión del ADN de entrada con endonucleasa(s) de restricción para la determinación posterior del estado de metilación, una etapa inicial de transcripción inversa, reacción de extensión del cebador y/o adición de un cebador de bucle al miARN, facilitando su seguimiento preciso, captura y detección.

Las unidades de reactor de flujo continuo del dispositivo utilizado para las reacciones térmicas bioquímicas mencionadas anteriormente se representan como módulos 450 y 500 del dispositivo uMPS mostrado en las figuras 17A y 17B. Estos reactores se basan en un formato de flujo continuo, en el que un solo canal serpenteante se introduce con los reactivos de reacción del depósito adyacente 124 (por ejemplo, reactivos de reacción r T) y el material objetivo. Los calentadores térmicos colocados en la parte inferior de la zona de reacción generan la temperatura necesaria. Este reactor térmico de flujo continuo consiste en un canal serpenteante con la velocidad lineal y la longitud del canal del reactor determinando el tiempo de reacción. Estos reactores térmicos de flujo continuo se han utilizado para una variedad de reacciones, incluyendo PCR, reacciones de detección de ligasa y transcripción inversa utilizando sustratos termoplásticos (véase, por ejemplo, Hashimoto et al, Lab on a Chip 4:638-645 (2004); Hashimoto et al., Analytical Chemistry 77:3243-3255 (2005), Chen et al., Assessment and Improvement of the Thermal Performance of a Polycarbonate Micro Continuous Flow Polymerase Chain Reactor (CFPCR) (2007), Chen et al., Biomedical Microdevices 10:141-152 (2008)). El reactor se construye durante la etapa de impresión utilizada para producir la placa de base de fluido. Un calentador Kapton de película delgada se coloca debajo del reactor para generar la temperatura necesaria para la reacción.

En una realización, el dispositivo de la presente invención tiene una unidad de purificación de flujo que está aguas arriba del procesador biomolecular y uno o más nanotubos. La unidad de purificación de flujo comprende una carcasa que define una cámara, una o más entradas conectadas a la cámara, una salida de producto conectada a la cámara, una salida de residuos conectada a la cámara y una pluralidad de obstáculos colocados dentro de la cámara y orientados para dirigir preferentemente el producto, en la recámara, a la salida del producto y a los residuos directos, en la recámara, a la salida de residuos. La unidad de purificación de flujo 550 y la unidad de nanosensor 50 constituyen el tercer subsistema del dispositivo uMPS representado en las figuras 17A y 17B.

La unidad de purificación de flujo está diseñada para purificar las moléculas de ácido nucleico objetivo (por ejemplo, ADN complementario) que se generan en otras unidades aguas arriba del dispositivo a partir de dNTP en exceso y/u otros componentes de nucleótidos de ácido nucleico no objetivo. Se requiere purificación debido al número limitado de sitios de unión disponibles en las estructuras de soporte sólido de las cámaras del biorreactor de la unidad de procesamiento biomolecular. Si bien existe una variedad de métodos para lograr la eliminación requerida de reactivo(s) en exceso, como técnicas cromatográficas o electroforéticas, utilizan un modo operativo "por lotes" en el que las muestras se inyectan en la columna y la separación se invoca con un corte de corazón utilizado para aislar el material deseado. La unidad de purificación de flujo del dispositivo descrito en el presente documento usa un modo de separación continuo que no requiere inyección y corte de fracciones para simplificar la operación. Es particularmente deseable utilizar un formato de flujo continuo, debido a que no se requieren ciclos de inyección / ejecución con los productos de reacción continuamente insertados en la matriz de separación con la capacidad de redirigir el exceso de reactivo(s) a un depósito de desechos y, al mismo tiempo, dirigir los objetivos procesados a otra trayectoria.

La arquitectura de la unidad 550 de purificación de flujo por difusión se muestra en la figura 26A. El módulo se fabrica en el sustrato apropiado mediante microrreplicación en el mismo paso utilizado para producir la red fluídica y, por lo tanto, no requiere técnicas litográficas de varias etapas. El concepto básico consiste en emplear el uso de una red regular de obstáculos asimétricos 558 para alterar el movimiento browniano lateral de las moléculas de modo que las moléculas de diferentes tamaños sigan diferentes trayectorias a través del dispositivo. En una realización, los obstáculos 558 dentro del lecho de purificación de flujo 556 poseen una longitud de -5-7 pm, un ancho de ~0,5-2 pm, un espacio de separación (G) ~4-5 pm, y están situados en un ángulo de ~ 45 ° con respecto a la trayectoria del flujo (Chou et al., Proc. Nat'l. Acad. Sci. Ee . UU. 96:13762-13765 (1999)). Una mezcla de moléculas en una muestra entra en el módulo 550 a través del canal de entrada de muestra 552, el tampón entra en el módulo a través de los canales de entrada del tampón 554, y la mezcla se clasifica continuamente a medida que se mueve a través del dispositivo. La salida se divide en dos canales 560, 562, una 562 para dirigir reactivos (por ejemplo, dNTP) para desperdiciar y la otra 560 para enviar moléculas objetivo (por ejemplo, ADN complementario) al módulo final del uMPS, es decir, el módulo de nanosensor, para el procesamiento final y la detección. Las métricas de rendimiento de este módulo incluyen generar tiempos de desarrollo cortos (< 60 s), eliminando > 95 % del exceso de reactivo(s) y pérdida mínima del objetivo (< 1 %).

El flujo de fluidos a través de las diversas unidades del dispositivo uMPS de las figuras 17A y 17B está controlado por una pluralidad de válvulas 132 ubicadas a lo largo de la red 134 de fluidos del dispositivo 100. Las válvulas tienen una estructura de tres capas, tal y como se muestra en la figura 27. Estas tres capas consisten en una placa de cubierta, capa fluídica y placa de cubierta trasera. El asiento de la válvula y la membrana de la válvula están configurados para estar en la parte posterior de la placa de base de fluido del uMPS 100 junto con los solenoides mecánicos para accionar las válvulas. Esto permitirá conexiones eléctricas completas colocadas en la placa de cubierta superior del uMPS. La figura 27 también muestra el moldeado frontal y posterior simultáneo de la válvula y el asiento de la válvula mediante estampado. La red fluídica ubicada en la parte superior de la placa de base se realiza en la misma etapa de estampado. La mayoría de las interconexiones de microfluidos del dispositivo uMPS de la figura 17A se basan en el contacto físico directo entre el orificio de fluido y la unidad que se está conectando. Cada contacto actúa como una restricción cinemática pasiva en el ensamblaje. Si no se tiene cuidado, dos o más interconexiones en conjunto con otras características de ensamblaje conducirán a sistemas sobrerestringidos y volúmenes muertos impredecibles.

Para orificios de microfluidos con separaciones a microescala entre superficies enfrentadas, las fuerzas capilares, según lo definido por la ecuación de Young-Laplace, deben resistir las fugas sin ningún contacto físico directo entre las superficies enfrentadas, formando un sello sin junta, tal y como se muestra en la figura 28B (Brown, et al., IMECE 2012, 9-15 de noviembre 2012. ASME, Houston, Texas, en nombre de IMECE2012-89634 (2012)). Los pasadores cinemáticos y las ranuras de estos sellos sin juntas se muestran en la figura 28A. Los pasadores de alineación y las ranuras se pueden fabricar en la parte trasera del sustrato fluídico utilizando un estampado de doble cara con las clavijas y las ranuras colocadas en las dos piezas de acoplamiento. La precisión de alineación es de -10 pm. Los sellos superhidrófobos entre piezas de acoplamiento que pueden alinearse perfectamente o desplazarse ligeramente. Los agujeros pasantes de cada pieza de acoplamiento están rodeados por una superficie con un ángulo de contacto con el agua de ~150°; las fuerzas de tensión superficial y las fuerzas capilares hacen que la solución se mueva hacia el agujero opuesto sin volumen muerto (consulte la figura 28C).

Los sellos sin juntas requieren superficies superhidrófobas en las superficies opuestas alrededor de cada orificio de entrada/salida. Se pueden utilizar diferentes enfoques para obtener las superficies superhidrófobas, que incluyen: (1) moldeo por inyección, (2) NIL, o (3) deposición capa por capa. Otro enfoque implica montar membranas de óxido de aluminio anodizado (AAO) dentro de un inserto de molde convencional y llenar los patrones con un polímero fundido. Estas técnicas aportan la superhidrofobicidad necesaria. La ventaja de este enfoque es que las superficies superhidrófobas se pueden moldear en el mismo material que el dispositivo y, al mismo tiempo, por lo que no hay problemas de adsorción o adhesión a la superficie.

Se puede usar NIL con sellos de polímero para transferir un patrón superhidrófobo a las superficies de entrada/salida. Esto se puede realizar en sustratos moldeados por inyección o estampados en caliente como un proceso secundario. Otro enfoque es la deposición capa por capa (LBL), que se puede utilizar para construir películas delgadas a nanoescala con ángulos de contacto estáticos altos (188). Esto se puede realizar usando una máscara para asegurar que solo se cubran las áreas deseadas. El proceso de LBL puede producir capas con mucho mejor control del espesor. Los sucesivos pasos de inmersión requieren tiempo adicional para obtener las propiedades de capa deseadas, pero pueden ser comparables en duración a los necesarios para cambiar a otra máquina como en el caso de NIL.

Estructura de alineación pasiva: Se utilizarán estructuras de alineación pasiva para establecer la altura de la separación que separa dos módulos (< 20 |jm) reduciendo al mínimo el desplazamiento lateral para que no se introduzcan volúmenes muertos en las entradas/salidas de los módulos y se reduzca al mínimo el ángulo relativo entre las dos superficies (véanse las figuras 28A-28B). Esto requiere seleccionar el tipo, el tamaño y la ubicación de las estructuras de alineación que se vayan a utilizar. Estas estructuras de alineación son pasadores semiesféricos en pares cinemáticos de surcos que se han caracterizado (You et al., J. Micromech. Microeng. 19:125025 (2009) y You et al., JMEMS 24:634-650 (2015)). Los anillos anulares alrededor de los postes resultaron en mejores pasadores, lo que permite un mejor llenado y menor variación entre los pasadores (Chen et al., Replication of Reliable Assembly Features for Polymer Modular Microfluidic Systems (2008).

Otro aspecto de la presente invención hace referencia a un dispositivo que comprende una unidad de tipo aislamiento de plasma de extensión longitudinal tal y como se ha descrito anteriormente y tal y como se representa en las figuras 20A-20D. La unidad de tipo aislamiento de plasma de extensión longitudinal está definida por el sustrato sólido y comprende un paso de entrada, un paso de descarga que es más ancho y menos profundo que el paso de entrada y un paso de transición que conecta el paso de entrada y el paso de descarga. El paso de transición se vuelve más ancho y menos profundo a medida que los pasos de transición progresan desde el paso de entrada al paso de descarga. La unidad de aislamiento de plasma comprende además canales laterales principales que se extienden lateralmente en sentido opuesto al de entrada, donde un separador, colocado entre el paso de entrada y cada canal lateral principal, está dimensionado para permitir que el plasma, pero no las células, pase del paso de entrada a los canales laterales principales. La unidad de aislamiento de plasma comprende además canales laterales secundarios que se extienden lateralmente lejos del paso de descarga, donde un separador, colocado entre el paso de descarga y cada canal lateral secundario, está dimensionado para permitir que el plasma, pero no las células, pase del paso de entrada a los canales laterales secundarios.

Otro aspecto de la presente invención hace referencia a un dispositivo que comprende una unidad de tipo extractor tal y como se ha descrito anteriormente y tal y como se representa en la figura 25. La unidad de tipo extractor está definida por un sustrato sólido y comprende una entrada, una salida, una pluralidad de cámaras separadas, extendiéndose cada una de las cuales entre la entrada y dicha salida y compartiéndolas. El dispositivo también comprende una pluralidad de pilares sólidos en cada una de las cámaras, en donde los pilares tienen pasos entre medias, y están provistos de un material adecuado para inmovilizar células, ácidos nucleicos o exosomas de una muestra.

Otro aspecto de la presente invención hace referencia a un dispositivo que comprende una unidad de tipo sensor tal y como se ha descrito anteriormente y tal y como se representa en las figuras 23A-23B. La unidad de tipo sensor está definida por el sustrato sólido y comprende: una entrada; una salida; y un contador de células posicionado para contar las células que pasan desde la entrada a la salida de dicha unidad de tipo sensor.

Modificación superficial de superficies termoplásticas en el uMPS

Las propiedades de la superficie son importantes para controlar el transporte de moléculas a través de los distintos microcanales, nanocanales y otras nanoestructuras de los módulos en el uMPS, especialmente cuando las moléculas portan cargas y el transporte lo permite la electrocinética. Las superficies de las nanoestructuras y microestructuras poliméricas se modifican mediante una combinación de un proceso de activación para producir andamios funcionales seguido de la modificación de la superficie para crear nuevas especies químicas en la superficie de los sustratos poliméricos (Jackson et al., Lab Chip. 14:106-117 (2014) and McCarley et al., J. Am. Chem. Soc. 127:842-843 (2005)). Además, cuando se requieren grupos funcionales en las superficies del polímero en los micro y nano dominios para la unión covalente de varios agentes biológicos (por ejemplo, anticuerpos u oligonucleótidos), se utilizan técnicas para producir grupos funcionales específicas por región. Activación específica de la región, que se requiere, por ejemplo, para activar solo regiones con pilares para la unión covalente de varios objetivos moleculares dentro del módulo nanosensor, se puede lograr usando activación UV/O³ a través de una fotomáscara.

Muchos termoplásticos no contienen grupos funcionales superficiales y, por lo tanto, pueden emplearse protocolos de activación para crear los andamios funcionales apropiados. En la técnica, se conocen químicas de modificación superficial adecuadas, robustas y aun así simples para termoplásticos dentro del régimen de microescala, donde la superficie se activa con UV/O³ o un plasma de O² (Jackson et al., Lab Chip. 14: 106-117 (2014) y Situma et al., Anal. Biochem. 340:123-135 (2005)). La exposición al plasma o UV/O³ hace que la superficie sea hidrófila debido a las interacciones de radicales de alta energía en la superficie. A una energía suficientemente alta, tanto el estrés oxidativo como el UV pueden generar radicales dentro del polímero, que pueden formar ácidos carboxílicos u otras especies que contienen O. La presencia de estos grupos funcionales proporciona grupos ionizables que, cuando están en contacto con soluciones, pueden alterar el flujo electroosmótico o servir como andamios para la unión de biológicos. Fabricación del nanotubo

Se pueden usar tres estrategias diferentes para fabricar los nanotubos que comprenden los nanoporos sintéticos en el plano y los canales de tiempo de vuelo como se describe en el presente documento. Un primer enfoque implica una litografía de nanoimpresión (NIL) de una sola etapa. En las figuras 29A-29B y la figura 30 se muestra un esquema de este procedimiento. En resumen, debido a que se requieren estructuras de sello < 10 nm, se puede usar para la fabricación maestra el sustrato de Si recubierto con una capa de cromo (~300 A) para el fresado de haz de iones enfocado (FIB) con dosis de exposición variables que controlan tanto el ancho como la profundidad de los nanocanales y nanoporos sintéticos en el plano (Menard & Ramsey, Nano Letters 11:512-517 (2010)). Tal y como se muestra en la figura 29A, el sello de resina se puede fabricar mediante un proceso UV-NIL. El sello de resina se utiliza para imprimir las estructuras del sensor en varios sustratos de polímero tal y como se muestra en la figura 29B. La relación S/N de los transitorios de corriente generados por los nanoporos sintéticos en el plano dependerá de la relación de tamaño del nanocanal a los poros.

El segundo enfoque de fabricación implica una combinación de NIL y un proceso de reducción de tamaño. Puede ser un desafío producir nanocanales largos a través de NIL de una sola etapa con los nanoporos sintéticos requeridos en el plano, porque la fabricación se ve afectada por varios factores, como una deposición no uniforme de la capa intermedia de cromo, una corriente de haz no uniforme para la exploración de áreas grandes en FIB y defectos superficiales. En consecuencia, en algunas realizaciones, puede ser deseable combinar NIL con un proceso de reducción de tamaño. Se pueden producir estructuras de sensor agrandadas en el sustrato de polímero con una relación de escala de 2-5, lo que significa que el ancho y la profundidad de los nanocanales estarán en el intervalo de 100-200 nm y el tamaño de los orificios en el intervalo de 20-50 nm. El control preciso sobre la deformación del polímero a escala nanométrica es la clave del proceso de reducción de tamaño para lograr estructuras por debajo de los 10 nm, lo cual es difícil de lograr a una temperatura de moldeo durante NIL.

Dos procesos de reducción de tamaño adecuados incluyen (i) proceso de autoperfección prensado (PSP) y (ii) proceso de reflujo de polímero. En el proceso de PSP, las nanoestructuras de polímero se presionan mediante una oblea de sílice en blanco a una temperatura cercana a la temperatura de transición vítrea (Wang et al., Nano Letters 8:1986-1990 (2008)). Este proceso no solo disminuye el ancho y el diámetro de las trincheras y agujeros a nanoescala, respectivamente, sino que también reduce la rugosidad de las paredes laterales de esas estructuras. El PSP se puede utilizar en combinación con NIL para generar nanoporos en una membrana de polímero independiente (Choi et al., J. Nanosci. Nanotechnol. 13:4129-4133 (2013)). Comenzando con microporos de 3 pm de diámetro, el tamaño de los poros se puede reducir eficazmente a -300 nm. El segundo proceso de reducción de tamaño, es decir, el proceso de reflujo de polímero, puede generar membranas SU-8 independientes con poros por debajo de 10 nm. La tasa de contracción para SU-8 sin curar por el proceso de reflujo de polímero a 45 °C es -3 nm/min (véase la figura 38C), que es comparable a las tasas de contracción de 6-16 nm/min y 1,2-15 nm/min que se utilizan para fabricar nanoporos de silicio y vidrio mediante irradiación con un haz de electrones de alta energía et al., Nano Letters 13:1717-1723 (2013)). Una baja tasa de contracción hace que el proceso de reflujo de polímero sea extremadamente atractivo para lograr la capacidad de control a nanoescala para la fabricación de polímeros.

El tercer enfoque de fabricación implica la integración de membranas de nanoporos con membranas grabadas en pistas. En este enfoque, los nanotubos se fabrican apilando verticalmente membranas de nanoporos prefabricadas con una membrana en pista. En este proceso, las membranas de nanoporos independientes se producen con un diámetro de poro bien definido en el intervalo de 10 nm mediante una sola etapa NIL en una capa de resistencia doble. El tamaño de los poros en la membrana se puede reducir aún más empleando un proceso de reflujo de polímero posterior de NIL para lograr poros por debajo de 10 nm. Para los nanocanales, las membranas de policarbonato en pista se utilizan para generar nanoporos de baja densidad. El diámetro de los poros y el espesor de la membrana están en el intervalo de 100-200 nm y 60-100 pm, respectivamente. La alineación de un nanoporo en la membrana SU-8 independiente y un nanoporo en la membrana grabada en pista se realiza mediante microscopía óptica. Esto es factible, porque el nanoporo en la membrana SU-8 tiene una estructura ahusada a lo largo del espesor de la membrana y el poro inferior a microescala de la membrana grabada con pistas tiene una forma de octágono bien definida. Las membranas apiladas (membrana SU-8 / membrana grabada en pista / membrana SU-8) contendrán las estructuras diseñadas de nanocanal con dos nanoporos y la entrada y salida ahusada para los nanoporos en el SU-8 para reducir el error causado por la barrera entrópica en la determinación del tiempo de vuelo. Por último, la membrana apilada se intercala entre dos chips termoplásticos (PMMA u otros) con un microcanal en una configuración cruzada para completar un dispositivo fluídico cerrado para mediciones de corrientes transitorias longitudinales. Se puede registrar un solo poro en la membrana apilada entre los microcanales superior e inferior controlando el ancho de los microcanales. La figura 2A-2B muestra un ejemplo de un nanoporo posicionado verticalmente fabricado usando este enfoque.

Métodos para detectar una molécula de ácido nucleico objetivo

Otro aspecto de la presente invención se refiere a un método para detectar la presencia de una molécula de ácido nucleico objetivo en una muestra que implica proporcionar el dispositivo que comprende el procesador biomolecular y uno o más nanotubos como se describe en el presente documento, y alimentar una muestra que comprende una molécula de ácido nucleico objetivo o producto de extensión complementario de la misma en el procesador biomolecular en condiciones efectivas para que la molécula de ácido nucleico objetivo se una a las moléculas de captura en las estructuras de soporte espaciadas para inmovilizar la molécula objetivo en las estructuras de soporte espaciadas. El método implica además someter a la molécula de ácido nucleico objetivo inmovilizada o complementos inmovilizados de las moléculas de ácido nucleico objetivo a un proceso de reacción para formar un producto de reacción de oligonucleótidos que se libera, se introduce en el nanotubo y se detecta a medida que pasa a través de uno o más nanoporos en el nanotubo. Tal y como se describirá con mayor detalle más adelante, el detector detecta una firma de identificación del producto de reacción de oligonucleótidos, que es exclusivo del producto oligonucleotídico y lo distingue de otros productos oligonucleotídicos que pueden formarse en el proceso de reacción.

En una realización, el proceso de reacción en una reacción de detección de ligasa que produce productos de ligadura hibridados con las moléculas de ácido nucleico objetivo inmovilizadas o productos de extensión inmovilizados de las mismas. Los productos de ligadura se desnaturalizan de las moléculas de ácido nucleico objetivo inmovilizadas y sus productos de extensión inmovilizados, para liberar los productos de ligadura de las estructuras de soporte espaciadas. Los productos de ligadura atraviesan uno o más nanotubos y el detector detecta las firmas de identificación de los productos de ligadura que pasan a través de los uno o más nanotubos. La presencia de moléculas de ácido nucleico objetivo en la muestra que difieren de otras moléculas de ácido nucleico en la muestra se identifica en función de la detección de la firma de identificación del producto de ligadura.

De conformidad con este aspecto de la presente invención, el dispositivo que comprende el procesador biomolecular y uno o más nanotubos puede contener una o más unidades aguas arriba del procesador biomolecular que están configuradas para preparar la muestra para el análisis en el procesador biomolecular y uno o más nanotubos. Estas unidades se han descrito anteriormente e incluyen una unidad de separador de células (por ejemplo, módulo 150, figuras 17A y 17B) para separar o enriquecer las células biológicas objetivo (por ejemplo, células tumorales circulantes), una unidad de tipo aislamiento de plasma de extensión longitudinal (por ejemplo, módulo 200, figuras 17A y 17B) para separar el plasma de los glóbulos rojos y los glóbulos blancos, una primera unidad de tipo extractor (por ejemplo, módulo 250, figuras 17A y 17B) para exosomas purificadores de afinidad, una segunda unidad de tipo extractor (por ejemplo, módulo 300, figuras 17A y 17B) para la purificación de ADN libre circulante, una unidad de tipo sensor (por ejemplo, módulo 350, figuras 17A y 17B) para contar células y determinar la viabilidad, una segunda unidad de tipo extractor (por ejemplo, módulo 400, figuras 17A y 17B) para el aislamiento de ADN y/o ARN, uno o más módulos de reactor para reacciones de transcriptasa inversa y reacciones de TdT (por ejemplo, módulos 450 y 500, figuras 17A y 17B) y un módulo de purificación de flujo (por ejemplo, módulo 550, figura 17A) para eliminar el exceso de dNTP y otros componentes de la molécula de ácido nucleico no objetivo de la muestra antes de entrar en la cámara del nanosensor y el procesador biológico.

Se describen métodos para llevar a cabo la reacción de ligadura y generar los productos de ligadura dentro de la cámara de biorreactor del procesador biomolecular descrito más adelante. Los productos de ligadura, una vez formados, se desnaturalizan a partir de su molécula de ácido nucleico objetivo inmovilizada complementaria o producto de extensión de la misma y se introducen a través de un nanotubo que contiene uno o más nanoporos capaces de detectar y distinguir una firma de identificación de cada producto de ligadura a medida que lo atraviesa. En una realización, la firma de identificación de un producto de ligadura es el cambio en la corriente a través de uno o más nanoporos que se produce cuando el producto de ligadura pasa a través de él. El cambio en la corriente puede ser un aumento (es decir, aumento de corriente) o una disminución de la corriente (es decir, un bloqueo de corriente) a través de los uno o más nanoporos. La magnitud y duración del cambio de corriente a través de un nanoporo se detecta y se mide para identificar y distinguir un producto de ligadura de otro. De conformidad con esta realización, la firma de identificación de un producto de ligadura está influenciada por el tamaño (es decir, longitud), forma o conformación (por ejemplo, plegada frente a lineal), carga y conductividad del producto de ligadura.

En otra realización, la firma de identificación de un producto de ligadura es su tiempo de vuelo a través de una o más secciones del nanotubo. En esta realización, el producto de ligadura se introduce a través de al menos un primer y un segundo nanoporo de un nanotubo, donde el primer y segundo nanoporo se coloca en extremos opuestos del canal de tiempo de vuelo de nanotubos. El tiempo que tarda el producto de ligadura en atravesar el primer nanoporo, el canal de tiempo de vuelo y el segundo nanoporo se miden y se utilizan como firma de identificación del producto de ligadura. De conformidad con esta realización, la firma de identificación de un producto de ligadura está influenciada por el tamaño (es decir, longitud), forma o conformación (por ejemplo, plegada frente a lineal), carga y conductividad del producto de ligadura.

En otra realización, la firma de identificación de un producto de ligadura es el cambio en la corriente a través de al menos dos nanoporos que se produce cuando el producto de ligadura pasa a través de los dos nanoporos en combinación con la medición del tiempo de vuelo entre los dos nanoporos. De conformidad con esta realización, la firma de identificación de un producto de ligadura también está influenciada por el tamaño (es decir, longitud), forma o conformación (por ejemplo, plegada frente a lineal), carga y conductividad del producto de ligadura.

La firma de identificación de un producto de ligadura es una propiedad inherente del propio producto de ligadura que puede modificarse adicionalmente mediante la incorporación o apéndice de uno o más modificadores de firma de identificación. En una realización, los modificadores de firma identificativos son moléculas solubles en agua, neutras o cargadas que modifican la movilidad del producto de ligadura, por ejemplo, etiquetas de arrastre. Los modificadores de movilidad ilustrativos incluyen, sin limitación, polipéptidos, polinucleótidos, multímeros de análogos peptídicos nucleotídicos (PNA), peptoides, poliéteres (óxido de polietileno y óxido de polipropileno), nanoesferas, nanocristales, oligosacáridos, dendrímeros, poliésteres (ácido poliglicólico, ácido polilactico), poliuretanos, poliamidas, polisulfonamidas, polisulfóxidos, polifosfatos, polifosfonatos y combinaciones de los mismos. Este enfoque se basa en electroforesis conjugada en solución libre (FSCE), también conocida como electroforesis en solución libre etiquetada al final (ELFSE) (Ren et al., "Separating DNA Sequencing Fragment without a Sieving Matrix", Electrophoresis 20(12):2501-9 (1999)). En esta realización, las diferencias de base única de los productos de ligadura se distinguen por el uso de colas de diferentes longitudes y/o etiquetas de arrastre en una de las sondas de ligadura utilizadas en la reacción de ligadura para crear el producto de ligadura (Albrecht et al., "Simultaneous Detection of 19 K-ras Mutations by Free Solution Conjugate Electrophoresis of Ligase Detection Reaction Products on Glass Microchips", Electrophoresis 34(4):590-7 (2013); Sinville et al., "Ligase Detection Reaction for the Analysis of Point Mutations using Free-solution Conjugate Electrophoresis in a Polymer Microfluidic Device", Electrophoresis 29(23):4751-60 (2008)). Los productos de ligadura resultantes difieren en longitud y/o relación masa/carga y, por lo tanto, migran de manera diferente entre sí y las sondas iniciales, y pueden distinguirse por su influencia en la corriente a través de un nanoporo. Se ha demostrado la separación electroforética en solución libre de etiquetas de arrastre de ADN para ADN de hasta 265 bases de longitud (Albrecht et al., Anal Chem. 83(2):509-15 (2011)).

En otra realización, el modificador de firma de identificación es un código de barras de secuencia molecular, es decir, una secuencia de nucleótidos que se puede distinguir a través de un nanoporo en función de la modificación de corriente específica de la secuencia a través de uno o más nanoporos (Manrao et al., "Reading DNA at Singlenucleotide Resolution with a Mutant MspA Nanopore and phi29 DNA Polymerase", Nat Biotechnol. 30(4):349-53 (2012)). En este ejemplo, las diferencias de una sola base en la unión de ligadura se distinguen por el uso de códigos de barras de secuencia diferente en las sondas de ligadura de oligonucleótidos aguas arriba, que sirven como marcadores para la base individual que está siendo interrogada. Los productos de ligadura corta generados pueden distinguirse por su secuencia innata al pasar a través de un nanoporo o por el uso de códigos de barras de secuencia que han sido diseñados para compensar las altas tasas de error de los sistemas de secuenciación de nanoporos existentes.

Como alternativa, los códigos de barras pueden estar compuestos de polímeros no nucleotídicos que mejoran su detección y discriminación cuando pasan a través de un nanoporo (Kumar et al. "PEG-Labeled Nucleotides and Nanopore Detection for Single Molecule DNA Sequencing by Synthesis", Sci. Reports 2:684 (2012)). Dado que la movilidad de las moléculas de ADN monocatenario a través de los nanoporos es demasiado alta para una determinación precisa de la secuencia, a veces es necesario añadir un motor molecular directamente al nanoporo o, como alternativa, a un motivo de secuencia adjunto covalentemente al producto de ligadura para permitir el trinqueteo controlado por etapas del producto de ligadura a través del nanoporo (Lieberman et al., "Dynamics of the translocation step measured in individual DNA polymerase complexes", JAm Chem Soc. 134(45):18816-23 (2012)).

Otro aspecto de la presente invención hace referencia a un método para identificar un nucleótido dentro de una molécula de ácido nucleico objetivo de una muestra. Este método implica proporcionar el dispositivo que comprende el procesador biomolecular y uno o más nanotubos tal y como se describe en el presente documento. La muestra que comprende moléculas de ácido nucleico objetivo se introduce en dicho procesador biomolecular en condiciones efectivas para que las moléculas de ácido nucleico objetivo se unan a sus moléculas de captura complementarias inmovilizadas en las estructuras de soporte sólidas espaciadas, inmovilizando de ese modo las moléculas de ácido nucleico objetivo en las estructuras de soporte espaciadas. Las moléculas de ácido nucleico objetivo inmovilizadas o los productos de extensión inmovilizados que son complementarios a la molécula de ácido nucleico objetivo se ponen en contacto con una solución para formar una mezcla de reacción de extensión nucleotídica. La solución comprende uno o más cebadores de oligonucleótidos complementarios a una porción de las moléculas de ácido nucleico objetivo inmovilizadas o el producto de extensión inmovilizado de las mismas, una polimerasa y un grupo de nucleótidos trifosfatos. Cada tipo de nucleótido trifosfato del grupo tiene (1) una fracción generadora de firma de identificación escindible diferente y (2) una fracción de bloqueo escindible que bloquea las reacciones de extensión nucleotídica adicionales. El método además implica someter la mezcla de extensión nucleotídica a un tratamiento de hibridación, donde uno o más cebadores de oligonucleótidos de la solución se hibridan de una manera específica de base con sus moléculas de ácido nucleico objetivo inmovilizadas complementarias o productos de extensión inmovilizados de las mismas. Los cebadores de oligonucleótidos hibridados se extienden mediante la adición específica de una sola base de un nucleótido trifosfato del grupo de nucleótidos trifosfatos al extremo 3' de los cebadores hibridados. La fracción generadora de firma de identificación se escinde de cada nucleótido añadido al cebador oligonucleotídico hibridado después de la extensión, y la fracción generadora de firma de identificación escindida se pasa a través de uno o más nanotubos. El detector detecta la firma de identificación generada por la fracción generadora de firma de identificación escindida cuando la fracción generadora de firma de identificación escindida pasa a través de uno o más nanotubos, y el nucleótido del grupo de nucleótidos que se añadió durante dicha extensión se identifica en función de la detección de la fracción identificadora generadora de firmas, identificando de ese modo uno o más nucleótidos en la molécula de ácido nucleico objetivo en la muestra.

De conformidad con este aspecto de la presente invención, la secuencia de nucleótidos objetivo de una molécula de ácido nucleico objetivo se puede secuenciar repitiendo, las etapas de extensión, escisión, paso, detección e identificación.

De conformidad con este aspecto de la presente invención, el dispositivo que comprende el procesador biomolecular y uno o más nanotubos alojados en una unidad de nanosensor puede contener una o más unidades aguas arriba de la unidad de nanosensor que están configuradas para preparar la muestra para su análisis en el procesador biomolecular. Estas unidades se han descrito anteriormente e incluyen una unidad de separador (por ejemplo, módulo 150, figura 17A) para separar o enriquecer las células biológicas objetivo (por ejemplo, células tumorales circulantes), una unidad de tipo aislamiento de plasma de extensión longitudinal (por ejemplo, módulo 200, figura 17A) para separar el plasma de los glóbulos rojos y los glóbulos blancos, una primera unidad de tipo extractor (módulo 250, figura 17A) para exosomas purificadores de afinidad, una segunda unidad de tipo extractor (módulo 300, figura 17A) para la purificación de ADN libre circulante, una unidad de tipo sensor (módulo 350, figura 17A) para contar células y determinar la viabilidad, una segunda unidad de tipo extractor (módulo 400, figura 17A) para el aislamiento de ADN y/o ARN, uno o más módulos de reactor para reacciones de transcriptasa inversa y reacciones TdT (módulos 450 y 500, figura 17A) y un módulo de purificación de flujo (módulo 550, figura 17A) para eliminar el exceso de dNTP y otros componentes de la molécula de ácido nucleico no objetivo de la muestra antes de entrar en la cámara del nanosensor y el procesador biológico.

La fracción de bloqueo del nucleótido trifosfato puede bloquear directamente la adición de un nucleótido trifosfato posterior en su grupo 3'OH. En esta realización, la fracción de bloqueo está unida al nucleótido trifosfato en el 2'-O de una ribosa, o en el 3'-O de una desoxirribosa. Estos nucleótidos trifosfatos son análogos a la secuenciación por síntesis fluorescente (Ju et al., "Four-color DNA sequencing by synthesis using cleavable fluorescent nucleotide reversible terminators", Proc Natl Acad Sci USA. 103(52):19635-40 (2006)). En el caso de grupos de bloqueo 3'-O, hay varios ejemplos bien demostrados en la literatura, incluyendo, pero sin limitación, grupos amino, azidometil y cianoetil. La naturaleza específica del grupo debe elegirse por una combinación de eficiencia de incorporación enzimática y facilidad de eliminación durante la etapa de desbloqueo. La eliminación del grupo de bloqueo es específica de la naturaleza química del grupo de bloqueo; sin embargo, los ejemplos incluyen el uso de reactivos acuosos suaves (es decir, agentes reductores) a temperaturas que conservan el par cebador-molde y no provocan pérdida de señal debido a la fusión del par cebador-molde.

Como alternativa, la fracción de bloqueo del nucleótido trifosfato inhibe de forma reversible la adición de un nucleótido trifosfato posterior en su grupo 3'OH. Estas fracciones de bloqueo se pueden unir a un nucleótido trifosfato en la posición C5 o C7 del nucleótido, es decir, la pirimidina o purina, respectivamente. Estos nucleótidos trifosfatos son similares a Lightning Terminators™ (LaserGen, Inc.) (véase Gardner et al., "Rapid Incorporation Kinetics and Improved Fidelity of a Novel Class of 3 'OH Unblocked Reversible Terminators", Nucleic Acids Research doi:10.1093/nar/gks330 (mayo de 2012) y Litosh et al., "Improved Nucleotide Selectivity and Termination of 3'-OH Unblocked Reversible Terminators by Molecular Tuning of 2 nitrobenzyl Alkylated HOMedU Triphosphates", Nucleic Acids Research 39(6):e39 (2011)) y Virtual Terminator™ (Helicos BioSciences) (Bowers et al., "Virtual Terminator Nucleotides for Next-Generation DNA Sequencing", Nat. Methods 6:593-595 (2003), patente de Estados Unidos n.° 8.071.755 a Efcavitch et al., patente de Estados Unidos n.° 8.114.973 a Siddiqi et al., documento WO 2008/0169077 a Siddiqi et al.). Se pueden usar fracciones químicas que interfieren con la incorporación de dNTP por un ADN polimerasa dependiente del molde que utiliza un volumen estérico o inhibición cargada o combinaciones de ambos. Ejemplos de restos inhibidores son dipéptidos de Glu-Glu o Asp-Asp.

De conformidad con este aspecto de la presente invención, una fracción generadora de firma de identificación adecuada es una que se puede acoplar a un nucleótido trifosfato y es capaz de modificar o modular de manera mensurable (es decir, aumentar o bloquear) la corriente a través de uno o más nanoporos.

Las fracciones de generación de firmas de identificación adecuadas incluyen moléculas cargadas solubles en agua, por ejemplo y sin limitación, polipéptidos ácidos, polipéptidos básicos, dinucleótidos, trinucleótidos, análogos de nucleótidos peptídicos, polímeros cargados (por ejemplo, polímeros de polietilenglicol), nanoesferas, nanocristales, oligosacáridos cargados, dendrímeros, colorantes fluorescentes, tintes infrarrojos, cromóforos, quinolonas, cumarina, porfirinas, complejos de porfirina-metal, moléculas policíclicas aromáticas solubles en agua, moléculas heterocíclicas aromáticas solubles en agua, complejos de metales de transición, quelados de metales, polímeros de quelatos metálicos, derivados de 2-nitrobencilo, o cualquier combinación de estas fracciones. La fracción generadora de firma de identificación escindible se añade a cada nucleótido trifosfato en su posición de nucleótido C5 o su posición de nucleótido C7.

Una vez que se escinde la fracción generadora de la firma de identificación, se introduce a través de uno o más nanotubos para su detección. La fracción generadora de firma identificación se detecta a medida que pasa a través de uno o más nanoporos en función de un cambio mensurable en la corriente a través de cada nanoporo que se genera a medida que la fracción pasa a través de cada nanoporo. Tal y como se ha señalado anteriormente, el cambio en la corriente puede ser un aumento (es decir, aumento de corriente) o una disminución de la corriente (es decir, un bloqueo de corriente) a través de los uno o más nanoporos. La magnitud, la duración y la dirección del cambio de corriente a través de un nanoporo se detecta y mide para identificar y distinguir cada uno de los nucleótidos trifosfatos. La firma de identificación de la fracción generadora de firmas de identificación está influenciada por el tamaño, la forma, la carga y la conductividad de la fracción, así como la longitud, el diámetro y las propiedades moleculares del nanoporo tal y como se ha descrito anteriormente (por ejemplo, composición y/o revestimiento superficial del nanoporo).

En otra realización, la fracción generadora de firma de identificación se detecta y distingue en función de su tiempo de vuelo en el canal de tiempo de vuelo dentro del nanotubo. En esta realización, la fracción generadora electrónica escindida se introduce a través de al menos un primer y un segundo nanoporo, donde el primer y el segundo nanoporo se coloca en los extremos opuestos de un canal de tiempo de vuelo del nanotubo. El tiempo que tarda una fracción en atravesar el primer nanoporo, el canal de tiempo de vuelo y el segundo nanoporo se miden y se utilizan como la firma de identificación de la fracción generadora de firma de identificación. La firma de identificación de la fracción generadora de firmas de identificación está influenciada por el tamaño, la forma, la carga y la conductividad de la fracción, así como la longitud, el diámetro y las propiedades moleculares de los nanoporos y el nanocanal de tiempo de vuelo (por ejemplo, la composición y/o el recubrimiento superficial del nanoporo y nanocanal).

En otra realización, la fracción generadora de firma de identificación se detecta y distingue en función del cambio en la corriente a través de al menos dos nanoporos que se produce cuando la fracción generadora de firma de identificación pasa a través de los dos nanoporos en combinación con la medición del tiempo de vuelo entre los dos nanoporos.

De conformidad con este y con todos los aspectos de la presente invención, las muestras que contienen moléculas de ácido nucleico de interés para el análisis usando los métodos descritos en el presente documento incluyen, sin limitación, tejido, células, suero, sangre, plasma, líquido amniótico, esputo, orina, fluidos corporales, secreciones corporales, excreciones corporales, ácidos nucleicos circulantes libres de células, ácidos nucleicos tumorales circulantes sin células, ácidos nucleicos fetales circulantes libres de células en mujeres embarazadas, células tumorales circulantes, tumor, biopsia de tumor y exosomas.

Las moléculas de ácido nucleico objetivo dentro de la muestra que se va a detectar pueden ser moléculas de ácido desoxirribonucleico (ADN) bicatenarias, moléculas de ADN monocatenario, moléculas de ADN que comprenden una o más bases de nucleótidos metilados, moléculas de ADN que comprenden una o más bases de nucleótidos modificadas o dañadas, moléculas de ácido ribonucleico (ARN), es decir, ARN largo no codificante (IncRNA), ARN ribosómico (ARNr), ARN nuclear pequeño (ARNsno), microARN (miARN), transferencia de ARN (tRNA) y ARN interferente pequeño (siRNA), las moléculas de ARN que comprenden una o más bases de nucleótidos modificadas o dañadas y moléculas híbridas de ARN/ADN.

De conformidad con este y con todos los aspectos de la presente invención, la molécula de captura inmovilizada es un miembro de unión a una parte de la molécula de ácido nucleico objetivo o una parte unida a la molécula de ácido nucleico objetivo. Las moléculas de captura adecuadas y sus respectivos socios de unión presentes en la molécula de ácido nucleico incluyen, sin limitación, biotina y estreptavidina, proteína de unión a maltosa y maltosa, quitina y proteína de unión a quitina, amilasa y MBP, glutatión transferasa y glutatión-S-transferasa, matriz de histag y NTA, integrina y péptidos de unión a integrina. En otra realización, la molécula de captura es una secuencia de polinucleótidos que es complementaria a una porción de la secuencia de ácido nucleico de la molécula de ácido nucleico objetivo. Por ejemplo, en una realización, la molécula de captura es una secuencia homopolimérica de un mononucleótido trifosfato, por ejemplo, un cebador poli-dA o poli-T, y las moléculas de ácido nucleico objetivo de la muestra contienen la secuencia homopolimérica complementaria del mononucleótido trifosfato, es decir, una cola de poli-T o polydA.

En una realización de la presente invención, el miembro de unión de la molécula de captura inmovilizada se añade a la molécula de ácido nucleico objetivo para facilitar la inmovilización. Las moléculas de ácido nucleico en la muestra pueden fragmentarse aleatoriamente y tratarse para añadir las porciones adaptadoras que contienen un miembro de unión adecuado y, opcionalmente, una o más porciones adicionales, por ejemplo, una porción de unión de cebador, a cada extremo de las moléculas de ácido nucleico fragmentadas. Por ejemplo, los extremos de una molécula de ADN, ya sea con extremos romos o alineados con una variedad de enzimas, como polimerasa T4 o E. coli polimerasa, se pueden fosforilar usando T4 Quinasa. Se utiliza una polimerasa sin actividad de corrección de pruebas de 3' a 5' (como Klenow (exo)) para agregar una "A" adicional al extremo 3', creando un voladizo 3'A de base única adecuado para la ligadura del adaptador utilizando conectores que contienen voladizos 3'T de base única. La adición de porciones adaptadoras a una molécula de ácido nucleico y un complemento de la misma también se puede lograr usando cualquiera de una variedad de reacciones enzimáticas conocidas en la técnica. Las enzimas adecuadas incluyen, sin limitación, ligasas (por ejemplo, E. coli ligasa o ADN ligasa T4), polimerasas (por ejemplo, Polimerasa Taq, Polimerasa T4, o E. coli polimerasa), recombinasas, transferasas terminales, endonucleasas, enzimas reparadoras de ADN y transcriptasas inversas. Los enfoques ilustrativos para añadir porciones adaptadoras a varias moléculas de ácido nucleico objetivo (por ejemplo, ADN, ARNm, miRNA) son sobradamente conocidos en la técnica.

En una realización, las porciones del adaptador se agregan usando una transferasa terminal para añadir una secuencia homopolimérica de mononucleótido trifosfato, es decir, una cola de poli-T o poli-dA en el extremo 3' de la molécula de ácido nucleico objetivo. En otra realización, las porciones adaptadoras se añaden a la molécula de ácido nucleico objetivo usando un conjunto específico de locus de cebadores de oligonucleótidos y una polimerasa. En esta realización, un primer cebador oligonucleotídico del conjunto de cebadores comprende una secuencia adaptadora de nucleótidos 5' que sirve como miembro de unión a la molécula de captura, por ejemplo, un poli-dA, cola de secuencia de poli-T, y una secuencia de nucleótidos objetivo 3' que es complementaria a una porción de la molécula de ácido nucleico objetivo. El segundo cebador oligonucleotídico del conjunto de cebadores comprende una parte específica del cebador 5' opcional y una secuencia de nucleótidos 3' que es complementaria a una parte de un producto de extensión formado a partir del primer cebador. Para mejorar la especificidad de la reacción de la polimerasa adjunta al adaptador, uno o ambos cebadores de oligonucleótidos del conjunto de cebadores de oligonucleótidos tienen un nucleótido o análogo de nucleótido escindible en 3' y un grupo de bloqueo que bloquea la extensión mediada por polimerasa de uno o ambos cebadores. Los grupos de bloqueo adecuados incluyen, por ejemplo, sin limitación, un grupo de propanol (3'SpC3), una base de didesoxi ribosa (3'ddC), un fosfato (3' fosfato) o un grupo fosforotioato (Nikiforow, et al., "The Use of Phosphorothioate Primers and Exonuclease Hydrolysis for the Preparation of Singlestranded PCR Products and their Detection by Solid-phase Hybridization", p Cr Methods and Applications, 3: págs.

285-291 (1994). La escisión del grupo de bloqueo 3' del cebador oligonucleotídico para liberar un 3'OH adecuado para la polimerasa se puede lograr usando RNaseH cuando el cebador está diseñado para contener una base ribonucleotídica interna (véase Dobosy et. al. "RNase H-Dependent PCR (rhPCR): Improved Specificity and Single Nucleotide Polymorphism Detection Using Blocked Cleavable Primers", Bm C Biotechnology 11(80):1011 (2011)), usando T endonucleasas IV o endonucleasas IV E. coli cuando el cebador está diseñado para contener un sitio abásico interno (por ejemplo, tetrahidrofurano), o usando T endonucleasas V o endonucleasas V E. coli cuando el cebador está diseñado para contener una U interna emparejada con una G en la plantilla (la escisión liberará el segundo o tercer enlace fosfodiéster 3' al desajuste U-G).

Las moléculas de ácido nucleico objetivo se pueden enriquecer opcionalmente antes de la inmovilización al soporte sólido mediante la unión a su respectiva molécula de captura. El enriquecimiento de la molécula de ácido nucleico objetivo se puede llevar a cabo usando métodos conocidos en la técnica y, tal y como se describe en el presente documento.

Una vez que las moléculas de ácido nucleico objetivo se inmovilizan al soporte sólido mediante la unión a sus respectivas moléculas de captura inmovilizadas, las moléculas de ácido nucleico objetivo inmovilizadas o los productos de extensión inmovilizados que son complementarios a las moléculas de ácido nucleico objetivo se someten a un proceso de reacción de ligadura, proceso de reacción de extensión u otra reacción enzimática.

En una realización, la molécula de ácido nucleico objetivo inmovilizada se utiliza como molde para el proceso de reacción de ligadura. En esta realización, la transferasa terminal añade nucleótidos trifosfatos biotinilados al extremo de la molécula de ácido nucleico, y la molécula de ácido nucleico objetivo biotinilada se inmoviliza sobre el soporte sólido mediante la unión a estreptavidina que recubre la superficie del soporte sólido. Aunque la biotina-estreptavidina no es una interacción de unión covalente, las colas con biotina generalmente permiten la captura de 2-3 biotinas de la misma molécula en el tetrámero de estreptavidina, y la inmovilización de esta manera puede soportar las condiciones de desnaturalización (alto contenido de formamida y/o calentamiento a 90 °C) del proceso de reacción de ligadura. Se requiere dicha desnaturalización para liberar los productos de ligadura generados por el proceso de reacción de ligadura del objetivo inmovilizado en la superficie sólida para la etapa posterior de detección y distinción.

En otra realización, la transferasa terminal añade dCTP a un extremo de ácido nucleico objetivo, y la molécula de ácido nucleico objetivo marcada se inmoviliza en el soporte sólido mediante la unión a moléculas de captura de oligonucleótidos dG50 en el soporte sólido. De manera similar a la interacción de unión biotina-estreptavidina, la unión del homopolímero dC:dG es lo suficientemente fuerte como para resistir las condiciones de desnaturalización descritas anteriormente. Se requiere dicha desnaturalización para liberar los productos de ligadura generados por el proceso de reacción de ligadura del objetivo inmovilizado en la superficie sólida para la etapa posterior de detección y distinción. Esto permite que la molécula de ácido nucleico objetivo sirva como molde para el proceso de reacción de ligadura.

En otra realización, los productos de extensión inmovilizados que son complementarios a la molécula de ácido nucleico objetivo inmovilizada se generan en las estructuras de soporte espaciadas de la cámara de biorreactor y se utilizan como plantilla para el proceso de reacción de ligadura. Los productos de extensión inmovilizados se generan usando reacciones de amplificación en fase sólida conocidas por los expertos en la técnica y/o tal y como se describen en el presente documento.

En una realización, la molécula de captura es un oligonucleótido de captura que también sirve como cebador para facilitar la amplificación lineal en fase sólida de las moléculas de ácido nucleico objetivo unidas. De conformidad con esta realización, un oligonucleótido de captura, por ejemplo, un cebador de captura poli-dA, hibridado con una porción complementaria de la molécula de ácido nucleico objetivo, por ejemplo, una porción adaptadora de la molécula de ácido nucleico objetivo que contiene una cola de poli-T, se extiende utilizando polimerasa y un conjunto de dNTP para hacer una copia completa de la molécula de ácido nucleico objetivo inmovilizada. Usar una polimerasa que tenga actividad de desplazamiento de cadena, como la polimerasa Bst, permite la amplificación lineal de la molécula de ácido nucleico objetivo. Después de la extensión del cebador para formar un producto de extensión inmovilizado que es complementario a la molécula de ácido nucleico objetivo, la temperatura aumenta de modo que las porciones de poli-T de la molécula de ácido nucleico objetivo y su producto de extensión se desnaturalizan, permitiendo un que un oligonucleótido de captura no hibridado adyacente se una a la molécula de ácido nucleico objetivo y se extienda. Esta amplificación lineal produce fielmente copias de la hebra molde original de la molécula de ácido nucleico cuando se "transfiere" al siguiente cebador. Este proceso continúa hasta que se agotan los cebadores de oligonucleótidos de captura no hibridados sobre el soporte sólido.

En otra realización, la molécula de ácido nucleico objetivo con porciones adaptadoras adjuntas se circulariza, y la amplificación de fase sólida se logra mediante una reacción de amplificación de círculo rodante (Lizardi et al., "Mutation Detection and Single-molecule Counting Using Isothermal Rolling-circle Amplification", Nat Genet 19:225-232 (1998)).

De conformidad con esta realización, el oligonucleótido de captura inmovilizado sirve como cebador para cebar la amplificación del círculo rodante en fase sólida. La molécula de ácido nucleico circularizada se híbrida con el oligonucleótido de captura inmovilizado a través de su porción adaptadora complementaria (por ejemplo, la secuencia de poli-T de la molécula de ácido nucleico circularizada hibrida con el oligonucleótido de captura de poli-dA inmovilizado). En presencia de polimerasa con actividad de desplazamiento de cadena y un grupo de dNTP, el cebador inmovilizado se extiende continuamente alrededor de la molécula de ácido nucleico circularizada para generar productos de extensión inmovilizados que comprenden secuencias repetidas lineales en tándem multiméricas que son complementarias a la secuencia de la molécula de ácido nucleico objetivo adjunta al adaptador circularizado.

Para mejorar aún más la amplificación en fase sólida y la inmovilización de productos de extensión que son complementarios a la molécula de ácido nucleico objetivo, la porción adaptadora de la molécula de ácido nucleico objetivo está diseñada para contener una o más porciones específicas del cebador universal. De conformidad con esta realización, se proporcionan uno o más cebadores que tienen una porción 3' que tiene la misma secuencia de la porción específica del cebador universal de la porción adaptadora de la molécula de ácido nucleico objetivo para hibridar con su porción específica complementaria del cebador universal de los productos de extensión inmovilizados. La extensión del cebador hibridado sobre los productos de extensión inmovilizados forma un producto de extensión secundario. El producto de extensión secundario se desnaturaliza y captura en un cebador oligonucleotídico de captura adyacente o cercano en el soporte sólido, cuyo cebador se extiende posteriormente para formar productos de extensión inmovilizados adicionales que son complementarios a la molécula de ácido nucleico objetivo. Este proceso continúa hasta que se agotan los cebadores de oligonucleótidos de captura no hibridados sobre el soporte sólido.

Otro enfoque adecuado para llevar a cabo la amplificación en fase sólida de conformidad con los métodos de la presente invención se describe en el documento WO2013/012440 de Barany. et al. Los enfoques isotérmicos para llevar a cabo nuestra amplificación en fase sólida de conformidad con los métodos de la presente invención se describen en Ma et al., Proc Natl Acad Sci EE. UU. 110(35):14320-3 (2013).

De conformidad con este aspecto de la presente invención, las moléculas de ácido nucleico objetivo inmovilizadas o sus productos de extensión inmovilizados se someten a una reacción de ligadura para producir productos de ligadura. En una realización de la presente invención, la reacción de ligadura es una reacción de detección de ligadura. La mezcla de reacción de detección de ligadura comprende una ligasa y uno o más conjuntos de sondas de oligonucleótidos, teniendo cada conjunto de sondas una primera sonda de oligonucleótidos que tiene una porción específica de secuencia de nucleótidos objetivo, y una segunda sonda de oligonucleótidos que tiene una porción específica de secuencia de nucleótidos objetivo. La primera y la segunda sonda de oligonucleótidos de un conjunto de sondas están configuradas para hibridar, de una manera específica de una base, en una región complementaria de las moléculas de ácido nucleico objetivo inmovilizadas o productos de extensión inmovilizados de las mismas. En una realización, la primera y la segunda sonda de oligonucleótidos de un conjunto de sondas se hibridan inmediatamente de forma adyacente entre sí, con una unión entre medias, en su región complementaria del ácido nucleico objetivo inmovilizado o producto de extensión del mismo y se ligan entre sí para formar un producto de ligadura. En otra realización, la primera y la segunda sonda de oligonucleótidos de un conjunto de sondas se hibridan con sus regiones complementarias en la molécula de ácido nucleico objetivo o producto de extensión de la misma con un espacio o separación entre medias. En esta realización, se utiliza una polimerasa para extender el extremo 3' de la primera sonda oligonucleotídica para crear una unión con la segunda sonda oligonucleotídica, y luego la ligasa une las dos sondas para formar un producto de ligadura.

Se pueden emplear varias variaciones de la reacción de ligadura descrita anteriormente para mejorar la especificidad de la generación del producto de ligadura y, por lo tanto, la detección de ácido nucleico objetivo. En una realización, la primera sonda oligonucleotídica lleva un grupo 3'OH competente para la ligadura mientras que la segunda sonda oligonucleotídica tiene un extremo 5' incompetente para la ligadura (es decir, una sonda de oligonucleótidos sin un fosfato 5'). De conformidad con el método de la presente invención, las sondas de oligonucleótidos de un conjunto de sondas se diseñan de modo que la base más 3' de la primera sonda oligonucleotídica se solape con la base más 5' inmediatamente flanqueante de la segunda sonda oligonucleotídica que es complementaria a la molécula de ácido nucleico objetivo. El nucleótido superpuesto se denomina "solapa". Cuando el nucleótido de solapa superpuesto de la segunda sonda oligonucleotídica es complementario a la secuencia de la molécula de ácido nucleico objetivo y la misma secuencia que el nucleótido 3' de terminación de la primera sonda oligonucleotídica, el enlace fosfodiéster inmediatamente aguas arriba del nucleótido de solapa de la segunda sonda de oligonucleótido se escinde de manera discriminatoria por una enzima que tiene actividad de endonucleasa de solapa (FEN) o nucleasa 5'. Esa actividad de FEN específica produce un nuevo extremo fosfato 5' competente para la ligadura en la segunda sonda oligonucleotídica que se coloca con precisión junto al 3'OH adyacente de la primera sonda oligonucleotídica. Este método y las variaciones del mismo que son adecuadas para su uso de conformidad con este aspecto de la presente invención se describen en la publicación de solicitud de patente de Estados Unidos n.° 2015/0038336 de Barany. et al.

La discriminación de ligasa se puede mejorar aún más empleando varias características de diseño de sonda. Por ejemplo, un desajuste intencional o análogo de nucleótido (por ejemplo, inosina, nitroindol o nitropirrol) se pueden incorporar en la primera sonda de oligonucleótidos en la 2.a o 3.a base desde el extremo de la unión 3' para desestabilizar ligeramente la hibridación del extremo 3' si está perfectamente emparejado en el extremo 3', pero desestabiliza significativamente la hibridación del extremo 3' si no coincide en el extremo 3'. Este diseño reduce las malignidades inapropiadas cuando las sondas mutantes se hibridan con el objetivo de tipo salvaje. Como alternativa, las bases de ARN que pueden escindirse mediante ARNasas pueden incorporarse en las sondas de oligonucleótidos para asegurar la formación de productos dependiente de la plantilla. Por ejemplo, en Dobosy et. al. "RNase H-Dependent PCR (rhPCR): Improved Specificity and Single Nucleotide Polymorphism Detection Using Blocked Cleavable Primers", BMC Biotechnology 11(80): 1011 (2011), se describe el uso de una base de ARN cerca del extremo 3' de una sonda oligonucleotídica con el extremo bloqueado en 3' y cortarla con ARNasa H2 generando un 3'-OH ligable y extensible por PCR. Este enfoque se puede utilizar para generar 3'OH o 5'-P competentes para la ligadura, o ambos, siempre que se utilice una ligasa que pueda ligar la base 5'-ARN.

Para inserciones o eliminaciones, la incorporación de una base emparejada o análogos de nucleótidos (por ejemplo, -amino-dA o 5-propinil-dC) en la primera sonda de oligonucleótidos en la 2.a o 3.a posición de la unión mejora la estabilidad y puede mejorar la discriminación de dichas mutaciones de desplazamiento de marco de las secuencias de tipo salvaje. Para inserciones, el uso de uno o más nucleótidos modificados con tiofosfato aguas abajo del enlace fosfato escindible deseado de la segunda sonda oligonucleotídica evitará la escisión inapropiada por la enzima nucleasa 5' cuando las sondas se hibridan con ADN de tipo salvaje y, por lo tanto, reducirá la unión de falsos positivos en objetivo de tipo salvaje. De igual manera, para eliminaciones, el uso de uno o más nucleótidos modificados con tiofosfatem aguas arriba del enlace fosfato escindible deseado de la segunda sonda oligonucleotídica evitará la escisión inapropiada por la enzima nucleasa 5' cuando las sondas se hibridan con el ADN de tipo salvaje y, por lo tanto, reducirá la ligadura de falsos positivos en tipo de destino.

Otras posibles modificaciones incluyen sitios básicos, por ejemplo, dSpacer (también conocido como THF tetrahidrofurano) u oxo-G. Estas "bases" anormales tienen enzimas específicas que eliminan la base anormal y generan sitios 3'-OH o 5'P competentes para la ligadura. La endonucleasa IV, T EndolV (NEB) eliminará los residuos abásicos después de que los oligonucleótidos de ligadura se hibriden con el ácido nucleico objetivo, pero no de un ADN monocatenario. De manera similar, se puede usar oxo-G con Fpg o inosina/uracilo con EndoV o Thimine glicol con EndoVIII.

En otra realización, un conjunto de sondas para la reacción de ligadura puede comprender además una tercera sonda oligonucleotídica que también tiene una porción específica del objetivo que es complementaria a una región de la molécula de ácido nucleico objetivo inmovilizada o producto de extensión de la misma. En esta realización, la segunda y la tercera sonda de oligonucleótidos de un conjunto de sondas están configuradas para hibridar adyacentes entre sí en la secuencia de nucleótidos objetivo con una unión entre ellas. La porción específica del objetivo de la tercera sonda de oligonucleótidos tiene un solapamiento de nucleótidos idéntico superpuesto en la unión con la segunda sonda de oligonucleótidos en un conjunto de sondas que se elimina mediante una enzima que tiene actividad FEN cuando es complementaria a la secuencia de nucleótidos objetivo y es la misma secuencia que el nucleótido 3' de terminación de la segunda sonda oligonucleotídica. La escisión del solapamiento libera un fosfato 5' competente para la ligadura en la tercera sonda de oligonucleótidos que permite la ligadura entre la segunda y la tercera sonda de oligonucleótidos en la unión para formar una secuencia de producto ligada. La utilización de tres sondas en un conjunto de cebadores permite la detección de regiones objetivo más largas con mayor especificidad

Las endonucleasas de superposición o nucleasas 5' que son adecuadas para escindir la superposición 5' de la segunda sonda oligonucleotídica antes de la ligadura incluyen, sin limitación, polimerasas que portan actividad nucleasa 5', como E. coli ADN polimerasa y polimerasas de Taq y T. thermophilus, así como T4 RNase H y TaqExo.

La reacción de ligadura utilizada en el método de la presente invención es sobradamente conocida en la técnica. Las ligasas adecuadas para ligar sondas de oligonucleótidos de un conjunto de sondas después de la escisión de la superposición 5' en la segunda sonda de oligonucleótidos incluyen, sin limitación, ligasa Thermus aquaticus, ligasa Thermus sp. AK16D, ligasa E. coli, ligasa ADN T4, ligasa RNA T4, ligasa Taq, ligasa 9 N.° y ligasa Pyrococcus, o cualquier otra ligasa termoestable conocida en la técnica. De conformidad con la presente invención, el proceso de ligadura de nucleasas de la presente invención se puede llevar a cabo empleando una reacción de ensayo de ligadura de oligonucleótidos (OLA) (véase Landegren, et al., "A Ligase-Mediated Gene Detection Technique", Science 241:1077-80 (1988); Landegren, et al., "DNA Diagnostics -- Molecular Techniques and Automation", Science 242:229-37 (1988); y la patente de Estados Unidos n.° 4.988.617 de Landegren, et al.), una reacción de detección de ligadura (LDR) que utiliza un conjunto de sondas oligonucleotídicas complementarias (véase, por ejemplo, el documento WO 90/17239 de Barany et al, o una reacción en cadena de ligadura (LCR) que utiliza dos conjuntos de sondas de oligonucleótidos complementarias; véase, por ejemplo, el documento WO 90/17239 de Barany et al).

Las sondas de oligonucleótidos de un conjunto de sondas pueden estar en forma de ribonucleótidos, desoxinucleótidos, ribonucleótidos modificados, desoxirribonucleótidos modificados, análogos de nucleótidos peptídicos, análogos de nucleótidos peptídicos modificados, oligonucleótidos de estructura fosfato-azúcar modificados, análogos de nucleótidos y mezclas de los mismos.

Tal y como se describe en el presente documento, el dispositivo y los métodos de la presente invención están diseñados para detectar, identificar, cuantificar (es decir, número de copias) y distinguir moléculas de ácido nucleico de baja abundancia que comprenden una o más mutaciones de bases de nucleótidos, inserciones, eliminaciones, translocaciones, variantes de empalme, variante de miARN, transcripción alternativa, sitio de inicio alternativo, secuencia de codificación alternativa, secuencia alternativa no codificante, empalme alternativo, inserción de exón, deleción de exón, inserción de intrones, translocación, mutación u otro reordenamiento a nivel del genoma y/o bases de nucleótidos metilados. Las moléculas de ácido nucleico de baja abundancia con una o más mutaciones de bases de nucleótidos, inserciones, eliminaciones, translocaciones, variantes de empalme, variante de miARN, transcripción alternativa, sitio de inicio alternativo, secuencia de codificación alternativa, secuencia alternativa no codificante, empalme alternativo, inserción de exón, deleción de exón, inserción de intrones, translocación, mutación u otro reordenamiento a nivel del genoma, y/o las bases nucleotídicas metiladas se identifican y distinguen usando los métodos de la presente invención de una gran abundancia de moléculas de ácido nucleico en la muestra que tiene una secuencia de nucleótidos similar a las moléculas de ácido de nucleótido de baja abundancia pero sin una o más mutaciones de base de nucleótidos, inserciones, eliminaciones, translocaciones, variantes de empalme, variante de miARN, transcripción alternativa, sitio de inicio alternativo, secuencia de codificación alternativa, secuencia alternativa no codificante, empalme alternativo, inserción de exón, deleción de exón, inserción de intrones, translocación, mutación u otro reordenamiento a nivel del genoma y/o bases de nucleótidos metilados.

La capacidad de detectar, identificar, cuantificar (es decir, número de copias) y distinguir moléculas de ácido nucleico de baja abundancia en una muestra permite el diagnóstico y pronóstico precoces de una enfermedad. En otra realización, la capacidad de detectar, identificar, cuantificar y distinguir moléculas de ácido nucleico de baja abundancia en una muestra permite la determinación de genotipos o predisposición a enfermedades.

Las moléculas de ácido nucleico objetivo que se detectan, identifican y distinguen pueden aislarse de cualquier muestra adecuada, incluyendo sin limitación, tejido, células, suero, sangre, plasma, líquido amniótico, esputo, orina, fluidos corporales, secreciones corporales, excreciones corporales, ácidos nucleicos circulantes libres de células, ácidos nucleicos tumorales circulantes libres de células, ácidos nucleicos fetales circulantes libres de células en mujeres embarazadas, células tumorales circulantes, tumor, biopsia de tumor y exosomas.

Ejemplos

Los siguientes ejemplos se proporcionan para ilustrar realizaciones de la presente invención, pero de ninguna manera pretenden limitar su alcance.

Ejemplo 1: detección y distinción de moléculas individuales en las cámaras de nanosensores del uMPS

Datos de simulación:

Las simulaciones preliminares generadas con el software de simulación COMSOL® se han realizado en una cámara de nanosensores compuesta por 8 procesadores biomoleculares, midiendo cada procesador 20 x 20 pm y conteniendo 288 pilares (1 pm x 5 pm con un espaciado de 250 nm). Para estas simulaciones, se abordaron tres cuestiones operativas: (1) ¿Pueden todos los procesadores biomoleculares de una sola cámara ser direccionados uniformemente desde una entrada común (reduce la huella de la cámara) hidrodinámicamente sin que ningún fluido se mueva al nanotubo?; (2) ¿Cuál es la eficiencia de captura de los productos de ADN con cola de TdT en los cebadores inmovilizados en la superficie de dA30?; y (3) después de la desnaturalización térmica, ¿podrían los productos dirigirse de manera eficiente a los sensores de nanotubos de forma electrocinética?

Para flujo impulsado por presión (véase la figura 31), la inclusión de deflectores Chevron en el área del procesador prebiomolecular de la cámara distribuye el fluido de entrada a través de toda la matriz del procesador biomolecular en una cantidad de tiempo sustancialmente menor que la difusión longitudinal solamente. Además, debido a la alta resistencia fluídica en el nanotubo durante la operación hidrodinámica, que surge de su pequeña sección transversal (menos de 50 x 50 nm, con una longitud superior a 100 pm de longitud), muy poco fluido o nada entra en los nanotubos debido a la extraordinariamente alta resistencia a los fluidos. Esto es conveniente porque, durante las fases de carga y reacción del ensayo, que utilizará flujo impulsado por presión para bombear muestras/reactivos, todo el material se desplazará alrededor de los tubos de vuelo como se muestra en la figura 31.

Sin embargo, cuando la cámara se acciona electrocinéticamente, lo que se produce después de que los productos en fase sólida se derritan térmicamente del objetivo inmovilizado que se adhiere a los pilares de la cámara de biorreactor, los productos fundidos térmicamente se dirigen preferentemente al interior del tubo de vuelo (figura 32A). Tal y como se puede observar en la figura 32A, los productos cargados negativamente (oligonucleótidos que pueden llevar una etiqueta de arrastre, pero son polianiónicos) se introducen preferentemente en el tubo de vuelo porque la mayor parte de la caída de potencial eléctrico (> 95 %) se produce dentro del tubo de vuelo nanométrico. Esto permite utilizar límites virtuales generados por la aplicación del campo eléctrico y las fuertes líneas de campo que canalizan los productos deseados en el tubo de vuelo (figura 32B). De este modo, no hay necesidad de fabricar mediante la impresión de paredes sólidas que requerirían operaciones de válvulas para dirigir el flujo de fluido en la dirección correcta.

Por último, al utilizar el modo de difusión basado en pilares desarrollado para predecir la recuperación de lechos de extracción con pilares y el tamaño y espaciado de los pilares que se emplearán, la eficacia de captura del ADN con cola es > 80 % con la misma carga en todos los pilares (figura 33). Esta recuperación se calcula para los pilares de entrada del componente de cámara única cuando el flujo se impulsa hidrodinámicamente. Debido al uso de los deflectores Chevron y al direccionamiento uniforme de todos los procesadores biomoleculares de una sola cámara, es decir, ocho procesadores de biomoléculas por cámara de nanosensores (figura 31), existe la misma probabilidad de captura por cada pilar de la cámara. Los pilares aquí pueden ser de cualquier tamaño y forma para adaptarse a la aplicación dada para adaptarse a la carga de material objetivo requerida para la medición. Los pilares pueden ser redondos, tal y como se muestra en la figura 31, o pueden ser cuadrados, en forma de diamante, de forma rectangular, etc., tal y como se ha descrito anteriormente.

Exclusiva de esta aplicación es una estrategia que permite la detección de moléculas individuales que se desplazan a través de nanotubos que consisten en un nanocanal largo y dos o más nanoporos sintéticos en el plano. Los nanoporos tienen aberturas que van desde 5-50 nm y están ubicados cerca de los extremos de entrada y salida del nanocanal, que sirve como tubo de vuelo (véase figura 1B). Cuando una molécula pasa por un nanoporo, se genera una firma de corriente dependiendo de la concentración de sal iónica y el tamaño de la molécula, similar a lo que se ve en los nanoporos verticales, que consisten en pequeñas aberturas en poros que están suspendidos en membranas de nitruro de silicio. Los nanoporos pueden ser poros naturales, tales como alfa-hemolisina o nanoporos fabricados mediante molienda con haz de iones enfocado o molienda con haz de electrones en las membranas de nitruro de silicio. Único en esta aplicación es que los poros están en el plano con respecto al tubo de vuelo nanométrico y fabricados la misma etapa de impresión utilizada para crear la red nanofluídica. Además, se pueden colocar varios poros en serie a lo largo del mismo camino y las moléculas que entran/salen del primer poro y se desplazan a los poros posteriores se muestrean con una eficacia del 100 %.

Los dos nanoporos formados en un nanocanal generarán dos firmas de corriente, donde la separación en el tiempo entre los dos picos corresponde al tiempo de vuelo del producto en fase sólida fundido térmicamente liberado de los pilares de la cámara de biorreactor.

Se han llevado a cabo extensas simulaciones para demostrar la viabilidad de la estrategia de nanoporos sintéticos en el plano para detectar moléculas individuales. La figura 34 es un gráfico que muestra la distribución del campo eléctrico simulado en función de la posición dentro de un nanotubo que contiene un nanoporo. En este ejemplo, el tubo de vuelo es de 100 x 100 nm (ancho x profundidad) y 100 pm de longitud con el poro de 50 x 50 x 50 nm, y la tensión aplicada a través del tubo es de 10 V. Sin embargo, la longitud del tubo de vuelo puede ser de 10 micrones de longitud para adaptarse a la aplicación dada. Los tubos de vuelo más largos proporcionan una mejor resolución electroforética mejorando la eficiencia de identificación de las moléculas individuales. Tal y como se muestra en el gráfico de la figura 34, cuando se aplica un campo eléctrico longitudinal a lo largo del tubo de vuelo nanométrico, hay una gran mejora en el campo eléctrico a través del poro en el plano debido a su tamaño reducido con respecto al tubo de vuelo. Esto indica que la única molécula se acelerará al desplazarse en esta región del tubo de vuelo.

La figura 35A muestra un modelo de una partícula de forma esférica que reside dentro del nanoporo sintético en el plano. En este ejemplo, la partícula esférica posee un diámetro de ~40 nm y el poro es de 50 x 50 nm con un espesor de 50 nm. La respuesta de corriente que se genera (AI^b) cuando la partícula esférica reside dentro del poro se predice por AI^b “ I(V^p/V^d). En este caso, AI^b es igual a la corriente desbloqueada (I) multiplicada por la relación del volumen de la partícula (V^p) al volumen intersticial entre los poros (V^d). Tal y como puede observarse en la figura 35B, se generan distintos eventos de bloqueo de corriente cuando la partícula reside en el volumen de los poros, V^d, independientemente de la fuerza iónica del electrolito portador.

Las figuras 36A y 36B muestran los resultados de un bloqueo de corriente simulado producido por una única molécula de ADN esférica que tiene un diámetro de 40 nM que se mueve a través de un nanoporo sintético en el plano de varias longitudes, pero una sección transversal constante (50 x 50 nm). En este caso, la longitud de los poros se modificó en las siguientes etapas, 20 nm, 50 nm y 80 nm. Tal y como puede verse en el gráfico de la figura 36a , el ancho del pico del transistorio de corriente (AI^b) se alteró en función de la longitud de los poros y los poros más largos produjeron señales más anchas. La figura 36B muestra una gráfica de la relación de V^p/ V^d en función de la amplitud de AI^b. La gráfica no era lineal con la relación funcional que se muestra en el gráfico adjunto.

Estas simulaciones demuestran que la firma de identificación de una molécula, que en este caso es un evento de corriente de bloqueo, se puede moldear por la longitud de los poros, es decir, una mayor longitud de poro genera un transitorio de corriente más amplio. De esta forma, la identificación de firmas de diferentes poros en el nanotubo se puede discernir ajustando la longitud del poro como muestran estas simulaciones. Otra forma de cambiar la forma de la firma de identificación, es decir, el evento de bloqueo de corriente, es cambiar el diámetro de los poros. Los poros más grandes producen eventos de bloqueo de corriente más pequeños en términos de su amplitud.

Datos experimentales:

Se ha desarrollado un proceso de alto rendimiento simple para producir membranas poliméricas autoportantes en SU-8 con nanoporos perforados. La característica clave del proceso es utilizar una capa de resistencia doble para NIL, que se recubre por centrifugación secuencialmente. En primer lugar, se utiliza una resistencia de despegue (LOR) como capa de sacrificio, y luego se utiliza una fotorresistencia negativa SU-8 como capa activa. Las micro/nanoestructuras se definen utilizando NIL con sellos de Si producidos mediante litografía y grabado químico húmedo o grabado profundo de iones reactivos. El poro más pequeño logrado mediante un proceso NIL de una sola etapa fue de -10 nm de diámetro. El tamaño de los poros se redujo aún más a ~6 nm empleando un proceso de reflujo de polímero en el que los nanoporos se colocaron entre dos placas y el polímero se calentó por encima de su temperatura de transición vítrea respectiva a 45 °C durante 1 min. Las figuras 38A y 38B son imágenes SEM de estos nanoporos cónicos de membrana SU-8 que tienen un diámetro de 10 nm (figura 38A) o 6 nm (figura 38B). La figura 38C es un gráfico que representa la reducción del tamaño de los poros en función del tiempo de reflujo. Se estimó que la tasa de reducción de tamaño era de 3 nm/min.

Las figuras 39A y 39B muestran nanotubos fabricados que tienen nanoporos de diferente longitud.

Los estudios experimentales preliminares con los nanotubos fabricados han confirmado los datos de simulación. La figura 37A muestra un gráfico ilustrativo de la corriente transitoria frente al tiempo en un nanotubo fabricado que contiene dos nanoporos de diferentes tamaños (50 nm x 50 nm para el primer poro y 80 nm x 80 nm para el segundo poro). En este experimento, el nanotubo se llenó primero con un electrolito tampón. Entonces, se añadió al depósito una solución de A-ADN de la misma fuerza iónica que el electrolito de tampón. Se aplicó una tensión de activación para impulsar electroforéticamente las moléculas de ADN a través del nanotubo. La corriente transitoria se midió durante la translocación del ADN. El gráfico resultante de la figura 37A muestra múltiples picos de corriente con diferentes amplitudes. La figura 37B muestra las estadísticas de la amplitud de los picos de corriente obtenidos de 156 eventos de translocación. El diagrama muestra una distribución bimodal con dos picos de amplitud centrados en 110 pA y 200 pA resultantes de los dos nanoporos diferentes. El resultado confirma que la amplitud y el ancho del pico de corriente se pueden utilizar como firmas moleculares complementarias.

Ejemplo 2: electroforesis para multiplexación

La identificación de los productos LDR en fase sólida (spLDR) y otros productos oligonucleotídicos producidos como resultado de las reacciones en fase sólida que se llevan a cabo en los pilares de la cámara de biorreactor se basa en su longitud (bp), que se logrará mediante el emparejamiento de movilidad electroforética. Esto permite la multiplexación de movilidad con la potencia de multiplexación determinada por la capacidad máxima (P) del sistema (aquí la multiplexación se define como el número de mutaciones que pueden identificarse en un solo ciclo de análisis utilizando diferentes pares de cebadores LDR).

Para probar la sensibilidad del microscopio de campo oscuro para visualizar nanopartículas de plata individuales (AgNP) en un nanocanal, se obtuvieron imágenes de un AgNP estacionario (60 nm) y se controló su resonancia de plasmón de superficie localizada (LSPR). La figura 40A muestra una imagen tridimensional de la señal resultante que demuestra una alta sensibilidad. El perfil de intensidad fue constante en el tiempo, indicando una falta de blanqueamiento. Se obtuvieron imágenes de lapso de tiempo del único AgNP (60 nm) moviéndose a través de un tubo de vuelo de nanocanales de PMMA a una intensidad de campo externo de 200 V/cm. La figura 40B muestra imágenes LSPR fijas del único AgNP moviéndose electroforéticamente a través de un tubo de vuelo de nanocanal de PMMA. El movimiento de las partículas fue en la dirección de ánodo a cátodo (la misma dirección que EOF) con un tiempo de transporte para este evento de 1,3 s. Las dimensiones de las nanoranuras eran de 100 pm de longitud y 150 nm de profundidad/ancho. En este caso, la partícula se movió con una velocidad constante sin ningún movimiento intermitente debido al comportamiento de adherencia/deslizamiento.

La figura 40C muestra la movilidad electroforética y la variación en las movilidades de los AgNP individuales como lo indica el número de placa, N, en función de la intensidad del campo eléctrico. Se descubrió que la movilidad electroforética era relativamente constante independientemente de la intensidad del campo eléctrico, excepto en las intensidades de campo más bajas (< 200 V/cm) debido al movimiento de adherencia/deslizamiento. Sin embargo, con campos eléctricos elevados (> 200 V/cm), el número de placas aumentó drásticamente.

La figura 40D-F muestra histogramas (100 eventos) de los tiempos de vuelo electroforéticos para 60 nm (ES3) y 100 nm (E3) AgNP transportados electrocinéticamente a través de un tubo de vuelo de 150 nm en tampón de citrato de 0,05 mM utilizando campos eléctricos aplicados de 100 V/cm (figura 40D), 500 V/cm (figura 40E), 1500 V/cm (figura 40F). Se observó un movimiento de "adherencia/deslizamiento" de los AgNP a intensidades de campo eléctrico de 100 V/cm, lo que resultó en la amplia naturaleza de los tiempos de vuelo de una sola partícula. En los campos eléctricos más altos (500 y 1500 V/cm), este efecto no se observó, lo que resultó en anchos de pico mucho más estrechos que mejoraron la separación de las distribuciones gaussianas.

La potencia de multiplexación se mejora utilizando campos eléctricos más altos y/o alargando la columna. Por ejemplo, el aumento de la intensidad del campo a 4000 V/cm y la longitud de la nanocolumna a 200 pm dio como resultado P 31 (figura 41). Esto se calculó asumiendo una resolución electroforética de 6, que describe una precisión de clasificación (es decir, precisión de identificación de moléculas en función del tiempo de vuelo) del 99,75 %. Los datos generados en la figura 41 se recopilaron asumiendo una diferencia de movilidad electroforética de 0,01 (Apapp) entre dos analitos con un número de placa electroforética (N) de 15650. Los resultados indican que se pueden identificar 31 especies moleculares diferentes con una precisión del 99,75 %. La capacidad máxima y la precisión de identificación se mejoran al mejorar la selectividad aumentando las diferencias en la movilidad electroforética de los productos spLDR. Esto se logra, por ejemplo, mediante el uso de etiquetas de arrastre molecular para mejorar las diferencias de movilidad de solución libre de los oligonucleótidos (Albrecht et al., Anal. Chem. 83:509-515 (2011); Chubynsky &Slater, Electrophoresis 35:596-604 (2014); Forster et al., Electrophoresis 30:2014-2024 (2009); McCormick & Slater, Electrophoresis 27:1693-1701 (2006); Meagher et al., Anal. Chem. 80:2842-2848 (2008); Sinville et al., Electrophoresis 29:4751-4760 (2008); y Albrecht et al., Electrophoresis 34:590-597 (2013)). Tal y como se ha indicado en la figura 41, cuando la resolución electroforética es 6,0 entre dos moléculas con diferentes tiempos de vuelo, la precisión de la llamada es del 99,75 %. Cambiar la resolución tendrá un efecto en Nc, para un cierto término de selectividad y diferentes números de placa generados para la separación.

Es fundamental comprender los efectos de la polarización de la concentración que pueden producirse en las interfaces de microcanal/nanocanal de polímero, que puede evitar que los productos de ADN monocatenario entren en los tubos de vuelo de electroforesis a nanoescala. La polarización de concentración no solo está determinada por ú/á^d, sino, lo que es más importante, por el número de Dukhin inverso dado por Ggrane/G a = (Fdzco/o), donde Ggranel es la conductancia global, Ga es la conductancia superficial, F es la constante de Faraday, D es la dimensión crítica del canal (ancho y profundidad en nuestro caso, relación de aspecto = 1), z es el cargo, Co es la concentración de iones fuera de la e Dl y a es la carga superficial.

Para electroforesis capilar convencional, las características operativas están optimizadas para proporcionar la máxima resolución de los componentes en tiempos cortos con alta capacidad máxima. Para maximizar la resolución, se minimiza la dispersión zonal y se maximiza la selectividad (es decir, diferencias en la movilidad electroforética). Para la dispersión zonal, hay varios parámetros que afectan la dispersión, incluida la difusión, longitudes de inyección y detección, calentamiento Joule, diferencias de conductividad de la muestra/tampón e interacciones de la pared del soluto. La resolución (Res) para dos componentes (i, j) se puede determinar a partir de la expresión;

1 Amopp ní /2 (1)

4 papp/prom edio

donde N es el número de placa y ú^app es la diferencia en la movilidad aparente (cm2V 'V 1) para los dos componentes para los que Resij se está determinando y Japp, promedio es la movilidad media de los dos componentes. Para un sistema bien diseñado, la difusión longitudinal es el efecto de dispersión predominante y N se puede calcular a partir de;

__ f *promedio v

_{' ’ ~~ 2} D ⁽2 ⁾

donde D es el coeficiente de difusión molecular y V es la tensión aplicada; por lo tanto, Resij es proporcional a V1/2. La relación que se muestra en la ecuación (2) es similar al formalismo proporcionado por Xuan en el que se evaluaron las separaciones de iones en nanocanales (Xuan, X. Electrophoresis 29:3737-3743 (2008)).

La altura de la placa reducida (hi = Hi/d; donde Hi = L/N) es dado por;

donde vt es la velocidad media de iones para iones I, D es la dimensión crítica del canal, y D- es el coeficiente de difusión efectivo, que incluye dispersión hidrodinámica y difusión molecular.

Tal y como se desprende de las ecuaciones (2) y (3), el aumento de la tensión aplicada puede aumentar el número de placas o disminuir el valor de hi debido al aumento de la velocidad molecular media. Tal y como se indica en la figura 40D-40F, pueden usarse intensidades de campo eléctrico extremadamente altas sin efectos perjudiciales en N cuando se utilizan nanocolumnas.

La teoría y los estudios experimentales para las separaciones electrocinéticas en nanocanales han aparecido en revisiones recientes (Baldessari & Santiago, J. Nanobiotechnol. 4:12 (2006) y Yuan et al., Electrophoresis 28:595-610 (2007)). Para el transporte de iones con proporciones ú/á^d que van de 1 a 10, se ha observado un comportamiento de transporte anómalo, tal como velocidades de iones dependientes de la carga debido a la electromigración transversal (TEM) resultante de los efectos electrostáticos de pared/soluto (Pennathur & Santiago, Anal. Chem. 77:6782-6789 (2005); Pennathur & Santiago, Anal. Chem., 77:6772-6781 (2005); y Xuan & Li, Electrophoresis 27:5020-5031 (2006)); la resolución máxima de iones se produce cuando el diámetro de la columna es de 1 a 10 veces á^d (Xuan, X. Electrophoresis 29:3737-3743 (2008). Pennathur y Santiago determinaron que las separaciones electrocinéticas en nanocanales dependían de la valencia iónica, Z (potencial zeta), movilidad de iones y á^d (Pennathur y Santiago, Anal. Chem. 77:6782-6789 (2005) y Pennathur & Santiago, Anal. Chem., 77:6772-6781 (2005)). Por ejemplo, Garcia et al. ilustraron la separación electrocinética de los tintes fluorescentes Alexa 488 (cargada negativamente) y rodamina B (neutra) en nanocanales de varios anchos que van desde 35 a 200 nm (García et al., Lab Chip. 5:1271 -1276 (2005)). La movilidad de los tintes fluorescentes se basó en su carga e interacción(ones) con las paredes del canal. Por lo tanto, los efectos únicos producidos por la electroforesis a nanoescala pueden usarse para afectar las separaciones electroforéticas que no son posibles usando separaciones a microescala convencionales.

También se pueden usar etiquetas de arrastre para mejorar las diferencias de movilidad entre los productos de oligonucleótidos usando electroforesis a nanoescala (175, 176). En este caso, la movilidad del ADN en solución libre tiene un valor constante independientemente de la longitud de la molécula de ADN. Sin embargo, cuando la etiqueta de arrastre está unida a la molécula de ADN, alivia su comportamiento de drenaje libre y hace que el ADN migre en solución libre a una velocidad que depende de su tamaño (los ADN más largos se mueven más rápido que los más cortos). Puede usarse una variedad de etiquetas de arrastre diferentes, tales como péptidos y/o proteínas que consisten en unidades de aminoácidos repetidas de secuencia única (Albrecht et al., Electrophoresis 34:590-597 (2013)) o incluso estreptavidina (Heller et al., J. Chromatog. A 806:113-121 (1998)). La etiqueta de arrastre se puede anclar covalentemente a uno de los cebadores LDR. Para mejorar la resolución aumentando las diferencias de movilidad, también se pueden adjuntar etiquetas de arrastre al final de cada cebador (Meagher et al., Electrophoresis 27:1702-1712 (2006)).

Ejemplo 3: evaluación de viabilidad y enumeración de una sola célula utilizando el módulo de impedancia

Tal y como se ha descrito anteriormente, el módulo de impedancia (también denominado módulo sensor) se utiliza para contar células individuales, así como para determinar la viabilidad celular y el tamaño celular. La figura 42 muestra mediciones de impedancia de células individuales de células de cáncer de mama (MCF-7) usando el módulo de impedancia de tres capas tal y como se ha descrito en el presente documento (mostrado en las figuras 23A-23B). Las células MCF-7 se introdujeron en el microcanal del módulo de impedancia a través del orificio de entrada y se midieron a medida que pasaban individualmente a través del par de electrodos que se cruzan con los lados opuestos del microcanal. Cada pico en el gráfico de la figura 42 representa una firma de una sola célula con la amplitud relacionada con el tamaño de la célula. La medición de impedancia se realizó a una frecuencia de 40 KHz.

Las simulaciones, generadas por medio del software COMSOL®, se utilizaron para determinar los efectos del tamaño del electrodo en el módulo de impedancia en función del diámetro de las partículas para mostrar que la diferencia relativa en la amplitud de la señal con el tamaño de las partículas no se vio muy afectada por el tamaño del electrodo, pero la relación señal-ruido sí. Los electrodos más pequeños proporcionaron una mejor relación señal-ruido en comparación con los electrodos más grandes. La figura 43 es un gráfico de los datos de simulación que muestra la respuesta de impedancia de células de diferente diámetro para electrodos de diferentes tamaños (es decir, 20, 25 y 75 |jm). También se muestran datos experimentales para la amplitud máxima de impedancia para células de tres tamaños medios diferentes (es decir, 8, 12 y 16 jm ) para un par de electrodos de 75 jm de ancho.

Única del módulo de impedancia de tres capas descrito en el presente documento es su capacidad para determinar la viabilidad celular. La señal medida por el sensor de impedancia es proporcional a la resistencia del medio entre los electrodos y puede usarse para determinar la viabilidad de la célula. Cuando no hay célula entre los electrodos, la señal es proporcional a la resistencia de la solución de tampón y esto define el valor de referencia para las mediciones. Cada célula que pasa entre los electrodos reemplaza un pequeño volumen de la solución de tampón. Las células intactas se consideran no conductoras a la frecuencia de la señal eléctrica (40 kHz) aplicada entre electrodos debido a la alta capacitancia de la membrana celular. De este modo, el pequeño volumen de la solución reemplazada por la célula tiene mayor resistencia que el volumen correspondiente del tampón solo. Esto conduce a un aumento en la resistencia general medida por el sensor de impedancia, que se presenta como picos positivos registrados para una célula que pasa, tal y como se demuestra en la figura 44A. Cuando la membrana de las células se ve comprometida, la resistencia de la célula se puede aproximar por la resistencia del interior de la célula, que está compuesta principalmente por componentes citoplasmáticos. Si la resistencia del citoplasma celular es menor que la del volumen correspondiente de solución de tampón, la resistencia total medida por las caídas del sensor, lo que da como resultado un pico negativo (figura 44B).

Para demostrar la funcionalidad del módulo de impedancia para distinguir células viables y no viables, las células Hs578T vivas y fijadas que se permeabilizaron suavemente se volvieron a suspender en tampón IX TG introducido en el sensor de impedancia. Las figuras 44C y 44D muestran trazas de células vivas y células fijas, respectivamente. Para suspensiones de células vivas, solo se observaron picos positivos consistentes con membranas intactas. Para células fijas y ligeramente permeabilizadas, se observaron picos positivos y negativos. Claramente, las células que tienen membranas comprometidas (es decir, permeabilizadas) proporcionan detección eléctrica del interior de la célula generando así una resistencia o impedancia menor que en ausencia de la célula para el volumen de solución entre el par de electrodos creando picos de polaridad negativa en la traza con respecto al electrolito portador. Estas conclusiones también están respaldadas por otros experimentos que muestran que las células tratadas con formaldehído solo produjeron picos predominantemente positivos (reticulación de la membrana celular), mientras que las células expuestas a una incubación prolongada con Triton X-100 después de la fijación mostraron solo picos negativos (membrana celular comprometida).

Ejemplo 4: extracción de exosomas en el uMPS

Se han llevado a cabo experimentos de simulación dinámica de fluidos computacional para investigar el flujo de plasma a través de un lecho de extracción en fase sólida para el aislamiento de exosomas. El lecho de SPE en estas simulaciones está compuesto por micropilares de diamante con una longitud lateral de 15 jm y un espaciado de 5 jm (véase la figura 45A). Además de las regiones cercanas a las esquinas de los micropilares, la dinámica del flujo en el lecho de SPE se puede aproximar utilizando un perfil de velocidad parabólico simplificado que es típico del flujo de Poiseuille, lo que reduce en gran medida el coste computacional para simular la dinámica de exosomas en el fluido en movimiento. Aquí, el ancho efectivo del microcanal viene dado por el espaciado micropilar y la longitud del canal por la longitud de extremo a extremo del lecho de SPE que luego se amplifica por un factor de corrección de trayectoria, que se ajusta a la distancia que se extiende alrededor del pilar. Las propiedades físicas del exosoma utilizado para las simulaciones de Monte Carlo se resumen en la Tabla 1 que se muestra a continuación.

La transferencia de exosomas tanto por convección como por difusión se simula luego mediante métodos de Monte Carlo. La posición de un exosoma se propaga en etapas de tiempo incrementales (At). La posición del exosoma se mueve primero por convección utilizando el perfil de flujo de Poiseuille con la posición axial y longitudinal del exosoma perturbada por la dinámica de difusión, que se aproximan con un generador de números pseudoaleatorios que se distribuye normalmente alrededor de la posición del exosoma con a dado por y'2DAt donde D es el coeficiente de difusión del exosoma (véase la figura 45B).

Cada encuentro con una superficie micropilar puede o no conducir a una SPE exitosa del exosoma a la superficie que está decorada con un anticuerpo asociado con un antígeno que se encuentra en la membrana del exosoma, y estas dinámicas de reacción se evalúan comparando la probabilidad de anticuerpos/asociación de antígeno según la dinámica de Chang-Hammer con un generador de números pseudoaleatorios con distribución uniforme. Cabe destacar que las simulaciones se repiten hasta que la recuperación resultante converge con respecto al número de trayectorias de exosomas simuladas y la discretización del tiempo. De manera adicional, para cada simulación, las recuperaciones de 41 posiciones de partida axiales diferentes se promediaron para representar una solución de exosoma inicialmente homogénea.

Ta l 1. Pr i fí i l x m iliz r l im l i n M n rlo.

La figura 46 es un gráfico que muestra el efecto de la velocidad y la longitud del lecho de extracción sobre la recuperación de exosomas en los experimentos de simulación. Para cada espacio entre pilares y longitud de lecho, se varió la velocidad y se evaluó la recuperación. Las longitudes del lecho utilizadas aquí fueron de 2,5 mm, 5 mm, 10 mm, 25 mm y 50 mm. Los pilares tenían un tamaño de 15 pm con un espaciado de 5 pm. Tal y como se muestra en la figura 46, la recuperación de exosomas se maximiza a velocidades más bajas a través de lechos de extracción más largos.

La figura 47 es un gráfico de contorno isosuperficial y subyacente en 3D para las condiciones en las que se predice que la recuperación del exosoma será del 95 % mediante las simulaciones de Monte Carlo/Chang-Hammer. Cabe destacar que la longitud del lecho SPE se mantiene constante en 50 mm para este gráfico. El rendimiento se deriva de las velocidades generadas por las simulaciones. El ancho del lecho se limitó a 2 mm para proporcionar presiones longitudinales que reducen la probabilidad de burbujas de aire en el dispositivo SPE, que afectó el número de pilares y conductos abiertos entre pilares que afectan el rendimiento. Se observan dos condiciones que proporcionan una alta recuperación y un rendimiento máximo de 1,4 pl/min por lecho de SPE: Dimensiones del pilar de 10 pm x 5 pm x 20 pm y de 25 pm x 10 pm x 100 pm (longitud lateral x distancia x altura). También se observa que las grandes dimensiones de los pilares requieren una presión más baja de un orden de magnitud para la infusión de plasma, lo que permite una incorporación más sencilla de múltiples lechos SPE en conexión en serie (para extraer exosomas con marcadores ortogonales) y la incorporación del sistema SPE en sistemas más complejos, redes de microfluidos integradas que pueden realizar más ensayos en la misma muestra de sangre.

Ejemplo 5: extracción de ácidos nucleicos mediante el módulo extractor en fase sólida del uMPS

Se fabricó una unidad de tipo extractor de fase sólida (SPE) utilizando moldeo por inyección de un plástico. La unidad consiste en un lecho de micropilares que tiene un gradiente de tamaños de entrada a salida que permite que algún filtrado de partículas entre en el lecho SPE. El gráfico de la figura 48 muestra que la recuperación de ADN/ARN depende en gran medida del diámetro del pilar con un espaciado similar. Por ejemplo, el uso de pilares de 10 pm con una separación de 10 pm puede proporcionar una recuperación de ADN > 80 %. La Tabla 2 que aparece a continuación muestra el efecto del tamaño del pilar y el espaciado sobre el volumen del lecho y la carga de ADN genómico. Para un tamaño de pilar de 10 pm y un espaciado de 10 pm, un solo lecho de SPE puede alojar 190 ng de ADN genómico con un volumen de 120 nl.

Tabla 2. Efecto del tamaño y el espaciado del pilar sobre el volumen del lecho SPE y la carga de ADN genómico

10 10 120 1,90

50 40 230 94

70 100 390 5,6

100 150 590 1,3

El lecho de policarbonato SPE que se ha activado con UV se puede utilizar para aislar ADN cortos, de tamaño similar al ADN libre circulante y la eficiencia del aislamiento depende de la composición del tampón de inmovilización, que se compone de polietilenglicol (PEG), cloruro de sodio (NaCl) y etanol (EtOH). Tal y como se observa en la figura 49, la recuperación máxima del ADN se produce para una composición de tampón de inmovilización de 7 % de PEG, NaCl 0,9 mM y EtOH al 43 %. El módulo SPE también se puede utilizar para preconcentrar el ADN libre circulante. El ADN se puede enriquecer desde un volumen inicial de 1 ml de plasma hasta un volumen final de 10 pl (factor de enriquecimiento de 102).

Ejemplo 6: purificación de la molécula de ácido nucleico objetivo mediante el módulo de purificación por difusión

El módulo de purificación de flujo por difusión del dispositivo uMPS está diseñado para purificar las moléculas de ácido nucleico objetivo que se generan en otras unidades aguas arriba del dispositivo a partir del exceso de dNTP y/u otros componentes de nucleótidos de ácido nucleico no objetivo. La figura 50 muestra el desplazamiento simulado de ADN con diferentes números de base asociados con el ADN libre circulante. Los datos de este gráfico se basan en cálculos que utilizan ADN bicatenario y coeficientes de difusión de dNTP. La longitud de la matriz necesaria para eliminar la mayoría de los dNTP del ADN libre circulante (la resolución es proporcional a N1/2, donde N es el número de obstáculos; el desplazamiento lateral es proporcional a N) se puede determinar teniendo en cuenta las diferencias en el coeficiente de difusión entre el dNTP y la longitud de la molécula de ADN libre de células bicatenarias. Tal y como puede observarse en la figura 50, a medida que aumenta el número de obstáculos, la distancia de separación entre una molécula de ADN libre de células y el dNTP aumenta de forma lineal. Por ejemplo, una matriz que comprende 4000 obstáculos produce una distancia de separación de ~3750 pm entre el dNTP y el ADN libre circulante después de desplazarse a través de la matriz. También se muestra en la figura 50 que el cambio en el recorrido del ADN libre de células debido a los obstáculos es menor cuando la tasa de flujo es mayor. Por último, la figura 50 muestra que la distancia de desplazamiento para una molécula de ADN libre de células se reduce significativamente a medida que la longitud de la molécula de a Dn aumenta principalmente debido al hecho de que el coeficiente de difusión se reduce para las moléculas de ADN más grandes. Para moléculas de ADN que contienen > 100 bases, no se observa ningún cambio en el movimiento independientemente del caudal.

Ejemplo 7: conjunto de módulos en placas de base de fluido para construir el uMPS

Las válvulas del uMPS requieren una estructura de tres capas, la placa de cubierta, la capa de fluido y la placa de cubierta trasera. Los asientos de válvula y las válvulas de membrana están configurados para estar en la parte posterior de la placa de base de fluido para el uMPS junto con los solenoides mecánicos para accionar las válvulas. Por lo tanto, se empleó una estrategia única para producir estas válvulas termoplásticas, que no solo proporcionó mayores tasas de producción de válvulas exitosas, sino que no requirió procesamiento térmico para el montaje (Jackson et al., Lab Chip. 14:106-117 (2014)). Los laminados recubiertos con un adhesivo sensible a la presión se utilizan como membrana de modo que no se requiere unión térmica. Un laminado de poliolefina que posee una resistencia a la tracción favorable (25-40 mPa), alto alargamiento a la rotura (150-300 %), se utilizó un espesor de ~100 pm y se recubre con un adhesivo sensible a la presión de acrilato de silicona (50 pm de espesor). Se construyó un dispositivo de prueba sellando a presión el laminado mencionado anteriormente a un microcanal termoplástico. Se descubrió que se puede "desactivar" el adhesivo por tratamiento UV/O3; el laminado colocado directamente encima del asiento de la válvula se puede desactivar para evitar que la membrana se adhiera al asiento de la válvula. Este laminado puede soportar presiones > 600 kPa sin fallar (figura 51), suficiente para las etapas de procesamiento realizados por el uMPS.

Sellos sin juntas: La mayoría de las interconexiones de microfluidos se basan en el contacto físico directo entre el orificio de fluido y el dispositivo que se conecta. Cada contacto actúa como una restricción cinemática pasiva en el ensamblaje. Si no se tiene cuidado, dos o más interconexiones en conjunto con otras características de ensamblaje conducirán a sistemas sobrerestringidos y volúmenes muertos impredecibles.

Para orificios de microfluidos con separaciones a microescala entre superficies enfrentadas, las fuerzas capilares, según lo definido por la ecuación de Young-Laplace, deben resistir las fugas sin ningún contacto físico directo entre las superficies enfrentadas, formando un sello sin juntas, véase la figura 33B (Brown, et al., IMECE 2012, 9-15 de noviembre 2012. ASME, Houston, Texas, en nombre de IMECE2012-89634 (2012)). Este concepto fue probado y se descubrió que, si las superficies enfrentadas son superhidrófobas (ángulos de contacto del agua > 130°), las fuerzas capilares son suficientes para soportar la caída de presión en un canal de microfluidos típico. Las piezas de prueba se crearon moldeando por inyección de doble cara piezas de copolímero de olefina cíclica con agujeros pasantes de microfluidos cerca de un borde para permitir la observación a través de un microscopio, estándares de alineación para medir el desplazamiento relativo de las piezas de acoplamiento y las ranuras en V para que actúen como asientos de rodamientos de bolas (véase la figura 28B). Se crearon diferentes separaciones utilizando cojinetes de bolas de cerámica de precisión de diferentes diámetros como restricciones cinemáticas. Las superficies superhidrófobas se generaron revistiendo por rotación las superficies del polímero alrededor de los agujeros pasantes con un recubrimiento comercial (véase la figura 52). La figura 53 es un gráfico que muestra que las presiones máximas medidas que los sellos podían soportar eran consistentes con las estimadas usando la ecuación de Young-Laplace.

Aunque la invención se ha descrito en detalle con fines ilustrativos, se entiende que dichos detalles son únicamente para ese propósito y los expertos en la técnica pueden hacer variaciones en los mismos sin apartarse del alcance de las reivindicaciones adjuntas.

Claims (12)

REIVINDICACIONES

1. Un dispositivo que comprende:

un procesador biomolecular, comprendiendo cada procesador biomolecular:

una cámara de biorreactor definida por un sustrato sólido;

una pluralidad de estructuras de soporte espaciadas dentro de dicha cámara de biorreactor y fijadas al sustrato sólido;

una o más moléculas de captura inmovilizadas en algunas de dicha pluralidad de estructuras de soporte espaciadas o en todas ellas, dichas una o más moléculas de captura adaptadas para unirse a una porción de una molécula de ácido nucleico objetivo en una muestra;

uno o más nanotubos definidos por el sustrato sólido y acoplados de forma fluida a la cámara de biorreactor, teniendo cada uno de dichos uno o más nanotubos un paso que se extiende entre un extremo de entrada próximo a dicha cámara de biorreactor y un extremo de salida distal a dicha cámara de biorreactor y comprendiendo uno o más nanoporos dentro del paso, en donde un nanoporo es un pequeño agujero dentro del nanotubo que tiene un diámetro que es más pequeño que el diámetro del paso que se extiende a través del nanotubo a cada lado del nanoporo, de modo que el diámetro del paso de los uno o más nanotubos se reduzca en cada nanoporo; y una o más unidades definidas por el sustrato sólido y aguas arriba de dicho procesador biomolecular y uno o más nanotubos, estando configuradas dichas una o más unidades para transportar una preparación de muestra, en donde las una o más unidades se seleccionan de entre una unidad de tipo separador de células, una unidad de tipo aislamiento de plasma de extensión longitudinal, una unidad de tipo extractor, una unidad de tipo sensor, uno o más módulos de reactor y un módulo de purificación de flujo.

2. El dispositivo de acuerdo con la reivindicación 1, en donde dichas una o más unidades son una unidad de tipo separador de células, y en donde:

dicha unidad de tipo separador de células está definida por el sustrato sólido y aguas arriba de dicho procesador biomolecular y uno o más nanotubos, comprendiendo dicha unidad de tipo separador:

una cámara de separación que incluye superficies sólidas que definen canales entre medias con agentes de captura específicos de una célula fijados a las superficies sólidas;

una entrada a la cámara; y una salida de la cámara.

3. El dispositivo de acuerdo con la reivindicación 1, en donde dichas una o más unidades son una unidad de tipo extractor, y en donde:

dicha unidad de tipo extractor está definida por el sustrato sólido y aguas arriba de dicho procesador biomolecular y uno o más nanotubos, comprendiendo dicha unidad de tipo extractor soportes sólidos y pasos entre medias, en donde los soportes sólidos están provistos de un material adaptado para inmovilizar ácidos nucleicos o exosomas o vesículas.

4. El dispositivo de acuerdo con la reivindicación 1, en donde dichas una o más unidades son una unidad de tipo aislamiento de plasma de extensión longitudinal, y en donde

dicha unidad de tipo aislamiento de plasma de extensión longitudinal está definida por el sustrato sólido y aguas arriba de dicho procesador biomolecular y uno o más nanotubos, comprendiendo dicha unidad de tipo aislamiento de plasma de extensión longitudinal:

un paso de entrada;

un paso de descarga más ancho y menos profundo que el paso de entrada;

un paso de transición que conecta el paso de entrada y el paso de descarga, haciéndose dicho paso de transición más ancho y menos profundo a medida que los pasos de transición progresan desde el paso de entrada hasta el paso de descarga;

canales laterales principales que se extienden lateralmente en sentido opuesto al de entrada, en donde un separador, colocado entre el paso de entrada y cada canal lateral principal, está dimensionado para permitir que el plasma, pero no las células, pase del paso de entrada a los canales laterales principales; y

canales laterales secundarios que se extienden lateralmente en sentido opuesto al paso de descarga, en donde un separador, colocado entre el paso de descarga y cada canal lateral secundario, está dimensionado para permitir que el plasma, pero no las células, pase del paso de entrada a los canales laterales secundarios.

5. Un método para detectar la presencia de una molécula de ácido nucleico objetivo en una muestra, comprendiendo dicho método:

proporcionar un dispositivo que comprende:

un procesador biomolecular, comprendiendo cada procesador biomolecular:

una cámara de biorreactor definida por un sustrato sólido;

una pluralidad de estructuras de soporte espaciadas dentro de dicha cámara de biorreactor y fijadas al sustrato sólido;

una o más moléculas de captura inmovilizadas en algunas de dicha pluralidad de estructuras de soporte espaciadas o en todas ellas, estando adaptadas dichas una o más moléculas de captura para unirse a una porción de una molécula de ácido nucleico objetivo en una muestra;

uno o más nanotubos definidos por el sustrato sólido y acoplados de forma fluida a la cámara de biorreactor, teniendo cada uno de dichos uno o más nanotubos un paso que se extiende entre un extremo de entrada próximo a dicha cámara de biorreactor y un extremo de salida distal a dicha cámara de biorreactor y comprendiendo uno o más nanoporos dentro del paso, en donde un nanoporo es un pequeño agujero dentro del nanotubo que tiene un diámetro que es más pequeño que el diámetro del paso que se extiende a través del nanotubo a cada lado del nanoporo, de modo que el diámetro del paso de los uno o más nanotubos se reduzca en cada nanoporo; electrodos colocados en ubicaciones aguas arriba de dicha cámara de biorreactor y aguas abajo de dichos uno o más nanotubos;

una fuente de tensión acoplada eléctricamente a dichos electrodos para establecer un gradiente de tensión entre una ubicación aguas arriba de dicha cámara de biorreactor y aguas abajo de dichos uno o más nanotubos que hacen que las moléculas pasen desde dicha cámara de biorreactor a través de dichos uno o más nanotubos hasta el extremo de salida; y

un detector colocado para medir cambios en los niveles de corriente a través de los uno o más nanoporos cuando las moléculas pasan a través de dichos uno o más nanotubos;

introducir una muestra que comprende una molécula de ácido nucleico objetivo en dicho procesador biomolecular en condiciones eficaces para que la molécula de ácido nucleico objetivo se una a las moléculas de captura y se inmovilice en las estructuras de soporte espaciadas;

someter a la molécula de ácido nucleico objetivo inmovilizada o a los productos de extensión inmovilizados de la misma a una reacción de detección por ligasa para producir productos de ligadura hibridados con las moléculas de ácido nucleico objetivo inmovilizadas o los productos de extensión inmovilizados de las mismas; desnaturalizar los productos de ligadura de las moléculas de ácido nucleico objetivo inmovilizadas, o de los productos de extensión inmovilizados de las mismas, para liberar los productos de ligadura de las estructuras de soporte espaciadas;

pasar los productos de ligadura a través de los uno o más nanotubos;

detectar, con dicho detector, firmas de identificación de productos de ligadura que pasan a través de los uno o más nanotubos; e

identificar la presencia de la molécula de ácido nucleico objetivo en la muestra, diferente de otras moléculas de ácido nucleico en la muestra, en función de dicha detección.

6. El método según la reivindicación 5, en donde el dispositivo comprende, además:

una o más unidades para la preparación de una muestra aguas arriba de dicho procesador biomolecular y uno o más nanotubos, en donde las una o más unidades comprenden:

una unidad de tipo separador definida por el sustrato sólido y aguas arriba de dicho procesador biomolecular y uno o más nanotubos, comprendiendo dicha unidad de tipo separador una cámara de separación que incluye superficies sólidas que definen canales entre medias con agentes de captura específicos de una célula fijados a las superficies sólidas, una entrada a la cámara y una salida de la cámara,

comprendiendo dicho método, además:

pasar la muestra a través de dicha unidad de tipo separador antes de dicha introducción de la muestra en dicho procesador biomolecular.

7. El método según la reivindicación 5, en donde el dispositivo comprende, además:

una o más unidades para la preparación de una muestra aguas arriba de dicho procesador biomolecular y uno o más nanotubos, en donde las una o más unidades comprenden:

una unidad de tipo extractor definida por el sustrato sólido y aguas arriba de dicho procesador biomolecular y uno o más nanotubos, comprendiendo dicha unidad de tipo extractor soportes sólidos y pasos entre medias, en donde los soportes sólidos están provistos de un material adecuado para inmovilizar ácidos nucleicos, o exosomas, comprendiendo dicho método, además:

pasar la muestra a través de dicha unidad de tipo extractor antes de dicha introducción de la muestra en dicho procesador biomolecular.

8. El método según la reivindicación 5, en donde el dispositivo comprende, además:

una o más unidades para la preparación de una muestra aguas arriba de dicho procesador biomolecular y uno o más nanotubos, en donde las una o más unidades comprenden:

una unidad de tipo aislamiento de plasma de extensión longitudinal definida por el sustrato sólido y aguas arriba de dicho procesador biomolecular y uno o más nanotubos, comprendiendo dicha unidad de tipo aislamiento de plasma de extensión longitudinal:

un paso de entrada;

un paso de descarga más ancho y menos profundo que el paso de entrada;

un paso de transición que conecta el paso de entrada y el paso de descarga, haciéndose dicho paso de transición más ancho y menos profundo a medida que los pasos de transición progresan desde el paso de entrada hasta el paso de descarga;

canales laterales principales que se extienden lateralmente en sentido opuesto al de entrada, en donde un separador, colocado entre el paso de entrada y cada canal lateral principal, está dimensionado para permitir que el plasma, pero no las células, pase del paso de entrada a los canales laterales principales; y canales laterales secundarios que se extienden lateralmente en sentido opuesto al paso de descarga, en donde un separador, colocado entre el paso de descarga y cada canal lateral secundario, está dimensionado para permitir que el plasma, pero no las células, pase del paso de entrada a los canales laterales secundarios,

comprendiendo dicho método, además:

pasar la muestra a través de dicha unidad de tipo aislamiento de plasma antes de dicha introducción de la muestra en dicho procesador biomolecular.

9. Un método para identificar un nucleótido dentro de una molécula de ácido nucleico objetivo de una muestra, comprendiendo dicho método:

proporcionar un dispositivo que comprende:

un procesador biomolecular, comprendiendo cada procesador biomolecular:

una cámara de biorreactor definida por un sustrato sólido;

una pluralidad de estructuras de soporte espaciadas dentro de dicha cámara de biorreactor y fijadas al sustrato sólido;

una o más moléculas de captura inmovilizadas en algunas de dicha pluralidad de estructuras de soporte espaciadas o en todas ellas, estando adaptadas dichas una o más moléculas de captura para unirse a una porción de una molécula de ácido nucleico objetivo en una muestra;

uno o más nanotubos definidos por el sustrato sólido y acoplados de forma fluida a la cámara de biorreactor, teniendo cada uno de dichos uno o más nanotubos un paso que se extiende entre un extremo de entrada próximo a dicha cámara de biorreactor y un extremo de salida distal a dicha cámara de biorreactor y comprendiendo uno o más nanoporos dentro del paso, en donde un nanoporo es un pequeño agujero dentro del nanotubo que tiene un diámetro que es más pequeño que el diámetro del paso que se extiende a través del nanotubo a cada lado del nanoporo, de modo que el diámetro del paso de los uno o más nanotubos se reduzca en cada nanoporo; electrodos colocados en ubicaciones aguas arriba de dicha cámara de biorreactor y aguas abajo de dichos uno o más nanotubos;

una fuente de tensión acoplada eléctricamente a dichos electrodos para establecer un gradiente de tensión entre una ubicación aguas arriba de dicha cámara de biorreactor y aguas abajo de dichos uno o más nanotubos que hacen que las moléculas pasen desde dicha cámara de biorreactor a través de dichos uno o más nanotubos hasta el extremo de salida; y

un detector colocado para medir cambios en los niveles de corriente a través de los uno o más nanoporos cuando las moléculas pasan a través de dichos uno o más nanotubos;

introducir una muestra que comprende una molécula de ácido nucleico objetivo en dicho procesador biomolecular en condiciones eficaces para que la molécula de ácido nucleico objetivo se una a las moléculas de captura y se inmovilice en las estructuras de soporte espaciadas;

poner en contacto las moléculas de ácido nucleico objetivo inmovilizadas o los productos de extensión inmovilizados que son complementarios a la molécula de ácido nucleico objetivo con una solución para formar una mezcla de reacción de extensión nucleotídica, comprendiendo dicha solución uno o más cebadores de oligonucleótidos complementarios a una porción de las moléculas de ácido nucleico objetivo inmovilizadas o el producto de extensión inmovilizado de las mismas, una polimerasa y un grupo de nucleótidos trifosfatos, teniendo cada tipo de nucleótido trifosfato (1) una fracción generadora de firma de identificación escindible diferente y (2) una fracción de bloqueo escindible que bloquea otras reacciones de extensión nucleotídica;

someter a la mezcla de extensión nucleotídica a un tratamiento de hibridación, en donde los uno o más cebadores de oligonucleótidos se hibridan de una manera específica de una base con sus moléculas de ácido nucleico objetivo inmovilizadas complementarias o productos de extensión inmovilizados de las mismas;

extender los cebadores de oligonucleótidos hibridados mediante la adición específica de una base única de un nucleótido trifosfato del grupo de nucleótidos trifosfatos hasta el extremo 3' de los cebadores hibridados; escindir la fracción generadora de firma de identificación de cada nucleótido añadido al cebador de oligonucleótidos hibridado después de dicha extensión;

pasar la fracción generadora de firma de identificación escindido a través de los uno o más nanotubos; detectar, con dicho detector, la firma de identificación generada por la fracción generadora de firma de identificación escindida cuando la fracción generadora de firma de identificación escindida pasa a través de los uno o más nanotubos; e identificar, en función de dicha detección, el nucleótido del grupo de nucleótidos que se añadió durante dicha extensión, identificando de ese modo uno o más nucleótidos en la molécula de ácido nucleico objetivo en la muestra.

10. El método según la reivindicación 9, en donde el dispositivo comprende, además:

una o más unidades para la preparación de una muestra definidas por el sustrato sólido y aguas arriba de dicho procesador de biorreactor y uno o más nanotubos:

una unidad de tipo separador definida por el sustrato sólido y aguas arriba de dicho procesador biomolecular y uno o más nanotubos, comprendiendo dicha unidad de tipo separador:

una cámara de separación que incluye superficies sólidas que definen canales entre medias con agentes de captura específicos de una célula fijados a las superficies sólidas;

una entrada a la cámara; y

una salida de la cámara,

comprendiendo dicho método, además:

pasar la muestra a través de dicha unidad de tipo separador antes de dicha introducción de la muestra en dicho procesador biomolecular.

11. El método según la reivindicación 9, en donde el dispositivo comprende, además:

una o más unidades para la preparación de una muestra definidas por el sustrato sólido y aguas arriba de dicho procesador de biorreactor y uno o más nanotubos:

una unidad de tipo extractor definida por el sustrato sólido y aguas arriba de dicho procesador biomolecular y uno o más nanotubos, comprendiendo dicha unidad de tipo extractor soportes sólidos y pasos entre medias, en donde los soportes sólidos están provistos de un material adecuado para inmovilizar ácidos nucleicos o exosomas, comprendiendo dicho método, además:

pasar la muestra a través de dicha unidad de tipo extractor antes de dicha introducción de la muestra en dicho procesador biomolecular.

12. El método según la reivindicación 9, en donde el dispositivo comprende, además:

una o más unidades para la preparación de una muestra definidas por el sustrato sólido y aguas arriba de dicho procesador de biorreactor y uno o más nanotubos:

una unidad de tipo aislamiento de plasma de extensión longitudinal definida por el sustrato sólido y aguas arriba de dicho procesador biomolecular y uno o más nanotubos, comprendiendo dicha unidad de tipo aislamiento de plasma de extensión longitudinal:

un paso de entrada;

un paso de descarga más ancho y menos profundo que el paso de entrada;

un paso de transición que conecta el paso de entrada y el paso de descarga, haciéndose dicho paso de transición más ancho y menos profundo a medida que los pasos de transición progresan desde el paso de entrada hasta el paso de descarga;

canales laterales principales que se extienden lateralmente en sentido opuesto al de entrada, en donde un separador, colocado entre el paso de entrada y cada canal lateral principal, está dimensionado para permitir que el plasma, pero no las células, pase del paso de entrada a los canales laterales principales; y canales laterales secundarios que se extienden lateralmente en sentido opuesto al paso de descarga, en donde un separador, colocado entre el paso de descarga y cada canal lateral secundario, está dimensionado para permitir que el plasma, pero no las células, pase del paso de entrada a los canales laterales secundarios, comprendiendo dicho método, además:

pasar la muestra a través de la unidad de tipo aislamiento de plasma de extensión longitudinal antes de dicha introducción de la muestra en dicho procesador biomolecular.