BR112013013325A2 - dispositivo e método para simultaneamente extrair e fracionar dna de lisado ou amostra integral e para fabricar dispositivo microfluídico - Google Patents

Abstract

DISPOSITIVO E MÉTODOS PARA SIMULTANEAMENTE EXTRAIR E FRACIONAR DNA DE LISADO OU AMOSTRA INTEGRAL E PARA FABRICAR DISPOSITIVO MICROFLUÍDICO. Várias modalidades da presente revelação geralmente se referem aos protocolos de biologia molecular, equipamento e reagentes para extração e fracionamento de moléculas de DNA, de amostras integrais ou lisadas, em um dispositivo de fluxo contínuo único.

Description

"Dispositivo e Métodos Para Simultaneamente Extrair e Fracionar DNA de Lisado ou Amostra Integral e Para Fabricar Dispositivo Microfluidico" Relatório Descritivo 5 REFERÊNCIA REMISSIVA A PEDIDOS RELACIONADOS

[1] Este Pedido reivindica o beneficio de prioridade do Pedido Provisório US 61/418.305 depositado em 30 de novembro de 2010.

FUNDAMENTOSDA INVENÇÃO Campo da Invenção 10 [2] Várias modalidades da presente revelação geralmente refe- rem-se aos protocolos de biologia molecular, equipamento e reagentes para a extração e fracionamento de moléculas de DNA, de amostras inteiras ou usadas, em um dispositivo único de fluxo contínuo.

Descrição da Técnica Anterior 15 [3] DNA é um polímero longo que consiste em unidades cha- madas nucleotídeos. Os polímeros de DNA são cadeias longas de unida- des únicas, que juntas formam moléculas chamadas de ácidos nuclei- cos. Os nucleotídeos podem ser uma de quatro subunidades (adenina (A), citosina (C), guanina (G) & timina (T)) e, quando em um polímero, 20 podem conduzir a informação genética na célula. O DNA compreende duas cadeias longas de nucleotídeos compreendendo as quatro diferen- tes bases de nucleotídeos (por exemplo, AGTCATCGTAGCT... etc.) com uma estrutura de açúcares e grupos fosfato unidos por ligações éster, torcidos em uma dupla hélice e unidos por ligações de hidrogénio entre 25 os nucleotídeos complementares (ligação de hidrogênio de A para T e de

C para G na fita oposta). A sequência de bases de nucleotídeo junto com a estrutura pode determinar características hereditárias individuais, ou outras doenças adquiridas como câncer.

[4] 0 dogma central da biologia molecular geralmente descreve 5 o fluxo normal de informações biológicas: DNA pode ser replicado ao DNA, a informação genética no DNA pode ser `transcrita' em mRNA, e proteínas podem ser traduzidas a partir da informação no mRNA, em um processo chamado de tradução, em que as subunidades de proteína (aminoácidos) são colocadas juntas o suficiente para se ligarem, na 10 ordem (como ditado pela sequência de mRNA e, portanto, o DNA) da ligação de tRNA (cada tRNA conduz um aminoácido específico depen- dente de sua sequência) ao mRNA.

[5] Para estudar, ou analisar a sequência e biologia de DNA ou RNA de uma amostra, é geralmente necessário extrair, ou isolar, os 15 ácidos nucleicos do resto da amostra clínica ou biológica (ou seja, outros componentes celulares como lipídios, carboidratos, proteínas etc.). Isto é atualmente realizado por um número de métodos pelos familiares na técnica. Estes métodos são descritos resumidamente abaixo. 20 [6] A metodologia padrão consiste em um protocolo com dife- rentes variações dependendo da aplicação e tipo de amostra, começa com rompimento de célula ou lise de célula, para liberar o DNA. Isto é comumente atingido por lise mecânica (como moagem, ou moagem de tecido em nitrogênio líquido), sonicação, enzimaticamente ou quimica- 25 mente (como adicionando um sal caotrópico (por exemplo, tiocianato de guanidínio) à amostra). As membranas lipídicas das células e outros lipídios são geralmente removidas pela adição de um detergente e as proteínas geralmente removidas por adição de uma protease (como Protinase K, opcional, mas quase sempre realizado). Fenol saturado 30 com água, clorofórmio permite separação de fase por centrifugação de uma mistura de amostra aquosa e uma solução, contendo resultante em uma fase aquosa superior e uma fase orgânica inferior (principal-

mente clorofórmio). O ácido nucleico é encontrado na fase aquosa, enquanto as proteínas são encontradas na fase orgânica. Na última etapa, RNA é recuperado da fase aquosa por precipitação com 2- propanol ou etanol gelado. DNA estará localizado na fase aquosa na ausência de tiocianato de guanidínio. Uma vez que o DNA é insolúvel nestes álcoois, este irá precipitar e agregar-se, gerando um pellet na centrifugação. Esta etapa ainda remove sais solúveis em álcool. Adicio- nar um agente quelante para sequestrar cátions divalentes como Mg2+ e Ca2+ previne que enzimas dnase degradem o DNA. Proteínas celulares e histona ligadas ao DNA podem ser removidas pela adição de uma protease ou por tendo precipitado as proteínas com acetato de sódio ou amónio, ou extraídas as mesmas com mistura de fenol-clorofórmio antes da precipitação de DNA. 17] Um segundo método isola DNA de um usado (independen- 15 temente de qual método de lise é usado) em virtude de sua capacidade de se ligar à sílica na presença de altas concentrações de sais caotrópi- cos (Chen and Thomas, 1980; Marko et al. 1982; Boom et al. 1990). 0 DNA pode se ligar a qualquer superfície de sílica, se isto é sustentado com cassetes microfluídicos, esferas paramagnéticas revestidas com sílica, um filtro de sílica dentro de uma coluna giratória, ou outra superfície de sílica. Os sais caotrópicos são então removidos com uma lavagem a base de álcool e o DNA eluído em uma solução de baixa força iõnica como um tampão TE (um tampão que consiste em tris hidroxime- tilaminometano ('Tris') e ácido Etilenodiaminotetracético ('EDTA')) ou 25 água. O DNA se liga à sílica devido à desidratação e formação de ligação de hidrogênio, que compete contra repulsão eletrostática fraca (Melzak et al. 1996). Portanto, uma concentração alta de sal irá ajudar a dire- cionar a adsorção de DNA na silica, e uma concentração baixa irá liberar o DNA. Como o DNA é ligado à superfície da sílica o resto dos debris celulares e outros é simplesmente eliminado com tampões de lavagem antes da eluição do DNA ligado à sílica em H2O ou tampão TE.

[8] A metodologia ChargeSwitch® (Invitrogen) vê DNA negati-

vamente carregado (através de estrutura de fosfato negativamente ligada) em uma ligação de usado a um ligante especial que adquire uma carga positiva em valores de pH baixo (< 6,5). As proteínas e outras impurezas são removidas dos ácidos nucleicos ligados a ChargeSwitch 5 através do uso de tampões de lavagem aquosos. Ácidos nucleicos podem então ser liberados do ligante ChargeSwitch® quando o pH do meio ao redor é elevado (> 8,5) e a carga positiva é neutralizada.

[9] 0 sistema de isolamento de DNA Nexttec, permite a purifi- cação de DNA com uma única etapa de centrifugação dentro de quatro lo minutos após lise de célula. É até cinco vezes mais rápido do que os sistemas de isolamento de DNA atualmente usados. É possível através de uma matriz adsorvente própria, que, em um reverso dos métodos a base de sílica, retém substâncias inibitórias, como proteínas e substân- cias de baixo peso molecular e permite a passagem de DNA puro dentro 15 de uma amostra lisadas. Uma limitação deste método é que este depen- de de uma etapa de lise enzimática longa, a 60°C.

[10] As metodologias atualmente usadas pelos especialistas na técnica são implantadas em tubos, colunas giratórias, ou placas e requerem mãos substanciais no tempo de operação e várias etapas e, 20 assim, apresentam um gargalo para a análise de DNA. O uso de máqui- nas de manipulação de líquidos e implantação das tecnologias apresen- tadas acima em placas de vários poços, utilizando vácuos para extrair as amostras e soluções de reação na matriz ativa para cada tecnologia, foi usado para uso de maior rendimento, no entanto, estes requerem 25 lotes de amostras para torná-los de custo efetivo e ainda causam um gargalo. Para muitas aplicações, como análise molecular de DNA clini- camente relevante no ponto de cuidado, que rapidamente é reconhecido como a única metodologia para controlar problemas de resistência emergente às drogas em doenças infecciosas, especialmente nas nações 30 em desenvolvimento e de terceiro mundo, estas metodologias são ina- propriadas e não podem ser prontamente implantadas em dispositivos do ponto de cuidado.

[11] Algumas metodologias, como revestimento de micro-pilares ou outras características e/ou estruturas em canais microfluídicos ou esferas paramagnéticas com superfícies de sílica foram traduzidas e implementadas em dispositivos microfluídicos, no entanto, o requisito para várias etapas de lavagem e tampões significa que a programação fluídica e o desenho do próprio dispositivo de microfluídico é complexo, assim, tornando os dispositivos caros.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[12] Em uma modalidade, um dispositivo é revelado para simul- lo taneamente extrair e fracionar DNA de um usado ou uma amostra integral, o dispositivo compreendendo um canal microfluídico contínuo, o canal compreendendo cãmaras de tampão e reagente e um filtro sorvente.

[13] 0 filtro sorvente pode compreender um suporte pelo menos parcialmente coberto por um revestimento polimérico compreendendo polianilina ou derivados dos mesmos.

[14] 0 dispositivo pode compreender um material de vidro.

[15] 0 dispositivo pode compreender um material PDMS.

[16] Em uma modalidade do dispositivo, o canal microfluídico 20 contínuo único compreende uma estrutura bulbosa em uma entrada do mesmo e em que a estrutura bulbosa afunila a uma estrutura mais fina em uma saída do mesmo.

[17] Em algumas modalidades, o filtro sorvente compreende uma série de microestruturas sólidas ou ocas fabricadas nas paredes do 25 canal microfluídico.

[18] Em algumas modalidades, o filtro sorvente é frouxo e emba- lado dentro do canal microfluídico. 1191 Em outra modalidade, o filtro sorvente é uma matriz confi- gurada para ligar material de amostra celular e outros clíni- 30 cos/biológicos além dos ácidos nucleicos.

[20] É revelado um método de acordo com algumas modalidades da invenção para fabricar um dispositivo microfluidico para extrair e fracionar DNA de uma amostra. O método compreende: formar pelo menos duas camadas cegas contendo um canal; formar uma camada 5 adesiva com cortes de abertura através da camada correspondente a uma entrada e uma abertura de saída do canal; empacotamento a vácuo de uma parte do canal com um material sorvente; e alinhar as camadas cegas com a camada adesiva entre estas e ligação das cama- das juntas sob pressão. 10 [21] É revelado um método para simultaneamente extrair e fra- cionar DNA de um usado ou uma amostra completa em outra modali- dade. O método compreende: fornecer um dispositivo compreendendo um canal microfluidico contínuo único, o canal compreendendo câma- ras de tampão e reagente e um filtro sorvente; aplicar a amostra a uma 15 entrada do canal microfluidico contínuo único; ativar o filtro sorvente com um tampão; fluir a amostra na porção do canal contendo o filtro sorvente; fluir a amostra através do canal e circular este através da porção do canal contendo o filtro sorvente de entre uma a dez vezes; e fluir o DNA extraído e fracionado para fora do dispositivo. 20 [22] Em uma variação, a amostra é escoada para a porção do canal contendo o filtro sorvente e então incubada neste por entre 15 segundos e 15 minutos, antes de ser fluido para fora do dispositivo. Em outra variação, a amostra é fluida dentro da porção do canal contendo o filtro sorvente e então oscilada para trás e para frente dentro do canal 25 de filtro sorvente, antes de fluir a amostra para fora do dispositivo.

[23] Em algumas modalidades, o filtro sorvente é ativado com um tampão, e amostra lisada flui dentro do canal contendo o filtro e a amostra flui através do canal para o final, resultando em uma solução pura ou quase pura de DNA. 30 [24] 0 eluato resultante é suficientemente puro e concentrado para ser detectado em um gel de agarose e pode ser usado em PCR, RT- PCR, sequenciamento DNA, experimentos de hibridização e pode ser

• 7/25 detectado em nanobiosenssores como nanoporos, nanotubos de carbo- no e biossensores nanofio.

[25] Em algumas modalidades, os tampões e outros reagentes são armazenados em cassetes e liberados através de fluidos de um 5 dispositivo externo.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[26] A Figura 1 representa um vista esquemática explodida de um dispositivo microfluídico para extração e fracionamento de DNA.

[27] A Figura 2 representa uma vista superior de um dispositivo lo microfluídico.

[28] A Figura 3 representa uma vista inferior de um dispositivo microfluidico.

[29] A Figura 4 ilustra um inserto de policarbonato de um dis- positivo microfluídico. 15 [30] A Figura 5 ilustra uma concha de policarbonato de um dis- positivo microfluídico.

[31] A Figura 6 ilustra uma camada de fita de dupla face corta- da a laser que pode ser usada para unir o inserto (Figura 4) e concha (Figura 5) juntos, assim formando os canais microfluídicos do dispositi- 20 vo microfluídico.

[32] A Figura 7 ilustra uma concha e inserto laminado para co- brir reservatórios fluidos.

[33] A Figura 8 representa os filtros colocados no inserto de car- tucho e a entrada e saída da cãmara empacotada com sorvente para 25 garantir que o material sorvente permaneça no local.

[34] A Figura 9 mostra uma camada de fita de dupla face sendo aplicada ao inserto para manter as metades do cassete (inserto e con- cha) juntas para criar os canais microfluídicos.

[35] A Figura 10 ilustra uma cãmara sorvente preenchida sob 30 vácuo.

[36] A Figura 11 ilustra a vista superior de um dispositivo mi- crofluídico de extração de acido nucleico montado.

[37] A Figura 12 ilustra a vista inferior de um dispositivo micro- fluídico de extração de acido nucleico montado. 5 [38] A Figura 13 mostra os resultados de corrida de 80u1 de 1 1pg/ml de esperma de salmão por um experimento de extração usan- do o cassete de extração e marcação deste com extração de DNA de coluna Nexttec clean.

[39] A Figura 14 mostra PCR de frações de eluato de sangue humano usado passado pelo dispositivo de extração microfluídico. A Figura 14a mostra a escada de massa na linha 1 e eluatos 1 a 11 nas linhas 2 a 12. A Figura 14b mostra uma escada de massa na linha 1 com linhas 2-10 contendo frações de eluato 13 a 21.

[40] A Figura 15 ilustra uma imagem de gel de uma análise Bio 15 Analyzer de frações de eluato que separam DNA baseado no tamanho.

[41] A Figura 16 mostra uma modalidade alternativa de um dispositivo de extração e fracionamento de DNA. A.

[42] A Figura 17 é uma vista em perspectiva que mostra um ponto de cuidado e cassete microfluidico que inclui o dispositivo de 20 extração e fracionamento de DNA dentro do cassete.

[43] A Figura 18 é uma vista esquemática que mostra os com- ponentes de um cassete microfluidico desenhado para diagnósticos portáteis de acordo com algumas modalidades.

[44] A Figura 19 ilustra um desenho de cassete microfluídico 25 desenhado para sequenciamento portátil em algumas modalidades.

DESCRIÇÃO DETALHADA

DA MODALIDADE PREFERENCIAL [451 Em algumas modalidades, um dispositivo e métodos de bio- logia molecular são revelados para extração e fracionamento de ácido nucleico integrado (DNA, RNA, cDNA etc.) de moléculas de ácido de diferentes pesos moleculares, a partir de amostras biológicas e clínicas para aplicações a jusante como, entre outras, reação em cadeia da polimerase (PCR), amplificação dependente de Helicase (HDA), amplifi- cação de recombinase polimerase (RPA), hibridização (como southern blotting, microarranjos, arranjos de expressão etc.), sequenciamento de DNA (incluindo extração integrada e seleção por tamanho para sequen- ciamento de extremidade emparelhada) e outros pedidos relacionados.

[46] Metodologias para analisar a sequência e biologia de DNA ou RNA atualmente usado na técnica meramente coletar todo o DNA presente em uma amostra clínica ou biológica. Nenhum separado baseado em tamanho, ou peso molecular, dos fragmentos de DNA, ou genomas. Separação de fragmentos de DNA baseado em peso molecular fornece um método para enriquecer amostras para DNA específico de interesse. Por exemplo, um teste de diagnóstico molecular para uma 15 infecção bacteriana nascida no sangue poderia se beneficiar do enrique- cimento para DNA de peso molecular na faixa de tamanho do DNA genõmico bacteriano (gDNA) e descartando fragmentos menores de DNA Humano.

[47] 0 fracionamento é definido como um processo de separação em que certa quantidade de uma mistura (neste caso, fragmentos de DNA de diferente peso molecular) é dividido até em um número de quantidades menores (frações) em que a composição muda de acordo com um gradiente (ou seja, diferentes fragmentos de DNA são organiza- dos por peso molecular, tamanho ou carga). As frações são coletadas com base em diferenças em uma propriedade específica dos componen- tes individuais (como peso molecular). Não existe tecnologia que é capaz de extrair e fracionar moléculas de DNA de diferentes pesos molecula- res, em um único dispositivo de fluxo contínuo. Esta invenção é, por- tanto, referenciada com a fabricação e uso de tecnologias para extração e fracionamento de DNA de fragmentos de DNA de diferentes pesos moleculares (como vírus, plasmídeos, gDNA etc.) e amostras inteiras ou lisadas em um dispositivo único de fluxo contínuo.

[48] As metodologias de sequenciamento de geração seguintes se baseiam em urna técnica chamada de pareamento de extremidade, ou sequenciamento de combinação de par, pare resolver elementos estru- turais. Este protocolo requer que moléculas de DNA moldes a serem 5 sequenciadas devem estar dentro de um tamanho de conjunto, ou faixa de peso molecular. Muito trabalho e recursos são gastos preparando estas bibliotecas para sequenciamento de pareamento em extremidade. Usando o dispositivo tudo em um, integrado, como apresentado neste pedido, para extração de DNA e seleção para o peso molecular de DNA, 10 irá eliminar este gargalo e apresenta a oportunidade para automatizar preparação de amostra por dispositivos de sequenciamento de 'front- ending' com o dispositivo apresentado nesta patente.

[49] Um método de fabricação de um dispositivo microfluidico e métodos de extração de DNA e fracionamento deste com base em peso 15 molecular, usando o dispositivo microfluidico que é revelado de acordo com as modalidades da presente invenção. O método compreende fornecer um cassete microfluídico e sugeriu protocolos e exemplos para o uso deste cassete para extração e fracionamento de ácidos nucleicos em um dispositivo único de fluxo contínuo. 20 [501 0 conceito básico é um dispositivo único de fluxo contínuo que tanto extrai de um usado ou amostra integral, quanto fraciona o DNA com base no peso molecular do fragmento. O dispositivo mais simples consiste em um canal de entrada de amostra ou abertura, uma cãmara de extração e fracionamento, canal ou coluna e uma abertura 25 de saída de eluato ou canal fluido. Os canais, cãmara, ou colunas estão mais geralmente nas dimensões micro, mas pode ainda estar nas dimensões macro, nano e pico. O aspecto único da invenção é a câmara única que tanto extrai quanto fraciona o DNA das amostras inteiras ou usados. 30 [51] Para testar a possibilidade de extração e fracionamento de DNA em um canal único/câmara um dispositivo microfluídico foi criado de acordo com as modalidades da invenção. O dispositivo foi fabricado e utilizado como descrito abaixo e com referência às Figuras 1 - 12. [521 Componentes brancos (concha e inserto) do cartucho são moldados por injeção usando vários polímeros dependentes dos requisi- tos de aplicação (por exemplo, PP, PE, PC, COP, COC, PMMA etc.), moído, ou outro processo de fabricação. Se necessário, os canais são ainda moídos e processados em polímero para especificar profundida- des e larguras requeridas. Os cartuchos são limpos vigorosamente antes da montagem. Um adesivo é cortado a laser para corresponder às aberturas requeridas para interfacear com entrada e saída de fluidos lo macro, micro, nano, pico e fornece canais de fluxo entre os componen- tes no cartucho. Filtros hidrofóbicos que retardam o escape de material sorvente são manualmente perfurados, cortados, ou outro método para corrigir o tamanho. O sorvente é preenchido a vácuo na câmara sorven- te e vedado com filtros hidrofóbicos. Várias camadas são alinhadas e 15 mantidas juntas com camadas intermediárias (como PSA). Componen- tes de cartucho são firmemente unidos usando um sistema a base de pressão (por exemplo, laminação, prensa hidráulica). Em modalidades preferenciais do dispositivo, o cassete será moldado por injeção ou moído de um policarbonato, ou outro material plástico biocompatível. 20 Em outras modalidades o cassete será moldado ou moído de vidro.

[53] Alguns elementos/características do cassete de extração de ácido nucleico microfluídico são uma câmara que pode separar DNA de todos os outros componentes celulares e ainda fracionar o DNA na amostra baseada em peso molecular. Dentro câmara são filtros e/ou colunas de cromatografia que separadamente ou juntas, separam o DNA de todos os outros constituintes dentro de um lisado, ou amostra integral e ainda separa os fragmentos de DNA com base no tamanho. Em muitos dos exemplos apresentados abaixo e em muito do trabalho apresentado para estudar estes dispositivos, o método de extração de 30 DNA é fornecido por um filtro sorvente (como aquele descrito na patente US 7.018.538; incorporado aqui em sua totalidade por referência), que quando empacotado em uma determinada densidade e em um canal

• , 12/25 alongado ou cãmara, ainda faz com que o DNA fracione com base em tamanho. O filtro sorvente pode compreender um suporte pelo menos parcialmente coberto por um revestimento polimérico compreendendo polianilina ou derivados dos mesmos. O uso deste filtro sorvente em 5 diferentes densidades de empacotamento e dentro do desenho do dispositivo microfluídico, que alonga o filtro, em combinação, cria a capacidade surpreendente de fracionar bem como extrair DNA.

[54] Aumentando a densidade de empacotamento e estudando a retenção de populações de fragmento de DNA de diferentes pesos mole- 10 culares conforme passaram pelo canal empacotado com o filtro sorven- te, foi observado que fragmentos de DNA com diferentes pesos molecu- lares eluíram em tempos diferentes. A Figura 13 mostra DNA genõmico de esperma de salmão não cortado eluindo nas primeiras 5 frações de eluato e então na figura 14 fragmentos menores de uma escada log de 15 0,1-10kó de eluato nas frações 6-10. Os fragmentos de DNA de menores pesos moleculares são impedidos e os fragmentos maiores passam pelo primeiro. Os resultados claramente fornecem evidência que tanto a extração quanto o fracionamento são possíveis dentro de uma única ou várias câmaras/canais para aumentar a resolução. 20 [55] Em outras modalidades da presente invenção, filtros alter- nativos ou estruturas ou produtos químicos podem ser usados para extrair e fracionar o DNA de uma amostra. Outros filtros de estruturas macro, micro, nano, pico capazes de ligar todos os debris celulares de um usado de amostra ou amostra de sangue inteira, podem ser implan- 25 tados com fracionamento fornecido por outras colunas de cromatografia padrão ou um gel ou campo elétrico, integrado com estas características ou produtos químicos.

[56] Ainda em outras modalidades, formas de canal, dimensão e caminhos podem ser usadas. O exemplo ilustrado nas Figuras 1 -12 30 mostram o canal para serpentear com micro dimensões. No entanto, o canal ou dimensões da cãmara não são particularmente limitantes e podem alterar ou afinar ou seguir outros desenhos, contanto que o

• , 13/25 canal ou camada seja suficientemente longo para facilitar a extração e fracionamento de DNA de DNA de um usado. As dimensões do canal podem ser na faixa de macro, micro, nano, pico, contanto que o filtro ou material de cromatografia sejam empacotados nestes.

[57] Em uma modalidade, a câmara de microfluídico é uma es- trutura bulbosa na entrada que afunila para uma saída mais fina (ver, por exemplo, Figura 16). A extremidade bulbosa é empacotada com um material que facilita espalhamento da amostra que é carregada pelo canal fluido macro, micro, nano, pico. Isto então permite que a amostra seja carregada em no filtro de extração e fracionamento ao mesmo tempo, assim permitindo melhor fracionamento.

[58] Em algumas modalidades do dispositivo, reservatórios de reagentes podem ser fornecidos no dispositivo microfluídico e estes poderiam fornecer em armazenamento de cartucho para tampões de 15 ativação, reservatórios de amostra para coleção de eluato e resíduo.

[59] Ainda em mais modalidades, diferentes pressões e fluxos são exercidos e aplicados ao canal de fluxo contínuo único para facilitar eficiente extração e fracionamento de DNA de peso molecular. Estas pressões e taxas de fluxo podem ser alteradas para ajustar diferentes 20 aplicações, junto com densidades de empacotamento e dimensões de canal/câmara.

[60] Uma das questões usando uma área de superfície alta em microfluídico é a razão alta de área de superfície para volume, que neste caso apresenta a possibilidade que o DNA não irá especificamente se 25 ligar à superfície e não eluir. Os produtos químicos de superfície conhe- cidos aos especialistas na técnica podem ser empregados para impedir que o DNA seja absorvido nos cassetes.

[61] Em algumas modalidades, a superfície dos canais microflu- ídicos pode ser tratada como para prevenir a absorção e adsorção em e 30 no material. Dito tratamento de superfície pode compreender de méto- dos incluindo, entre outros; fluir uma substância sacrificial através do canal, assim reduzindo a perda do material, tratar a superfície com material biológico como soro bovino, enzimas polimerase ou outros ditos materiais, ou tratar quimicamente a superfície para impedir perda. Os tratamentos podem incluir, entre outros, substituição de materiais que criam uma superfície hidrofílica ou hidrofóbica para 5 permitir um fluxo mais suave. Em alguns outros fluorcarbonos e mate- riais semelhantes das modalidades (Teflon, como exemplo, poderia atuar como uma barreira hidrofóbica ou poliacrilatos) podem ser depo- sitados nas superfícies dos canais. Outras metodologias como revesti- mentos UV e escolas de polímero que são quimicamente crescidas na superfície podem ainda estar incluindo nesta invenção. Ainda em outra modalidade, pode ser que o material do qual o cartucho é fabricado de é escolhido ou adaptado em seu desenho e material de preparo, para prevenir perda do material em ou na superfície.

[62] Com referência à Figura 1, está representado la. Abertura de enchimento de tampão - ponta de pipeta, ou outro dispositivo usado com tampão, inserido na abertura para preenchimento do cartucho com tampão preparado, lb. Bomba de seringa 3 Abertura - tampa da aber- tura conecta abertura de tampão (la) na abertura de tampão (lb) . Esta passagem percorre a espessura do cartucho para interface de bomba de seringa externa ou outro dispositivo para criar fluxo ou pressão, lc. Reservatório de tampão - um tampão está contido neste reservatório e é usado para ativar ou umedecer o filtro, até o ponto de uso. 2a. Abertura de enchimento de amostra (Lisado) - ponta de pipeta, ou outro disposi- tivo usado para encher com amostra/lisado, inserido na abertura para enchimento do dispositivo microfluídico com amostra/usado. 2b. Aber- tura 1 de bomba de seringa - a tampa da abertura conecta abertura da Amostra (2a) à abertura da seringa (2b), Este caminho percorre a espessura do cartucho para interface de bomba de seringa externa. 2c. Reservatório de Amostra -Amostra (Lisado) contida neste reservatório, 30 até o ponto de uso. 3a. Cavidade de filtro 1 - manter o filtro na entrada da câmara empacotada com sorvente. Alternativamente, micro estrutu- ras e outros materiais para separar DNA de um lisado podem ser usa-

dos. 3b. Cavidade de filtro 2 - manter o filtro na saída da câmara empacotada com sorvente. 4. Canal e abertura de resíduo - via de resíduos para o excesso de tampão preparado para fora da câmara sorvente, e fora do cartucho através da bomba de seringa 2. 5a. Reser- 5 vatório de coleta - Eluato das coleções de câmara sorvente neste reser- vatório para extração posterior com pipeta. 5b. Abertura 4 de Bomba de seringa - fornece sucção para extrair o eluato através da câmara empa- cotada com sorvente e no reservatório de coleção. 6. Filtros - filtros hidrofílicos Vyon®. 7. Vias de filtro - tampão/ amostra usado, ou outra 10 amostra passa da camada de inserto do cartucho para a camada de concha através destas vias. S. Vias de Bomba de seringa (fita) - As vias na extremidade da fita formam canais da camada de inserto do cartu- cho para a camada da concha, onde estão interfaces com as bombas de seringa externas. 9. Vias de Bomba de seringa (concha) - Interface com 15 bombas de seringas externas. 10. Câmara empacotada com sorvente, que contém um pó sorvente, por exemplo, um pó sorvente Nexttec.

[63] Com referência à Figura 2, a vista superior de um dispositi- vo microfluídico montado é mostrada. Com referência à Figura 3, a vista inferior de um dispositivo microfluídico montado é mostrada. 20 [64] 0 inserto de um dispositivo microfluídico mostrado na Figu- ra 4 pode ser criado por moagem, litograficamente preparado, ou outro processo de fabricação. Pode ser feito de um plástico, como policarbona- to, ou outro material.

[65] A concha mostrada na Figura 5 pode ser criada por moa- 25 gem, litograficamente preparada, ou outro processo de fabricação. Pode ser feito de um plástico, como policarbonato, ou outro material.

[66] Com referência à Figura 6, uma camada de fita de dupla fa- ce cortada a laser é mostrada. A fita de dupla face 60, ou qualquer outro adesivo conhecido na técnica, pode ser usada para unir o inserto 30 (Figura 4; No. de referência 50) e concha (Figura 5; no. de referência 70) junto, assim, formando os canais microfluídicos do dispositivo microflu- ídico 80.

[67] Com referência à Figura 7, a concha 70 é mostrada lamina- da para cobrir os reservatórios de fluido. Outros meios para cobrir os reservatórios de fluido podem ser empregados em outras modalidades.

[68] Com referência à Figura 8, filtros 6 foram substituídos nas 5 cavidades de filtro (3a e 3b) do inserto 50 na entrada e saída da cãmara empacotada com sorvente para garantir que o material sorvente perma- neça no lugar. Em outras modalidades, estes filtros podem não ser usados, como o desenho do cassete (o inserto montado e componentes de concha) podem ser estruturalmente modificados para prevenir que o 10 material sorvente escape, por exemplo, reduzindo a área luminal trans- versai da cãmara preenchida com sorvente na entrada e saída.

[69] Com referência à Figura 9, uma camada de fita de dupla fa- ce é mostrada sendo aplicada ao inserto para manter as metades do cassete (inserto e concha) juntas para criar os canais microfluídicos. 15 Claro, qualquer tipo de fita de ligação reconhecida na técnica, adesivos, camadas de polímero etc., podem ser empregado ao invés da fita adesi- va de dupla face.

[70] Com referência à Figura 10, a cãmara sorvente do cassete montado 80 é ilustrado sendo preenchido em vácuo. O sorvente é 20 fornecido em uma extremidade da cãmara sorvente por um aplicador 82, por exemplo, uma pipeta. Preenchimento de sorvente na modalidade ilustrada aplicando um vácuo à outra extremidade da cãmara sorvente. O vácuo é aplicado por uma tubulação de vácuo 84 (conectada a uma fonte de vácuo). A extremidade distal da tubulação de vácuo 84 pode ser 25 modificada como ilustrado por incluindo ou interfaceando com um copo de sucção elastomérico para fornecer aplicação adequada de pressão negativa à abertura da cãmara sorvente.

[71] Com referência à Figura 11, a vista superior de um disposi- tivo microfluidico de extração de acido nucleico montado é mostrada. 30 [72] Com referência à Figura 12, a vista inferior de um dispositi- vo microfluídico de extração de acido nucleico montado é mostrada.

[73] Com referência à Figura 13, os resultados de corrida de

17 / 25 80}.tí de 1 1pg/ml de esperma de salmão por um experimento de extra- ção usando o cassete de extração e marcação deste com extração de DNA de coluna Nexttec clean são apresentados. Como o eluato saiu do cassete cada fração foi avaliada para concentração de DNA usando o 5 sistema Quant IT. Os resultados da extração das colunas clean e cada fração de eluato do cassete são tabulados e as concentrações da fração ilustradas graficamente próximo a estes. O DNA final total extraído 0,043ug, comparado a 0,46ug e 0,58ug nas colunas clean. Estes resul- tados demonstram que DNA foi extraído e fracionado usando o cassete 10 microfluídico. Embora a quantidade de DNA e a concentração foram significativamente inferiores do cassete de extração do que as colunas clean, o cassete de extração não foi integrado com um ciclador térmico para realizar uma reação de amplificação única. A amplificação poderia ser esperada para substancialmente aumentar o rendimento de DNA. 15 [74] Com referência à Figura 14, PCR das frações de eluato de sangue humano usado passou pelo dispositivo microfluidico de extração foi realizada. Figura 14a mostra a escada de massa na linha 1 e eluatos 1 a 11 nas linhas 2 a 12. As bandas de intensidade mais fortes estão nas primeiras duas frações como esperado, conforme este irá conter o 20 gDNA. A Figura 14b mostra a escada de massa na linha 1 com linhas 2- 10 contendo frações de eluato 13 a 21. Linha 11 contém um PCR de água (o branco) e linha 12 a PCR de uma amostra DNA extraída com uma concentração conhecida de DNA (21pl/mL).

[75] Com referência à Figura 15, uma imagem de gel de uma 25 análise BioAnalyzer de frações eluato que separam DNA baseado em tamanho é ilustrado. Esta escada de tamanho incluída no kit BioAnaly- zer, são corridas em linhas L e 12. Linhas 1-10 representam as primei- ras frações de 10}x1 de eluato para sair do dispositivo microfluídico apresentado nas Figuras 1 a 12, após 20p1 de 'Quick-Load 2 -log DNA 30 Ladder' (#N0469S, New England BioLabs) foi carregado e correu pelo dispositivo.

[76] Com referência à Figura 16, um desenho não limitante de um desenho de microfluídico alternativo para a estrutura de um dispo- sitivo de extração e fracionamento de DNA é mostrado. A entrada de amostra (161) é mostrada. O canal fluido (162) pode ser um canal fluido em escala macro, micro, nano, ou pico. Material sorvente (163) é descri- 5 to, que facilita espalhamento da amostra que é carregada pelo canal fluido, de modo que a amostra é carregada no filtro (164). Preferencial- mente, o material sorvente (163) não se liga ou fraciona o DNA, embora pode ser desenhado para ligar e impedir certos outros constituintes do lisado. O filtro (164) ambos separam DNA de outros constituintes de 10 lisado e fraciona o DNA baseado em peso molecular. A cãmara/canal é afunilada e a densidade de empacotamento do filtro é tal que o fracio- namento aumente a resolução do fracionamento. Um canal fluido em escala de macro, micro, nano, pico (165) é onde por as frações de eluato saem. 15 [77] A Figura 17 é uma vista em perspectiva mostrando um dis- positivo em ponto de cuidado e cassete microfluídico que inclui o dispo- sitivo de extração e fracionamento de DNA dentro do cassete.

[78] A Figura 18 é uma vista esquemática que mostra os com- ponentes de um cassete microfluídico desenhado para diagnóstico 20 portátil de acordo com algumas modalidades. O cassete descartável inclui uma área de recepção de amostra 181 e uma câmara de lise de amostra 182. 0 tampão/ condições específicas de lise são conhecidos na técnica. Preparação de amostra ocorre no canal microfluídico 183, preferencialmente com um sorvente, por exemplo, material sorvente 25 Nexttec. A concentração de DNA pode em algumas modalidades ocorrer na cãmara 184 após extração de DNA. A reconstituição de reagentes liofilizados (se usando reagentes secos) e/ou reagentes PCR podem ainda ocorrer na cãmara 184 (ou mistura de reagentes úmidos). Cicia- gem térmica se empregada, por exemplo, para amplificação de PCT, 30 poderia ocorrer na cãmara 185. 0 DNA processado (e opcionalmente amplificado) poderia viajar pelo canal microfluídico 186 para arranjos analíticos /sensores 187, compreendendo, por exemplo, nano fios ou outros biossensores arrumados após ou dentro da presente invenção.

Eletrônicos 188 são usados para ligar o sinal dos nanofios/biossensores ao dispositivo leitor (não ilustrado). O resíduo é simplesmente um reservatório de microfluídico vazio 189. 5 [79] A Figura 19 ilustra um cassete microfluídico desenhado pa- ra sequenciamento portátil em algumas modalidades.

Área de recepção de amostra 191 pode atuar como uma barreira para que a amostra escape e pode ainda ser capaz de aceitar amostras, por exemplo, muito como a tampa de borracha em vacutainers de sangue.

A cãmara de lise 10 192 pode ser uma cãmara única de microreator, que compreende um reagente de lise para quebrar as células e para liberar DNA genómico.

Esta seção pode ainda se assemelhar a um filtro para remover células de sangue se o polímero de nucleotídeo alvo pode ser livre no soro de sangue.

Uma cãmara de preparação de amostra de ácido nucleico 193 15 pode ser usada para isolar e extrair a fração de polímero de nucleotídeo da amostra do resto dos constituintes da amostra (proteínas, carboidra- tos, lipídios etc.). Isto pode ser conseguido por alguns métodos bem conhecidos aos especialistas na técnica.

Por exemplo, esta cãmara macrofluídica pode conter a tecnologia de filtro Nexttec.

A amplificação 20 do polímero de nucleotídeo alvo pode ocorrer em um ciclador 194 configurado para amplificação de PCR do polímero de nucleotídeo alvo.

O ciclador 194 pode empregar elementos de aquecimento ou outras estratégias bem conhecidas de ciclagem de uma mistura de reação através de diferentes temperaturas requeridas para PCR, para realizar a 25 ciclagem térmica requerida, ou métodos de amplificação de isoterma (como LAMB, RPA etc.), que pode não requerer aquecimento da amos- tra.

Processamento de amostra, se empregado, pode ser desejado pelo menos em algumas modalidades para concentrar os ácidos nucleicos, ou remover cadeias de nucleotídeo "pendentes" que podem causar sinal 30 de fundo, antes do sequenciamento.

Tal processamento ocorreria na cãmara 195. Microfluídico geral 196 inclui variáveis como o tamanho dos canais, fluxo de fluido, válvulas e controle, materiais e válvulas usadas em algumas modalidades. Conectores de metal 197 se conectam às nanoestruturas de detecção sensíveis (em modalidades preferenciais, nanofios) ao dispositivo detector (não mostrado) em algumas modalida- des. Arranjos de nanoestruturas de detecção sensíveis 198 podem 5 contatar os canais microfluídico e podem ser nanoestruturas de detec- ção sensíveis justamente arrumadas (como nanofios, ou nanotubos de carbono). Métodos de posicionamento de DNA no canal podem incluir, por exemplo, canais justos que permitem extensões grandes de DNA para desenrolar, migrar e esticar pelos canais que podem permitir comprimentos longos de leitura, se necessário, e sondas ti- ling/iniciadores podem ser manchados em aglomerados de nanofio e reações de sequenciamento paralelas múltiplas curtas realizadas ao longo dos canais. Um canal microfluídico de tecelagem 199 pode ser preenchido com reagentes, em algumas modalidades separadas por bolhas de ar. Como o canal microfluídico pode ser bombeado, ou um atuador muito pequeno movimenta os reagentes juntos, a sequência dos reagentes no canal microfluídico pode correr o sequenciamento por reação de síntese como revelado, por exemplo, em 2011-0165572 Al, 2011-0165563 Al e PCT/1B2009/005008; incorporado em suas totali- dades aqui por referência a estes. Alternativamente, este método de armazenamento de reagente pode ser substituído por reservatórios, ou embalagens de blister e ainda reagentes liofilizados, são reconstituídos pela própria solução de reação.

EXEMPLOS 25 [80] Os seguintes são alguns exemplos ilustrativos e não limi- tantes de algumas modalidades da presente revelação.

Exemplo 1 - Extração de DNA de Sangue Inteiro Mecanicamente Lisado, Para PCR

[81] Sangue humano completo foi mecanicamente lisado forçan-

do este em poros de diâmetro pequeno, que fez com que as paredes da célula rompessem e liberassem o DNA (outros métodos de lise mecânica podem ainda ser usados). Este usado foi passado pelo dispositivo microfluídico de extração de DNA e frações de eluato coletadas. Estas frações de eluato foram usadas como moldes em reações de PCR que amplificaram uma região pequena no genoma humano. As primeiras duas frações eluidas foram 34111 e 32p 1 respectivamente, com as 18 frações seguintes com 20p1 de volumes. Os dados mostrados na Figura 14 claramente demonstram que o dispositivo é capaz de extrair DNA lo que não contém impurezas que deleteriamente afeta ação de polimera- Exemplo 2 - Fracionamento de Fragmento de DNA

[82] 40pL de escada 2X log foram carregados no cassete exem- plar (como descrito na figura 1-12), e bombeado na coluna de extração e 15 fracionamento de DNA. Frações de 10pL foram então coletados para um total de 400}..íL. Cada fração de eluato foi então analisadas para distri- buição de tamanho e abundância em um dispositivo Bio Analyzer (Agilent). A Figura 15 mostra os resultados para isto. Um experimento de controle foi conduzido com o protocolo de amostra com DNA de esperma de salmão não cortado DNA passado pelo cassete de extração de DNA (como descrito na figura 1-12). Os resultados são mostrados na figura 13 e mostram esperma de salmão maior eluindo do dispositivo mais precocemente do que a escada de log menor, demonstrando capacidade de fracionamento.

25 Exemplo 3 - Sequenciamento de DNA

[83] Muitas metodologias de sequenciamento, helicos, FLX (Ro- che), sequenciador de genoma (Illumina), Nanoporo e nanoiio (Quan- tuMDx, US61 094,006), utilizam microfluídico e fluxo de células para liberar a amostra de DNA extraído para onde a reação de sequencia-

mento é realizada. No entanto, todas as tecnologias até o momento empregam preparação de amostra foram dispositivo, em que a amostra tem seu DNA (ou RNA/ cDNA) extraído usando metodologias de bancada tradicionais (coluna giratória da Qiagen, Invitrogen's Charge Switch, 5 colunas giratórias de filtro sorvente Nexttec etc) que adicionam tempo significativo ao processo de sequenciamento e demanda mãos do opera- dor significativa no tempo. Esta solução microfluïdica irá "afrontar" estas tecnologias, permitindo que cada tecnologia se torne uma amostra para o dispositivo de resultado e automatize todos os processados lo requeridos para gerar dados de sequência.

Exemplo 4 — Extração Automatizada e Integrada de DNA e Seleção de Tamanho Para Sequenciamento de Extremidade Pareada

[84] 0 sequenciamento de geração seguinte padrão, usando o método de shotgun é limitado por comprimentos de leitura pequenos. 15 Uma solução desta limitação crítica é a estratégia de sequenciamento de tag de pareamento na extremidade (PET), em que tags pareados e pequenos são extraídos de fragmentos longos de DNA para sequencia- mento de rendimento ultra alto. As sequências de PET podem ser precisamente mapeadas ao genoma de referência, assim demarcando as 20 fronteiras genõmicas de fragmentos de DNA representados por PET e revelando as identidades dos elementos de DNA alvos. Para preparar este, a extração de DNA é seguida por seleção de fragmentos de tama- nho específicos para permitir a implementação bem sucedida desta estratégia. Isto consome tempo e é caro. 25 [85] Por exemplo, o protocolo Illumina HiSeq e MiSeq inclui uma etapa de limpeza Zymo (após "marcação") e uma etapa de seleção de tamanho Ampure XP (após PCR de ciclo limitado). A biblioteca final tem um tamanho de inserto mediano de -250-300 para suportar longo pareamento 2x150 comprimentos de leitura em sistema MiSeq. 30 [86] Usando o dispositivo tudo em um, integrado para extrair

DNA e selecionar para o tamanho irá cortar este gargalo de preparação da amostra e apresenta a oportunidade de automatizar este por disposi- tivos de sequenciamento front-ending com o dispositivo apresentado nesta patente.

5 Exemplo 4 - Diagnóstico

[87] Muitas metodologias de diagnóstico molecular, Cepheid (Smart Cycler), Light Cycler (Roche), sistema BeadXpress & Eco Real- Time PCR (I1lumina), sistema 7500 Real-Time PCR (ABI), sistema Gene - Chip (Affymetrix), e dispositivos futuros como um dispositivo Nanoporo, dispositivos microfluídicos e dispositivos nanofio & nanotubo de carbo- no (QuantuMDx), utilizam DNA (ou RNA/cDNA) como seus substratos de teste. No entanto, a maioria, se não todas as tecnologias até o mo- mento empregam preparação da amostra fora do dispositivo, em que a amostra tem seu DNA (ou RNA/cDNA) extraída usando metodologias de bancada tradicionais (colunas giratórias de Qiagen, Invitrogen's Charge Switch, colunas giratórias de filtro sorvente Nexttec etc.) que adiciona tempo significativo ao processo de diagnóstico molecular e demanda significativamente as mãos do operador no tempo. Esta solução micro- fluídica irá "afrontar" estas tecnologias, permitindo que cada tecnologia torne a amostra no dispositivo resultante e automatize todos os proces- sos requeridos para gerar dados de sequência.

Exemplo 5 - Análise Molecular de Dispositivo Único

[88] Em algumas modalidades, sequências de DNA alvo específi- cas podem ser extraídas em um canal microfluídico que leva a outro processo a jusante em um cassete microfluídico único de fluxo contí- nuo. O cassete irá realizar a lise, extração, concentração da amostra, amplificação, detecção e manuseio de resíduo, ou qualquer combinação destes processos. Os cassetes podem ser totalmente incluídos, descar- táveis e ser operados por um dispositivo portátil, ou de bancada, ou de alto rendimento.

Exemplo 6 - Dispositivo de Seguenciamento Portátil

[89] Em algumas modalidades, sequências de DNA alvo específi- cas podem ser extraídas em um canal microfluídico que leva a outro 5 processo a jusante em um cassete microfluidico único de fluxo contínuo em que o DNA é sequenciado (Figura 13). Todos os reagentes requeridos para a lise e extração de DNA das amostras podem ser armazenados em um canal microfluídico, cada solução de lavagem e tampão de lise, pode ser separada por uma bolha de ar, ou outro método de separação dos lo reagentes, ou os reagentes podem ser armazenados em embalagens de blister, liof lizados ou outros métodos para reagentes de armazenamen- to dentro de microcanais.

[90] Em algumas modalidades, regiões pequenas específicas de DNA alvo viral, bacteriano ou genómico podem ser extraídas para 15 sequenciamento e, portanto, ser diagnosticados para a presença ou ausência de uma sequência específica de vírus, bactéria, ou genética (como um SNP), bem como para fornecer informações de adição de valor em tipo genético, mutações (conhecidas ou desconhecidas), estado de resistência a droga etc. 20 [91] Várias modalidades usadas em conexão com a presente re- velação prestam-se ao sequenciamento portátil, pois ele pode não requerer equipamento volumoso para extrair o DNA antes da reação de sequenciamento. [921 Em uma modalidade, uma sequência de sonda pode ser i- 25 mobilizada em uma nanoestrutura de detecção sensível (neste caso um nanofio) e o molde de molécula de ssDNA a ser sequenciada pode hibridizar à sequência de sonda e a sequência de sonda pode atuar como um iniciador para o sequenciamento por reação de síntese. Em outra modalidade, a molécula de molde de ssDNA pode ser imobilizada 30 à nanoestrutura de detecção sensível e pode ser iniciada para sequenci-

amento com um oligonucleotídeo de iniciador livre.

Exemplo 7 - Desenho de Dispositivo Microfluídico de Alta Resolução de Extração e Fracionamento de DNA.

[93] Um dos problemas com fracionamento da amostra introdu- 5 zindo esta a uma coluna de um canal microfluídico de densidade seme- lhante é que nem todas as amostra são faseadas ao mesmo tempo. Uma mistura de fragmentos de DNA de fragmentos de diferentes pesos moleculares irá mais provavelmente ser espalhada de modo homogéneo na amostra, ao longo do canal microfluídico e, assim, o fracionamento 10 será prejudicado pela entrada da amostra no filtro de extração e fracio- namento por um período de tempo com o primeiro DNA a ser carregado correndo fora da fase de moléculas de DNA que entra por último. Por- tanto, a mistura precisa ser faseada na coluna de extração e fraciona- mento ao mesmo tempo. Uma cãmara microfluida que consiste em uma 15 entrada bulbosa que é enchida com um material que facilita o espalha- mento da amostra sem afetar o fracionamento da amostra, que, portan- to, permite que a amostra integral entre na coluna de fracionamento ao mesmo tempo, seguido imediatamente por uma coluna em afunilamento (em termos de dimensões da cãmara), empacotada com um material 20 que tanto separa o DNA dos constituintes do usado quanto fraciona o DNA baseado em peso molecular do fragmento, é uma solução. Um desenho não limitante de tal possível projketo microfluídico para a estrutura de um dispositivo de extração e fracionamento de DNA é apresentado na Figura 16.

Claims (5)

1. Reivindicações 1 - Dispositivo Para Extrair Ácidos Nucleicos a Partir de Lisado ou Amostra Integral, sendo o dispositivo caracterizado por compreender um canal microfluídico contínuo único, compreendendo o canal câmaras de tampão e reagente e um filtro sorvente, configurado para separar os ácidos nucleicos, que passam através do filtro sorvente, a partir de outros constituintes dentro do lisado ou a amostra integral, sendo os referidos outros constituintes retidos pelo filtro sorvente.
2. 2 - Dispositivo Para Extrair Ácidos Nucleicos a Partir de Lisado ou Amostra Integral, de acordo com a Reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o filtro sorvente compreende um suporte pelo menos parcial- mente coberto por um revestimento polimérico compreendendo poliani- lina ou derivados da mesma.

   3 - Dispositivo Para Extrair Ácidos Nucleicos a Partir de Lisado ou Amostra Integral, de acordo com a Reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o dispositivo compreende um.material de vidro.

   4 - Dispositivo Para Extrair Ácidos Nucleicos a Partir de Lisado ou Amostra Integral, de acordo com a Reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o dispositivo compreende um material PDMS.

   - Dispositivo Para Extrair Ácidos Nucleicos a Partir de Lisado ou Amostra Integral, de acordo com a Reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o canal microfluídico contínuo único compreende uma estru- tura bulbosa em uma entrada da mesma e em que a estrutura bulbosa afunila para uma estrutura mais fina em uma saída da mesma.

   6 - Dispositivo Para Extrair Ácidos Nucleicos a Partir de Lisado ou Amostra Integral, de acordo com a Reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o filtro sorvente compreende uma série de microestruturas sólidas ou ocas fabricadas nas paredes do canal microfluídico.

   7 - Dispositivo Para Extrair Ácidos Nucleicos a Partir de Lisado ou Amostra Integral, de acordo com a Reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o filtro sorvente é frouxo e empacotado dentro do canal mi- crofluídico.

   8 - Método Para Fabricar Dispositivo Microfluídico, para extrair ácidos nucleicos a partir de uma amostra, conforme definido em qualquer uma das Reivindicações precedentes, caracterizado por compreender: formar pelo menos duas camadas cegas tendo um canal; formar uma camada adesiva com aberturas cortadas através da camada correspondente a uma abertura de entrada e uma abertura de saída do canal; empacotar a vácuo uma parte do canal com um material sorvente; e alinhar as camadas cegas com a camada adesiva entre as mesmas e unir as camadas juntas sob pressão.

   9 - Método Para Extrair Ácidos Nucleicos a Partir de Lisado ou Amos- tra Integral, sendo o método caracterizado por compreender: fornecer o dispositivo da Reivindicação 1; aplicar a amostra a uma entrada do canal microfluídico contínuo único; ativar o filtro sorvente com um tampão; fluir a amostra para a parte do canal que contém o filtro sorvente; fluir a amostra através do canal e circular esta através da parte do canal que contém o filtro sorvente dentre uma a dez vezes; e

   ,. 3/3 fluir os ácidos nucleicos extraídos para fora do dispositivo.

   10 - Método Para Extrair Ácidos Nucleicos a Partir de Lisado ou Amostra Integral, de acordo com a Reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que a amostra é escoada para a parte do canal que contém o filtro sorvente e, então, incubada na mesma por entre 15 segundos e 15 minu- tos, antes de ser escoada para fora do dispositivo.

   11 - Método Para Extrair Ácidos Nucleicos a Partir de Lisado ou Amostra Integral, de acordo com a Reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que a amostra é escoada para a parte do canal que contém o filtro sorvente e, então, oscilada para frente e para trás dentro do canal do filtro sorvente, antes de fluir a amostra para fora do dispositivo.

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4. 4.7pghrl 2.S1p mi Usar SO til de 1,0 ng%ml de aiuosrra para extração Amostra Tat sol Conc. Amostra 1 Vol I extraído ApWmIl Clean1 10 89 5.21 SORVENTE NEXTTEC DE EXTRAÇÃO DE DNA Clean2 10 87 6.72 0-42 10 42 0 43-113 10 71 0..323 103 114-191 10 78 0.125 0 28 192-218 10 27 0.207 0.2 219-238 10 20 0.225 239-261 10 23 0.012 01 252-286 10 25 0 0.05 287-314 10 28 0 O 315-340 10 29 0 12 34 5 8 7 8 9 10 11 12 13 14 15 18 17 341-369 10 29 0.017 Numero da amostra 370-396 10 27 0.012

   397.426 10 30 0 427-453 10 27 0 454-479 10 26 0 480-506 10 27 0 507-534 10 28 0 535-555 10 24 0 DNA in = 80p1 01 ygltwl 4 0.88py DNA twt la— p= 0.46~tg (53% d INJ, CINA out — rj= 0.58}rá (6 6% of IN) DNA aul Is, e = 0.043,}19 (4.9% of IN)

   Figura 14a

   I';gura14b

   Figura 15

   Figura 16

   Figura 17 figura i8 amontri dc sungie

   Primei dispositivopur1Ltìl que dirwona u Iluxo dc fluido e tâ os sinais elétricos a partir de nauufam

   - guru 19 amostra de sangue [Q ~~~jjj I- integral 4 4 n ___ I 1, •1 ('••/ ^+

   J r \ ~ Y~ t L 4 ~ -- Q s ~~-~-~, rse ~.mo ~ .

   ¡~ y ir p -^. ILL. Á 4i..á. r ~! l .. sY .-~! I • :: AE c- ft j I _ l iiiV IIlE $ 4 resíduo Bomba R. Adenine *Citosina •Guanina =Timina , DTams o de lavagem de clivagem

   "Dispositivo e Métodos Para Simultaneamente

   Extrair e Fracionar DNA de Lisado ou Amostra Integral e Para Fabricar Dispositivo Microfluídico"

   Resumo
5. 5 Várias modalidades da presente revelação geralmente se referem aos protocolos de biologia molecular, equipamento e reagentes para extração e fracionamento de moléculas de DNA, de amostras integrais ou usadas, em um dispositivo de fluxo contínuo único.