DE102018207106A1 - Mikrofluidische Sequenzierungsvorrichtung zum Vervielfältigen und Trennen von Molekülketten und Verfahren zum Trennen von aus einer Amplifikationsreaktion gewonnen Molekülketten - Google Patents

Mikrofluidische Sequenzierungsvorrichtung zum Vervielfältigen und Trennen von Molekülketten und Verfahren zum Trennen von aus einer Amplifikationsreaktion gewonnen Molekülketten Download PDF

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Abstract

Die Erfindung betrifft eine mikrofluidische Sequenzierungsvorrichtung (100) zum Vervielfältigen und Trennen von Molekülketten, wobei die Sequenzierungsvorrichtung (100) dazu ausgebildet ist, biochemisches Material aufzunehmen. Die Sequenzierungsvorrichtung (100) weist zumindest eine Zuführöffnung (105) zum Zuführen von biochemischem Material in die Sequenzierungsvorrichtung (100) auf. Ferner weist die Sequenzierungsvorrichtung (100) zumindest eine mikrofluidische Separationseinheit (101) auf, wobei die Separationseinheit (101) zumindest einen Separationskanal (102) mit zumindest einer Amplifikationskavität (115) zum Vervielfältigen von über die Zuführöffnung (105) zugeführten Molekülketten als biochemischem Material und mit zumindest einer mit der Amplifikationskavität (115) mikrofluidisch verbindbare oder verbundene Trenneinheit (120) mit einem mehrporigen Material aufweist, wobei die Trenneinheit (120) dazu ausgebildet ist, Nukleinsäuren von weiteren makromolekularen Bestandteilen zu trennen und/oder Nukleinsäuren aufzutrennen. Außerdem weist die Sequenzierungsvorrichtung (100) zumindest eine Abführöffnung (125a) zum Abführen von in der Separationseinheit (101) aufgetrennten Nukleinsäuren als biochemischem Material aus der Sequenzierungsvorrichtung (100) auf.

Description

  • Stand der Technik
  • Die Erfindung geht von einer Sequenzierungsvorrichtung oder einem Verfahren nach Gattung der unabhängigen Ansprüche aus. Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist auch ein Computerprogramm.
  • Die Entschlüsselung des genetischen Codes, auch DNA-Sequenzierung genannt, ist ein Standard-Verfahren in Forschung und Medizin. Bei der etablierten Didesoxy-Sequenziermethode nach Frederick Sanger werden in einer Amplifikationsreaktion, also einer Polymerase-Kettenreaktion (PCR), modifizierte Nukleotide eingesetzt. Werden diese von einer Polymerase in einen entstehenden PCR-Produktstrang eingebaut, kann kein weiteres Nukleotid mehr eingebaut werden und der Produktstrang verbleibt in der jeweiligen Länge. Anschließend werden die Produkt-Fragmente Gel-elektrophoretisch aufgetrennt. Aufgrund der Längenverteilung der mit einer bestimmten Nukleobase terminierten Produkt-Fragmente lässt sich die Sequenz des PCR-Produkts eindeutig bestimmen. Bei Next Generation Sequencing (NGS) Verfahren hingegen kommen hauptsächlich Sequencing-by-Synthesis Verfahren zum Einsatz. Die zu sequenzierende DNA-Moleküle werden zunächst klonal amplifiziert und auf einer Festphase angebunden. Bei der Synthese des Produktstranges wird der Einbau einzelner fluoreszenzmarkierter Nukleotide gemessen, was schlussendlich auf die Sequenz rückschließen lässt. In jüngster Zeit kamen Einzelmolekülsequenzierer auf den Markt. Bei diesen Systemen entfällt die klonale Amplifikation der Nukleinsäuren im Vergleich zu NGS, wodurch beispielsweise kein Sequenzier-Bias mehr auftritt. Dennoch benötigen auch diese Systeme immer noch eine aufwändige Probenvorbereitung.
  • Offenbarung der Erfindung
  • Vor diesem Hintergrund werden mit dem hier vorgestellten Ansatz eine Sequenzierungsvorrichtung zum Vervielfältigen und Trennen von Molekülketten, weiterhin ein Verfahren zum Trennen von aus einer Amplifikationsreaktion gewonnen Molekülketten und ein Verfahren zum Herstellen einer solchen Sequenzierungsvorrichtung, eine Vorrichtung zum Ansteuern solcher Verfahrens sowie schließlich ein entsprechendes Computerprogramm gemäß den Hauptansprüchen vorgestellt. Durch die in den abhängigen Ansprüchen aufgeführten Maßnahmen sind vorteilhafte Weiterbildungen und Verbesserungen der im unabhängigen Anspruch angegebenen Vorrichtung möglich.
  • Es wird eine mikrofluidische Sequenzierungsvorrichtung zum Vervielfältigen und Trennen von Molekülketten vorgestellt. Die Sequenzierungsvorrichtung ist dazu ausgebildet biochemisches Material aufzunehmen. Die Sequenzierungsvorrichtung weist zumindest eine Zuführöffnung zum Zuführen von biochemischem Material in die Sequenzierungsvorrichtung auf. Ferner weist die Sequenzierungsvorrichtung zumindest eine mikrofluidische Separationseinheit mit einem Separationskanal auf, wobei der Separationskanal zumindest eine Amplifikationskavität zum Vervielfältigen von über die Zuführöffnung zugeführten Molekülketten als biochemischem Material und zumindest eine mit der Amplifikationskavität mikrofluidisch verbindbare oder verbundene Trenneinheit mit einem mehrporigem Material aufweist, wobei die Trenneinheit dazu ausgebildet ist, Nukleinsäuren von weiteren makromolekularen Bestandteilen zu trennen und/oder Nukleinsäuren aufzutrennen. Außerdem weist die Sequenzierungsvorrichtung eine Abführöffnung zum Abführen von in der Separationseinheit aufgetrennten Nukleinsäuren als biochemischem Material aus der Sequenzierungsvorrichtung auf.
  • Der hier vorgestellte Ansatz bietet die Vorteile, dass durch die Integration der Amplifikationsreaktion in die Sequenzierungsvorrichtung und/oder das Verfahren das Risiko einer DNA-Kontamination sinkt, da die Produkte der Amplifikationsreaktion vor der Sequenzierung nicht manuell pipettiert werden müssen. Die Trenneinheit aus mehrporigem Material bietet den Vorteil, dass sich aufgrund der vielen Eintrittsstellen des porösen Materials die Gefahr einer Verstopfung der Poren mit Bestandteile der Amplifikationsreaktion reduziert.
  • Unter einer Sequenzierungsvorrichtung zum Vervielfältigen und Trennen von Molekülketten kann eine integrierte Vorrichtung verstanden werden, in der sowohl eine Amplifikationsreaktion stattfinden kann, als auch das Trennen der zumindest einen Molekülketten aus der Amplifikationsreaktion. Die nach der Trennung entstandenen Sequenzen können mit einer herkömmlichen Auswerteeinrichtung ausgewertet werden. Die Amplifikationsreaktion kann beispielsweise eine Polymerase-Kettenreaktion (PCR) sein, insbesondere eine PCR, bei der der entstehende Produktstrang durch die Verwendung eines Kettenabbruchnukleotids (Didesoxyribonukleosid-Triphosphat) terminiert wird. Bei den zu vervielfältigenden und zu trennenden Molekülketten kann es sich beispielsweise um Desoxyribonukleinsäure-Molekülketten (DNA), oder um Ribonukleinsäure-Molekülketten (RNA) oder um Fragmente dieser Molekülketten handeln. Die Sequenzierungsvorrichtung kann also beispielsweise genutzt werden, um eine DNA-Probe zu sequenzieren, indem die DNA der Probe vervielfältigt wird, mittels Kettenabbruchnukleotide Kettenabbruchprodukte erzeugte werden, und in der Trenneinheit makromolekulare Bestandteile von den Kettenabbruchprodukten getrennt werden und/oder die Kettenabbruchprodukte, also die DNA-Sequenzen, aufgetrennt werden. Die Länge der DNA-Sequenzen kann dann gemessen werden.
  • Bei dem biochemischen Material kann es sich beispielsweise um DNA oder RNA oder um ein Fragment dieser beiden Säuren, oder um Polymerase oder um eine Reaktionskomponente, wie beispielsweise einen Primer für die Amplifikation einer bestimmten DNA-Sequenz oder um ein modifiziertes oder artifizielles DNA-Nukleotid und/oder ein Kettenabbruchnukleotid handeln.
  • Gemäß einer Ausführungsform kann es sich bei der Sequenzierungsvorrichtung beispielsweise um ein mikrofluidisches Chiplabor und/oder ein Ein-Chip-System handeln, oder um einen Baustein eines mikrofluidischen Chiplabors und/oder eines Ein-Chip-Systems. Ein solcher Sequenzierbaustein kann aufgrund seiner Größe als miniaturisierter stand-alone Sequenzierer oder auch als Baustein in einem Chiplabor (Lab-on-Chip) eingesetzt werden. Bei letzterem ist dann eine Sample-to-Sequenz Funktionalität realisierbar. Dies ist beispielsweise im Bereich der Onkologie interessant, da auf verschiedenen Onkogenen wie beispielsweise EGFR, KRAS,NRAS, BRAF verschiedenste Mutationen vorhanden sind, die mittels der Sequenzierungsvorrichtung beispielsweise in einem therapeutischen Monitoring-Setting am Point-of-Care auf einfache Weise abgefragt werden können.
  • Gemäß einer Ausführungsform kann die Trenneinheit zumindest teilweise poröses Silizium und/oder zumindest teilweise Polycarbonat - Filtermembrane, beispielsweise track-etched Membrane und/oder zumindest teilweise gewebeartige Polymermembrane und/oder zumindest teilweise nanoporöses Metalloxid, beispielsweise Aluminiumoxid umfassen. Zusätzlich oder alternativ kann die Trenneinheit zumindest teilweise ein Array aus Microposts, beispielsweise realisiert in Silizium, Siliziumoxid Siliziumnitrit oder Photolack, wobei die Abstände der Posts zwischen 1 und 1000 nm, bevorzugt zwischen 50 und 300 nm sind, umfassen. Weiterhin zusätzlich oder alternativ kann die Trenneinheit zumindest teilweise ein Acrylamidgel und/oder zumindest teilweise ein Agarosegel umfassen, hierfür ist die Trenneinheit dann als mikrofluidischer Kanal ausgeformt, in dem ein Gel eingebracht und auspolymerisiert wird. Durch den porösen Charakter wird die Verweilzeit des biochemischen Materials in der Trenneinheit erhöht, was die Unterscheidbarkeit von Kettenabbruchprodukten, beispielsweise DNA-Fragmenten unterschiedlicher Länge, verbessert. Die Poren können beispielsweise mittels Focused Ion Beam oder dem Transfer einer Graphen-Membran in eine Kavität hergestellt werden.
  • Die Trenneinheit kann in der Art einer Strecke ausgeformt sein, im Folgenden wird die Trenneinheit auch Trennstrecke genannt. Die Trennstrecke kann wie beschrieben vorzugsweise eine poröse Festphase, ein mikrotechnisch hergestelltes Säulenarray oder aber auch ein klassisches Sequenziergel sein. Die Verwendung eines mehrporigen porösen Materials für die Trenneinheit bietet verschiedene Vorteile gegenüber der Verwendung einer 2,5D-Pore. Bei einer 2,5D-Pore handelt es um eine gerade Pore in einer dünnen (Graphen-)Schicht:
  • Die Herstellung der Trenneinheit als Trennstrecke aus einem porösen Material kann vorteilhafterweise einfacher als die Herstellung beispielsweise einer Graphen-Schicht sein, die Poren mit Durchmessern von ca. 1 - 3 nm in einer kontrollierbaren Anzahl enthalten muss. Eine Trennstrecke, beispielsweise aus porösem Silizium, kann mit gängigen Verfahren, wie in Waferfabs vorhanden, hergestellt werden.
  • Die Trennstrecke für die Auftrennung von Molekülketten, beispielsweise DNA-Molekülen, kann sich durch die gewebeartige Ausformung des porösen Materials verlängern. Dadurch kann sich das Auflösungsvermögen für Nukleobasen verbessern, da die einzelnen Fragmente aufgrund der längeren Trennstrecke besser voneinander getrennt werden können. Wenn beispielsweise gemäß einer Ausführungsform für das Bewegen der Molekülketten durch die Trenneinheit elektrische Felder genutzt werden, können die elektrischen Felder vorteilhafterweise kleiner sein als bei einem Nanoporenansatz mit wenigen Poren, da es für die Molekülketten, beispielsweise die DNA-Fragmente, mehr Eintritts-/Einfädelstellen in die mehrporige Trennstrecke gibt. Dadurch reduziert sich die Migrationsgeschwindigkeit, was eine Verbesserung in punkto Auflösung (Abtastrate) bringt, was vorteilhafterweise eine Messung der Trennprodukte, beispielsweise der DNA-Sequenzen, erleichtert.
  • Je nach Ausführungsform können sehr viele DNA-Fragmente gleichzeitig durch die Trennstrecke migrieren, weil das an eine Amplifikationskavität angrenzende poröse Material mehr Eintrittsstellen als einzelne 2,5D-Poren aufweist, was in einer stärkeren Änderung in einem elektrischen Messsignal resultiert oder beispielsweise bei eingefärbter DNA gut detektierbare optische Signale liefert.
  • Gemäß einer Ausführungsform kann die Trenneinheit zumindest zwei mehrporige Schichten mit unterschiedlicher Porosität aufweisen. Unter der Definition einer Porosität kann eine Eigenschaft verstanden werden, die eine Anzahl von Poren pro Volumeneinheit beschreibt. Vorteilhafterweise ist es somit möglich, in einer ersten Schicht Nukleinsäuren von weiteren makromolekularen Bestandteilen, beispielsweise Polymerase, zu trennen und/oder Nukleinsäuren aufzutrennen. Durch ein Hintereinanderschalten von Schichten mit unterschiedlicher Porosität in der Trenneinheit kann man vorteilhafterweise beispielsweise verschiedene Trennschritte und/oder Trennvorgänge durchführen. Man kann beispielsweise erreichen, dass in einer ersten Schicht, mit einem Porendurchmesser D1, makromolekulare Bestandteile (z.B. Polymerase) abgetrennt werden können, wohingegen die Nukleinsäuren (DNA-Fragmente) in einer zweiten Schicht, mit einem Porendurchmesser D2, aufgetrennt werden können, wobei D1 größer D2 gilt. Mit anderen Worten ausgedrückt kann vorteilhafterweise mit der gleichen Prozesstechnik eine Aufreinigung des Produkts der Amplifikationsreaktion, beispielsweise des PCR-Produktes, vor der eigentlichen Sequenzierung realisiert werden. Der Hintergrund dessen ist darin zu sehen, dass bei der Sanger- Sequenzierungen vor der Kapillar-Elektrophorese das PCR-Produkt aufgereinigt wird. Diese Funktion kann eine Trenneinheit mit mehreren mehrporigen Schichten mit unterschiedlicher Porosität übernehmen.
  • Die Trenneinheit kann gemäß einer Ausführungsform eine Breite aufweisen, die im Wesentlichen der Breite der Amplifikationskavität entspricht. Beispielsweise kann die Breite der Amplifikationskavität der Breite der Trenneinheit exakt entsprechen, oder es kann eine geringfügige Abweichung der Breite der Trenneinheit vorliegen, beispielsweise im Bereich von 5 bis 10% der Breite der Trenneinheit. Dies ermöglicht vorteilhafterweise eine besonders einfache Herstellung der Separationseinheit, in dem die Amplifikationskavität und die Trenneinheit in einem Separationskanal angeordnet werden können, da der Separationseinheit eine Öffnung durchgängiger Breite für den zumindest einen Separationskanal aufweisen kann. Die Breite der Trenneinheit kann zwischen 0,1 und 100 % der Breite der Amplifikationskavität entsprechen, bevorzugterweise zwischen 50 und 100 %.
  • Die Amplifikationskavität kann mit der Trenneinheit gemäß einer Ausführungsform durch eine Wand mit einer Engstelle verbindbar oder verbunden sein. Dies hat den Vorteil, dass die Menge des während des Trennvorgangs in der Trenneinheit vorhandenen biochemischen Materials, beispielsweise DNA, limitiert wird, was vorteilhafterweise eine genauere Messung ermöglicht, da sich nur eine begrenzte Menge biochemischen Materials, besonders der Kettenabbruchprodukte, gleichzeitig in der Trenneinheit befinden. Mischsignale durch zu viele und/oder sich überlappende Kettenabbruchprodukte unterschiedlicher Länge in der Trenneinheit können dadurch vermieden werden.
  • Gemäß einer Ausführungsform können die Zuführöffnung und/oder die Abführöffnung als Verengung des Separationskanals ausgeformt sein. Die Zufuhröffnung kann eine Verengung in der Amplifikationskavität sein und/oder die Abführöffnung kann eine Verengung der Trenneinheit darstellen. Diese integrierte Anordnung der Zuführöffnung und der Abführöffnung an den Separationskanal senkt vorteilhafterweise das Risiko einer Kontamination, da es so möglich ist, biochemisches Material direkt in die Sequenzierungsvorrichtung einzuleiten und aus ihr abzuführen.
  • Die Sequenzierungsvorrichtung kann gemäß einer Ausführungsform außerdem eine Feldausbildungseinheit zur Erzeugung eines elektrischen Feldes über die Trenneinheit aufweisen, um eine Molekülkette elektrophoretisch durch die Trennstrecke zu befördern. Dies ermöglich vorteilhafterweise eine elektrophoretische Trennung der Molekülketten in der porösen Trenneinheit. Zusätzlich kann eine Messung der Wanderungsgeschwindingkeit der Kettenabbruchprodukte, beispielsweise DNA-Sequenzen der terminierten PCR-Produktstränge, für die Bestimmung der Länge der Kettenabbruchprodukte genutzt werden.
  • Die Vorrichtung mit der „Feldausbildungseinheit zur Erzeugung eines elektrischen Feldes“ kann zudem für die Ausbildung/Anwendung eines dielektrophoretischen Separationsprinzipes verwendet werden, um beispielsweise Bestandteile der PCR-Reaktion dielektrophoretisch voneinander zu trennen. Damit können bspw. Polymerase von den Abbruchprodukten getrennt werden, um das Risiko der Verstopfung von Poren durch makromolekulare Bestandteile wie bspw. Polymerase zu minimieren.
  • Gemäß einer Ausführungsform kann in der Amplifikationskavität der Sequenzierungsvorrichtung zumindest eine Reaktionskomponente und zumindest ein artifizielles DNA-Nukleotid und/oder ein Kettenabbruchsnukleotid vorgehalten sein. Zusätzlich oder alternativ kann die Amplifikationskavität dazu ausgebildet sein, eine Flüssigkeit für eine Amplifikationsreaktion aufzunehmen.
  • Bei der vorgehaltenen Reaktionskomponente kann es sich beispielsweise um einen Primer, beispielsweise in Form einer Nukleotidabfolge, für die Amplifikation einer bestimmten Molekülkette, beispielsweise einer bestimmten DNA-Sequenz, handeln. Bei dem artifiziellen DNA-Nukleotid kann es sich beispielsweise um ein modifiziertes Nukleotid handeln, bei dem Kettenabbruchsnukleotid kann es sich beispielsweise um ein sogenanntes Stop-Nukleotid, ein ddNTP (Didesoxyribonukleosid-Triphosphat) mit einer der Nukleobasen Thymin, Guanin, Adenin oder Cytosin handeln. Die Kettenabbruchsnukleotide können beispielsweise auch zusätzlich mit Fluorophoren radioaktiv oder redoxaktiv gelabelt sein.
  • Die Separationseinheit kann gemäß einer Ausführungsform zumindest zwei Amplifikationskavitäten, insbesondere vier Amplifikationskavitäten aufweisen, die dazu ausgebildet sind, je zumindest eine gleiche Reaktionskomponente und je zumindest ein anderes, artifizielles DNA-Nukleotid und/oder zumindest ein je anderes Kettenabbruchsnukleotid zu enthalten und/oder dazu ausgebildet sind, eine Flüssigkeit für eine Amplifikationsreaktion aufzunehmen. Bei dem je anderen Kettenabbruchsnukleotid kann es sich beispielsweise um ein zuvor beschriebenes Stop-Nukleotid mit einer je anderen Nukleobasen, nämlich Thymin, Guanin, Adenin oder Cytosin handeln, wodurch jede der vier Amplifikationskavitäten nach der Reaktion ein Kettenabbruchsnukleotid terminiert mit einer je anderen Nukleobase enthalten kann. Bei der Flüssigkeit für eine Amplifikationsreaktion kann es sich beispielsweise einen handelsüblichen Amplifikationsmix handeln. Der Amplifikationsmix kann beispielsweise auch einen interkalierenden Farbstoff enthalten, um das entstehende Amplifikationsprodukt einzufärben. Zusätzlich oder alternativ kann die Flüssigkeit für die Amplifikationsreaktion zu sequenzierende Molekülketten, insbesondere Proben-DNA enthalten.
  • Von Vorteil ist ferner eine Ausführungsform des hier vorgestellten Ansatzes, bei dem die Sequenzierungsvorrichtung eine Längenbestimmungseinheit zur Bestimmung einer Länge von aufgetrennten Nukleinsäuren als biochemischem Material aufweist. Auf diese Weise kann sehr schnell und effizient das biochemische Material auf das Vorliegen von bestimmten Eigenschaften analysiert werden.
  • Weiterhin wird ein Verfahren zum Trennen von aus einer Amplifikationsreaktion gewonnen Molekülketten, unter Verwendung einer Ausführungsform der vorgestellten Sequenzierungsvorrichtung vorgestellt, wobei das Verfahren zumindest die folgenden Schritte aufweisen kann:
    • Einleiten einer Flüssigkeit für eine Amplifikationsreaktion in die zumindest eine Amplifikationskavität, um eine Amplifikationsreaktion vorzubereiten;
    • Leiten einer Abdichtungsflüssigkeit über die Zuführöffnung und die Abführöffnung, um die Zuführöffnung und die Abführöffnung zu versiegeln;
    • Durchführen einer Amplifikationsreaktion, um zumindest eine Molekülkette zu erzeugen und Terminieren von gewonnen Molekülketten, um Kettenabbruchprodukte zu erzeugen; und
    • Anlegen einer Spannung zwischen dem Zuführbereich und dem Abführbereich, um die zumindest eine Trenneinheit zu befüllen, und Trennen der zumindest einen erzeugten Molekülkette in der Trenneinheit, um Kettenabbruchprodukte zu gewinnen;
    • Im Schritt des Einleitens kann als Flüssigkeit für die Amplifikationsreaktion eine zuvor beschriebene solche Flüssigkeit mit zumindest einer zu sequenzierenden Molekülkette, beispielsweise Proben-DNA, für das Erzeugen von Kettenabbruchprodukten aus der Amplifikationsreaktion eingeleitet werden.
  • Im Schritt des Leitens einer Abdichtungsflüssigkeit über die Zuführöffnung und die Abführöffnung kann als Abdichtungsflüssigkeit beispielsweise ein Öl, insbesondere ein Mineralöl, ein Paraffinöl, fluoriertes Öl oder Silikonöl verwendet werden um die Zuführöffnung und die Abführöffnung zu versiegeln, was vorteilhafterweise das Risiko einer Kontamination senkt.
  • Im Schritt des Durchführens einer Amplifikationsreaktion kann beispielsweise eine Polymerase-Kettenreaktion (PCR) durchgeführt werden die beispielsweise bis zu 80 Zyklen umfassen kann, bevorzugt zwischen 5 und 40 Zyklen. Bei der Amplifikationsreaktion können Molekülketten erzeugt werden. Die erzeugten Molekülketten können beispielsweise durch modifizierte Nukleotide oder Kettenabbruchsnukleotide terminiert werden, sodass Kettenabbruchprodukte unterschiedlicher Länge entstehen können, je nachdem, wann ein modifiziertes Nukleotid oder ein Kettenabbruchsnukleotid eingebaut wird. Bei diesen Kettenabbruchsprodukten kann es sich beispielsweise Fragmente der zu sequenzierenden DNA, also um DNA-Sequenzen handeln.
  • Im Schritt des Anlegens einer Spannung zwischen dem Zuführbereich und dem Abführbereich, um die zumindest eine Trenneinheit zu befüllen kann beispielsweise unter Verwendung einer Feldausbildungseinheit ein elektrisches Feld über die Trenneinheit angelegt werden, um die zumindest eine Trenneinheit zu befüllen. Durch die elektrophoretische Migration der Produkte der Amplifikationsreaktion durch die Trenneinheit können die Produkte der Amplifikationsreaktion getrennt werden, wodurch die Kettenabbruchprodukte gewonnen werden können. Durch diese Verbindung der Amplifikationsreaktion mit dem Trennen sinkt vorteilhafterweise das Risiko einer DNA-Kontamination, da die Produkte der Amplifikationsreaktion vor der Sequenzierung nicht manuell pipettiert werden müssen. Zusätzlich oder alternativ kann für das Befüllen der Trenneinheit, also für die fluidische Aktuierung, auch eine Druckdifferenz in der Separationseinheit angelegt werden. Zusätzlich oder alternativ können außerdem die Kapillarkräfte ausgenutzt werden, beispielsweise für eine Benetzung der Trenneinheit.
  • Weiterhin wird ein Verfahren zum Detektieren von Kettenabbruchprodukten vorgestellt, wobei das Verfahren zumindest die Schritte des zuvor vorgestellten Verfahrens und einen Schritt zum Messen der Länge der Kettenabbruchprodukte aufweist, um die der Sequenz der Kettenabbruchprodukte zu detektieren. Der Schritt des Messens der Länge der Kettenabbruchprodukte, um die Sequenz der Kettenabbruchprodukte zu detektieren, kann beispielsweise in Form eines optischen Auslesens oder einer Strommessung erfolgen. Bei einem großflächigen Kontakt, beispielsweise bei drei oder mehr Poren an der Eintrittsstelle von der Amplifikationskavität in die poröse Trenneinheit, können aufgetrennte und angefärbte Produkt-Fragmente der Amplifikationsreaktion bevorzugt optisch ausgelesen werden. Alternativ kann beispielsweise die Durchlaufzeit der Produkt-Fragmente der Amplifikationsreaktion durch die Trenneinheit über eine Strommessung bei bekannter (vorkalibrierter) Migrationsgeschwindigkeit gemessen werden. Wird der Kontaktbereich zwischen der Trenneinheit und der Amplifikationskavität verkleinert, beispielsweise bei weniger als drei Poren an der Eintrittsstelle von der Amplifikationskavität in die poröse Trenneinheit, kann bevorzugt die Dauer der Veränderung des Stromflusses bei Durchlauf einzelner Produkt-Fragmente gemessen werden.
  • Die vorgestellten Verfahren und die vorgestellte Vorrichtung können beispielsweise die etablierte Sequenziermethode von Frederick Sanger verwenden und mittels Mikrosystem-Technologie (MEMS-Technologie) und Silizium integrieren und miniaturisieren. Eine solche Vorrichtung weist mindestens einen Amplifikationsbereich in Form einer Amplifikationskavität auf, der an eine miniaturisierte Trenneinheit, beispielsweise in Form einer Trennstrecke, angeschlossen ist. In dieser Trennstrecke können die in dem Amplifikationsbereich generierten Amplifikationsprodukte, die gemäß der Sanger Methode unterschiedlich lang sind, aufgetrennt werden.
  • Weiterhin wird ein Verfahren zum Herstellen einer Ausführungsform der vorgestellten Sequenzierungsvorrichtung vorgestellt, wobei das Verfahren zumindest die folgenden Schritte aufweist:
    • Ausbilden einer Trenneinheit aus einem mehrporigem Material; und
    • Verbinden der Trenneinheit mit einer Amplifikationskavität in einer Separationseinheit, um die Sequenzierungsvorrichtung herzustellen.
  • Im Schritt des Ausbildens der Trenneinheit aus mehrporigem Material kann ein Beschichtungsverfahren, beispielsweise eine chemische Gasphasenabscheidung (LPCVD) angewendet werden. Zusätzlich oder alternativ kann die Trenneinheit beispielsweise mittels Bedampfen, Sputtern oder Silanisierung hydrophilisiert oder hydrophobisiert werden. Die Trenneinheit kann gemäß einer Ausführungsform beispielsweise auch mit einem gängigen Verfahren aus porösem Silizium hergestellt werden, wie bei Waferfabs. Die Herstellung der Trennstrecke aus einem porösen Material ist vorteilhafterweise einfach umsetzbar.
  • Im Schritt des Verbindens der Trenneinheit mit einer Amplifikationskavität in einer Separationseinheit, um die Sequenzierungsvorrichtung herzustellen, kann die mehrporige Trenneinheit mikrofluidisch mit einer Amplifikationskavität in einem Separationskanal verbunden werden. Die direkte Verbindung der Trenneinheit mit einer Amplifikationskavität ermöglicht vorteilhafterweise eine besonders kompakte Bauweise der Sequenzierungsvorrichtung.
  • Diese Verfahren können beispielsweise in Software oder Hardware oder in einer Mischform aus Software und Hardware beispielsweise in einem Steuergerät implementiert sein.
  • Der hier vorgestellte Ansatz schafft ferner eine Vorrichtung, die ausgebildet ist, um die Schritte einer Variante eines hier vorgestellten Verfahrens in entsprechenden Einrichtungen durchzuführen, anzusteuern bzw. umzusetzen. Auch durch diese Ausführungsvariante der Erfindung in Form einer Vorrichtung kann die der Erfindung zugrunde liegende Aufgabe schnell und effizient gelöst werden. Die Vorrichtung kann beispielsweise eine Ausbildeinheit zum Ausbilden der Trenneinheit aus mehrporigem Material und eine Verbindeinheit zum Verbinden der Trenneinheit mit einer Amplifikationskavität in einer Separationseinheit aufweisen.
  • Unter einer Vorrichtung kann vorliegend ein elektrisches Gerät verstanden werden, das Sensorsignale verarbeitet und in Abhängigkeit davon Steuer- und/oder Datensignale ausgibt. Die Vorrichtung kann eine Schnittstelle aufweisen, die hard- und/oder softwaremäßig ausgebildet sein kann. Bei einer hardwaremäßigen Ausbildung können die Schnittstellen beispielsweise Teil eines sogenannten System-ASICs sein, der verschiedenste Funktionen der Vorrichtung beinhaltet. Es ist jedoch auch möglich, dass die Schnittstellen eigene, integrierte Schaltkreise sind oder zumindest teilweise aus diskreten Bauelementen bestehen. Bei einer softwaremäßigen Ausbildung können die Schnittstellen Softwaremodule sein, die beispielsweise auf einem Mikrocontroller neben anderen Softwaremodulen vorhanden sind.
  • Der hier vorgestellte Ansatz schafft ferner ein Steuergerät, das ausgebildet ist, um die Schritte einer Variante eines hier vorgestellten Verfahrens in entsprechenden Einrichtungen durchzuführen, anzusteuern bzw. umzusetzen. Auch durch diese Ausführungsvariante der Erfindung in Form eines Steuergeräts kann die der Erfindung zugrunde liegende Aufgabe schnell und effizient gelöst werden.
  • Von Vorteil ist auch ein Computerprogrammprodukt oder Computerprogramm mit Programmcode, der auf einem maschinenlesbaren Träger oder Speichermedium wie einem Halbleiterspeicher, einem Festplattenspeicher oder einem optischen Speicher gespeichert sein kann und zur Durchführung, Umsetzung und/oder Ansteuerung der Schritte des Verfahrens nach einer der vorstehend beschriebenen Ausführungsformen verwendet wird, insbesondere wenn das Programmprodukt oder Programm auf einem Computer oder einer Vorrichtung ausgeführt wird.
  • Ausführungsbeispiele des hier vorgestellten Ansatzes sind in den Zeichnungen dargestellt und in der nachfolgenden Beschreibung näher erläutert. Es zeigt:
    • 1A bis 1C eine schematische Darstellung einer Sequenzierungsvorrichtung gemäß verschiedener Ausführungsbeispiele;
    • 2 eine schematische Darstellung einer Sequenzierungsvorrichtung gemäß einem weiteren Ausführungsbeispiel;
    • 3 eine schematische Darstellung einer Sequenzierungsvorrichtung gemäß einem weiteren Ausführungsbeispiel;
    • 4 ein Ablaufdiagramm eines Verfahrens zum Vervielfältigen und Trennen von Molekülketten gemäß einem Ausführungsbeispiel;
    • 5 ein Ablaufdiagramm eines Verfahrens zum Herstellen einer Sequenzierungsvorrichtung gemäß einem Ausführungsbeispiel.
    • 6 eine schematische Darstellung einer Vorrichtung zum Ausführen oder Ansteuern der Schritte eines Verfahrens zum Herstellen einer Sequenzierungsvorrichtung gemäß einem Ausführungsbeispiel.
    • 7 eine schematische Darstellung einer Vorrichtung zum Ausführen oder Ansteuern der Schritte eines Verfahrens zum Vervielfältigen und Trennen von Molekülketten gemäß einem Ausführungsbeispiel.
  • In der nachfolgenden Beschreibung günstiger Ausführungsbeispiele der vorliegenden Erfindung werden für die in den verschiedenen Figuren dargestellten und ähnlich wirkenden Elemente gleiche oder ähnliche Bezugszeichen verwendet, wobei auf eine wiederholte Beschreibung dieser Elemente verzichtet wird.
  • 1A zeigt eine schematische Darstellung eines Querschnitts einer mikrofluidischen Sequenzierungsvorrichtung 100 gemäß einem Ausführungsbeispiel. Die Sequenzierungsvorrichtung 100 ist dazu ausgebildet, biochemisches Material aufzunehmen und Molekülketten zu vervielfältigen und zu trennen. Die Sequenzierungsvorrichtung 100 weist zumindest eine Separationseinheit 101 auf. Die Separationseinheit 101 weist zumindest einen Separationskanal 102 auf. Beispielhaft sind in diesem Ausführungsbeispiel zwei solcher Separationskanäle 102 gezeigt. Die Separationseinheit 101 weist zumindest eine Zuführöffnung 105, zumindest einen mikrofluidischen Separationskanal 102 mit einer Amplifikationskavität 115 und einer Trenneinheit 120 sowie eine Abführöffnung 125 auf. Die Zuführöffnung 105 ist dazu ausgebildet, biochemisches Material in die Sequenzierungsvorrichtung 100 zuzuführen. Der zumindest eine Separationskanal 102 ist dazu ausgebildet, die Amplifikationskavität 115 mikrofluidisch mit der Trenneinheit 120 zu verbinden. Die Amplifikationskavität 115 ist dazu ausgebildet Molekülketten zu vervielfältigen. Die Trenneinheit 120 besteht aus mehrporigem Material und ist dazu ausgebildet, Nukleinsäuren von weiteren makromolekularen Bestandteilen zu trennen und/oder Nukleinsäuren aufzutrennen. Die ab Abführöffnung 125 ist dazu ausgebildet biochemisches Material aus der Sequenzierungsvorrichtung 100 abzuführen.
  • Gemäß einem Ausführungsbeispiel kann über die Zuführöffnung 105 biochemisches Material, insbesondere eine Flüssigkeit für eine Amplifikationsreaktion in die Amplifikationskavität 115 eingebracht werden. An die Amplifikationskavität 115 schließt sich die Trenneinheit 120 an, die in die Abführöffnung 125 mündet. Zudem ist die Separationseinheit 101 gemäß einem Ausführungsbeispiel ausgeformt, um an der Zuführöffnung 105 und an der Abführöffnung 125 über eine Feldausbildungseinheit 130 mit einer Spannungsquelle 135 elektrisch kontaktierbar zu sein, um PCR-Produkte elektrophoretisch durch die Trennstrecke zu befördern. Die Feldausbildungseinheit 130 kann hierbei sowohl Gleich- als auch alternativ Wechselspannung einsetzen.
  • Die Trenneinheit 120 umfasst gemäß einem Ausführungsbeispiel zumindest teilweise poröses Silizium und/oder zumindest teilweise Polycarbonat - Filtermembrane, insbesondere track-etched Membrane. Zusätzlich oder alternativ umfasst die Trenneinheit 120 zumindest teilweise gewebeartige Polymermembrane und/oder zumindest teilweise nanoporöses Metalloxid und/oder zumindest teilweise ein Array aus Microposts und/oder zumindest teilweise ein Acrylamidgel und/oder zumindest teilweise ein Agarosegel. Durch den porösen Charakter der Trenneinheit 120 wird die Verweilzeit in der Trenneinheit 120 erhöht, was die Unterscheidbarkeit von DNA-Fragmenten unterschiedlicher Länge verbessert.
  • Gemäß einem Ausführungsbeispiel weist die Trenneinheit 120 eine Breite auf, die im Wesentlichen der Breite der Amplifikationskavität 115 entspricht.
  • Die Zuführöffnung 105 ist gemäß einem Ausführungsbeispiel am Eingang der Amplifikationskavität 115 angeordnet, in der Flussrichtung der Zuführung von biochemischem Material, insbesondere der Flüssigkeit für die Amplifikationsreaktion. Die Abführöffnung 125 ist gemäß diesem Ausführungsbeispiel im Wesentlichen in der Breite der Trenneinheit 120 ausgeformt, an dem Ausgang der Trenneinheit 120, aus dem das biochemische Material, insbesondere die getrennten Kettenabbruchprodukte, abgeführt wird.
  • 1B zeigt eine schematische Darstellung eines Querschnitts einer mikrofluidischen Sequenzierungsvorrichtung 100 gemäß einem weiteren Ausführungsbeispiel. Dieses Ausführungsbeispiel unterscheidet sich vom vorhergehenden nur in der Ausformung der Abführöffnung. In diesem Ausführungsbeispiel ist die Abführöffnung 125b als eine Verengung am Ausgang der Trenneinheit 120 ausgeformt.
  • 1C zeigt eine schematische Darstellung eines Querschnitts einer mikrofluidischen Sequenzierungsvorrichtung 100 gemäß einem weiteren Ausführungsbeispiel. Dieses Ausführungsbeispiel unterscheidet sich von den beiden vorhergehenden nur durch eine Engstelle 140 zwischen der Amplifikationskavität 115 und der Trenneinheit 120. Die Abführöffnung 125a entspricht der in 1A dargestellten Ausformung. Gemäß einem Ausführungsbeispiel ist die Amplifikationskavität 115 mit der Trenneinheit 120 durch eine Wand mit einer Engstelle 140 verbindbar oder verbunden.
  • Die Menge des während des Trennvorganges in der Trenneinheit 120 vorhandenen biochemischen Materials, insbesondere einer DNA-Menge, wird so limitiert, um bei einer Messung Mischsignale (wenn sich zu viele DNA-Fragmente unterschiedlicher Länge in dem Trennbereich befinden und/oder überlappen) zu minimieren.
  • 2 zeigt eine schematische Darstellung einer Sequenzierungsvorrichtung 100 gemäß einem weiteren Ausführungsbeispiel. Dieses Ausführungsbeispiel unterscheidet sich von den vorhergehenden nur durch die Ausformung der Trenneinheit 120. Die Trenneinheit 120 weist gemäß diesem Ausführungsbeispiel zumindest zwei mehrporige Schichten 210, 220 mit unterschiedlicher Porosität auf. Beispielhaft sind in dieser Darstellung eine erste mehrporige Schicht 210 und eine zweite mehrporige Schicht 220 gezeigt, die eine unterschiedliche Porosität aufweisen. Das Hintereinanderschalten von Schichten 210, 220 mit unterschiedlicher Porosität ermöglicht insbesondere verschiedene Trennschritte, beispielsweise dass in einer ersten Schicht 210 makromolekulare Bestandteile abgetrennt werden, wohingegen die Kettenabbruchprodukte, insbesondere Nukleinsäuren (DNA-Fragmente) in einer zweiten Schicht 220 aufgetrennt werden.
  • 3 zeigt eine schematische Darstellung einer Sequenzierungsvorrichtung 100 gemäß einem weiteren Ausführungsbeispiel. Dieses Ausführungsbeispiel unterscheidet sich von den vorhergehenden nur durch den Inhalt der Amplifikationskavität 115 und durch die Anzahl der dargestellten Separationskanäle in der Separationskanalseinrichtung 101. Zudem besteht die Separationskanalseinrichtung 101 hier beispielhaft aus zwei Abschnitten, die jeweils vier Separationskanäle 102 mit der Amplifikationskavität 115 und der Trenneinheit 120 aufweisen, wobei die Abschnitte der Separationskanalseinrichtung 101 hier gegenbildlich (gespiegelt) gezeigt sind.
  • Gemäß diesem Ausführungsbeispiel ist in jeder Amplifikationskavität 115 zumindest eine Reaktionskomponente und zumindest ein artifizielles DNA-Nukleotid und/oder ein Kettenabbruchsnukleotid der Basen A, G, T, C vorgehalten. Die Amplifikationskavität 115 ist zusätzlich oder alternativ dazu ausgebildet, eine Flüssigkeit für eine Amplifikationsreaktion aufzunehmen.
  • Gemäß einem Ausführungsbeispiel weist die Separationseinheit 101 zumindest zwei Amplifikationskavitäten 115, insbesondere vier Amplifikationskavitäten 115, auf. Beispielhaft sind hier je Abschnitt der Separationseinheit 101 je vier Amplifikationskavitäten 115 gezeigt. Die Amplifikationskavitäten 115 sind dazu ausgebildet, je zumindest eine gleiche Reaktionskomponente und je zumindest ein anderes, artifizielles DNA-Nukleotid und/oder zumindest ein je anderes Kettenabbruchsnukleotid A, G, T C zu enthalten. Die Amplifikationskavität 115 ist zusätzlich oder alternativ dazu ausgebildet, eine Flüssigkeit für eine Amplifikationsreaktion aufzunehmen.
  • Gemäß dem hier gezeigten Ausführungsbeispiel können in der Sequenzierungsvorrichtung 100 zwei verschiedene DNA Sequenzen sequenziert werden können, insbesondere in jedem Abschnitt der Separationseinheit 101 eine. Dazu weisen die jeweils vier Amplifikationskavitäten 115 beider Abschnitte der Separationseinheit 101 für die Generierung verschieden terminierter Kettenabbruchprodukte 310 (insbesondere terminiert mit A = Adenin, G = Guanin, T = Thymin, C = Cytosin) auf. An die Amplifikationskavitäten 115 schließt sich je eine Trenneinheit 120 an. Mittels einer Feldausbildungseinrichtung 130 und einer Spannungsquelle 135 kann ein elektrisches Feld über die Trenneinheiten 120 generiert werden. In einem Ablauf wird der Flüssigkeit für die Amplifikationsreaktion vor oder nach der Reaktion ein Farbstoff zugeführt, der eine fluorometrische Detektion von in der Amplifikationsreaktion gewonnenen und durch die Trenneinheit 120 aufgetrennten Kettenabbruchprodukten 310 ermöglicht. Somit lassen sich in ihrer Länge verschiedene Kettenabbruchprodukte 310 in einer Trenneinheit 120 unterscheiden.
  • 4 zeigt ein Ablaufdiagramm eines Verfahrens 400 zum Trennen von aus einer Amplifikationsreaktion gewonnen Molekülketten gemäß einem Ausführungsbeispiel. Das Verfahren 400 ist ausführbar unter Verwendung einer bereits beschriebenen mikrofluidischen Sequenzierungsvorrichtung 100 gemäß einem der Ausführungsbeispiele, wobei das Verfahren 400 zumindest einen Schritt 410 des Einleitens, einen Schritt 420 des Leitens, einen Schritt 430 des Durchführens und einen Schritt 440 des Anlegens umfasst.
  • Im Schritt 410 des Einleitens wird einer Flüssigkeit für eine Amplifikationsreaktion in die zumindest eine Amplifikationskavität eingeleitet, um eine Amplifikationsreaktion vorzubereiten. Beispielsweise wird zum Einleiten eine Druckdifferenz zwischen dem Eingang der Amplifikationskavität und dem Ausgang der Trenneinheit angelegt, um die Flüssigkeit für eine Amplifikationsreaktion in den Separationskanal einzuführen. Ebenso können für die fluidische Aktuierung, also für das Einleiten der Flüssigkeit für eine Amplifikationsreaktion, Kapillarkräfte ausgenutzt werden.
  • Im Schritt 420 des Leitens wird eine Abdichtungsflüssigkeit über die Zuführöffnung und die Abführöffnung geleitet, um die Zuführöffnung und die Abführöffnung zu versiegeln. Dabei werden die Abführöffnung und die Zuführöffnung mit einer Abdichtungsflüssigkeit durchgespült.
  • Im Schritt 430 des Durchführens werden die Bedingungen für eine Amplifikationsreaktion geschaffen und es wird eine Amplifikationsreaktion durchgeführt, um zumindest eine Molekülkette zu erzeugen. Die in der Amplifikationsreaktion gewonnen Molekülketten werden dabei terminiert, um Kettenabbruchprodukte zu erzeugen. Das Terminieren erfolgt durch ein artifizielles DNA-Nukleotid und/oder ein Kettenabbruchsnukleotid.
  • Im Schritt 440 des Anlegens wird eine Spannung zwischen dem Zuführbereich und dem Abführbereich angelegt, um die zumindest eine Trenneinheit zu befüllen. Zudem wird die zumindest eine erzeugte Molekülkette in der Trenneinheit aufgetrennt, um Kettenabbruchprodukte zu gewinnen. Zusätzlich kann die Trenneinheit vor dem Anlegen der Spannung an ihren Enden mit einem Laufpuffer beaufschlagt werden. Dadurch befüllt sich die Trenneinheit kapillar, was bei Anliegen eines elektrischen Feldes das Migrationsverhalten der Kettenabbruchprodukte verbessert.
  • Außerdem ist in 4 ein Ablaufdiagramm eines Verfahrens 450 zum Detektieren von Kettenabbruchprodukten gezeigt. Das Verfahren 450 umfasst zumindest die Schritte des Verfahrens 400, nämlich einen Schritt 410 des Einleitens, einen Schritt 420 des Leitens, einen Schritt 430 des Durchführens und einen Schritt 440 des Anlegens und zusätzlich einen Schritt 460 des Messens, der zeitgleich mit dem Schritt 440 des Anlegens erfolgen kann.
  • Im Schritt 460 des Messens wird die Länge der Kettenabbruchprodukte gemessen, um die Sequenz der Kettenabbruchprodukte zu detektieren. Beispielsweise wird gleichzeitig zum Schritt 440 des Anlegens der Strom an der Separationseinheit gemessen, der von der Menge der Kettenabbruchprodukte abhängt, und/oder es wird die Durchlaufgeschwindigkeit einzelner Fragmente biochemischen Materials gemessen. Zusätzlich oder alternativ werden die aufgetrennten und vorher eingefärbten Kettenabbruchprodukte optisch ausgelesen.
  • 5 zeigt ein Ablaufdiagramm eines Verfahrens 500 zum Herstellen einer Sequenzierungsvorrichtung gemäß einem vorgestellten Ausführungsbeispiel. Das Verfahren 500 weist zumindest einen Schritt 510 des Ausbildens und einen Schritt 520 des Verbindens auf.
  • Im Schritt 510 des Ausbildens wird eine Trenneinheit aus einem mehrporigen Material ausgebildet. Das Ausbilden der mehrporigen Trenneinheit kann mittels eines Beschichtungsverfahrens, insbesondere einer chemischen Gasphasenabscheidung (LPCVD), erfolgen. Zusätzlich oder alternativ kann die Trenneinheit auch mit einem gängigen Verfahren aus porösem Silizium hergestellt werden, wie bei Waferfabs, und/oder mittels Bedampfen, Sputtern oder Silanisierung hydrophilisiert oder hydrophobisiert werden.
  • Im Schritt des Verbindens wird die Trenneinheit mit einer Amplifikationskavität in einer Separationseinheit verbunden, um die Sequenzierungsvorrichtung herzustellen.
  • 6 zeigt eine schematische Darstellung einer Vorrichtung 600 zum Ausführen und/oder Ansteuern der Schritte eines Verfahrens zum Herstellen einer Sequenzierungsvorrichtung gemäß einem Ausführungsbeispiel.
  • Die Vorrichtung 600 ist eingerichtet, um die Schritte des Verfahrens in entsprechenden Einheiten auszuführen und/oder anzusteuern. Die Vorrichtung umfasst zumindest eine Ausbildeinheit 610 und eine Verbindeinheit 620. Die Ausbildeinheit ist dazu ausgebildet, den Schritt des Ausbildens einer Trenneinheit aus mehrporigem Material anzusteuern und/oder auszuführen und die Verbindeinheit 620 ist dazu ausgebildet, den Schritt des Verbindens der Trenneinheit mit einer Amplifikationskavität in einer Separationseinheit auszuführen und/oder anzusteuern.
  • 7 zeigt eine schematische Darstellung einer Vorrichtung 700 zum Ausführen und/oder Ansteuern der Schritte eines Verfahrens 400 zum Vervielfältigen und Trennen von Molekülketten und/oder eines Verfahrens 450 zum Detektieren von Kettenabbruchprodukten gemäß einem Ausführungsbeispiel. Die Vorrichtung 700 ist eingerichtet, um die Schritte des Verfahrens in entsprechenden Einheiten auszuführen und/oder anzusteuern. Die Vorrichtung umfasst zumindest eine Einleiteinheit 710, eine Leiteinheit 720, eine Durchführeinheit 730 und eine Anlegeeinheit 740. Die Einleiteinheit ist ausgebildet, um eine Flüssigkeit für eine Amplifikationsreaktion in die zumindest eine Amplifikationskavität einzuleiten, um eine Amplifikationsreaktion vorzubereiten. Die Leiteinheit ist ausgebildet, um eine Abdichtungsflüssigkeit über die Zuführöffnung und die Abführöffnung zu leiten, um die Zuführöffnung und die Abführöffnung zu versiegeln. Die Durchführeinheit ist ausgebildet, um eine Amplifikationsreaktion durchzuführen, um zumindest eine Molekülkette zu erzeugen und die zumindest eine gewonnene Molekülketten zu terminieren, um Kettenabbruchprodukte zu erzeugen. Die Anlegeeinheit ist ausgebildet, um eine Spannung zwischen der Zuführöffnung und der Abführöffnung anzulegen, um die zumindest eine Trenneinheit zu befüllen, und um die zumindest eine erzeugte Molekülkette in der Trenneinheit zu trennen, um Kettenabbruchprodukte zu gewinnen.
  • Zusätzlich kann die Vorrichtung 700 eine Messeinheit umfassen, die ausgebildet ist, um die Länge der Kettenabbruchprodukte messen, um die Sequenz der Kettenabbruchprodukte zu detektieren.
  • Umfasst ein Ausführungsbeispiel eine „und/oder“-Verknüpfung zwischen einem ersten Merkmal und einem zweiten Merkmal, so ist dies so zu lesen, dass das Ausführungsbeispiel gemäß einer Ausführungsform sowohl das erste Merkmal als auch das zweite Merkmal und gemäß einer weiteren Ausführungsform entweder nur das erste Merkmal oder nur das zweite Merkmal aufweist.

Claims (16)

  1. Mikrofluidische Sequenzierungsvorrichtung (100) zum Vervielfältigen und Trennen von Molekülketten, wobei die Sequenzierungsvorrichtung (100) dazu ausgebildet ist, biochemisches Material aufzunehmen und die Sequenzierungsvorrichtung (100) zumindest folgende Merkmale aufweist: eine Zuführöffnung (105) zum Zuführen von biochemischem Material in die Sequenzierungsvorrichtung (100) zumindest eine mikrofluidische Separationseinheit (101), wobei die Separationseinheit (101) zumindest einen Separationskanal (102) mit zumindest einer Amplifikationskavität (115) zum Vervielfältigen von über die Zuführöffnung (105) zugeführten Molekülketten als biochemischem Material und mit zumindest einer mit der Amplifikationskavität (115) mikrofluidisch verbindbare oder verbundene Trenneinheit (120) mit einem mehrporigem Material aufweist, wobei die Trenneinheit (120) dazu ausgebildet ist, Nukleinsäuren von weiteren makromolekularen Bestandteilen zu trennen und/oder Nukleinsäuren aufzutrennen; und eine Abführöffnung (125a, 125b) zum Abführen von in der Separationseinheit (101) aufgetrennten Nukleinsäuren als biochemischem Material aus der Sequenzierungsvorrichtung (100).
  2. Sequenzierungsvorrichtung (100) gemäß Anspruch 1, wobei die Trenneinheit (120) zumindest teilweise poröses Silizium umfasst und/oder zumindest teilweise Polycarbonat - Filtermembrane, insbesondere track-etched Membrane umfasst und/oder zumindest teilweise gewebeartige Polymermembrane umfasst und/oder zumindest teilweise nanoporöses Metalloxid umfasst und/oder zumindest teilweise ein Array aus Microposts umfasst und/oder zumindest teilweise ein Acrylamidgel umfasst und/oder zumindest teilweise ein Agarosegel umfasst.
  3. Sequenzierungsvorrichtung (100) gemäß einem der vorangegangenen Ansprüche, wobei die Trenneinheit (120) zumindest zwei mehrporige Schichten (210, 220) mit unterschiedlicher Porosität aufweist.
  4. Sequenzierungsvorrichtung (100) gemäß einem der vorangegangenen Ansprüche, wobei die Trenneinheit (120) eine Breite aufweist, die im Wesentlichen der Breite der Amplifikationskavität (115) entspricht.
  5. Sequenzierungsvorrichtung (100) gemäß einem der vorangegangenen Ansprüche, wobei die Amplifikationskavität (115) mit der Trenneinheit (120) durch eine Wand mit einer Engstelle (140) verbindbar oder verbunden ist.
  6. Sequenzierungsvorrichtung (100) gemäß einem der vorangegangenen Ansprüche, wobei die Zuführöffnung (105) und/oder die Abführöffnung (125a, 125b) als Verengung des Separationskanals (102) ausgeformt sind.
  7. Sequenzierungsvorrichtung (100) gemäß einem der vorangegangenen Ansprüche mit einer Feldausbildungseinheit (130) zur Erzeugung eines elektrischen Feldes über die Trenneinheit (120), um eine Molekülkette elektrophoretisch durch die Trenneinheit (120) zu befördern.
  8. Sequenzierungsvorrichtung (100) gemäß einem der vorangegangenen Ansprüche, wobei in der Amplifikationskavität (115) zumindest eine Reaktionskomponente und zumindest ein artifizielles DNA-Nukleotid und/oder ein Kettenabbruchsnukleotid (A, G, T, C) vorgehalten ist und/oder die Amplifikationskavität (115) dazu ausgebildet ist, eine Flüssigkeit für eine Amplifikationsreaktion aufzunehmen.
  9. Sequenzierungsvorrichtung (100) gemäß Anspruch 8, wobei die zumindest eine Separationseinheit (101) zumindest zwei Amplifikationskavitäten (115), insbesondere vier Amplifikationskavitäten (115), aufweist, die dazu ausgebildet sind, je zumindest eine gleiche Reaktionskomponente und je zumindest ein anderes, artifizielles DNA-Nukleotid und/oder zumindest ein je anderes Kettenabbruchsnukleotid (A, G, T, C) zu enthalten und/oder dazu ausgebildet sind, eine Flüssigkeit für eine Amplifikationsreaktion aufzunehmen.
  10. Sequenzierungsvorrichtung (100) gemäß einem der vorangegangenen Ansprüche mit einer Längenbestimmungseinheit zur Bestimmung einer Länge von aufgetrennten Nukleinsäuren als biochemischem Material.
  11. Verfahren (400) zum Trennen von aus einer Amplifikationsreaktion gewonnen Molekülketten, unter Verwendung einer mikrofluidischen Sequenzierungsvorrichtung (100) gemäß einem der Ansprüche 1 bis 9, wobei das Verfahren zumindest die folgenden Schritte aufweist: Einleiten (410) einer Flüssigkeit für eine Amplifikationsreaktion in die zumindest eine Amplifikationskavität (115), um eine Amplifikationsreaktion vorzubereiten; Leiten (420) einer Abdichtungsflüssigkeit über die Zuführöffnung (105) und die Abführöffnung (125a, 125b), um die Zuführöffnung (105) und die Abführöffnung (125a, 125b) zu versiegeln; Durchführen (430) einer Amplifikationsreaktion, um zumindest eine Molekülkette zu erzeugen und Terminieren von gewonnen Molekülketten, um Kettenabbruchprodukte (310) zu erzeugen; und Anlegen (440) einer Spannung zwischen der Zuführöffnung (105) und der Abführöffnung (125 a, 125b), um die zumindest eine Trenneinheit (120) zu befüllen, und Trennen der zumindest einen erzeugten Molekülkette in der Trenneinheit (120), um Kettenabbruchprodukte (310) zu gewinnen;
  12. Verfahren (450) zum Detektieren von Kettenabbruchprodukten (310), wobei das Verfahren (450) zumindest die folgenden Schritte aufweist: die Schritte des Verfahrens (400) gemäß Anspruch 11; und einen Schritt zum Messen (460) der Länge der Kettenabbruchprodukte (310), um die Sequenz der Kettenabbruchprodukte (310) zu detektieren.
  13. Verfahren (500) zum Herstellen einer Sequenzierungsvorrichtung (100) gemäß einem der Ansprüche 1 bis 10, wobei das Verfahren (500) zumindest die folgenden Schritte aufweist: Ausbilden (510) einer Trenneinheit (120) aus einem mehrporigem Material; und Verbinden (520) der Trenneinheit (120) mit einer Amplifikationskavität (115) in einer Separationseinheit (101), um die Sequenzierungsvorrichtung (100) herzustellen.
  14. Vorrichtung (600; 700), die eingerichtet ist, um die Schritte des Verfahrens (400, 450; 500) gemäß einem der vorangegangenen Ansprüche 10 bis 12 in entsprechenden Einheiten (610, 620; 710, 720, 730, 740, 760) auszuführen und/oder anzusteuern.
  15. Computerprogramm, das dazu eingerichtet ist, das Verfahren (400, 450, 500) gemäß einem der vorangegangenen Ansprüche 11 bis 13 auszuführen und/oder anzusteuern.
  16. Maschinenlesbares Speichermedium, auf dem das Computerprogramm nach Anspruch 15 gespeichert ist.
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