WO2015144345A1 - Mikrofluidische vorrichtung und verfahren zum analysieren einer probe biologischen materials - Google Patents

Mikrofluidische vorrichtung und verfahren zum analysieren einer probe biologischen materials Download PDF

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WO2015144345A1
WO2015144345A1 PCT/EP2015/052053 EP2015052053W WO2015144345A1 WO 2015144345 A1 WO2015144345 A1 WO 2015144345A1 EP 2015052053 W EP2015052053 W EP 2015052053W WO 2015144345 A1 WO2015144345 A1 WO 2015144345A1
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WO
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reaction
chamber
polymerase chain
pcr
microfluidic device
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Application number
PCT/EP2015/052053
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English (en)
French (fr)
Inventor
Jochen Hoffmann
Original Assignee
Robert Bosch Gmbh
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Publication date
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    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L7/00—Heating or cooling apparatus; Heat insulating devices
    • B01L7/52—Heating or cooling apparatus; Heat insulating devices with provision for submitting samples to a predetermined sequence of different temperatures, e.g. for treating nucleic acid samples
    • B01L7/525—Heating or cooling apparatus; Heat insulating devices with provision for submitting samples to a predetermined sequence of different temperatures, e.g. for treating nucleic acid samples with physical movement of samples between temperature zones
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L3/00—Containers or dishes for laboratory use, e.g. laboratory glassware; Droppers
    • B01L3/50—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes
    • B01L3/502—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures
    • B01L3/5027—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures by integrated microfluidic structures, i.e. dimensions of channels and chambers are such that surface tension forces are important, e.g. lab-on-a-chip
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
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    • B01L3/00—Containers or dishes for laboratory use, e.g. laboratory glassware; Droppers
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    • B01L3/502—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures
    • B01L3/5027—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures by integrated microfluidic structures, i.e. dimensions of channels and chambers are such that surface tension forces are important, e.g. lab-on-a-chip
    • B01L3/502738—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures by integrated microfluidic structures, i.e. dimensions of channels and chambers are such that surface tension forces are important, e.g. lab-on-a-chip characterised by integrated valves

Definitions

  • the present invention relates to a microfluidic device for analyzing a sample of biological material, to a method for analyzing a sample of biological material, to a device for carrying out the steps of the method and to a corresponding device
  • a microfluidic diagnostic system such as a so-called chip lab or lab-on-chip (LoC) is a miniaturized and integrated implementation of complex fluidic workflows, especially for the specific
  • US 2011/0070578 A1 discloses a DNA analyzer in which a polymerase chain reaction and a dilution are carried out for a subsequent electrophoretic separation.
  • microfluidic device for analyzing a sample of biological material a method for analyzing a sample of biological material, furthermore a device using this method, and finally
  • Primer sequences in the first and the second polymerase chain reaction can be provided.
  • dUTP deoxyuridine triphosphates
  • PCR primers having a melting point between 55 and 65 ° C. and in the second single-plex PCR primers having a melting point of 72 ° C. would be used.
  • PCR primers for the first and second PCR need not be designed in different lengths for different melting temperatures.
  • Nucleic acid molecules in the first polymerase chain reaction sufficient material for single detection reactions in the second polymerase chain reaction can be generated. Therefore, it can be prevented that, for example, a sample material to be examined, which contains very few DNA molecules, is distributed directly to a plurality of reaction chambers and thus the individual chambers contain too little genetic starting material for a PCR. Rather, by raising an amount of to be examined
  • Nucleic acid molecules can be detected in the first PCR in each reaction chamber of the second PCR, for example, any desired of the existing nucleic acid molecules. By interleaving two polymerase chain reactions, a large number of genetic reactions can occur in singleplex reactions
  • Characteristics can be detected from a small amount of sample.
  • Process time can be shortened.
  • a real-time capability or real-time capability can be provided.
  • Reactions can be carried out, for example, in triplicates, whereby a significance of the reactions can be increased.
  • microfluidic device for analyzing a sample
  • the microfluidic device having the following features: a first reaction chamber configured to perform a first polymerase chain reaction on the sample to produce a first reaction product; a mixing chamber fluidically connected or connectable to the first reaction chamber and configured to mix the first reaction product with a diluting medium to produce a dilute mixture; and at least one second reaction chamber fluidically connected or connectable to the mixing chamber and configured to analyze the sample by a second polymerase chain reaction on the dilute mixture
  • the microfluidic device can be used, for example, in connection with analytical systems, in particular for microfluidic lab-on-chip systems for environmental analysis or medical diagnostics.
  • the microfluidic device may be a microfluidic system or an analytical device, in particular a microfluidic lab-on chip or chip laboratory for medical diagnostics, microbiological diagnostics or environmental analysis.
  • a liquid to be analyzed typically a liquid or liquefied patient sample, e.g. Blood, urine, stool, sputum, cerebrospinal fluid, lavage, a flushed swab or liquefied tissue sample, or a sample of a non-human material.
  • cells contained in the sample may contain human cells, e.g.
  • reaction chambers may be fluidly connected to the mixing chamber using valves.
  • At least one substance may be present in the first reaction chamber for carrying out the first polymerase chain reaction.
  • the dilution medium may be upstream in the mixing chamber.
  • at least one substance for Be preceded by performing the second polymerase chain reaction in the at least one second reaction chamber and additionally or alternatively in the mixing chamber, at least one substance for Be preceded by performing the second polymerase chain reaction.
  • the device may have at least two or at least three second reaction chambers.
  • Reaction mix can also be introduced into the reaction chamber "ready-to-use.” Also, a fluidically connected or connectable to the mixing chamber
  • Storage chamber may be provided for storing dilution medium.
  • at least one substance for carrying out the first polymerase chain reaction may be disposed in the first reaction chamber, it being possible for the dilution medium to be preceded in the storage chamber.
  • at least one second reaction chamber in the storage chamber and additionally or alternatively in the mixing chamber at least one substance for carrying out the second polymerase chain reaction may be upstream.
  • reaction mixture can already
  • Volume of the mixing chamber may be formed to cause a mixing ratio in the diluted mixture, which is suitable to primer from the first
  • Polymerase chain reaction of the second polymerase chain reaction at least partially exclude.
  • the dilution and concomitant reduction in the concentration of primers from the first polymerase chain reaction suppresses the involvement of these primers in the second polymerase chain reaction. Also, a volume of
  • Storage chamber may be configured to enter the diluted mixture
  • the PC R product of the first PCR can be diluted to such an extent that the primers of the first PCR, which are likewise diluted, are at least partially effectively inactivated thereby in the second PCR.
  • the biochemical background of the described approach is that the concentration of the primers of the first PCR by dilution of the reaction volume (after completion of the first PCR) is reduced or reduced so far that these primers are no longer active in the subsequent second PCR on the second reaction because the concentration of these primers is insufficient.
  • the reaction volume of the first PCR is then distributed to several chambers, in which primers are upstream for the second PCR, which mix when filling the chambers with the diluted mix of the first PCR, so that establish functional reaction mixes.
  • a ventilation opening can be provided, which is formed in the mixing chamber as a compensation opening relative to an ambient pressure.
  • the ventilation opening may be formed to allow a pressure equalization between the mixing chamber and an environment of the microfluidic device.
  • Reaction chamber and the mixing chamber switched pumping chamber and a plurality of valves may be provided. Also, a plurality of second reaction chambers may be provided. In this case, the first reaction chamber can be arranged between a first pair of valves, the
  • Pumping chamber may be arranged between a second pair of valves and the plurality of second reaction chambers between a plurality of third pairs of valves may be arranged.
  • the chambers of the microfluidic device may be fluidly connected by means of channels, wherein the valves may be configured to influence a fluid flow through the channels.
  • the storage chamber may be fluidly connected to the mixing chamber via a channel and a valve.
  • a method of analyzing a sample of biological material comprising the steps of:
  • the method may be advantageously carried out in conjunction with an embodiment of the aforementioned microfluidic device to analyze a sample of biological material. Further, between the step of performing and the step of mixing, the method may include a first step of conveying the first reaction product from the first one
  • the steps of conveying can be carried out by controlling at least one valve and additionally or alternatively at least one conveyor.
  • the at least one valve and / or the at least one conveyor may have interfaces which are designed to receive drive signals.
  • drive signals may be generated to drive at least one valve and additionally or alternatively at least one conveyor of the microfluidic device to effect a mixing ratio in the dilute mixture suitable to contain primers from the first polymerase chain reaction of The second
  • two polymerase chain reactions can be performed sequentially.
  • the first polymerase chain reaction several primer pairs can be used, whereby in the sense of a multiplex PCR specifically several nucleic acid sequences or in particular
  • DNA sequences in a reaction chamber can be amplified simultaneously.
  • a PCR product of the first reaction can then be distributed to several spatially separated reaction chambers, each of which can contain a primer pair.
  • DNA molecules of the first PCR function as so-called "template DNA" in the second PCR, as a result of which a nucleic acid molecule can be detected in each chamber during the second PCR in the sense of a single-plex PCR.
  • a sample solution to be examined can be introduced, for example, into a first reaction chamber and pre-amplified by means of multiplex PCR.
  • this reaction several, for example between 5 and 100, different sections of a nucleic acid can be amplified.
  • this PCR product can be distributed to many second reaction chambers in which substances such as polymerase and a primer pair can be preceded. This can be done in the
  • Single chambers different nucleic acid molecules can be detected in single reactions of the single-plex PCR in parallel parallel or highly parallel in the process.
  • the approach presented here also provides a device which is designed to implement the steps of a variant of a method presented here to implement, control or implement appropriate facilities. Also by this embodiment of the invention in the form of a device, the object underlying the invention can be solved quickly and efficiently.
  • a device can be understood as meaning an electrical device which processes sensor signals and outputs control and / or data signals in dependence thereon.
  • the device may have an interface, which may be formed in hardware and / or software.
  • the interfaces can be part of a so-called system ASIC, for example, which contains a wide variety of functions of the device.
  • the interfaces are their own integrated circuits or at least partially consist of discrete components.
  • the interfaces may be software modules that are present, for example, on a microcontroller in addition to other software modules.
  • An advantage is also a computer program product with program code, which on a machine-readable carrier such as a semiconductor memory, a
  • FIG. 1 is a schematic representation of a microfluidic device according to an embodiment of the present invention.
  • FIGS. 3 and 4 are comparative representations of analysis results according to embodiments of the present invention.
  • FIG. 1 shows a schematic representation of a microfluidic device 100 for analyzing a sample of biological material according to a
  • the microfluidic device 100 is, for example, as a microfluidic chip or a
  • FIG. 1 shows a first reaction chamber 110, a pumping chamber 120, a mixing chamber 130, a ventilation opening 140, a plurality of second reaction chambers 150, wherein in FIG. 1 only four second reaction chambers 150 are shown in FIG. and a plurality of valves 161, 162, 163, 164, 165 and 166.
  • the first reaction chamber 110 is disposed between a first valve 161 and a second valve 162.
  • the first valve 161 is in one
  • Microfluidic supply channel arranged.
  • the sample can be fed into the first reaction chamber 110 via the microfluidic feed channel.
  • Reaction chamber 110 is configured to perform a first polymerase chain reaction on the sample to produce a first reaction product.
  • the second valve 162 is arranged in a first microfluidic connection channel.
  • the first reaction chamber 110 is by means of the first
  • Microfluidic connection channel fluidly connected to the pumping chamber 120.
  • the pumping chamber 120 is disposed between a third valve 163 and a fourth valve 164.
  • the third valve 163 is the first
  • Microfluidic connection channel arranged.
  • the second valve 162 and the third valve 163 are arranged.
  • the pumping chamber 120 is by means of a second microfluidic
  • the fourth valve 164 is disposed in the second microfluidic connection channel.
  • the pumping chamber 120 is fluidly disposed between the first reaction chamber 110 and the mixing chamber 130.
  • the mixing chamber 130 is fluidly connected to the pumping chamber 120 via the second microfluidic connection channel.
  • the fourth valve 164 is in this case arranged between the pumping chamber 120 and the mixing chamber 130 in the second microfluidic connecting channel.
  • the mixing chamber 130 is fluidly connected to the first via the second microfluidic connection channel, the pumping chamber 120 and the first microfluidic connection channel
  • the first reaction product can be supplied from the first reaction chamber 110 via the pumping chamber 120 into the mixing chamber 130.
  • a dilution medium is storable or upstream.
  • the mixing chamber 130 is formed around the first
  • the ventilation opening 140 is formed in the mixing chamber 130. Although it is not explicitly recognizable in FIG. 1 because of the presentation, it is the
  • Air vent 140 as a through-hole between the mixing chamber 130 and an outer surface of the microfluidic device 100
  • the ventilation opening 140 is formed as a compensation opening relative to an ambient pressure.
  • a branch point is arranged in the first microfluidic connection channel between the first reaction chamber 110 and the pumping chamber 120.
  • branching point branches off from the first microfluidic connection channel from a third microfluidic connection channel.
  • the third microfluidic connecting channel extends between the branching point and the exemplary four second reaction chambers 150. In this case, the third microfluidic connecting channel branches into four subchannels.
  • Each of the exemplary four second reaction chambers 150 is disposed between a fifth valve 165 and a sixth valve 166.
  • a fifth valve 165 and a sixth valve 166 are provided.
  • the second reaction chambers 150 are fluidically connected to the mixing chamber 130 via the microfluidic connection channels.
  • the dilute mixture from the mixing chamber 130 can be fed into the second reaction chambers 150 via the third microfluidic connection channel.
  • the second reaction chambers 150 are configured to analyze a second polymerase chain reaction on the sample
  • the exemplary four sixth valves 166 are arranged in four sub-channels, which are in a microfluidic
  • At least one substance for carrying out the first polymerase chain reaction is disposed in the first reaction chamber 110. Furthermore, in the mixing chamber 130, at least one first substance precedes to carry out the second polymerase chain reaction. Finally, in the second reaction chambers 150 at least one second substance precedes to carry out the second polymerase chain reaction.
  • the microfluidic device 100 is particularly designed to produce a dilute mixture having a mixing ratio suitable for at least partially eliminating primers from the first polymerase chain reaction from the second polymerase chain reaction.
  • the valves 161, 162, 163, 164, 165 and 166 may include interfaces adapted to receive drive signals. According to one embodiment, a volume of the first
  • Reaction chamber 110 and a volume of the mixing chamber 130 is formed to cause a mixing ratio in the dilute mixture, which is suitable for at least partially excluding primers from the first polymerase chain reaction from the second polymerase chain reaction in the second reaction chambers 150.
  • FIG. 1 shows a schematic plan view of the microfluidic device 100 according to one exemplary embodiment.
  • Device 100 is embodied for example as a microfluidic chip and comprises inter alia the first reaction chamber 110 for carrying out a first polymerase chain reaction or PCR (PCR) as a multiplex PCR, the pumping chamber 120, the mixing chamber 130 and the second reaction chambers 150 for carrying out the second PCR as single-polymerase chain reactions.
  • PCR polymerase chain reaction
  • Reaction components for the first PCR such as polymerase, different primer pairs for a multiplexed PCR,
  • Nucleoside triphosphates in particular deoxyribonucleoside triphosphates or dNTP, PCR buffers, additives and the like upstream in the first reaction chamber 110.
  • Polymerase, primer pairs and, for example, real-time probes or probes for performing a real-time PCR, are preceded by second reaction chambers 150.
  • the sample or DNA sample is introduced into the first reaction chamber 110 and mixed with the reaction components upstream there.
  • the first valve 161 and the second valve 162 are closed, reaction conditions are created for the first PCR.
  • the first reaction product from the first PCR or the liquid volume of the first reaction chamber 110 is transferred into the mixing chamber 130 by means of a conveying device, which has the pumping chamber 120 and the third valve 163 and the fourth valve 164 as pumping valves, and with the dilution medium contained therein mixed.
  • a Displacement of excess air of the mixing chamber 130 in this case takes place via the ventilation opening 140.
  • the diluted mixture is distributed by means of the pumping chamber 120 with the second valve 162 closed to the second reaction chambers 150.
  • reaction conditions for the second PCR are created.
  • a reaction course can either be followed in real time, whereby quantitative information about an initial quantity of respective DNA molecules can be obtained, or measured at the end of the second reaction, with yes / no statements being possible.
  • Mixing ratio or a dilution stage determined by an amount of upstream dilution medium in the mixing chamber 130.
  • At least one second reaction chamber 150 is simplified.
  • a channel leading into the second reaction chamber 150 can, as shown in FIG , branch off from a connection channel between the first reaction chamber 110 and the mixing chamber 130, or alternatively from the mixing chamber 130 into the second
  • An optional pumping chamber 120 may connect at a suitable position to one of the chambers 110, 130, 150
  • Connection channel network may be arranged.
  • FIG. 2 shows a schematic representation of a microfluidic device 100 for analyzing a sample of biological material according to a
  • the microfluidic device 100 corresponds to the microfluidic device of FIG. 1, with the exception that the microfluidic device 100 in FIG. 2 additionally has a seventh valve 267 and a storage chamber 270.
  • the first reaction chamber 110, the pumping chamber 120, the mixing chamber 130, the vent 140, the exemplary only four second reaction chambers 150, the valves 161, 162, 163, 164, 165, 166 and 267 and the storage chamber 270 are shown.
  • the storage chamber 270 is via a fourth microfluidic
  • the seventh valve 267 is disposed in the fourth microfluidic connection channel.
  • the storage chamber 270 is configured to store the dilution medium. With the mixing chamber 130, the storage chamber 270 is fluidically connected via the fourth microfluidic connection channel. Thus, the first reaction product in the mixing chamber 130 can be diluted with the diluting medium from the storage chamber 270 in an adjustable mixing ratio.
  • FIG. 2 shows a structure of the microfluidic device 100 in which different dilution stages of the first reaction product can be set for the second PCR. According to that shown in Fig. 2
  • the dilution medium for the second PCR in the storage chamber 270 upstream.
  • a reaction volume of the first PCR or the first reaction product is transferred by means of the pumping chamber 120 into the mixing chamber 130.
  • the pumping chamber 120 By means of the pumping chamber 120, a defined amount of the dilution medium from the storage chamber 270 is also supplied to the mixing chamber 130 and there with the first
  • This dilute mixture is then, as described in Fig. 1, distributed to the second reaction chambers 150, and temperature-cycled there in the second PCR.
  • different dilution stages of the first reaction product in the diluted mixture can be set.
  • FIG. 3 is a comparative illustration of analysis results according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 3 shows a comparison of a
  • column A is a PCR product of the first PCR or a first
  • Column B shows a second reaction product or a PCR product of the second PCR, for which the first reaction product diluted by a factor of 50 was used as template DNA.
  • Column C shows a second reaction product or a PCR product of the second PCR, for which the first reaction product was diluted by a factor of 500 as template DNA.
  • Column D shows a second reaction product or a PCR product of the second PCR, for which the first reaction product diluted by a factor of 5000 was used as template DNA.
  • Column E shows a second reaction product or a PCR product of the second PCR, for which the first reaction product was diluted by a factor of 50,000 and used as template DNA.
  • Column F shows a second reaction product or a PCR product of the second PCR, for which the first reaction product diluted by a factor of 500,000 was used as template DNA.
  • column G a negative control is shown and column H shows a DNA ladder, merely exemplified by the type 50 bp plus.
  • FIG. 4 shows a comparison of a
  • column A is a PCR product of the first PCR or a first
  • Reaction product shown and column B shows a DNA ladder, for example only type 50 bp plus.
  • Column C shows a second reaction product or a PCR product of the second PCR, for which the first reaction product diluted by a factor of 50 was used as template DNA.
  • column D a second reaction product or a PCR product of the second PCR is shown, for which the first reaction product diluted by a factor of 500 was used as template DNA.
  • Column E shows a second reaction product or a PCR product of the second PCR, for which the first reaction product diluted by a factor of 5000 was used as template DNA.
  • Column F shows a second reaction product or a PCR product of the second PCR for which the first reaction product was diluted by a factor of 50,000 and used as template DNA.
  • Column G shows a second reaction product or a PCR product of the second PCR, for which the first reaction product diluted by a factor of 500,000 was used as template DNA.
  • Column H shows a negative control.
  • FIG. 5 shows a flowchart of a method 500 for analyzing a sample of biological material according to an embodiment of the invention
  • the method 500 may be implemented using a microfluidic device comprising a first reaction chamber, a mixing chamber fluidically connected to the first reaction chamber, and at least one second fluidically connected to the mixing chamber
  • Reaction chamber has.
  • the method 500 is below
  • the method 500 includes a step 510 of performing a first
  • the method 500 includes a step 520 of mixing the first reaction product with a
  • the method 500 includes a step 530 of performing a second polymerase chain reaction on the dilute mixture in the at least one second reaction chamber to analyze the sample.
  • the second PCR a single, specific PCR product is generated.
  • a dilution of the first reaction product can prevent the primers of the first PCR are still active in the second PCR.
  • the desired single-plex PCR product can be generated, and not all others addressed by the multiplex primer pairs,
  • the first reaction chamber 110 has a volume of 10 microliters and the storage chamber 270, which contains the diluent with reaction components, has a volume of 490 microliters.
  • a thickness of the microfluidic device 100 may be 0.5 to 5 millimeters, wherein channel diameters of microfluidic channels may be 10 microns to 3 millimeters and volumes of chambers may be between 1 cubic millimeter to 1000 cubic millimeters.
  • An example process flow includes a first PCR
  • thermocycles Parameter space with a number of 1 to 20 thermocycles
  • a parameter space comprises a number of 20 to 60 thermocycles, with temperature cycles of 93 degrees Celsius to 96 degrees Celsius for denaturation, 72 degrees Celsius for extension, 54 degrees Celsius to 65 degrees Celsius for primer attachment, although possible is to omit the step on the extension temperature and thus perform a two-step PCR.
  • a number of polymerase chain reactions have between 1 and 20 reactions for the first PCR and between 1 and 50 reactions for the second PCR.
  • a measurement of a PCR reaction success includes, for example, a use of hydrolysis probes, for example TaqMan probes, LightCycler probes, LoopTag probes, Scorpion primers or molecular beacons. This can be on an increasing fluorescence signal, the reaction success can be determined. Also conceivable are an electrical readout by means of ISFETs, a
  • Impedance measurement a measurement of a surface-bound PCR product by means of interdigital electrode structures or the like.
  • an exemplary embodiment comprises an "and / or" link between a first feature and a second feature, then this is to be read so that the embodiment according to one embodiment, both the first feature and the second feature and according to another embodiment either only first feature or only the second feature.

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Abstract

Die Erfindung betrifft eine mikrofluidische Vorrichtung (100) zum Analysieren einer Probe biologischen Materials. Dabei weist die mikrofluidische Vorrichtung (100) eine erste Reaktionskammer (110) auf, die ausgebildet ist, um eine erste Polymerase-Kettenreaktion an der Probe auszuführen, um ein erstes Reaktionsprodukt zu erzeugen. Auch weist die mikrofluidische Vorrichtung (100) eine fluidisch mit der ersten Reaktionskammer (110) verbundene Mischkammer (130) auf, die ausgebildet ist, um das erste Reaktionsprodukt mit einem Verdünnungsmedium zu mischen, um ein verdünntes Gemisch zu erzeugen. Ferner weist die mikrofluidische Vorrichtung (100) zumindest eine fluidisch mit der Mischkammer (130) verbundene, zweite Reaktionskammer (150) auf, die ausgebildet ist, um zum Analysieren der Probe eine zweite Polymerase- Kettenreaktionan dem verdünnten Gemisch durchzuführen.

Description

Beschreibung Titel
Mikrofluidische Vorrichtung und Verfahren zum Analysieren einer Probe biologischen Materials
Stand der Technik
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf eine mikrofluidische Vorrichtung zum Analysieren einer Probe biologischen Materials, ferner auf ein Verfahren zum Analysieren einer Probe biologischen Materials, zudem auf eine Vorrichtung zum Ausführen der Schritte des Verfahrens sowie auf ein entsprechendes
Computerprogramm.
Bei einem mikrofluidischen Diagnosesystem, wie einem sogenannten Chiplabor bzw. Lab-on-Chip (LoC) ist eine miniaturisierte und integrierte Durchführung komplexer fluidischer Arbeitsabläufe insbesondere für den spezifischen
Nachweis verschiedenster Moleküle ermöglicht. Die US 2011/0070578 AI offenbart eine DNA-Analyseeinrichtung, bei der eine Polymerase- Kettenreaktion und eine Verdünnung für eine nachfolgende elektrophoretische Separation durchgeführt werden.
Offenbarung der Erfindung
Vor diesem Hintergrund werden mit dem hier vorgestellten Ansatz eine mikrofluidische Vorrichtung zum Analysieren einer Probe biologischen Materials, ein Verfahren zum Analysieren einer Probe biologischen Materials, weiterhin eine Vorrichtung, die dieses Verfahren verwendet, sowie schließlich ein
entsprechendes Computerprogramm gemäß den Hauptansprüchen vorgestellt. Vorteilhafte Ausgestaltungen ergeben sich aus den jeweiligen Unteransprüchen und der nachfolgenden Beschreibung. Gemäß Ausführungsformen der Erfindung kann insbesondere eine
verschachtelte (engl, nested) Polymerase- Kettenreaktion bzw. PCR (engl.
Polymerase Chain Reaction) geschaffen werden, bei der eine Probe zwischen einer ersten und einer zweiten Polymerase- Kettenreaktion verdünnt wird (engl, diluted), was als eine„Diluted Nested PCR" bezeichnet werden kann. Somit können gemäß Ausführungsformen der Erfindung mikrofluidische Strukturen und Prozessabläufe für eine Durchführung einer verschachtelten Polymerase- Kettenreaktion mit Verdünnung und unter Verwendung gleicher
Primersequenzen bei der ersten und der zweiten Polymerase- Kettenreaktion bereitgestellt werden.
Vorteilhafterweise kann gemäß Ausführungsformen der Erfindung insbesondere eine Implementierung von PCR-Assays ohne Primer- Modifikation, wie
beispielsweise herkömmlicherweise üblich durch Verwendung dUTP-haltiger
(dUTP = Deoxyuridine Triphosphate) Primer, Primer mit unterschiedlichen Schmelztemperaturen, „Abfangprimern", die in der zweiten PCR eingesetzt werden, zu den Primern der ersten PCR komplementär sind und somit die Primer deaktivieren, oder dergleichen, ermöglicht werden. Somit braucht insbesondere nicht auf die Verwendung von dUTP-haltigen Primern bei der ersten PCR zurückgegriffen werden, wobei nach Überführung des PCR-Produkts in die singleplex- Reaktionskammern ein UNG-Verdau (U NG = Uracil-N-Glycosylase) durchgeführt würde, um die Primer der ersten Reaktion zu deaktivieren. Daher kann auf spezielle Nukleotide bei einer Primer-Synthese sowie auf ein zusätzliches Enzymsystem für den UNG-Verdau verzichtet werden. Ebenso braucht nicht auf die Verwendung von Primern mit unterschiedlichen
Schmelztemperaturen zurückgegriffen werden, wobei in der ersten multiplex- PCR beispielsweise Primer mit einer Schmelztemperatur zwischen 55 und 65°C, bei den zweiten singleplex-PCRs Primer mit einer Schmelztemperatur um 72 °C eingesetzt würden. Somit brauchen PCR-Primer für die erste und zweite PCR nicht in unterschiedlichen Längen für unterschiedliche Schmelztemperaturen ausgelegt werden.
Daher können gemäß Ausführungsformen der Erfindung Kosten und Aufwand bei der verschachtelten Polymerase- Kettenreaktion eingespart werden. Auch kann dadurch eine Flexibilität eines LoC-Systems gesteigert werden, da viele verschiedene PCR-Assays bzw. Biocontents ohne Anpassung in einem LoC implementiert werden können. So gibt es beispielsweise deutlich mehr Assays, bei denen DNA-Moleküle direkt über eine singleplex- bis quadplex-PCR-Reaktion nachgewiesen werden als in einer Kombination aus multiplex-PCR plus anschließender Mikroarrayanalyse.
Vorteile einer Verschachtelung der Polymerase- Kettenreaktionen bestehen darin, dass durch eine Voramplifikation von in der Probe enthaltenen
Nukleinsäuremolekülen in der ersten Polymerase- Kettenreaktion genügend Material für Einzelnachweisreaktionen in der zweiten Polymerase- Kettenreaktion erzeugt werden kann. Daher kann verhindert werden, dass beispielsweise ein zu untersuchendes Probenmaterial, das sehr wenige DNA-Moleküle enthält, direkt auf mehrere Reaktionskammern verteilt wird und somit die einzelnen Kammern zu wenig genetisches Ausgangsmaterial für eine PCR enthalten. Vielmehr kann durch eine Anhebung einer Menge an zu untersuchenden
Nukleinsäuremolekülen in der ersten PCR in jeder Reaktionskammer der zweiten PCR beispielsweise jedes gewünschte der vorhandenen Nukleinsäuremoleküle nachgewiesen werden kann. Durch die Verschachtelung zweier Polymerase- Kettenreaktionen können in singleplex- Reaktionen sehr viele genetische
Merkmale aus einer kleinen Probenmenge nachgewiesen werden.
Ferner braucht kein DNA-Mikroarray für einen Nachweis unterschiedlicher DNA- Moleküle eingesetzt zu werden. Dadurch können auch Anforderungen an eine optische Detektionseinheit in puncto Auflösung gesenkt werden und eine
Prozesszeit verkürzt werden. Zudem kann gemäß Ausführungsformen der Erfindung eine Echtzeitfähigkeit bzw. Real-time- Fähigkeit vorgesehen sein.
Reaktionen können beispielsweise in Triplikaten durchgeführt werden, wodurch eine Aussagekraft der Reaktionen erhöht werden kann.
Es wird eine mikrofluidische Vorrichtung zum Analysieren einer Probe
biologischen Materials vorgestellt, wobei die mikrofluidische Vorrichtung folgende Merkmale aufweist: eine erste Reaktionskammer, die ausgebildet ist, um eine erste Polymerase- Kettenreaktion an der Probe auszuführen, um ein erstes Reaktionsprodukt zu erzeugen; eine fluidisch mit der ersten Reaktionskammer verbundene oder verbindbare Mischkammer, die ausgebildet ist, um das erste Reaktionsprodukt mit einem Verdünnungsmedium zu mischen, um ein verdünntes Gemisch zu erzeugen; und zumindest eine fluidisch mit der Mischkammer verbundene oder verbindbare, zweite Reaktionskammer, die ausgebildet ist, um zum Analysieren der Probe eine zweite Polymerase- Kettenreaktion an dem verdünnten Gemisch
durchzuführen.
Die mikrofluidische Vorrichtung kann beispielsweise in Verbindung mit analytischen Systemen, insbesondere für mikrofluidische Lab-on-Chip-Systeme zur Umweltanalytik oder medizinischen Diagnostik verwendet werden. Bei der mikrofluidischen Vorrichtung kann es sich um ein mikrofluidisches System bzw. eine analytische Vorrichtung handeln, insbesondere ein mikrofluidisches Lab-on- Chip bzw. Chiplabor zur medizinischen Diagnostik, mikrobiologischen Diagnostik oder Umweltanalytik. Als Probe kann eine zu analysierende Flüssigkeit, typischerweise eine flüssige oder verflüssigte Patientenprobe, z. B. Blut, Urin, Stuhl, Sputum, Liquor, Lavage, ein ausgespülter Abstrich oder eine verflüssigte Gewebeprobe, oder eine Probe eines nichtmenschlichen Materials bezeichnet werden. In der Probe enthaltene Zellen können beispielsweise menschliche Zellen, z. B. Blutzellen oder dergleichen, tierische Zellen oder pathogene Zellen bzw. Pathogene, z. B. Viren oder Mikroorganismen, wie z. B. Bakterien oder Pilze, umfassen, die DNA und/oder RNA, d. h. Nukleinsäuremoleküle, aufweisen. Die Reaktionskammern können beispielsweise unter Verwendung von Ventilen mit der Mischkammer fluidisch verbunden sein.
Gemäß einer Ausführungsform kann in der ersten Reaktionskammer zumindest eine Substanz zum Ausführen der ersten Polymerase- Kettenreaktion vorgelagert sein. Hierbei kann in der Mischkammer das Verdünnungsmedium vorgelagert sein. Dabei kann in der zumindest einen zweiten Reaktionskammer und zusätzlich oder alternativ in der Mischkammer zumindest eine Substanz zum Durchführen der zweiten Polymerase- Kettenreaktion vorgelagert sein. Gemäß einer Ausführungsform kann die Vorrichtung zumindest zwei oder zumindest drei zweite Reaktionskammern aufweisen. Eine solche Ausführungsform bietet den Vorteil, dass eine besonders platzsparende Anordnung von Kammern in der mikrofluidischen Vorrichtung sowie eine Vereinfachung einer Anordnung von
Kammern ermöglicht werden. Gemäß einer Ausführungsform kann der
Reaktionsmix auch schon„ready-to-use" in die Reaktionskammer eingeleitet werden. Auch kann eine fluidisch mit der Mischkammer verbundene oder verbindbare
Speicherkammer zum Speichern von Verdünnungsmedium vorgesehen sein. Hierbei kann in der ersten Reaktionskammer zumindest eine Substanz zum Ausführen der ersten Polymerase- Kettenreaktion vorgelagert sein, wobei in der Speicherkammer das Verdünnungsmedium vorgelagert sein kann. Dabei kann in der zumindest einen zweiten Reaktionskammer, in der Speicherkammer und zusätzlich oder alternativ in der Mischkammer zumindest eine Substanz zum Durchführen der zweiten Polymerase- Kettenreaktion vorgelagert sein. Eine solche Ausführungsform bietet den Vorteil, dass ein variables
Mischungsverhältnis bzw. eine variable Verdünnung in der Mischkammer erzeugt werden kann. Gemäß einer Ausführungsform kann der Reaktionsmix auch schon
„ready-to-use" in die Reaktionskammer eingeleitet werden.
Insbesondere können ein Volumen der ersten Reaktionskammer und ein
Volumen der Mischkammer ausgebildet sein, um in dem verdünnten Gemisch ein Mischungsverhältnis zu bewirken, das geeignet ist, um Primer aus der ersten
Polymerase- Kettenreaktion von der zweiten Polymerase- Kettenreaktion zumindest teilweise auszuschließen. Durch die Verdünnung und der damit einhergehenden Verringerung der Konzentration von Primern aus der ersten Polymerase- Kettenreaktion wird eine Beteiligung dieser Primer an der zweiten Polymerase- Kettenreaktion unterdrückt. Auch kann ein Volumen der
Speicherkammer ausgebildet sein, um in dem verdünnten Gemisch ein
Mischungsverhältnis zu bewirken, das geeignet ist, um Primer aus der ersten Polymerase- Kettenreaktion für die zweite Polymerase- Kettenreaktion zumindest teilweise zu inaktivieren. Bei einer verschachtelten PCR können somit insbesondere PCR-Primer der ersten bzw. multiplex-Polymerase-Kettenreaktion von der nachfolgenden singleplex- Polymerase- Kettenreaktionen im Wesentlichen ausgeschlossen werden. Daher ist es möglich, ein spezifisches Zielmolekül nachzuweisen. Anders ausgedrückt kann das PC R-Produkt der ersten PCR soweit verdünnt werden, dass die ja ebenfalls verdünnten Primer der ersten PCR in der zweiten PCR im Wesentlichen dadurch zumindest teilweise effektiv inaktiviert sind. Der biochemische Hintergrund des beschriebenen Ansatzes besteht darin, dass die Konzentration der Primer der ersten PCR durch eine Verdünnung des Reaktionsvolumens (nach Vollendung der ersten PCR) soweit herabgesetzt oder verringert wird, dass diese Primer in der anschließenden zweiten PCR nicht mehr aktiv an der zweiten Reaktion teilnehmen können, weil die Konzentration dieser Primer dafür nicht ausreicht. Das Reaktionsvolumen der ersten PCR wird dann auf mehrere Kammern verteilt, in denen Primer für die zweite PCR vorgelagert sind, die sich beim Befüllen der Kammern mit dem verdünnten Mix der ersten PCR vermischen, sodass sich funktionsfähige Reaktionsmixe einstellen.
Ferner kann eine Lüftungsöffnung vorgesehen sein, die in der Mischkammer als Ausgleichsöffnung relativ zu einem Umgebungsdruck ausgeformt ist. Hierbei kann die Lüftungsöffnung ausgebildet sein, um einen Druckausgleich zwischen der Mischkammer und einer Umgebung der mikrofluidischen Vorrichtung zu ermöglichen. Eine solche Ausführungsform bietet den Vorteil, dass
überschüssige Luft in der Mischkammer somit durch die Lüftungsöffnung entweichen kann und somit ein Mischvorgang in der Mischkammer erleichtert werden kann.
Gemäß einer Ausführungsform können eine fluidisch zwischen die erste
Reaktionskammer und die Mischkammer geschaltete Pumpkammer und eine Mehrzahl von Ventilen vorgesehen sein. Auch kann eine Mehrzahl von zweiten Reaktionskammern vorgesehen sein. Dabei kann die erste Reaktionskammer zwischen einem ersten Paar von Ventilen angeordnet sein, kann die
Pumpkammer zwischen einem zweiten Paar von Ventilen angeordnet sein und kann die Mehrzahl von zweiten Reaktionskammern zwischen einer Mehrzahl von dritten Paaren von Ventilen angeordnet sein. Die Kammern der mikrofluidischen Vorrichtung können mittels Kanälen fluidisch verbunden sein, wobei die Ventile ausgebildet sein können, um einen Fluidfluss durch die Kanäle zu beeinflussen. Die Speicherkammer kann über einen Kanal und ein Ventil fluidisch mit der Mischkammer verbunden sein. Eine solche Ausführungsform bietet den Vorteil, dass eine besonders effiziente, platzsparende und konstruktionsunaufwendige mikrofluidische Vorrichtung bereitgestellt werden kann.
Es wird auch ein Verfahren zum Analysieren einer Probe biologischen Materials vorgestellt, wobei das Verfahren unter Verwendung einer mikrofluidischen Vorrichtung ausführbar ist, die eine erste Reaktionskammer, eine fluidisch mit der ersten Reaktionskammer verbundene Mischkammer und zumindest eine fluidisch mit der Mischkammer verbundene, zweite Reaktionskammer aufweist, wobei das Verfahren folgende Schritte aufweist:
Ausführen einer ersten Polymerase- Kettenreaktion an der Probe in der ersten Reaktionskammer, um ein erstes Reaktionsprodukt zu erzeugen;
Mischen des ersten Reaktionsprodukts mit einem Verdünnungsmedium in der Mischkammer, um ein verdünntes Gemisch zu erzeugen; und
Durchführen einer zweiten Polymerase- Kettenreaktion an dem verdünnten Gemisch in der zumindest einen zweiten Reaktionskammer, um die Probe zu analysieren.
Das Verfahren kann in Verbindung mit einer Ausführungsform der vorstehend genannten mikrofluidischen Vorrichtung vorteilhaft ausgeführt werden, um eine Probe biologischen Materials zu analysieren. Ferner kann das Verfahren zwischen dem Schritt des Ausführens und dem Schritt des Mischens einen ersten Schritt des Förderns des ersten Reaktionsprodukts von der ersten
Reaktionskammer in die Mischkammer sowie zwischen dem Schritt des
Mischens und dem Schritt des Durchführens einen zweiten Schritt des Förderns des verdünnten Gemischs von der Mischkammer in die zumindest eine zweite Reaktionskammer aufweisen. Die Schritte des Förderns können durch Ansteuern von zumindest eines Ventils und zusätzlich oder alternativ zumindest einer Fördereinrichtung ausgeführt werden. Dabei können das zumindest eine Ventil und/oder die zumindest eine Fördereinrichtung Schnittstellen aufweisen, die ausgebildet sind, um Ansteuersignale zu empfangen. Gemäß einer Ausführungsform können im Schritt des Mischens Ansteuersignale zum Ansteuern zumindest eines Ventils und zusätzlich oder alternativ zumindest einer Fördereinrichtung der mikrofluidischen Vorrichtung erzeugt werden, um in dem verdünnten Gemisch ein Mischungsverhältnis zu bewirken, das geeignet ist, um Primer aus der ersten Polymerase- Kettenreaktion von der zweiten
Polymerase- Kettenreaktion auszuschließen. Eine solche Ausführungsform bietet den Vorteil, dass exakte Nachweise von Nukleinsäuresequenzen unter
Vermeidung des Einsatzes spezieller oder unterschiedlicher Primer ermöglicht werden.
Bei einer verschachtelten PCR können zwei Polymerase- Kettenreaktionen nacheinander durchgeführt werden. Bei der ersten Polymerase- Kettenreaktion können mehrere Primerpärchen eingesetzt werden, wodurch im Sinne einer multiplex-PCR spezifisch mehrere Nukleinsäuresequenzen bzw. insbesondere
DNA-Sequenzen in einer Reaktionskammer gleichzeitig amplifiziert werden können. Ein PCR-Produkt der ersten Reaktion kann dann auf mehrere räumlich getrennte Reaktionskammern verteilt werden, die jeweils ein Primerpaar enthalten können. Somit können amplifizierte Nukleinsäuremoleküle bzw.
insbesondere DNA-Moleküle der ersten PCR als sogenannte„Template DNA" in der zweiten PCR fungieren. Dadurch ist bei der zweiten PCR im Sinne einer singleplex-PCR in jeder Kammer ein Nukleinsäuremolekül nachweisbar.
Zunächst kann eine zu untersuchende Probenlösung beispielsweise in eine erste Reaktionskammer eingebracht und mittels multiplex-PCR voramplifiziert werden. Bei dieser Reaktion können mehrere, beispielsweise zwischen 5 und 100, verschiedene Abschnitte einer Nukleinsäure vervielfältigt werden. Nach dem Mischen bzw. Verdünnen kann dieses PCR-Produkt beispielsweise auf viele zweite Reaktionskammern verteilt werden, in denen Substanzen wie Polymerase und ein Primerpaar vorgelagert sein können. Dadurch können in den
Einzelkammern verschiedene Nukleinsäuremoleküle in Einzelreaktionen der singleplex-PCR insbesondere im Ablauf parallel bzw. hochparallel nachgewiesen werden.
Der hier vorgestellte Ansatz schafft ferner eine Vorrichtung, die ausgebildet ist, um die Schritte einer Variante eines hier vorgestellten Verfahrens in entsprechenden Einrichtungen durchzuführen, anzusteuern bzw. umzusetzen. Auch durch diese Ausführungsvariante der Erfindung in Form einer Vorrichtung kann die der Erfindung zugrunde liegende Aufgabe schnell und effizient gelöst werden.
Unter einer Vorrichtung kann vorliegend ein elektrisches Gerät verstanden werden, das Sensorsignale verarbeitet und in Abhängigkeit davon Steuer- und/oder Datensignale ausgibt. Die Vorrichtung kann eine Schnittstelle aufweisen, die hard- und/oder softwaremäßig ausgebildet sein kann. Bei einer hardwaremäßigen Ausbildung können die Schnittstellen beispielsweise Teil eines sogenannten System-ASICs sein, der verschiedenste Funktionen der Vorrichtung beinhaltet. Es ist jedoch auch möglich, dass die Schnittstellen eigene, integrierte Schaltkreise sind oder zumindest teilweise aus diskreten Bauelementen bestehen. Bei einer softwaremäßigen Ausbildung können die Schnittstellen Softwaremodule sein, die beispielsweise auf einem Mikrocontroller neben anderen Softwaremodulen vorhanden sind.
Von Vorteil ist auch ein Computerprogrammprodukt mit Programmcode, der auf einem maschinenlesbaren Träger wie einem Halbleiterspeicher, einem
Festplattenspeicher oder einem optischen Speicher gespeichert sein kann und zur Durchführung und/oder Ansteuerung der Schritte des Verfahrens nach einer der vorstehend beschriebenen Ausführungsformen verwendet wird,
insbesondere wenn das Programmprodukt auf einem Computer oder einer Vorrichtung ausgeführt wird.
Der hier vorgestellte Ansatz wird nachstehend anhand der beigefügten
Zeichnungen beispielhaft näher erläutert. Es zeigen:
Fig. 1 eine schematische Darstellung einer mikrofluidischen Vorrichtung gemäß einem Ausführungsbeispiel der vorliegenden Erfindung;
Fig. 2 eine schematische Darstellung einer mikrofluidischen Vorrichtung gemäß einem Ausführungsbeispiel der vorliegenden Erfindung; Figuren 3 und 4 Vergleichsdarstellungen von Analyseergebnissen gemäß Ausführungsbeispielen der vorliegenden Erfindung; und
Fig. 5 ein Ablaufdiagramm eines Verfahrens gemäß einem
Ausführungsbeispiel der vorliegenden Erfindung.
In der nachfolgenden Beschreibung günstiger Ausführungsbeispiele der vorliegenden Erfindung werden für die in den verschiedenen Figuren
dargestellten und ähnlich wirkenden Elemente gleiche oder ähnliche
Bezugszeichen verwendet, wobei auf eine wiederholte Beschreibung dieser Elemente verzichtet wird.
Fig. 1 zeigt eine schematische Darstellung einer mikrofluidischen Vorrichtung 100 zum Analysieren einer Probe biologischen Materials gemäß einem
Ausführungsbeispiel der vorliegenden Erfindung. Dabei ist die Mikrofluidische Vorrichtung 100 beispielsweise als ein mikrofluidischer Chip bzw. ein
Westentaschenlabor bzw. LoC (engl. Lab on Chip) ausgeführt, insbesondere zur medizinischen Diagnostik, mikrobiologischen Diagnostik oder Umweltanalytik. Gezeigt sind von der mikrofluidischen Vorrichtung 100 in Fig. 1 hierbei eine erste Reaktionskammer 110, eine Pumpkammer 120, eine Mischkammer 130, eine Lüftungsöffnung 140, eine Mehrzahl von zweiten Reaktionskammern 150, wobei in Fig. 1 lediglich beispielhaft vier zweite Reaktionskammern 150 gezeigt sind, sowie eine Mehrzahl von Ventilen 161, 162, 163, 164, 165 und 166.
Die erste Reaktionskammer 110 ist zwischen einem ersten Ventil 161 und einem zweiten Ventil 162 angeordnet. Dabei ist das erste Ventil 161 in einem
mikrofluidischen Zufuhrkanal angeordnet. Über den mikrofluidischen Zufuhrkanal ist die Probe in die erste Reaktionskammer 110 zuführbar. Die erste
Reaktionskammer 110 ist ausgebildet, um eine erste Polymerase- Kettenreaktion an der Probe auszuführen, um ein erstes Reaktionsprodukt zu erzeugen. Das zweite Ventil 162 ist in einem ersten mikrofluidischen Verbindungskanal angeordnet. Die erste Reaktionskammer 110 ist mittels des ersten
mikrofluidischen Verbindungskanals fluidisch mit der Pumpkammer 120 verbunden. Die Pumpkammer 120 ist zwischen einem dritten Ventil 163 und einem vierten Ventil 164 angeordnet. Dabei ist das dritte Ventil 163 dem ersten
mikrofluidischen Verbindungskanal angeordnet. Somit sind zwischen der ersten Reaktionskammer 110 und der Pumpkammer 120 in dem ersten mikrofluidischen Verbindungskanal das zweite Ventil 162 und das dritte Ventil 163 angeordnet.
Die Pumpkammer 120 ist mittels eines zweiten mikrofluidischen
Verbindungskanals fluidisch mit der Mischkammer 130 verbunden. Das vierte Ventil 164 ist in dem zweiten mikrofluidischen Verbindungskanal angeordnet. Die Pumpkammer 120 ist fluidisch zwischen der ersten Reaktionskammer 110 und der Mischkammer 130 angeordnet.
Die Mischkammer 130 ist über den zweiten mikrofluidischen Verbindungskanal fluidisch mit der Pumpkammer 120 verbunden. Das vierte Ventil 164 ist hierbei zwischen der Pumpkammer 120 und der Mischkammer 130 in dem zweiten mikrofluidischen Verbindungskanal angeordnet. Somit ist die Mischkammer 130 über den zweiten mikrofluidischen Verbindungskanal, die Pumpkammer 120 und den ersten mikrofluidischen Verbindungskanal fluidisch mit der ersten
Reaktionskammer 110 verbunden. Das erste Reaktionsprodukt ist von der ersten Reaktionskammer 110 über die Pumpkammer 120 in die Mischkammer 130 zuführbar. In der Mischkammer 130 ist ein Verdünnungsmedium vorlagerbar bzw. vorgelagert. Die Mischkammer 130 ist ausgebildet, um das erste
Reaktionsprodukt aus der ersten Reaktionskammer 110 mit dem
Verdünnungsmedium zu mischen, um ein verdünntes Gemisch zu erzeugen. Die Lüftungsöffnung 140 ist in der Mischkammer 130 ausgeformt. Auch wenn es in Fig. 1 darstellungsbedingt nicht explizit erkennbar ist, so ist die
Lüftungsöffnung 140 als eine Durchgangsöffnung zwischen der Mischkammer 130 und einer Außenoberfläche der mikrofluidischen Vorrichtung 100
angeordnet. Dabei ist die Lüftungsöffnung 140 als eine Ausgleichsöffnung relativ zu einem Umgebungsdruck ausgeformt.
Zwischen dem zweiten Ventil 162 und dem dritten Ventil 163 ist gemäß dem in Fig. 1 dargestellten Ausführungsbeispiel der vorliegenden Erfindung eine Verzweigungsstelle in dem ersten mikrofluidischen Verbindungskanal zwischen der ersten Reaktionskammer 110 und der Pumpkammer 120 angeordnet. An der Verzweigungsstelle zweigt von dem ersten mikrofluidischen Verbindungskanal ein dritter mikrofluidischer Verbindungskanal ab. Der dritte mikrofluidische Verbindungskanal erstreckt sich zwischen der Verzweigungsstelle und den beispielhaft vier zweiten Reaktionskammern 150. Dabei verzweigt sich der dritte mikrofluidische Verbindungskanal in vier Teilkanäle.
Jede der beispielhaft vier zweiten Reaktionskammern 150 ist zwischen einem fünften Ventil 165 und einem sechsten Ventil 166 angeordnet. Somit sind gemäß dem in Fig. 1 dargestellten Ausführungsbeispiel der vorliegenden Erfindung vier fünfte Ventile 165 und vier sechste Ventile 166 vorgesehen. Dabei ist jedes der fünften Ventile 165 in einem der Teilkanäle des dritten mikrofluidischen
Verbindungskanals angeordnet. Die zweiten Reaktionskammern 150 sind über die mikrofluidischen Verbindungskanäle fluidisch mit der Mischkammer 130 verbunden. Über den dritten mikrofluidischen Verbindungskanal ist das verdünnte Gemisch aus der Mischkammer 130 in die zweiten Reaktionskammern 150 zuführbar. Die zweiten Reaktionskammern 150 sind ausgebildet, um zum Analysieren der Probe eine zweite Polymerase- Kettenreaktion an dem
verdünnten Gemisch durchzuführen. Die beispielhaft vier sechsten Ventile 166 sind in vier Teilkanälen angeordnet, die sich in einem mikrofluidischen
Abfuhrkanal vereinigen.
Auch wenn es in Fig. 1 nicht explizit erkennbar ist, so ist gemäß dem in Fig. 1 dargestellten Ausführungsbeispiel der vorliegenden Erfindung in der ersten Reaktionskammer 110 zumindest eine Substanz zum Ausführen der ersten Polymerase- Kettenreaktion vorgelagert. Ferner ist in der Mischkammer 130 zumindest eine erste Substanz zum Durchführen der zweiten Polymerase- Kettenreaktion vorgelagert. Schließlich ist in den zweiten Reaktionskammern 150 zumindest eine zweite Substanz zum Durchführen der zweiten Polymerase- Kettenreaktion vorgelagert. Die mikrofluidische Vorrichtung 100 ist insbesondere ausgebildet, um ein verdünntes Gemisch mit einem Mischungsverhältnis zu erzeugen, das geeignet ist, um Primer aus der ersten Polymerase- Kettenreaktion von der zweiten Polymerase- Kettenreaktion zumindest teilweise auszuschließen. Die Ventile 161, 162, 163, 164, 165 und 166 können Schnittstellen aufweisen, die ausgebildet sind, um Ansteuersignale zu empfangen. Gemäß einem Ausführungsbeispiel sind ein Volumen der ersten
Reaktionskammer 110 und ein Volumen der Mischkammer 130 ausgebildet, um in dem verdünnten Gemisch ein Mischungsverhältnis zu bewirken, das geeignet ist, um Primer aus der ersten Polymerase- Kettenreaktion von der zweiten Polymerase- Kettenreaktion in den zweiten Reaktionskammern 150 zumindest teilweise auszuschließen.
Anders ausgedrückt zeigt Fig. 1 eine schematische Aufsicht der mikrofluidischen Vorrichtung 100 gemäß einem Ausführungsbeispiel. Die mikrofluidische
Vorrichtung 100 ist beispielsweise als ein mikrofluidischer Chip ausgeführt und umfasst unter anderem die erste Reaktionskammer 110 für die Durchführung einer ersten Polymerase- Kettenreaktion bzw. PCR (engl. Polymerase Chain Reaction) als eine multiplex-PCR, die Pumpkammer 120, die Mischkammer 130 und die zweiten Reaktionskammern 150 für die Durchführung der zweiten PCR als singleplex- Polymerase- Kettenreaktionen. Dabei sind Substanzen bzw.
Reaktionskomponenten für die erste PCR, wie beispielsweise Polymerase, unterschiedliche Primerpärchen für eine gemultiplexte PCR,
Nukleosidtriphosphate, insbesondere Desoxyribonukleosidtriphosphate bzw. dNTP, PCR-Puffer, Additive und dergleichen, in der ersten Reaktionskammer 110 vorgelagert. Substanzen bzw. Reaktionskomponenten für die zweite PCR, wie beispielsweise dNTP, PCR-Puffer und Additive, sind in dem
Verdünnungsmedium in der Mischkammer 130 vorgelagert. Polymerase, Primerpärchen und beispielsweise real-time-Sonden bzw. Sonden für die Durchführung einer real-time-PCR, sind in den zweiten Reaktionskammern 150 vorgelagert.
Im Betrieb der mikrofluidischen Vorrichtung 100 wird die Probe bzw. DNA-Probe in die erste Reaktionskammer 110 eingefüllt und mit den dort vorgelagerten Reaktionskomponenten vermischt. Wenn das erste Ventil 161 und das zweite Ventil 162 geschlossen sind, werden Reaktionsbedingungen für die erste PCR geschaffen. Anschließend wird mittels einer Fördereinrichtung, welche die Pumpkammer 120 und das dritte Ventil 163 sowie das vierte Ventil 164 als Pumpventile aufweist, das erste Reaktionsprodukt aus der ersten PCR bzw. das Flüssigkeitsvolumen der ersten Reaktionskammer 110 in die Mischkammer 130 überführt und mit dem darin befindlichen Verdünnungsmedium vermischt. Eine Verdrängung überschüssiger Luft der Mischkammer 130 erfolgt hierbei über die Lüftungsöffnung 140. Das verdünnte Gemisch wird mittels der Pumpkammer 120 bei geschlossenem zweiten Ventil 162 auf die zweiten Reaktionskammern 150 verteilt. Anschließend werden die fünften Ventile 165 und sechsten Ventile 166 geschlossen und Reaktionsbedingungen für die zweite PCR geschaffen. Ein Reaktionsverlauf kann entweder in Echtzeit (engl, real time) verfolgt werden, wobei quantitative Informationen über eine initiale Menge jeweiliger DNA- Moleküle gewonnen werden können, oder am Ende der zweiten Reaktion gemessen werden, wobei ja/nein-Aussagen möglich sind. Gemäß dem in Fig. 1 gezeigten Ausführungsbeispiel der vorliegenden Erfindung ist ist das
Mischungsverhältnis bzw. eine Verdünnungsstufe durch eine Menge an vorgelagertem Verdünnungsmedium in der Mischkammer 130 bestimmt.
Gemäß einem im Bezug zu dem in Fig. 1 gezeigten Ausführungsbeispiel vereinfachten Ausführungsbeispiel einer mikrofluidischen Vorrichtung 100 neben der ersten Reaktionskammer 110 und der Mischkammer 130 noch zumindest eine zweite Reaktionskammer 150. Ein in die zweite Reaktionskammer 150 führender Kanal kann, wie in Fig. 1 gezeigt, von einem Verbindungskanal zwischen der ersten Reaktionskammer 110 und der Mischkammer 130 abzweigen, oder alternativ von der Mischkammer 130 in die zweite
Reaktionskammer 150 führen. Eine optionale Pumpkammer 120 kann an einer geeigneten Position eines die Kammern 110, 130, 150 verbindenden
Verbindungskanalnetzes angeordnet sein.
Fig. 2 zeigt eine schematische Darstellung einer mikrofluidischen Vorrichtung 100 zum Analysieren einer Probe biologischen Materials gemäß einem
Ausführungsbeispiel der vorliegenden Erfindung. Hierbei entspricht die mikrofluidische Vorrichtung 100 der mikrofluidischen Vorrichtung aus Fig. 1 mit der Ausnahme, dass die mikrofluidische Vorrichtung 100 in Fig. 2 zusätzlich ein siebtes Ventil 267 und eine Speicherkammer 270 aufweist. Somit sind von der mikrofluidischen Vorrichtung 100 in Fig. 2 die erste Reaktionskammer 110, die Pumpkammer 120, die Mischkammer 130, die Lüftungsöffnung 140, die lediglich beispielhaft vier zweiten Reaktionskammern 150, die Ventile 161, 162, 163, 164, 165, 166 sowie 267 und die Speicherkammer 270 gezeigt. Die Speicherkammer 270 ist über einen vierten mikrofluidischen
Verbindungskanal fluidisch mit der Verzweigungsstelle in dem ersten
mikrofluidischen Verbindungskanal zwischen der ersten Reaktionskammer 110 und der Pumpkammer 120 verbunden. Das siebte Ventil 267 ist in dem vierten mikrofluidischen Verbindungskanal angeordnet. Die Speicherkammer 270 ist ausgebildet, um das Verdünnungsmedium zu speichern. Mit der Mischkammer 130 ist die Speicherkammer 270 fluidisch über den vierten mikrofluidischen Verbindungskanal fluidisch verbunden. Somit ist das erste Reaktionsprodukt in der Mischkammer 130 mit dem Verdünnungsmedium aus der Speicherkammer 270 in einem einstellbaren Mischungsverhältnis verdünnbar.
Anders ausgedrückt zeigt Fig. 2 eine Struktur der mikrofluidischen Vorrichtung 100, bei der unterschiedliche Verdünnungsstufen des ersten Reaktionsprodukts für die zweite PCR einstellbar sind. Gemäß dem in Fig. 2 dargestellten
Ausführungsbeispiel der vorliegenden Erfindung ist das Verdünnungsmedium für die zweite PCR in der Speicherkammer 270 vorgelagert. Ein Reaktionsvolumen der ersten PCR bzw. das erste Reaktionsprodukt wird mittels der Pumpkammer 120 in die Mischkammer 130 transferiert. Mittels der Pumpkammer 120 wird eine definierte Menge des Verdünnungsmediums aus der Speicherkammer 270 ebenfalls der Mischkammer 130 zugeführt und dort mit dem ersten
Reaktionsprodukt vermischt. Dieses verdünnte Gemisch wird nun, wie es in Fig. 1 beschrieben ist, auf die zweiten Reaktionskammern 150 verteilt, und dort bei der zweiten PCR temperaturzykliert. Somit sind hierbei ohne Designänderung verschiedene Verdünnungsstufen des ersten Reaktionsprodukts in dem verdünnten Gemisch einstellbar.
Fig. 3 zeigt eine Vergleichsdarstellung von Analyseergebnissen gemäß einem Ausführungsbeispiel der vorliegenden Erfindung. Die Analyseergebnisse sind dabei durch händisches Pipettieren unter Verwendung von Eppendorf-Tubes (= Reaktionsgefäße) entstanden: Die Ergebnisse zeigen, dass die Grundidee
(Inaktivierung von Primern einer ersten PCR-Reaktion mittels Verdünnen) funktioniert.
Anders ausgedrückt zeigt Fig. 3 eine Vergleichsdarstellung einer
Gelelektrophorese von Analyseergebnissen einer„Diluted Nested PCR" gemäß Ausführungsbeispielen der vorliegenden Erfindung, durchgeführt in einem Labor- PCR-Gerät. Das erste Reaktionsprodukt bzw. ein PCR-Produkt einer ersten PCR, einer multiplex-PCR, wurde um unterschiedliche Verdünnungsfaktoren verdünnt und als sogenannte Template-DNA für die zweite PCR, in Gestalt mehrerer singleplex-PCRs, verwendet. Dabei wurde ein Primerpaar für das PVL-
Gen eingesetzt. Einige der Spalten A, B, C, D, E, F, G und H in Fig. 3
repräsentieren hierbei die Analyseergebnisse, die aufgrund unterschiedlicher Verdünnungsfaktoren erhalten wurden.
In Spalte A ist ein PCR-Produkt der ersten PCR bzw. ein erstes
Reaktionsprodukt gezeigt. Spalte B zeigt ein zweites Reaktionsprodukt bzw. ein PCR-Produkt der zweiten PCR, für die das erste Reaktionsprodukt um den Faktor 50 verdünnt als Template-DNA eingesetzt wurde. In Spalte C ist ein zweites Reaktionsprodukt bzw. ein PCR-Produkt der zweiten PCR gezeigt, für die das erste Reaktionsprodukt um den Faktor 500 verdünnt als Template-DNA eingesetzt wurde. Spalte D zeigt ein zweites Reaktionsprodukt bzw. ein PCR- Produkt der zweiten PCR, für die das erste Reaktionsprodukt um den Faktor 5000 verdünnt als Template-DNA eingesetzt wurde. In Spalte E ist ein zweites Reaktionsprodukt bzw. ein PCR-Produkt der zweiten PCR gezeigt, für die das erste Reaktionsprodukt um den Faktor 50000 verdünnt als Template-DNA eingesetzt wurde. Spalte F zeigt ein zweites Reaktionsprodukt bzw. ein PCR- Produkt der zweiten PCR, für die das erste Reaktionsprodukt um den Faktor 500000 verdünnt als Template-DNA eingesetzt wurde. In Spalte G ist eine Negativkontrolle dargestellt und Spalte H zeigt eine DNA-Leiter, lediglich beispielhaft vom Typ 50 bp plus.
Fig. 4 zeigt eine Vergleichsdarstellung von Analyseergebnissen gemäß einem Ausführungsbeispiel der vorliegenden Erfindung. Die Analyseergebnisse sind dabei durch händisches Pipettieren unter Verwendung von Eppendorf-Tubes (= Reaktionsgefäße) entstanden: Die Ergebnisse zeigen, dass die Grundidee
(Inaktivierung von Primern einer ersten PCR-Reaktion mittels Verdünnen) funktioniert.
Anders ausgedrückt zeigt Fig. 4 eine Vergleichsdarstellung einer
Gelelektrophorese von Analyseergebnissen einer„Diluted Nested PCR" gemäß Ausführungsbeispielen der vorliegenden Erfindung, durchgeführt in einem Labor- PCR-Gerät. Das erste Reaktionsprodukt bzw. ein PCR-Produkt einer ersten PCR, einer multiplex-PCR, wurde um unterschiedliche Verdünnungsfaktoren verdünnt und als sogenannte Template-DNA für die zweite PCR, in Gestalt mehrerer singleplex-PCRs, verwendet. Dabei wurde ein Primerpaar für das
SSCl-Gen eingesetzt. Einige der Spalten A, B, C, D, E, F, G und H in Fig. 4 repräsentieren hierbei die Analyseergebnisse, die aufgrund unterschiedlicher Verdünnungsfaktoren erhalten wurden.
In Spalte A ist ein PCR-Produkt der ersten PCR bzw. ein erstes
Reaktionsprodukt gezeigt und Spalte B zeigt eine DNA-Leiter, lediglich beispielhaft vom Typ 50 bp plus. Spalte C zeigt ein zweites Reaktionsprodukt bzw. ein PCR-Produkt der zweiten PCR, für die das erste Reaktionsprodukt um den Faktor 50 verdünnt als Template-DNA eingesetzt wurde. In Spalte D ist ein zweites Reaktionsprodukt bzw. ein PCR-Produkt der zweiten PCR gezeigt, für die das erste Reaktionsprodukt um den Faktor 500 verdünnt als Template-DNA eingesetzt wurde. Spalte E zeigt ein zweites Reaktionsprodukt bzw. ein PCR- Produkt der zweiten PCR, für die das erste Reaktionsprodukt um den Faktor 5000 verdünnt als Template-DNA eingesetzt wurde. In Spalte F ist ein zweites Reaktionsprodukt bzw. ein PCR-Produkt der zweiten PCR gezeigt, für die das erste Reaktionsprodukt um den Faktor 50000 verdünnt als Template-DNA eingesetzt wurde. Spalte G zeigt ein zweites Reaktionsprodukt bzw. ein PCR- Produkt der zweiten PCR, für die das erste Reaktionsprodukt um den Faktor 500000 verdünnt als Template-DNA eingesetzt wurde. In Spalte H ist eine Negativkontrolle dargestellt.
Fig. 5 zeigt ein Ablaufdiagramm eines Verfahrens 500 zum Analysieren einer Probe biologischen Materials gemäß einem Ausführungsbeispiel der
vorliegenden Erfindung. Das Verfahren 500 ist unter Verwendung einer mikrofluidischen Vorrichtung ausführbar, die eine erste Reaktionskammer, eine fluidisch mit der ersten Reaktionskammer verbundene Mischkammer und zumindest eine fluidisch mit der Mischkammer verbundene, zweite
Reaktionskammer aufweist. Insbesondere ist das Verfahren 500 unter
Verwendung einer mikrofluidischen Vorrichtung ausführbar, wie sie
beispielsweise anhand der Fig. 1 bzw. Fig. 2 beschrieben ist. Das Verfahren 500 weist einen Schritt 510 des Ausführens einer ersten
Polymerase- Kettenreaktion an der Probe in der ersten Reaktionskammer auf, um ein erstes Reaktionsprodukt zu erzeugen. Auch weist das Verfahren 500 einen Schritt 520 des Mischens Des ersten Reaktionsprodukts mit einem
Verdünnungsmedium in der Mischkammer auf, um ein verdünntes Gemisch zu erzeugen. Ferner weist das Verfahren 500 einen Schritt 530 des Durchführens einer zweiten Polymerase- Kettenreaktion an dem verdünnten Gemisch in der zumindest einen zweiten Reaktionskammer auf, um die Probe zu analysieren.
Gemäß einem Ausführungsbeispiel werden im Schritt 520 des Mischens
Ansteuersignale zum Ansteuern zumindest eines Ventils und zusätzlich oder alternativ zumindest einer Fördereinrichtung der mikrofluidischen Vorrichtung erzeugt, um in dem verdünnten Gemisch ein Mischungsverhältnis zu bewirken, das geeignet ist, um Primer aus der ersten Polymerase- Kettenreaktion von der zweiten Polymerase- Kettenreaktion zumindest teilweise auszuschließen.
Im Folgenden werden Ausführungsbeispiele der vorliegenden Erfindung unter Bezugnahme auf die Figuren 1 bis 5 zusammenfassend und in anderen Worten erläutert.
Die Vergleichsdarstellungen aus den Figuren 3 und 4 zeigen, dass bei
Verdünnen des ersten Reaktionsprodukts bzw. des PCR-Produkts der ersten PCR, der multiplex-PCR, um den Faktor 500 mit Verdünnungsmedium in der Mischkammer 130 dann in der zumindest einen nachgeschalteten singleplex-
PCR, der zweiten PCR, ein einziges, spezifisches PCR-Produkt generiert wird. Eine Verdünnung des ersten Reaktionsprodukts kann verhindern, dass die Primer der ersten PCR auch in der zweiten PCR noch aktiv sind. Somit kann in der zweiten PCR nur das gewünschte singleplex-PCR-Produkt generiert werden, und nicht auch alle anderen, von den multiplex-Primerpärchen adressierten,
PCR- Produkte. So kann eine erhöhte Reaktionseffizienz bei sparsamerem Verbrauch von Reaktionskomponenten und Erhöhung einer Enzymaktivität erreicht werden, weshalb beispielsweise auch DNA-Sequenzen in kleinen Menge nachgewiesen werden können. Gemäß einem Ausführungsbeispiel wird um einen Faktor 50 verdünnt. Hierbei kann eine teilweise Inaktivierung der Primerpärchen der ersten PCR erreicht werden, wie es in Fig. 3, Spalte B bzw. Fig. 4, Spalte C dargestellt ist. Die nötige Spezifität kann durch einen Einsatz von realtime-Sonden, die Signale nur bei Vorhandensein einer bestimmten DNA-Sequenz liefern, in der zweiten PCR erhalten werden. Wird dies beispielsweise unter Verwendung der
mikrofluidischen Vorrichtung 100 aus Fig. 2 realisiert, so weist beispielsweise die erste Reaktionskammer 110 ein Volumen von 10 Mikroliter auf und weist die Speicherkammer 270, die das Verdünnungsmedium mit Reaktionskomponenten enthält, ein Volumen von 490 Mikroliter auf.
Gemäß Ausführungsbeispielen der vorliegenden Erfindung kann eine Dicke der mikrofluidischen Vorrichtung 100 beispielsweise 0,5 bis 5 Millimeter betragen, wobei Kanaldurchmesser von mikrofluidischen Kanälen 10 Mikrometer bis 3 Millimeter und Volumen von Kammern zwischen 1 Kubikmillimeter bis 1000 Kubikmillimeter betragen können.
Ein beispielhafter Prozessablauf umfasst für eine erste PCR einen
Parameterraum mit einer Anzahl von 1 bis 20 Thermozyklen, wobei
Temperaturzyklen mit 93 Grad Celsius bis 96 Grad Celsius zur Denaturierung, 72 Grad Celsius zur Verlängerung, 54 Grad Celsius bis 65 Grad Celsius zur Primeranbindung vorgesehen sind, wobei es auch möglich ist, den Schritt auf der Verlängerungstemperatur wegzulassen und somit eine zweischrittige PCR durchzuführen. Für eine zweite PCR umfasst ein Parameterraum eine Anzahl von 20 bis 60 Thermozyklen, wobei Temperaturzyklen mit 93 Grad Celsius bis 96 Grad Celsius zur Denaturierung, 72 Grad Celsius zur Verlängerung, 54 Grad Celsius bis 65 Grad Celsius zur Primeranbindung vorgesehen sind, wobei es auch möglich ist, den Schritt auf der Verlängerungstemperatur wegzulassen und somit eine zweischrittige PCR durchzuführen. Eine Anzahl an Polymerase- Kettenreaktionen liegt beispielsweise für die erste PCR zwischen 1 und 20 Reaktionen und für die zweite PCR zwischen 1 und 50 Reaktionen.
Eine Messung eines PCR- Reaktionserfolgs umfasst beispielsweise einen Einsatz von Hydrolysesonden, beispielsweise TaqMan-Sonden, LightCycler-Sonden, LoopTag-Sonden, Scorpion-Primer oder Molecular Beacons. Hierbei kann an einem ansteigenden Fluoreszenzsignal der Reaktionserfolg bestimmt werden. Auch denkbar sind eine elektrische Auslese mittels ISFETs, eine
Impedanzmessung, eine Messung eines oberflächengebundenen PCR-Produkts mittels Interdigitalelektrodenstrukturen oder dergleichen.
Die beschriebenen und in den Figuren gezeigten Ausführungsbeispiele sind nur beispielhaft gewählt. Unterschiedliche Ausführungsbeispiele können vollständig oder in Bezug auf einzelne Merkmale miteinander kombiniert werden. Auch kann ein Ausführungsbeispiel durch Merkmale eines weiteren Ausführungsbeispiels ergänzt werden.
Ferner können die hier vorgestellten Verfahrensschritte wiederholt sowie in einer anderen als in der beschriebenen Reihenfolge ausgeführt werden.
Umfasst ein Ausführungsbeispiel eine„und/oder"- Verknüpfung zwischen einem ersten Merkmal und einem zweiten Merkmal, so ist dies so zu lesen, dass das Ausführungsbeispiel gemäß einer Ausführungsform sowohl das erste Merkmal als auch das zweite Merkmal und gemäß einer weiteren Ausführungsform entweder nur das erste Merkmal oder nur das zweite Merkmal aufweist.

Claims

Ansprüche
1. IVlikrofluidische Vorrichtung (100) zum Analysieren einer Probe
biologischen Materials, wobei die mikrofluidische Vorrichtung (100) folgende Merkmale aufweist: eine erste Reaktionskammer (110), die ausgebildet ist, um eine erste Polymerase- Kettenreaktion an der Probe auszuführen, um ein erstes Reaktionsprodukt zu erzeugen; eine fluidisch mit der ersten Reaktionskammer (110) verbundene oder verbindbare Mischkammer (130), die ausgebildet ist, um das erste Reaktionsprodukt mit einem Verdünnungsmedium zu mischen, um ein verdünntes Gemisch zu erzeugen; und zumindest eine fluidisch mit der Mischkammer (130) verbundene oder verbindbare, zweite Reaktionskammer (150), die ausgebildet ist, um zum Analysieren der Probe eine zweite Polymerase- Kettenreaktion an dem verdünnten Gemisch durchzuführen.
2. Mikrofluidische Vorrichtung (100) gemäß Anspruch 1, bei der in der ersten Reaktionskammer (110) zumindest eine Substanz zum Ausführen der ersten Polymerase- Kettenreaktion vorgelagert ist oder sein kann, wobei in der Mischkammer (130) das Verdünnungsmedium vorgelagert ist, wobei in der zumindest einen zweiten Reaktionskammer (150) und/oder in der Mischkammer (130) zumindest eine Substanz zum Durchführen der zweiten Polymerase- Kettenreaktion vorgelagert ist.
3. Mikrofluidische Vorrichtung (100) gemäß Anspruch 1, mit einer fluidisch mit der Mischkammer (130) verbundenen oder verbindbaren
Speicherkammer (270) zum Speichern von Verdünnungsmedium, wobei in der ersten Reaktionskammer (110) zumindest eine Substanz zum Ausführen der ersten Polymerase- Kettenreaktion vorgelagert ist oder sein kann, wobei in der Speicherkammer (270) das
Verdünnungsmedium vorgelagert ist, wobei in der zumindest einen zweiten Reaktionskammer (150), in der Speicherkammer (270) und/oder in der Mischkammer (130) zumindest eine Substanz zum Durchführen der zweiten Polymerase- Kettenreaktion vorgelagert ist.
Mikrofluidische Vorrichtung (100) gemäß einem der vorangegangenen Ansprüche, bei der ein Volumen der ersten Reaktionskammer (110) und ein Volumen der Mischkammer (130) ausgebildet sind, um in dem verdünnten Gemisch ein Mischungsverhältnis zu bewirken, das geeignet ist, um Primer aus der ersten Polymerase- Kettenreaktion von der zweiten Polymerase- Kettenreaktion auszuschließen.
Mikrofluidische Vorrichtung (100) gemäß einem der vorangegangenen Ansprüche, mit einer Lüftungsöffnung (140), die in der Mischkammer (130) als Ausgleichsöffnung relativ zu einem Umgebungsdruck ausgeformt ist.
Mikrofluidische Vorrichtung (100) gemäß einem der vorangegangenen Ansprüche, mit einer fluidisch zwischen die erste Reaktionskammer (110) und die Mischkammer (130) geschalteten Pumpkammer (120) und einer Mehrzahl von Ventilen (161, 162, 163, 164, 165, 166, 267), wobei eine Mehrzahl von zweiten Reaktionskammern (150) vorgesehen ist, wobei die erste Reaktionskammer (110) zwischen einem ersten Paar von Ventilen (161, 162) angeordnet ist, die Pumpkammer (120) zwischen einem zweiten Paar von Ventilen (163, 164) angeordnet ist und die Mehrzahl von zweiten Reaktionskammern zwischen einer Mehrzahl von dritten Paaren von Ventilen (165, 166) angeordnet ist.
Verfahren (500) zum Analysieren einer Probe biologischen Materials, wobei das Verfahren unter Verwendung einer mikrofluidischen
Vorrichtung (100) ausführbar ist, die eine erste Reaktionskammer (110), eine fluidisch mit der ersten Reaktionskammer (110) verbundene Mischkammer (130) und zumindest eine fluidisch mit der Mischkammer (130) verbundene, zweite Reaktionskammer (150) aufweist, wobei das Verfahren (500) folgende Schritte aufweist:
Ausführen (510) einer ersten Polymerase- Kettenreaktion an der Probe in der ersten Reaktionskammer (110), um ein erstes Reaktionsprodukt zu erzeugen;
Mischen (520) des ersten Reaktionsprodukts mit einem
Verdünnungsmedium in der Mischkammer (130), um ein verdünntes Gemisch zu erzeugen; und
Durchführen (530) einer zweiten Polymerase- Kettenreaktion an dem verdünnten Gemisch in der zumindest einen zweiten Reaktionskammer (150), um die Probe zu analysieren.
Verfahren (500) gemäß Anspruch 7, bei dem im Schritt (520) des Mischens Ansteuersignale zum Ansteuern zumindest eines Ventils (161, 162, 163, 164, 165, 166, 267) und/oder zumindest einer
Fördereinrichtung der mikrofluidischen Vorrichtung (100) erzeugt werden, um in dem verdünnten Gemisch ein Mischungsverhältnis zu bewirken, das geeignet ist, um Primer aus der ersten Polymerase- Kettenreaktion von der zweiten Polymerase- Kettenreaktion
auszuschließen.
Vorrichtung, die ausgebildet ist, um alle Schritte eines Verfahrens (500) gemäß einem der Ansprüche 7 bis 8 durchzuführen.
Computerprogramm, das dazu eingerichtet ist, alle Schritte eines Verfahrens (500) gemäß einem der Ansprüche 7 bis 8 durchzuführen.
Maschinenlesbares Speichermedium mit einem darauf gespeicherten Computerprogramm nach Anspruch 10.
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