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Die vorliegende Erfindung bezieht sich allgemein auf ein Kit für die Amplifikation von Nukleinsäuren. Insbesondere betrifft die Erfindung ein Kit für die Amplifikation von Nukleinsäuren mittels Real Time PCR-Technologie, die viral, genomisch, synthetisch oder von anderer Natur sind.
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Die molekularbiologischen Techniken, die als NAT (Nucleic Acid Technology, Nukleinsäure-Technologie) bezeichnet werden, mit anderen Worten Amplifikation von Nukleinsäuren, haben in den letzten zwanzig Jahren eine sehr beachtliche Entwicklung durchgemacht, so dass sie gegenwärtig als Referenztechniken für Diagnostik in vielen Sektoren, wie beispielsweise viraler, bakterieller, und protozoischer, bis hin zu genetischen Krankheiten und forensischer Medizin angesehen werden.
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Zusätzlich zu den qualitativen Techniken für die Identifikation von Pathogenen sind kürzlich Verfahren für die Quantifizierung von Nukleinsäuren entwickelt worden und erregen immer größeres Interesse. Die erste Anwendung dieser Techniken fand im viralen Feld für die Quantifizierung des HCV-Virus statt, die bedeutsam für die Behandlung und Nachuntersuchung des Patienten ist.
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Die am weitesten verbreitete Nukleinsäure-Amplifikationstechnik basiert auf einem Verfahren, das als die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) bezeichnet wird, die, in ihren jüngsten Arten der Umsetzung (Real Time PCR), Proben, die mit fluoreszenten Molekülen markiert sind, benutzt. Kurz gesagt basiert das PCR-Verfahren auf der Verwendung spezifischer Oligonukleotid-Primer für die Reaktion einer thermisch stabilen Polymerase, wie beispielsweise Taq-Polymerase (Thermus aquaticus) oder Tth-Polymerase (Thermus thermophilus), auf einem DNA-Templat.
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Wo es notwendig ist, von einem RNA-Templat zu beginnen (zum Beispiel im Fall von RNA-Viren, wie beispielsweise HCV, HIV oder SARS), ist es notwendig, einen Anfangsschritt reverser Transkription durchzuführen unter Verwendung einer reversen Transkriptase (zum Beispiel AMV RT oder MoMULV), um eine Hybriddoppelhelix zu erhalten, die aus einem Strang RNA und einem Strang cDNA besteht. Im Fall von RNA können auch Enzyme, wie beispielsweise die Tth-Polymerase, die die doppelte Aktivität reverser Transkription und Polymerisation aufweisen, benutzt werden.
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Die Wiederholung von Zyklen, umfassend eine Denaturierungsphase, in der die zwei Helices der DNA getrennt werden, eine Annealing-Phase, in der die Primer spezifisch an komplementäre Sequenzen auf der Ziel-DNA hybridisieren (die sogenannten Zielsequenzen) und eine Elongationsphase, in der die thermisch stabile Polymerase ein Kopie-Molekül auf dem Templat der Ziel-DNA synthetisiert, machen es möglich, eine sehr beachtliche Anreicherung der anfänglichen Ziel-DNA sicherzustellen.
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In einer besonders verbreiteten Umsetzungsart des PCR-Verfahrens, das Real Time PCR genannt wird, wird die Bestimmung der Menge an Nukleinsäure, die in einer Probe vorhanden ist, bewirkt, während die Reaktion abläuft, mit anderen Worten tatsächlich „in Echtzeit”. Das Prinzip der Real Time PCR basiert, wie oben erwähnt, auf der Detektion und der Quantifizierung des fluoreszenten Signals, das sich während der Amplifikationsreaktion entwickelt, wenn die Probe positiv für das gesuchte Pathogen ist. In dieser Reaktion werden Sonden, die spezifisch sind für die Sequenzen, die mit den Primern der Amplifikationsreaktion identifiziert werden, verwendet, wobei die Sonden mit einem „Reporter”-Molekül und einem „Quencher” markiert werden. Wenn die Sonde intakt ist, befindet sich der Quencher in der Umgebung des Reporters, und dies verursacht die Suppression des fluoreszenten Signals, welches der Reporter emittieren kann. Während der Amplifikationsreaktion wird die Sonde, die aufgrund von Homologie innerhalb der Zielsequenz für die Amplifikation hybridisiert, von dem Polymeraseenzym geschnitten, wobei der Quencher vom Reporter getrennt wird, welcher, da er nicht länger vom Quencher supprimiert wird, ein detektierbares Fluoreszenzsignal emittiert, dessen Intensität direkt proportional ist zur Anzahl der amplifizierten Kopien des Ziels, das in der Mischung vorhanden ist.
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Normalerweise wird die Real Time PCR-Reaktion unter Verwendung von 96-Well-Platten durchgeführt, die in die Schlitze eines Thermocyclerinstruments platziert werden, um prozessiert zu werden. Die Anzahl an Proben, die pro Platte analysiert werden, ist variabel und ist im Allgemeinen etwa 30–40, da die PCR-Reaktion oft mit Duplikaten durchgeführt wird.
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Die Reaktionsmischungen, die im PCR-Verfahren verwendet werden, sind im Allgemeinen in der flüssigen Phase, was Probleme im Zusammenhang mit der Möglichkeit des Transferierens von Lösung aus einem Well in einen anderen während der Vorbereitungsphase und auch mit Übertragung aufgrund des Verdampfens der Lösung in der tatsächlichen Reaktionsphase verursacht.
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Um diesen Problemen zu begegnen, beschreibt die
italienische Patentanmeldung RM 1997A000038 ein Verfahren für die Amplifikation von Nukleinsäuren, wobei wenigstens einer der Oligonukleotid-Primer mit einem inerten thermisch kontrollierbaren Polymer gemischt wird, so dass die gebildete Mischung bei einer vorbestimmten Temperatur in der flüssigen Phase ist und bei einer niedrigeren Temperatur, vorzugsweise um 37°C, in der Gel-Phase.
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Eines der Hauptprobleme, das nichtsdestotrotz für die Anwendung der PCR in einem großen Maßstab als einen diagnostischen Assay auszuräumen bleibt, besteht in der Schwierigkeit des Verfahrens, das daher spezialisiertes Personal benötigt. Der Operator muss in der Tat im Vorhinein alle Reagenzien, die für das Ansetzen einer PCR-Reaktion notwendig sind, vorbereiten und in jeden der Wells der Platte das korrekte Volumen der Amplifikationsmischung aliquotieren, mit allen Risiken, die sich aus der Variabilität aufgrund des Operators ableiten.
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Zum Zweck des Ausräumens dieser Nachteile ist der Gegenstand der Erfindung ein Ready-to-Use-Kit für die PCR-Amplifikation von Nukleinsäuren, umfassend wenigstens ein Gefäß, in das ein Mastermix für die PCR-Amplifikation der Zielnukleinsäure präaliquotiert ist, wobei der Mastermix die Salze, die Puffer und die Desoxynukleotidtriphosphate, die für die PCR-Amplifikation benötigt werden, umfasst, wobei der Mastermix mit einer wirksamen Menge eines inerten temperaturkontrollierbaren Polymers gemischt wird, so dass die dadurch gebildete Endmischung bei einer vorbestimmten Temperatur in der flüssigen Phase ist und bei einer Temperatur, die niedriger als eine zweite vorbestimmte Temperatur ist, in der Gel-Phase. Die zweite vorbestimmte Temperatur ist vorzugsweise etwa 37°C.
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Der Begriff „Mastermix” bezieht sich auf eine Reaktionsmischung, im Allgemeinen in der Form einer wässrigen Lösung, die alle oder einen Teil der Reagenzien, die für die PCR-Amplifikation benötigt werden, in den geeigneten Mengen umfasst. In dieser ersten Ausführungsform umfasst der Mastermix die Salze und die Puffer, die für die Aktivität des Polymerase-Enzyms benötigt werden, und die Desoxynukleotidtriphosphate (dNTPs).
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Der Begriff „präaliquotiert” zeigt an, dass der Mastermix und die Komponenten davon im Inneren des Reaktionsgefäßes in vorbestimmten wirksamen Konzentrationen bereitgestellt werden, so dass die Amplifikation der Zielnukleinsäuresequenz stattfinden kann.
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In einer zweiten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Kits umfasst der Mastermix weiter die Oligonukleotid-Primer, die für die PCR-Amplifikation der Zielnukleotidsequenz benötigt werden.
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Wegen seiner Eigenschaften ermöglicht es das erfindungsgemäße Kit, die Tätigkeiten, die für die Durchführung des PCR-Verfahrens notwendig sind, vorteilhaft zu vereinfachen und die Testzeiten zu reduzieren, und auch das Problem der Variabilität aufgrund des Operators auszuräumen. Diese Eigenschaften machen das erfindungsgemäße Kit besonders geeignet für die Verwendung für klinische Anwendungen der PCR in einem großen Maßstab, sogar durch nicht spezialisiertes Personal.
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Das Gefäß des Kits kann zum Beispiel ein Probenröhrchen, eine Ampulle oder eine Platte beliebiger Größe und Konfiguration sein. Unter den Platten sind zerlegbare bevorzugt. Als eine Alternative zur Ausführungsform, wobei der Kit ein einzelnes Gefäß umfasst, ist auch angedacht, dass das Kit eine Vielzahl an Gefäßen einschließt – im Allgemeinen Probenröhrchen oder Ampullen, die in Reihen oder als ein Ring verbunden sind.
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Das inerte temperaturkontrollierbare Polymer, das im erfindungsgemäßen Kit verwendet wird, ist ein Polymer, das bei Umgebungstemperatur in einem „Gel”-Zustand existiert, und in jedem Fall bei einer Temperatur unter einer zweiten vorbestimmten Temperatur (bevorzugt etwa 37°C) und in einem „Sol”-Zustand nach geeignetem Erhitzen, dann in den „Gel”-Zustand zurückzukehren, wenn sich die Temperatur wieder der Umgebungstemperatur nähert. Wenn das System im festen („Gel”) Zustand ist, ist die Kinetik im Wesentlichen auf Null reduziert, was es ermöglicht, die Bildung von Primer-Dimeren zu vermeiden.
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Gemäß einer dritten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Kits wird der Mastermix, der zusätzlich zu den bereits erwähnten Oligonukleotid-Primern und Reagenzien, die für die PCR-Reaktion notwendig sind (Salze, Puffer, dNTPs), auch die Enzyme umfasst, die für die Amplifikation der Ziel-Nukleinsäure notwendig sind, im Gel-Zustand gehalten (und daher in einer Mischung mit dem temperaturkontrollierbaren Polymer).
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Die Enzyme, die für die Amplifikation einer Ziel-DNA-Sequenz durch PCR benötigt werden, sind Polymerase-Enzyme. Eine bevorzugte Polymerase für die Verwendung im erfindungsgemäßen Kit ist Taq-Polymerase. Für den Fall, dass die Zielsequenz ein RNA-Molekül ist, wird auch ein reverses Transkriptase-Enzym benötigt. Alternativ kann ein Enzym, das sowohl Polymerase-Aktivität als auch reverse Transkriptase-Aktivität, wie beispielsweise die Tth-Polymerase, die bereits erwähnt wurde, verwendet werden.
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In einer weiteren Ausführungsform des erfindungsgemäßen Kits umfasst der Mastermix auch eine markierte Sonde, bevorzugt fluoreszent, für die Echtzeit-Detektion der Amplifikationsprodukte und möglicherweise einer internen DNA- oder RNA-Kontrolle. In diesem Fall kann der Mastermix auch Primer und Sonden umfassen, die spezifisch für die Amplifikation und Detektion der internen Kontrolle sind.
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In noch einer anderen Ausführungsform des erfindungsgemäßen Kits umfasst der Mastermix auch eine wirksame Menge eines oder mehrerer inerter Farbstoffe, bevorzugt Methylenblau oder Malachitgrün.
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Falls der Kit für die Amplifikation einer Vielzahl verschiedener Zielnukleotidsequenzen vorgesehen ist, kann die Verwendung eines unterschiedlichen Farbstoffs für jede Zielnukleinsäuresequenz, die amplifiziert werden soll, angedacht werden, ebenso wie die Verwendung von Primern und Sonden, die spezifisch für die Amplifikation und die Detektion jeder Zielnukleinsäuresequenz sind.
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Ein Beispiel eines inerten temperaturkontrollierbaren Polymers, das für die Verwendung im erfindungsgemäßen Kit geeignet ist, ist das Polysaccharid Agarose, bevorzugt bei einer Konzentration, die innerhalb des Bereichs 0,5–0,8% liegt, aber der Fachmann wird erkennen, dass jedes inerte temperaturkontrollierbare Polymer mit einem Übergang von Sol zu Gel bei einer vorbestimmten Temperatur gleichermaßen verwendet werden kann. Bei der Annäherung an die Umgebungstemperatur geht die Lösung in den Gel-Zustand über, mit beachtlichen Vorteilen sowohl für die Lagerung (sogar bei Umgebungstemperatur) als auch für die Manipulation.
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Als eine Alternative für die Verwendung eines einzelnen temperaturkontrollierbaren Polymers kann auch die Verwendung verschiedener Polymere mit verschiedenen Temperaturkontrolleigenschaften angedacht werden, die sogar innerhalb eines einzelnen Reaktionsprobenröhrchens oder Wells kombiniert werden können. Solch ein Kit ist insbesondere angezeigt, um sowohl die reverse Transkription als auch die Polymerisation in einem einzelnen Reaktionsprobenröhrchen oder Well durchzuführen, indem ausschließlich auf dem thermischen Reaktionsprotokoll gearbeitet wird, das die verschiedenen Schmelztemperaturen der Polymere berücksichtigt.
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Das erfindungsgemäße Kit kann für die PCR-Amplifikation jeder beliebigen Nukleinsäure viralen, bakteriellen, tierischen oder pflanzlichen Ursprungs verwendet werden und findet Anwendung in der Diagnostik, in der Genetik, in der Onkologie und in der forensischen Medizin. Die viralen Nukleinsäuren schließen zum Beispiel die aus den folgenden Viren ein: HBV, HCV, SARS, CMV, HPV, HSV und HTLV I und II.
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Die folgenden Beispiele werden ausschließlich für illustrative Zwecke bereitgestellt und sollen nicht dazu dienen, den Schutzumfang der Erfindung, wie durch die angehängten Ansprüche definiert, zu beschränken.
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Beispiele
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Universal Solid Real Time Master Mix
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Universal Solid Real Time Master Mix ist ein universeller Mastermix für Systeme in der Real Time PCR, der auf Taqman-Probes basiert. Die Haupteigenschaft dieses Systems ist, dass es durch die Verwendung von Thermopolymeren, die entworfen wurden, um die Veränderung vom festen Zustand zum flüssigen bei einer gewünschten Temperatur zu bewirken, als ein Feststoff entwickelt wurde, ohne mit der Detektion des fluoreszenten Signals oder mit der Amplifikationsreaktion zu interferieren. Universal Solid Real Time Master Mix wird in zerlegbaren Platten hergestellt, um dem Operator zu erlauben, die Analyse einer variablen Anzahl an Proben abhängig von den verschiedenen Anforderungen durchzuführen und enthält, bereits gemischt, alle die Komponenten, die für eine quantitative Real Time PCR-Reaktion notwendig sind, außer die Templat-DNA, die Primer, die Sonden und die Taq-Polymerase.
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Daher wird jede Amplifikationsreaktion, in einem Gesamtvolumen von 25 μl, auf die folgende Art hergestellt werden:
R. Time Solid Master Mix | |
Vorwärts-Primer | 500 nM |
Reverser Primer | 500 nM |
Sonden | 200 nM |
Taq Gold (Applied Biosystems) | 0,05 U/μl |
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Zu der damit erzeugten Amplifikationsmischung werden 5 μl DNA von der betreffenden Probe gegeben und die Reaktion wird gemäß dem folgenden Amplifikationsprogramm durchgeführt: Amplifikationsprogramm
| 45 Zyklen |
50°C | 2 Minuten | 95°C | 10 Minuten | 95°C | 15 Sekunden | 60°C | 1 min |
verwendetes Detektionssystem: ABI-PRISM 7000 DETECTION SYSTEM. Zusammensetzung des Universal Solid Real Time Master Mix:
Reagenzien | Konzentration |
TAQ Puffer | 1 × |
MgCl2 | 3,5 mM |
dNTPs | 200 μM |
Referenzfarbstoff (ROX) | 1 × |
Thermopolymer (Agarose) | 0,8% |
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Universal Solid Real Time Master Mix wurde kontrolliert und mit Clonit-Systemen verglichen, die bereits für die quantitative Analyse einiger spezifischer Ziele verwendet wurden.
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Quantitative Analyse des HCV-Virus
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Die folgende Tabelle fasst die Konzentrationen und die Volumina, die für die Vervollständigung der Real-Time-Reaktionsmischung notwendig sind, zusammen.
Reagenzien | Anfangskonz. | Menge 1 Test | Menge 10 Tests | Endkonz. |
Vorwärts-Primer | 100 μM | 0,225 μl | 2,25 μl | 900 nM |
Reverser Primer | 100 μM | 0,125 μl | 1,25 μl | 500 nM |
Sonden | 10 μM | 0,5 μl | 5 μl | 200 nM |
Taq GOLD | 5 U/μl | 0,25 μl | 2,5 μl | 0,05 U/μl |
DEPC H2O | | 0,9 μl | 9 μl | |
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| | 2 μL | 20 μl | |
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– Amplifikation mit dem Universal Solid Real Time Master Mix
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Während der Amplifikation, d. h. „in Echtzeit”, wird ein Amplifikationsgraph auf dem Bildschirm des Detektionsinstruments angezeigt, wobei der Fortschritt der Amplifikation direkt verfolgt werden kann (siehe 1A). Je eher das Signal wächst, desto höher ist die Konzentration an Zielnukleinsäure in der getesteten Probe.
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Die Software konstruiert auch eine gerade Linie (siehe 1B), deren Steigung ein Indikator der guten Linearität der Standards ist, der in der analytischen Sitzung vorhanden ist, und ermöglicht es, die Sitzung zu validieren.
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Die verwendeten Kontrollen sind sekundäre Standards, die EC-markiert sind, die als eine Referenz für die Verifizierung der fraglichen Methode dienen. Deren Konzentrationen werden bei einem Verdünnungsfaktor von zehn von einem zum anderen gehalten. Der Graph zeigt, wie die Amplifikationskurven mit absoluter Genauigkeit mit den Konzentrationen, die den Standards selbst zugeschrieben werden, übereinstimmen, und verifizieren und validieren das System.
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– Linearität und Proportionalität des Systems
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Diese Parameter drücken die Kapazität einer analytischen Methode, Ergebnisse direkt proportional zur Konzentration des Analyten in der Probe zu erhalten, aus. Linearität und Proportionalität werden mit Standardlösungen bei verschiedenen Konzentrationsleveln verifiziert.
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Diese Funktion muss als linear gefunden werden und ihre charakteristischste Manifestation ist ein Korrelationskoeffizient, der sehr nah beim Wert 1 liegt. Tabelle 1
R2 | Durchschnitt | Standardabweichung | N | Standardfehler | UCL | ICL |
0,9951 | 0,9965 | 0,00303 | 4 | 0,0015 | 0,998 | 0,994686 |
0,9988 | | | | | | |
0,9992 | | | | | | |
0,9929 | | | | | | |
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– LOQ (Limit of Quantitation, Quantifizierungsgrenze) – LOD (Limit of Detection; Detektionsgrenze)
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LOQ (Quantifizierungsgrenze): drückt die kleinste Menge an Analyten in einer Probe aus, die mit einem akzeptablen Präzisions- und Genauigkeitswert bestimmt und quantifiziert werden kann. LOQ kann als eine Funktion der Standardabweichung relativ zur Steigung der Kalibrationskurve evaluiert werden.
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LOD (Detektionsgrenze): drückt die kleinste Menge an Analyten aus, die bestimmt, aber nicht notwendigerweise quantifiziert werden kann. LOD kann als eine Funktion der Standardabweichung relativ zur Steigung der Kalibrationskurve evaluiert werden. Tabelle 2
Steigung | Durch- schnitt | Varianz des Durchschnitts | St. Abw. des Durch- schnitts | LOG
(LOQ) | LOQ
[cps] | LOD
(cps) |
–3,21 | –3,29 | 0,27794 | 0,5272 | 1,5993 | 39,75 | 13,248 |
–3,21 | | | | | | |
–3,44 | | | | | | |
–3,32 | | | | | | |
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– VERGLEICH ZWISCHEN UNIVERSAL SOLID REAL TIME MASTER MIX UND HCV RNA REAL TIME MASTER MIX (FLÜSSIGE MISCHUNG)
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Um die Neutralität des Polymers zu verifizieren, das verwendet wird, um den Mastermix, der der Gegenstand des vorliegenden Patentes ist, herzustellen, wurde dies mit einer Mischung für Real Time PCR in der normalen Version in Flüssigkeit verglichen. Die Ergebnisse sind vollständig deckungsgleich und validieren daher das System. Tabelle 3
HCV-RNA REAL TIME MASTER MIX | UNIVERSAL SOLID REAL TIME MASTER MIX |
5000000
cps | 500000
cps | 50000
cps | 5000
cps | 5000000
cps | 500000
cps | 50000
cps | 5000
cps |
(Zyklen für Ausgang des Signals) |
19,5 | 23,375 | 27,09 | 30,65 | 19,53 | 22,36 | 25,74 | 28,96 |
Steigung – 3,7255
R2 0,9996 | Steigung – 3,212
R2 0,9994 |
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2 zeigt die Graphen der Steigungen der erhaltenen Kurven.
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Quantitative Analyse des HBV-Virus
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Die folgende Tabelle fasst die Konzentrationen und die Volumina zusammen, die benötigt werden, um die Real Time Reaktionsmischung zu vervollständigen. Tabelle 4
Reagenzien | Anfangskonz. | Menge
1 Test | Menge
10 Tests | Endkonz. |
Vorwärts-Primer | 100 μM | 0,125 μl | 1,25 μl | 900 nM |
Reverser Primer | 100 μM | 0,125 μl | 1,25 μl | 500 nM |
Sonden | 10 μM | 0,1 μl | 1 μl | 200 nM |
Taq GOLD | 5 U/μl | 0,25 μl | 2,5 μl | 0,05 U/μl |
DEPC H2O | | 1,4 μl | 14 μl | |
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| | 2 μl | 20 μl | |
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– Amplifikation mit Universal Solid Real Time Master Mix
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3A ist ein Graph, der den Fortschritt der Amplifikation zeigt. Die Steigung der geraden Linie in 3B ist ein Indikator der guten Linearität der Standards, die in der analytischen Sitzung vorhanden sind und ermöglicht es, die Sitzung zu validieren.
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– Linearität und Proportionalität des Systems
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Tabelle 5
R2 | Durchschnitt | Standardabweichung | N | Standardfehler | UCL | ICL |
0,9991 | 0,98467 | 0,01964 | 3 | 0,0113 | 0,996 | 0,973327 |
0,9926 | | | | | | |
0,9623 | | | | | | |
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– LOQ (Quantifizierungsgrenze) – LOD (Detektionsgrenze)
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Tabelle 6
Steigung | Durchschnitt | Varianz des Durchschnitts | St. Abw. des Durchschnitts | LOG
(LOQ) | LOQ
[cps] | LOD
(cps) |
–3,2395 | –3,40343 | 0,65952 | 0,65952 | 1,9378 | 86,66 | 28,886 |
–3,3863 | | | | | | |
–3,5845 | | | | | | |
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– VERGLEICH ZWISCHEN UNIVERSAL SOLID REAL TIME MASTER MIX UND HBV RNA REAL TIME MASTER MIX (MISCHUNG IN FLÜSSIGKEIT)
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Tabelle 7
HBV-RNA REAL TIME MASTER MIX | UNIVERSAL SOLID REAL TIME MASTER MIX |
5000000
cps | 500000
cps | 50000
cps | 5000
cps | 5000000
cps | 500000
cps | 50000
cps | 5000
cps |
18,85 | 21,63 | 25,59 | 28,80 | 18,24 | 21,475 | 24,5 | 28,03 |
Steigung – 3,381
R2 0,9959 | Steigung – 3,2395
R2 0,9991 |
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4 zeigt die Graphen der Steigungen der erhaltenen Kurven.
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ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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Zitierte Patentliteratur
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