DE202022100599U1

DE202022100599U1 - Wiederverwendbares Schleifen-Isotherm-Amplifikationssystem mit Einfach-Amplifikation zum genauen Nachweis von durch Saatgut übertragenen Krankheitserregern in Reis

Info

Publication number: DE202022100599U1
Application number: DE202022100599.0U
Authority: DE
Original assignee: AGRICULTURAL SCIENCES, University of; Dendrite Laboratories Private Ltd; Univ Of Agricultural Sciences
Current assignee: AGRICULTURAL SCIENCES, University of; Dendrite Laboratories Private Ltd; Univ Of Agricultural Sciences
Priority date: 2022-02-02
Filing date: 2022-02-02
Publication date: 2022-03-30
Anticipated expiration: 2032-02-03

Abstract

Eine tragbare, einklappbare Vorrichtung zum Nachweis von durch Saatgut übertragenen Krankheitserregern, die mit Reis in Verbindung stehen, wobei die Vorrichtung umfasst:
eine untere Schicht einer Acrylplatte, die für eine einfache Faltung geeignet ist, wobei die Faltunterstützung für die Acrylplatte durch eine PCR-Siegelfolie bereitgestellt wird;
eine integrierte Probenkammer, die parallel zu einer Aktionskammer gekoppelt ist, die für die Aufnahme einer Vielzahl von Primern, Thermopolpuffern und Enzymen konfiguriert ist, wobei eine DNA-Matrize zu der integrierten Kammer hinzugefügt wird und für 2 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert werden kann;
wobei die Reaktionskammer weiterhin mit einer Abdichtungsfolie abgedeckt wird, um die Verdunstung der Reagenzien zu verhindern, und dann 30 Minuten lang bei 60 °C inkubiert wird, wobei die Abdichtungsfolie vorsichtig entfernt wird und etwa 1 µl HCl in jede Reaktionsvertiefung gegeben und 5 Minuten lang bei 58 °C inkubiert wird, wobei 2 µl Natriumsulfit in die inkubierte integrierte Kammer gegeben werden; und
eine Detektionskammer, die so gefaltet ist, dass die Detektionskammer die Reaktionskammer überlappt, um die Farbveränderung einer Vielzahl von Fuchsinstreifen zum Nachweis von durch Saatgut übertragenen Krankheitserregern in Verbindung mit Reis zu bestimmen.

Description

BEREICH DER ERFINDUNG
Die vorliegende Offenbarung bezieht sich auf Systeme der Agrarbiotechnologie. Im Einzelnen handelt es sich um ein tragbares, einklappbares Gerät zum Nachweis von durch Saatgut übertragenen Krankheitserregern bei Reis.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Für den Nachweis von Krankheitserregern stehen mehrere konventionelle Methoden zur Verfügung, nämlich die visuelle Beobachtung und Inkubationstechniken. Obwohl herkömmliche Verfahren aufgrund ihrer Einfachheit häufig verwendet werden, sind sie weniger empfindlich, zeitaufwändig, erfordern mykologische Kenntnisse und sind bei einer großen Anzahl von Proben schwierig anzuwenden. In jüngster Zeit wurden hochempfindliche, robuste und erregerspezifische Techniken auf der Grundlage von Nukleinsäuren (NA) entwickelt. Die gebräuchlichste Technik ist die herkömmliche Polymerase-Kettenreaktion (PCR), während in jüngster Zeit auch andere Techniken wie Nested PCR, Multiplex-PCR, Echtzeit-PCR und Bio-PCR für den Nachweis entwickelt wurden. Obwohl NA-basierte Techniken hochempfindlich und spezifisch sind, gibt es viele Probleme, wie z. B. eine schlechte Qualität der DNA-Vorlage aufgrund des Vorhandenseins von PCR-Inhibitoren im Saatgut während des Assays. Darüber hinaus haben die konventionellen PCR-Techniken auch andere Nachteile, wie z. B. den Bedarf an hochentwickelten Geräten wie Thermocyclern und Gel-Dokumentationssystemen. Um diese Nachteile zu beheben, wurden verschiedene isothermische Amplifikationsverfahren wie die schleifenvermittelte isothermische Amplifikation (LAMP), die helikaseabhängige Amplifikation (HDA), die Nukleinsäuresequenz-basierte Amplifikation usw. entwickelt.
Die schleifenvermittelte isotherme Amplifikation LAMP ist eine leistungsstarke innovative Genamplifikationstechnik, die sich als einfaches und schnelles Diagnoseinstrument für den Nachweis mikrobieller Krankheiten entwickelt. Das gesamte Verfahren ist sehr einfach und schnell, wobei die Amplifikation in weniger als einer Stunde unter isothermen Bedingungen mit einem Satz von sechs speziell entwickelten Primern, die auf acht verschiedene Sequenzen eines Zielgens abzielen, abgeschlossen werden kann, indem alle Reagenzien in einem einzigen Röhrchen inkubiert werden.
Der Assay erfordert eine komplexe Methode zur Entwicklung spezifischer Primer. Der LAMP-Assay verwendet sechs Primer, die als F3 Forward Primer, B3 Backward Primer, FIP Forward Inner Primer, BIP Backward Inner Primer, LF Loop Forward und LB Loop Backward bekannt sind. Die Anforderungen an das Primerdesign schränken die Auswahl der Zielstellen ein, was die Auflösung des Verfahrens einschränken kann. Darüber hinaus sind ein spezielles Online-Tool und Hintergrundwissen für das spezifische Design erforderlich.
Der LAMP-Assay besitzt Eigenschaften wie die Tatsache, dass kein Thermocycler erforderlich ist, eine schnelle Amplifikation sowie eine hohe Spezifität und Empfindlichkeit, die sich gut zur Erleichterung von Point-of-Care-Anwendungen vor Ort eignen. Die Ergebnisse des LAMP-Tests werden mit dem basischen Fuchsin-Farbstoff sichtbar gemacht, um die positive Amplifikation von der gesunden Kontrolle zu unterscheiden.
In Anbetracht der vorstehenden Ausführungen wird deutlich, dass ein Bedarf an einem tragbaren, einfach zu handhabenden Gerät zum Nachweis von durch Saatgut übertragenen Krankheitserregern bei Reis besteht.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Offenbarung zielt darauf ab, eine verwendbare Schleifen-isotherme Amplifikations-Einfachfaltungsvorrichtung für den schnellen Nachweis von durch Saatgut übertragenen Krankheitserregern in Verbindung mit Reis bereitzustellen.
In einer Ausführungsform wird ein tragbares, einklappbares Gerät zum Nachweis von durch Saatgut übertragenen Krankheitserregern im Zusammenhang mit Reis offenbart. Die Vorrichtung umfasst eine untere Schicht aus einer Acrylfolie, die für eine einfache Faltung geeignet ist, wobei die Faltunterstützung für die Acrylfolie durch eine PCR-Versiegelungsfolie bereitgestellt wird. Die Vorrichtung umfasst ferner eine integrierte Probenkammer, die parallel mit einer Reaktionskammer gekoppelt ist, die für die Aufnahme einer Vielzahl von Primern, Thermopuffern und Enzymen konfiguriert ist, wobei eine DNA-Matrize in die integrierte Kammer gegeben wird und für 2 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert werden kann, wobei die Reaktionskammer weiterhin mit einer Versiegelungsfolie abgedeckt wird, um eine Verdunstung der Reagenzien zu vermeiden, und dann bei 60 °C für 30 Minuten inkubiert wird, wobei die Versiegelungsfolie vorsichtig entfernt wird und etwa 1 µl HCl in jede Reaktionsvertiefung gegeben wird und weiter bei 58 °C für 5 Minuten inkubiert wird, wobei 2 µl Natriumsulfit zu der inkubierten integrierten Kammer gegeben werden. Die Vorrichtung umfasst ferner eine Nachweiskammer, die so gefaltet ist, dass die Nachweiskammer die Reaktionskammer überlappt, um die Farbveränderung einer Vielzahl von Fuchsinstreifen zum Nachweis von durch Saatgut übertragenen Krankheitserregern in Verbindung mit Reis zu bestimmen.
In einer anderen Ausführungsform ist die Reaktionskammer mit einer Polycarbonat (PC)-Folie bedeckt und vier Reaktionsmulden mit einem Radius von 2.5 mm sind aus der PC-Folie ausgeschnitten.
In einer anderen Ausführungsform ist die Nachweiskammer mit einem basischen Fuchsin-Farbstoff beschichtet, um die Ergebnisse sichtbar zu machen.
In einer anderen Ausführungsform wird die Farbveränderung der Fuchsinstreifen entweder von magenta zu farblos (bei negativer Amplifikation) oder von magenta zu violett (bei positiver Amplifikation) bestimmt, um samenbürtige Krankheitserreger in Verbindung mit Reis nachzuweisen.
In einer anderen Ausführungsform wird die genomische DNA aus S. oryzae unter Verwendung einer CTAB-Methode isoliert und die RNA-Kontamination durch Verdau einer erhaltenen genomischen DNA-Probe mit 10 µg/mL RNase entfernt, wobei die isolierte genomische DNA mit Nanodrop quantifiziert wird.
In einer anderen Ausführungsform wird die genomische DNA-Probe von einem Satz von vier Schleifenprimern für den LAMP-Assay empfangen, die für die Ausrichtung auf konservierte Regionen ausgelegt sind, wobei die Schleifenprimer zwei innere Primer, den inneren Vorwärtsprimer (FIP) und den inneren Rückwärtsprimer (BIP) und zwei äußere Primer F3 und B3 umfassen.
Ein Ziel der vorliegenden Offenlegung ist die Entwicklung eines isothermen Amplifikationsverfahrens für den schnellen, empfindlichen, spezifischen und kostengünstigen Nachweis von S. oryzae in Reissamen.
Ein weiteres Ziel der vorliegenden Offenlegung ist die Entwicklung einer wiederverwendbaren, tragbaren, einfach faltbaren Plattform auf Membranbasis, die einen basischen Fuchsin-Farbstoff zur Durchführung des LAMP-Assays anstelle von Polypropylenröhrchen verwendet.
Ein weiteres Ziel der vorliegenden Offenbarung ist die Bereitstellung von Point-of-Care-Diagnosekits, die von den Beratungsdiensten verwendet werden.
Ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung ist es, ein schnelles und kostengünstiges tragbares Gerät zum Nachweis von durch Saatgut übertragenen Krankheitserregern bei Reis bereitzustellen.
Zur weiteren Verdeutlichung der Vorteile und Merkmale der vorliegenden Offenbarung wird eine genauere Beschreibung der Erfindung durch Bezugnahme auf bestimmte Ausführungsformen gegeben, die in den beigefügten Figuren dargestellt sind. Es wird davon ausgegangen, dass diese Figuren nur typische Ausführungsformen der Erfindung darstellen und daher nicht als Einschränkung des Umfangs der Erfindung zu betrachten sind. Die Erfindung wird mit zusätzlicher Spezifität und Detail mit den beigefügten Figuren beschrieben und erläutert werden.
Figurenliste
Diese und andere Merkmale, Aspekte und Vorteile der vorliegenden Offenbarung werden besser verstanden, wenn die folgende detaillierte Beschreibung unter Bezugnahme auf die beigefügten Figuren gelesen wird, in denen gleiche Zeichen gleiche Teile in den Figuren darstellen, wobei:

1 ein Blockdiagramm eines tragbaren, einfach gefalteten Geräts zum Nachweis von durch Saatgut übertragenen Krankheitserregern, die mit Reis in Verbindung stehen, gemäß einer Ausführungsform der vorliegenden Offenbarung zeigt;
2 eine Übersicht über die Membranplattform für ein einfach gefaltetes Mikrogerät zeigt, die die Neuartigkeit des Geräts gemäß einer Ausführungsform der vorliegenden Offenbarung veranschaulicht;
3 eine bildliche Darstellung der Arbeitsweise der einfach gefalteten Membranplattform für Mikrogeräte gemäß einer Ausführungsform der vorliegenden Offenbarung zeigt; und
4 einen in Tabelle 1 dargestellten Reaktionsaufbau des LAMP-Tests zeigt.

Der Fachmann wird verstehen, dass die Elemente in den Figuren der Einfachheit halber dargestellt sind und nicht unbedingt maßstabsgetreu gezeichnet wurden. Die Flussdiagramme veranschaulichen beispielsweise das Verfahren anhand der wichtigsten Schritte, um das Verständnis der Aspekte der vorliegenden Offenbarung zu verbessern. Darüber hinaus kann es sein, dass eine oder mehrere Komponenten der Vorrichtung in den Figuren durch herkömmliche Symbole dargestellt sind, und dass die Figuren nur die spezifischen Details zeigen, die für das Verständnis der Ausführungsformen der vorliegenden Offenbarung relevant sind, um die Figuren nicht mit Details zu überfrachten, die für Fachleute, die mit der vorliegenden Beschreibung vertraut sind, leicht erkennbar sind.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG
Um das Verständnis der Erfindung zu fördern, wird nun auf die in den Figuren dargestellte Ausführungsform Bezug genommen und diese mit bestimmten Worten beschrieben. Es versteht sich jedoch von selbst, dass damit keine Einschränkung des Umfangs der Erfindung beabsichtigt ist, wobei solche Änderungen und weitere Modifikationen des dargestellten Systems und solche weiteren Anwendungen der darin dargestellten Grundsätze der Erfindung in Betracht gezogen werden, wie sie einem Fachmann auf dem Gebiet der Erfindung normalerweise einfallen würden.
Der Fachmann wird verstehen, dass die vorstehende allgemeine Beschreibung und die folgende detaillierte Beschreibung beispielhaft und erläuternd für die Erfindung sind und nicht als einschränkend angesehen werden.
Wenn in dieser Beschreibung von „einem Aspekt“, „einem anderen Aspekt“ oder ähnlichem die Rede ist, bedeutet dies, dass ein bestimmtes Merkmal, eine bestimmte Struktur oder eine bestimmte Eigenschaft, die im Zusammenhang mit der Ausführungsform beschrieben wird, in mindestens einer Ausführungsform der vorliegenden Offenbarung enthalten ist. Daher können sich die Ausdrücke „in einer Ausführungsform“, „in einer anderen Ausführungsform“ und ähnliche Ausdrücke in dieser Beschreibung alle auf dieselbe Ausführungsform beziehen, müssen es aber nicht.
Die Ausdrücke „umfasst“, „enthaltend“ oder andere Variationen davon sollen eine nicht ausschließliche Einbeziehung abdecken, so dass ein Verfahren oder eine Methode, die eine Liste von Schritten umfasst, nicht nur diese Schritte umfasst, sondern auch andere Schritte enthalten kann, die nicht ausdrücklich aufgeführt sind oder zu einem solchen Verfahren oder einer solchen Methode gehören. Ebenso schließen eine oder mehrere Vorrichtungen oder Teilsysteme oder Elemente oder Strukturen oder Komponenten, die mit „umfasst...a“ eingeleitet werden, nicht ohne weitere Einschränkungen die Existenz anderer Vorrichtungen oder anderer Teilsysteme oder anderer Elemente oder anderer Strukturen oder anderer Komponenten oder zusätzlicher Vorrichtungen oder zusätzlicher Teilsysteme oder zusätzlicher Elemente oder zusätzlicher Strukturen oder zusätzlicher Komponenten aus.
Sofern nicht anders definiert, haben alle hierin verwendeten technischen und wissenschaftlichen Begriffe die gleiche Bedeutung, wie sie von einem Fachmann auf dem Gebiet, zu dem diese Erfindung gehört, allgemein verstanden wird. Das System, die Methoden und die Beispiele, die hier angegeben werden, dienen nur der Veranschaulichung und sind nicht als Einschränkung gedacht.
Ausführungsformen der vorliegenden Offenbarung werden im Folgenden unter Bezugnahme auf die beigefügten Figuren im Detail beschrieben.
Bezugnehmend auf 1 ist ein Blockdiagramm einer tragbaren, einfach faltbaren Vorrichtung 100 zum Nachweis von durch Saatgut übertragenen Krankheitserregern in Verbindung mit Reis gemäß einer Ausführungsform der vorliegenden Offenbarung dargestellt. Die Vorrichtung 100 umfasst eine untere Schicht 102 aus einer Acrylfolie, die für eine einfache Faltung geeignet ist, wobei die Faltunterstützung für die Acrylfolie durch eine PCR-Siegelfolie bereitgestellt wird.
In einer Ausführungsform ist eine integrierte Probenkammer 104 parallel mit einer Reaktionskammer 106 gekoppelt, die für die Aufnahme einer Vielzahl von Primern, Thermopolpuffern und Enzymen konfiguriert ist, wobei eine DNA-Matrize in die integrierte Kammer gegeben und für 2 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert wird, wobei die Reaktionskammer 106 weiterhin mit einer Versiegelungsfolie bedeckt ist, um die Verdunstung der Reagenzien zu vermeiden, und dann bei 60 °C für 30 Minuten inkubiert wird, wobei die Versiegelungsfolie vorsichtig entfernt wird und etwa 1 µl HCl zu jeder Reaktionsvertiefung hinzugefügt wird und weiter bei 58 °C für 5 Minuten inkubiert wird, wobei 2 µl Natriumsulfit zu der inkubierten integrierten Kammer hinzugefügt werden.
In einer Ausführungsform ist eine Nachweiskammer 108 so gefaltet, dass die Nachweiskammer 108 die Reaktionskammer 106 überlappt, um die Farbveränderung einer Vielzahl von Fuchsinstreifen 110 zum Nachweis von durch Saatgut übertragenen Krankheitserregern in Verbindung mit Reis zu bestimmen.
In einer anderen Ausführungsform ist die Reaktionskammer 106 mit einer Polycarbonat (PC)-Folie und vier aus der PC-Folie ausgeschnittenen Reaktionsmulden mit einem Radius von 2.5 mm bedeckt.
In einer anderen Ausführungsform ist die Nachweiskammer 108 mit einem basischen Fuchsin-Farbstoff beschichtet, um die Ergebnisse sichtbar zu machen.
In einer anderen Ausführungsform wird die Farbveränderung der Fuchsinstreifen 110 entweder von magenta zu farblos (bei negativer Amplifikation) oder von magenta zu violett (bei positiver Amplifikation) bestimmt, um samenbürtige Krankheitserreger in Verbindung mit Reis nachzuweisen.
In einer anderen Ausführungsform wird die genomische DNA aus S. oryzae unter Verwendung einer CTAB-Methode isoliert und die RNA-Kontamination durch Verdau einer erhaltenen genomischen DNA-Probe mit 10 µg/mL RNase entfernt, wobei die isolierte genomische DNA mit Nanodrop quantifiziert wird.
In einer anderen Ausführungsform wird die genomische DNA-Probe von einem Satz von vier Schleifenprimern für den LAMP-Assay empfangen, die für die Ausrichtung auf konservierte Regionen ausgelegt sind, wobei die Schleifenprimer zwei innere Primer, den inneren Vorwärtsprimer (FIP) und den inneren Rückwärtsprimer (BIP) und zwei äußere Primer F3 und B3 umfassen.
Die genomische DNA aus S. oryzae wurde mit der CTAB-Methode isoliert. Die RNA-Kontamination wurde durch Verdau der erhaltenen genomischen DNA-Probe mit 10 µg/mL RNase entfernt. Die isolierte genomische DNA wurde mit Nanodrop (Modell DS-11 FX +, DeNovix, USA) quantifiziert.
Primer-Design:
Ein Satz von vier Schleifenprimern für den LAMP-Assay wird mit Primer Explorer V5 speziell für die konservierten Regionen entworfen. Die Schleifenprimer umfassen zwei innere Primer, den inneren Vorwärtsprimer (FIP) und den inneren Rückwärtsprimer (BIP), sowie zwei äußere Primer F3 und B3. FIP bestand aus der F1c- und F2-Region und BIP aus der B1c- und B2-Region.
Der LAMP-Assay:
Der LAMP-Assay wird in einer 25-µl-Reaktionsmischung durchgeführt, die 1X Thermo-Pol-Puffer pH 8.8 (10 mM (NH4)2SO4, 20 mMTris-HCl, 10 mMKCl, 2 mM MgSO4, 0.1% Triton-X), 0.2 M Betain, 0.6 mM dNTPs, 10 pmol F3/B3-Primer, 20 pmol FIP/BIP-Primer, 8 U Bst-Polymerase großes Fragment (New England Biologicals, USA), Template-DNA mit einer Konzentration von 100 ng/µl und Auffüllen des Reaktionsvolumens auf 25 µl mit sterilem destilliertem Wasser.
Optimierung der LAMP-Reaktion:
Die LAMP-Reaktionsmischung wird hinsichtlich der Reaktionstemperatur (von 50 bis 66°C) und der Reaktionszeit (von 10 bis 90 Minuten) optimiert. Die optimierte Zeit und Temperatur werden für die Bewertung der Empfindlichkeit des LAMP-Assays bei verschiedenen Template-DNA-Verdünnungen (10 ng bis 100 fg) verwendet.
2 zeigt eine Übersicht über die einfach faltbare Membranplattform des Mikrogeräts, die die Neuartigkeit des Geräts gemäß einer Ausführungsform der vorliegenden Offenbarung veranschaulicht. Zur Entwicklung eines tragbaren, faltbaren membranbasierten Mikrogeräts zur Durchführung des LAMP-Tests wird eine 2 mm dicke Acrylplatte, die einer Temperatur von 160°C standhält, als untere Schicht 102 verwendet. Die Faltstütze für die Acrylplatte wird durch die PCR-Versiegelungsfolie bereitgestellt.
3 zeigt eine bildliche Darstellung der Funktionsweise der einfaltigen Membranplattform für Mikrogeräte gemäß einer Ausführungsform der vorliegenden Offenbarung. Die Membran ist in zwei Kammern unterteilt, nämlich eine integrierte Probenkammer 104 und eine Reaktionskammer 106 sowie eine Detektionskammer 108. Die Reaktionskammer 106 ist mit einer Polycarbonatfolie (40 x 30 mm) und vier aus der PC-Folie ausgeschnittenen Reaktionsvertiefungen mit einem Radius von 2.5 mm bedeckt. Die Detektionskammer 108 ist mit einem basischen Fuchsin-Farbstoff beschichtet, um die Ergebnisse sichtbar zu machen.
Arbeitsmethodik der faltbaren Membran-Mikrogeräteplattform:
Die integrierte Proben- und Reaktionskammer 106 wird mit spezifischen Primern, Thermopolpuffern und Enzymen beschichtet. Ungefähr ≈100 fg DNA-Template werden in die integrierte Kammer gegeben und 2 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Die Reaktionskammer 106 wird dann mit einer Versiegelungsfolie abgedeckt, um die Verdunstung der Reagenzien zu verhindern, und anschließend 30 Minuten lang bei 60 °C inkubiert. Nach der Inkubation wird die Versiegelungsfolie vorsichtig entfernt und etwa 1 µl HCl in jede Reaktionsvertiefung gegeben und erneut 5 Minuten lang bei 58°C inkubiert. Der bebrüteten integrierten Kammer werden 2 µl Natriumsulfit zugesetzt und zur Visualisierung des Ergebnisses auf die Nachweiskammer 108 gefaltet. Die Ergebnisse werden anhand des Farbwechsels entweder von Magenta zu farblos (bei negativer Amplifikation) oder von Magenta zu Violett (bei positiver Amplifikation) abgeleitet.
Empfindlichkeit der verschiedenen Nukleinsäure-Amplifikationsmethoden:
Die Empfindlichkeit von PCR-Methoden (konventionelle PCR und q-PCR) und isothermen Amplifikationsmethoden (LAMP und HDA) wird unter Verwendung verschiedener DNA-Template-Konzentrationen von 10ng bis 50fg von S. oryzae analysiert. Die konventionelle PCR zeigte ein positives Ergebnis bis zu 1ng, während die q-PCR ein positives Ergebnis bis zu 10pg zeigte. Unter den isothermen Assays zeigte der HDA-Assay positive Ergebnisse bis zu 50pg, während der LAMP-Assay positive Ergebnisse bis zu 100 fg zeigte. Daher ist der LAMP-Assay unter den verschiedenen in unserer Studie getesteten Methoden für den positiven Nachweis einer S. oryzae-Infektion in Reissamen am empfindlichsten.
Spezifität des LAMP-Assays:
Die Spezifität des LAMP-Assays zum Nachweis von S. oryzae wird anhand von Magnaporthe oryzae und B. oryzae bewertet. Die aus S. oryzae gewonnene Template-DNA zeigte positive Ergebnisse, wenn sie mittels LAMP unter Verwendung S. oryzae-spezifischer Primer amplifiziert wurde. Die DNA von M. oryzae und B. oryzae hingegen zeigte negative Ergebnisse, was die Spezifität des LAMP-Assays bestätigt. Alle Ergebnisse des LAMP-Assays wurden durch eine 2%ige Agarosegel-Elektrophorese bestätigt, und die Absorptionsintensität des Farbstoffs wurde ebenfalls validiert.
Der LAMP-Assay zum Nachweis von S. oryzae wird auf einer neu entwickelten, wiederverwendbaren, einfach faltbaren Membranplattform durchgeführt. Die faltbare Membranplattform weist das Vorhandensein von S. oryzae-Genom nach, wenn die DNA-Vorlage aus den Reinkulturen sowie aus infiziertem Saatgut in die integrierte Kammer geladen wird, während in gesundem Saatgut keine Amplifikation beobachtet wird. Die fuchsinbeschichtete Membran in der Detektionskammer 108 färbt sich bei positiver Amplifikation violett, während sie bei negativen Ergebnissen magentafarben bis farblos wird. Bei dem wiederverwendbaren LAMP-Assay mit Einfachmembranplattform zeigten die erregerspezifischen LAMP-Primer nur dann eine positive Amplifikation, wenn die entsprechende Erreger-Template-DNA in der integrierten Kammer vorhanden ist, während bei Zugabe von Template-DNA entweder aus gesundem Saatgut oder aus einem unspezifischen Erreger (B. oryzae) negative Ergebnisse zu beobachten sind, was auf die Spezifität des LAMP-Assays hinweist, der in Polypropylenröhrchen durchgeführt wird.
Der Assay ist für verschiedene Zeiten, Temperaturen und Template-Konzentrationen optimiert. Wie der LAMP-Assay wird er auf der wiederverwendbaren Einfachmembran-Plattform durchgeführt. Auch das Genom von Zielerregern kann unter den optimierten Bedingungen von 60°C für 30 Minuten mit einem Minimum von 100 fg DNA-Template nachgewiesen werden.
Die p-Werte in der LAMP-Assay-Optimierung der Zeit unter Verwendung der Varianz der Anova zwischen den Gruppen zeigten 95% Vertrauen bei p ist ≤ 0.05 und 99% Vertrauen bei p ist ≤ 0.01. Während der t-Test zwischen den Behandlungen eine Signifikanz ≤ 0.05 (*) und ≤ 0.01 (**) ergab. Die p-Werte in der LAMP-Assay-Optimierung der Temperatur unter Verwendung der Varianz der Anova zwischen den Gruppen zeigten 95% Konfidenz bei p ist ≤ 0.05 und 99% Konfidenz bei p ist ≤ 0.01. Der t-Test zwischen den Behandlungen zeigte eine Signifikanz ≤ 0.05 (*) und ≤ 0.01 (**). Die p-Werte in der LAMP-Assay-Optimierung der Vorlage unter Verwendung der Varianz der Anova zwischen den Gruppen zeigten eine 95%ige Sicherheit bei p ≤ 0.05 und eine 99%ige Sicherheit bei p ≤ 0.01. Der t-Test zwischen den Behandlungen zeigte eine Signifikanz ≤ 0.05 (*) und ≤ 0.01 (**).
Optimierung des LAMP-Tests über die Zeit. Boxplot, der die Krankheitsinzidenz darstellt und den Median (dünne schwarze Linie) beschreibt; die untere Grenze der Box gibt die Standardabweichung an, während die obere Grenze der Box die 95%-Perzentile der Inzidenzen angibt. Die p-Werte in der Grafik, die die Varianz der Anova zwischen den Gruppen (Zeit) verwendet, zeigen an, dass die 95%ige Sicherheit bei p ≤ 0.05 und die 99%ige Sicherheit bei p ≤ 0.01 ist. Der t-Test zwischen den Behandlungen ergab eine Signifikanz ≤ 0.05 (*) und ≤ 0.01 (**).
LAMPassay-Optimierung der Temperatur. Boxplot, der die Krankheitsinzidenz darstellt und den Median (dünne schwarze Linie) beschreibt; die untere Grenze der Box gibt die Standardabweichung an, während die obere Grenze der Box die 95%-Perzentile der Inzidenzen angibt. Die p-Werte in der Grafik, die die Varianz der Anova zwischen den Gruppen (Temperaturen) verwendet, zeigen an, dass die 95%ige Sicherheit bei p ≤ 0.05 und die 99%ige Sicherheit bei p ≤ 0.01 ist. Der t-Test zwischen den Behandlungen ergab eine Signifikanz ≤ 0.05 (*) und ≤ 0.01 (**).
Optimierung des LAMP-Assays für die Vorlage. Boxplot, der die Krankheitsinzidenz darstellt und den Median (dünne schwarze Linie) beschreibt; die untere Grenze der Box gibt die Standardabweichung an, während die obere Grenze der Box die 95%-Perzentile der Inzidenzen angibt. Die p-Werte in der Grafik unter Verwendung der Varianz der Anova zwischen den Gruppen (Schablonen) zeigten an, dass die 95%ige Sicherheit bei p ≤ 0.05 und die 99%ige Sicherheit bei p ≤ 0.01 ist. Der t-Test zwischen den Behandlungen ergab eine Signifikanz ≤ 0.05 (*) und ≤ 0.01 (**).
4 zeigt eine Tabelle 1 mit dem Reaktionsaufbau des LAMP-Assays, wobei die LAMP-Reaktionsmischung für die Reaktionstemperatur (von 50 bis 66°C) und die Reaktionszeit (von 10 bis 90 Minuten) optimiert werden soll. Die optimierte Zeit und Temperatur werden für die Bewertung der Empfindlichkeit des LAMP-Tests bei verschiedenen Verdünnungen der Template-DNA (10 ng bis 100 fg) verwendet.
Das entwickelte Gerät ermöglicht eine isothermische Amplifikationstechnik für den schnellen, empfindlichen, spezifischen und kostengünstigen Nachweis von S. oryzae in Reissamen. Die relative Empfindlichkeit der isothermen Amplifikationsmethode und der PCRbasierten Techniken wird verglichen. Darüber hinaus wurde eine wiederverwendbare, tragbare, einfach faltbare Plattform auf Membranbasis entwickelt, die den grundlegenden Fuchsin-Farbstoff verwendet und effektiv für die Durchführung des LAMP-Assays anstelle von Polypropylenröhrchen eingesetzt werden kann. Die in dieser Studie entworfene Membran-Mikrogeräteplattform kann als Prototyp für die Entwicklung von Point-of-Care-Diagnosekits dienen, die von den Mitarbeitern der Beratungsdienste verwendet werden.
Die Figuren und die vorangehende Beschreibung geben Beispiele für Ausführungsformen. Der Fachmann wird verstehen, dass eines oder mehrere der beschriebenen Elemente durchaus zu einem einzigen Funktionselement kombiniert werden können. Alternativ dazu können bestimmte Elemente in mehrere Funktionselemente aufgeteilt werden. Elemente aus einer Ausführungsform können einer anderen Ausführungsform hinzugefügt werden. Die Reihenfolge der hier beschriebenen Prozesse kann beispielsweise geändert werden und ist nicht auf die hier beschriebene Weise beschränkt. Darüber hinaus müssen die Handlungen eines Flussdiagramms nicht in der dargestellten Reihenfolge ausgeführt werden; auch müssen nicht unbedingt alle Handlungen ausgeführt werden. Auch können diejenigen Handlungen, die nicht von anderen Handlungen abhängig sind, parallel zu den anderen Handlungen ausgeführt werden. Der Umfang der Ausführungsformen istdurch diese spezifischen Beispiele keineswegs begrenzt. Zahlreiche Variationen sind möglich, unabhängig davon, ob sie in der Beschreibung ausdrücklich genannt sind oder nicht, wie z. B. Unterschiede in der Struktur, den Abmessungen und der Verwendung von Materialien. Der Umfang der Ausführungsformen ist mindestens so groß wie in den folgenden Ansprüchen angegeben.
Vorteile, andere Vorzüge und Problemlösungen wurden oben im Hinblick auf bestimmte Ausführungsformen beschrieben. Die Vorteile, Vorzüge, Problemlösungen und Komponenten, die dazu führen können, dass ein Vorteil, ein Nutzen oder eine Lösung auftritt oder ausgeprägter wird, sind jedoch nicht als kritisches, erforderliches oder wesentliches Merkmal oder Komponente eines oder aller Ansprüche zu verstehen.
Bezugszeichenliste

100: Ein tragbares, einfaches Gerät zum Nachweis von durch Saatgut übertragenen Krankheitserregern bei Reis
102: Untere Schicht
104: Eine integrierte Probenkammer
106: Reaktionskammer
108: Detektionskammer
110: Eine Vielzahl von Fuchsin-gefärbten Streifen
202: Sarocladium oryzae
204: Positiv- und Negativkontrolle
206: Vorhandensein des Erregers
208: Abwesenheit des Erregers
210: LAMP-Regenten-Absorptionsplättchen
212: Regenerierte Zellulosemembran
214: FALTUNG
216: EINFACHE FALTUNG

Claims

Eine tragbare, einklappbare Vorrichtung zum Nachweis von durch Saatgut übertragenen Krankheitserregern, die mit Reis in Verbindung stehen, wobei die Vorrichtung umfasst: eine untere Schicht einer Acrylplatte, die für eine einfache Faltung geeignet ist, wobei die Faltunterstützung für die Acrylplatte durch eine PCR-Siegelfolie bereitgestellt wird; eine integrierte Probenkammer, die parallel zu einer Aktionskammer gekoppelt ist, die für die Aufnahme einer Vielzahl von Primern, Thermopolpuffern und Enzymen konfiguriert ist, wobei eine DNA-Matrize zu der integrierten Kammer hinzugefügt wird und für 2 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert werden kann; wobei die Reaktionskammer weiterhin mit einer Abdichtungsfolie abgedeckt wird, um die Verdunstung der Reagenzien zu verhindern, und dann 30 Minuten lang bei 60 °C inkubiert wird, wobei die Abdichtungsfolie vorsichtig entfernt wird und etwa 1 µl HCl in jede Reaktionsvertiefung gegeben und 5 Minuten lang bei 58 °C inkubiert wird, wobei 2 µl Natriumsulfit in die inkubierte integrierte Kammer gegeben werden; und eine Detektionskammer, die so gefaltet ist, dass die Detektionskammer die Reaktionskammer überlappt, um die Farbveränderung einer Vielzahl von Fuchsinstreifen zum Nachweis von durch Saatgut übertragenen Krankheitserregern in Verbindung mit Reis zu bestimmen.
Vorrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Reaktionskammer mit einer Polycarbonatfolie (PC) und vier aus der PC-Folie ausgeschnittenen Reaktionsmulden mit einem Radius von 2.5 mm bedeckt ist.
Vorrichtung nach Anspruch 1, wobei die Detektionskammer mit basischem Fuchsin-Farbstoff zur Visualisierung der Ergebnisse beschichtet ist.
Vorrichtung nach Anspruch 1, wobei die Farbänderung der Fuchsinstreifen entweder von magenta zu farblos (bei negativer Amplifikation) oder von magenta zu violett (bei positiver Amplifikation) bestimmt wird, um durch Saatgut übertragene Krankheitserreger in Verbindung mit Reis nachzuweisen.
Vorrichtung nach Anspruch 1, wobei die genomische DNA aus S. oryzae unter Verwendung eines CTAB-Verfahrens isoliert wird und die RNA-Kontamination durch Verdau einer erhaltenen genomischen DNA-Probe mit 10 µg/mL RNase entfernt wird, wobei die isolierte genomische DNA unter Verwendung von Nanodrop quantifiziert wird.
Vorrichtung nach Anspruch 1, wobei die genomische DNA-Probe von einem Satz von vier Schleifen-Primern für den LAMP-Assay empfangen wird, die für die Ausrichtung auf konservierte Regionen ausgelegt sind, wobei die Schleifen-Primer zwei innere Primer, den inneren Vorwärts-Primer (FIP) und den inneren Rückwärts-Primer (BIP), und zwei äußere Primer F3 und B3 umfassen.