DE102018207098B4

DE102018207098B4 - Mikrofluidische Vorrichtung und Verfahren zur Nanostruktur-Sequenzierung von Nukleotidsträngen

Info

Publication number: DE102018207098B4
Application number: DE102018207098.9A
Authority: DE
Inventors: Franz Laermer
Original assignee: Robert Bosch GmbH
Current assignee: Robert Bosch GmbH
Priority date: 2018-05-08
Filing date: 2018-05-08
Publication date: 2024-06-13
Anticipated expiration: 2038-05-09
Also published as: EP3790992A1; US20210138465A1; CN112352056A; WO2019215005A1; DE102018207098A1; US11986823B2

Abstract

Mikrofluidische Vorrichtung (100) für eine Sequenzierung von Nukleotidsträngen umfassend eine Array-Einheit (200) und eine mit der Array-Einheit (200) verbundene Nanostruktur (300), wobei die Array-Einheit (200) Arrayzellen (221, 222, 223, 224) mit Substanzen (11, 12, 13) für eine Polymerase-Kettenreaktion umfasst, wobei die Arrayzellen (221, 222, 223, 224) Nukleotide (13) mit Stoppeigenschaften nach der Sanger-Sequencing-Methode und Primer (11, 12) für eine asymmetrische Polymerase-Kettenreaktion umfassen, und wobei die Nanostruktur (300) ausgebildet ist, Längen von durch die Polymerase-Kettenreaktion gebildeten Nukleotidsträngen zu bestimmen.

Description

Stand der Technik
Aus dem Stand der Technik sind mehrere Methoden der DNA-Sequenzierung zur Bestimmung einer Nukleotid-Abfolge in einem DNA-Molekül bekannt, insbesondere die Didesoxymethode nach Sanger, auch Kettenabbruch-Synthese genannt und im Weiteren als Sanger-Sequencing-Methode bezeichnet.
Bei dieser Methode werden in vier sonst gleichen Ansätzen für eine Polymerase-Kettenreaktion (PCR) je eine der vier Basen zum Teil als Didesoxynukleosidtriphosphat (ddNTP) zugegeben (also je ein Ansatz mit entweder ddATP, ddCTP, ddGTP oder ddTTP). Diese Kettenabbruch-ddNTPs besitzen keine 3'-Hydroxygruppe. Werden sie in den neusynthetisierten Strang eingebaut, ist eine Verlängerung der DNA durch die DNA-Polymerase nicht mehr möglich und es entstehen DNA-Fragmente unterschiedlicher Länge, die in jedem einzelnen Ansatz stets mit dem gleichen ddNTP enden (also je Ansatz nur mit A oder C oder G oder T). Diese ddNTPs können mit einer Sonde radioaktiv markiert werden, so dass über eine Gelelektrophorese die Längen dieser DNA-Fragmente bestimmt und über einen Längenvergleich die Nukleotidsequenz festgestellt werden kann. Alternativ kann die Sequenzierung über „Time-of-flight"-Messungen durch Leitung aller PCR-Produkte durch einen von einem Nanoporen-Paar begrenzten Kanal erfolgen, wie beispielsweise in WO16154337A2 beschrieben.
Ferner ist aus dem Stand der Technik die quantitative PCR (qPCR) bekannt, wobei insbesondere mit Hilfe von Fluoreszenzmessungen die Vervielfältigung von DNA-Fragmenten quantitativ in Echtzeit verfolgt werden kann.
Offenbarung der Erfindung
Vorteile der Erfindung
Vor diesem Hintergrund betrifft die Erfindung eine mikrofluidische Vorrichtung, insbesondere einen Array-Chip, welche eine Polymerase-Kettenreaktion (PCR) und eine Sequenzierung von Nukleotidsträngen, insbesondere von DNA-Fragmenten, kombiniert. Bei der mikrofluidischen Vorrichtung kann es sich dabei insbesondere um einen integrierbaren Teil einer mikrofluidischen Umgebung handeln, beispielsweise um einen Array-Chip zur Integration in eine Lab-on-a-Chip-Umgebung, beispielsweise in eine mikrofluidische Kartusche.
Die mikrofluidische Vorrichtung umfasst eine Array-Einheit und eine mit der Array-Einheit verbundene Nanostruktur, wobei die Array-Einheit Arrayzellen mit Substanzen für die Durchführung einer PCR umfasst. Insbesondere können die Arrayzellen für die Durchführung einer quantitativen PCR vorgesehen sein. Die Arrayzellen umfassen Nukleotide mit Stoppeigenschaften nach der Sanger-Sequencing-Methode sowie Primer für eine asymmetrische Polymerase-Kettenreaktion. Die Nanostruktur der mikrofluidischen Vorrichtung ist ausgebildet, Längen von durch die Polymerase-Kettenreaktion gebildeten Nukleotidsträngen zu bestimmen. Einige oder alle Primer können eine Fluoreszenzmarkierung für eine optische Überwachung der PCR umfassen.
Bei den Nukleotidsträngen kann es sich insbesondere um DNA-Abschnitte oder DNA-Fragmente handeln, welche beispielsweise aus einer Probenaufbereitung und Probenaufreinigung gewonnen wurden, beispielsweise in Kombination mit einer Voramplifikation, insbesondere einer verschachtelten PCR („nested-PCR“) oder einer Genomamplifikation („Whole Genome Amplifikation“, WGA). Die Abschnitte können dabei beispielsweise gemischt mit einem PCR-Mix aus Polymerase, Standard-Nukleotiden (A, T, C, G) und benötigten Salzpuffern in der Array-Einheit bereitgestellt sein. Die Array-Einheit kann insbesondere ein Substrat umfassen, wobei das Substrat die Arrayzellen in Form von Ausnehmungen oder Vertiefungen aufweist, in welchen die PCR ablaufen kann.
Bei dem Substrat kann es sich um ein in der Mikrofluidik übliches Substrat, insbesondere aus Kunststoff handeln.
Unter einer asymmetrischen Polymerase-Kettenreaktion ist insbesondere eine PCR zu verstehen, bei welcher nach Ablauf der PCR im Gegensatz zu einer klassischen PCR, insbesondere bezogen auf Größenordnungen, nicht die gleiche Anzahl von vervielfältigten Vorwärtssträngen und Rückwärtssträngen produziert wurden. Hingegen werden bei der asymmetrischen PCR eine, insbesondere um Größenordnungen, unterschiedlich große Anzahl von Vorwärtssträngen gegenüber Rückwärtssträngen oder umgekehrt produziert. Insbesondere weist die asymmetrische PCR einen exponentiellen Verlauf gefolgt von einem linearen Verlauf auf, wobei im exponentiellen Verlauf Vorwärtsstränge und Rückwärtsstränge grundsätzlich in gleicher Anzahl vervielfältigt und im linearen Verlauf nur entweder Vorwärtsstränge oder Rückstränge vervielfältigt werden.
Unter Nukleotiden mit Stoppeigenschaften (Stoppnukleotide) nach der Sanger-Sequencing-Methode sind insbesondere Didesoxyribonukleosid-Triphosphate (ddNTP) zu verstehen, so dass zu je einem PCR-Ansatz zusätzlich zu den Desoxyribonukleosid-Triphosphaten (dNTPs) eines der vier ddNTPs für die Durchführung der Sanger-Sequencing-Methode hinzugegeben werden kann.
Unter einer Nanostruktur kann insbesondere eine Struktur mit Strukturelementen im Nanometer-Größenbereich verstanden werden. Insbesondere kann die Nanostruktur Poren und/oder Kanäle mit Abmessungen im Nanometerbereich aufweisen, im Weiteren als Nanoporen beziehungsweise Nanokanäle bezeichnet.
Die erfindungsgemäße Vorrichtung hat den Vorteil, dass eine automatisierte Sequenzierung von DNA-Abschnitten wohldefiniert in einer mikrofluidischen Umgebung, insbesondere in einem Lab-on-a-Chip, integriert werden kann. Die Kombination der Sanger-Sequencing-Methode durch Stoppnukleotide mit der Fragmentlängenbestimmung durch die Nanostruktur ermöglicht einen Verzicht auf eine direkte Identifikation von Nukleinbasen mit Nanoporen oder Nanokanälen. Hingegen genügt vorteilhafterweise eine Bestimmung der Länge der PCR-Produkte zur indirekten Bestimmung der Basensequenz, wobei die Länge insbesondere durch Bestimmung einer Durchtrittszeit durch die Nanostruktur erfolgen kann, was die Bestimmung besonders robust macht. Durch die Kombination einer PCR mit einer unmittelbar angeschlossenen Längenbestimmung der PCR-Produkte über eine Nanostruktur kann bei Bedarf auch auf die übliche Fluoreszenzmarkierung der PCR-Produkte vorteilhafterweise verzichtet werden. Wenn die Arrayzellen für die Durchführung einer quantitativen PCR (qPCR) vorgesehen sind, dann ermöglicht die Erfindung eine vorteilhafte Synergie der Kombination einer asymmetrischen qPCR-Reaktion mit einer unmittelbar angeschlossenen Nanostruktur zur Längenbestimmung der generierten PCR-Produkte. Eine Überwachung der qPCR-Reaktion, auch Monitoring genannt, gestattet die exakte Feststellung des Übergangs von der exponentiellen in die lineare PCR-Phase, sowie ermöglicht nach einer Reihe von linearen Amplifikationsvorgängen einen exakten Startpunkt des Durchtrittsvorgangs durch die Nanostrukturen mit integrierter Längenmessung der Produkte über Durchtrittszeiten durch die Nanostruktur.
In einer besonders bevorzugten Ausgestaltung der Erfindung umfassen die Primer in den Arrayzellen jeweils Primerpaare mit einer Majoritätsprimersorte und einer Minoritätsprimersorte, so dass die asymmetrische Polymerase-Kettenreaktion einen exponentiellen Verlauf gefolgt von einem linearen Verlauf aufweist. Die Majoritätsprimersorte unterscheidet sich dabei von der Minoritätsprimersorte beispielsweise allein durch die relative Anzahl an Primern, so dass bezogen auf die Anzahl an Primern die Majoritätsprimersorte die Minoritätsprimersorte um vorzugsweise 1 bis 3, ganz bevorzugt 1 bis 2 Größenordnungen dominiert. Solange von beiden Primersorten eine genügend große Zahl vorhanden ist, wirkt sich eine Asymmetrie in ihren Anzahlen nicht aus, so dass die PCR exponentiell unter Verbrauch beider Primersorten abläuft. Sobald der Minoritätsprimer nicht mehr in ausreichender Zahl zur Verfügung steht, geht die PCR in die lineare Phase der Amplifikation über, das heißt es wird zunehmend nur noch ein Strang, beispielsweise der Vorwärtsstrang abgeschrieben und vervielfältigt. Vorzugsweise umfassen dabei ein oder mehrere Gruppen von Arrayzellen jeweils vier Arrayzellen, wobei für jede der Gruppen die Arrayzellen dieselben Arten von Primern aufweisen. Mit anderen Worten weisen alle Arrayzellen jeder Gruppe dieselben Arten von Primern auf. Für die Zwecke der optischen Überwachung der PCR können die Primer eine Fluoreszenzmarkierung aufweisen. Beispielsweise können entweder alle Primer oder nur gewisse Primer eine solche Markierung aufweisen. Beispielsweise weisen nur die Primer der Majoritätsprimersorte eine solche Markierung auf, um auch während der linearen Phase der PCR eine Überwachung zu ermöglichen. Alternativ können die Primer der Majoritätsprimersorte und die Primer der Minoritätsprimersorte unterschiedliche Markierungen aufweisen, was eine Beobachtung des Übergangs von der exponentiellen in die lineare Phase erleichtert. Alternativ weisen nur die Primer der Minoritätsprimersorte eine Markierung auf.
In den Arrayzellen befinden sich somit vorzugsweise jeweils eine stark asymmetrische Anzahl von für die jeweilige Arrayzelle oder für die jeweilige Gruppe von Arrayzellen charakteristischen Majoritäts- und Minoritätsprimer spezifisch für jeweils einen charakteristischen DNA-Abschnitt, kombiniert mit einem für die jeweilige Arrayzelle charakteristischen Stoppnukleotid vom Typ A*, T*, C* oder G* nach Art der Sanger- Sequencing-Methode. Beim Durchtritt von vor allem während des linearen Verlaufs der Polymerase-Kettenreaktion generierten sequenzspezifischen DNA-Fragmenten, die mit dem jeweils für die Arrayzelle charakteristischen Stoppnukleotid enden, durch die mit der Array-Einheit verbunden Nanostruktur kann gemäß einer vorteilhaften Ausgestaltung eine Veränderung eines elektrischen Stromflusses gemessen werden und damit die Durchtrittszeit des jeweiligen DNA-Fragments durch die Nanostruktur bestimmt werden. Somit kann die jeweilige Länge der durchtretenden Fragmente ermittelt werden. Die Summe aller Fragmentlängen für jeweils vier Arrayzellen mit denselben Primern und den Stoppnukleotiden vom Typ A*, T*, C* oder G* (jeweils ein Typ in jeder der vier Arrayzellen) ergibt die gesamte DNA-Sequenz des entsprechenden durch die Primer festgelegten DNA-Abschnitts.
In einer besonders vorteilhaften Weiterbildung der Erfindung sind in zumindest einer Arrayzelle ein oder mehrere unterdrückende Primer zur Verhinderung einer Vervielfältigung vorgegebener Spezies während der Polymerase-Kettenreaktion vorgelagert. Solche unterdrückende Primer, auch als „Clamps“ bezeichnet, können vorteilhafterweise beigefügt werden, um die Amplifikation gewisser Spezies zu unterdrücken, beispielsweise unmutierter Wildtyp-DNA-Abschnitte, wenn man auf eine Detektion von vom Wildtyp abweichenden Mutationen abzielt. Die Details der Abweichungen vom Wildtyp müssen dabei vorteilhafterweise nicht bekannt sein, so dass auch unbekannte Mutationen entschlüsseln werden können. Auch für die Wildtypdiskriminierung ist es vorteilhaft, wenn der Reaktionsverlauf der PCR-Reaktion als qPCR gemonitort wird.
Gemäß einer besonders vorteilhaften Weiterbildung der Erfindung sind einzelne Arrayzellen einzelnen Detektionsstrukturen der Nanostruktur derart zugeordnet, dass eine Detektionsstruktur Längen von Nukleotidsträngen aus jeweils einer Arrayzelle bestimmen kann. Vorzugsweise ist jeweils eine Detektionsstruktur mit einer Arrayzelle verbunden. Dies hat den Vorteil, dass eine eindeutige Zuordnung von durch die Detektionsstrukturen detektieren PCR-Produkten zu Arrayzellen erfolgen kann. Bei den Detektionsstrukturen kann es sich insbesondere um die oben genannten Nanoporen oder Nanokanäle der Nanostruktur handeln oder beispielsweise um Kanäle, welche jeweils von zwei Nanoporen begrenzt sind.
In einer vorteilhaften Ausgestaltung sind dabei zwischen einzelnen Arrayzellen und einzelnen Detektionsstrukturen elektrische Spannungen zur Beförderung und Längenbestimmung der Nukleotidstränge über Elektroden anlegbar.
Gegenstand der Erfindung ist auch ein Verfahren zur Sequenzierung von Nukleotidsträngen mit der erfindungsgemäßen mikrofluidischen Vorrichtung. In einem ersten Schritt des Verfahrens erfolgt die Durchführung der asymmetrischen Polymerase-Kettenreaktion mit der Array-Einheit der Vorrichtung zur Vervielfältigung der Nukleotidstränge nach der Sanger-Sequencing-Methode. In einem zweiten Schritt erfolgt die Bestimmung der Längen der vervielfältigten Nukleotidstränge durch die Nanostruktur der Vorrichtung.
Gemäß einer vorteilhaften Weiterbildung des Verfahrens wird die Durchführung der Polymerase-Kettenreaktion überwacht. Die Überwachung kann dabei vorzugsweise optisch mit Hilfe einer Fluoreszenzmarkierung erfolgen, beispielsweise einer Fluoreszenzmarkierung einer oder mehrerer der verwendeten Primer. Wie oben beschrieben, erlaubt dies vorteilhafterweise die Überwachung der einzelnen PCR-Zyklen. Insbesondere kann dadurch der Übergang zwischen exponentieller PCR und linearer PCR erkannt und überwacht werden. Ferner kann dadurch die Anzahl der linearen PCR-Zyklen auch auf einfache Weise überwacht werden, wobei vorzugsweise eine vorgegebene Anzahl von linearen PCR-Zyklen als Kriterium für den Start der Fragmentlängenbestimmung durch die Nanostrukturen verwendet werden kann. Mit anderen Worten wird die Fragmentlängenbestimmung nach einer vorgegebenen Anzahl von linearen PCR-Zyklen begonnen. Dies hat den Vorteil, dass die am Ende der PCR vorliegende Menge an PCR-Produkten auf einfache Weise für die Nachfolgende Längenbestimmung eingestellt werden kann.
Zu den Vorteilen des erfindungsgemäßen Verfahrens wird auch auf die oben ausgeführten korrespondierenden Vorteile der erfindungsgemäßen Vorrichtung und deren Weiterbildungen und Ausgestaltungen verwiesen.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
Ausführungsbeispiele der Erfindung sind in den Zeichnungen schematisch dargestellt und in der nachfolgenden Beschreibung näher erläutert. Für die in den verschiedenen Figuren dargestellten und ähnlich wirkenden Elemente werden gleiche Bezugszeichen verwendet, wobei auf eine wiederholte Beschreibung der Elemente verzichtet wird.
Es zeigen

1 bis 2 Ausführungsbeispiele der erfindungsgemäßen Vorrichtung und
3 ein Flussdiagramm eines Ausführungsbeispiels des erfindungsgemäßen Verfahrens.

Ausführungsformen der Erfindung
1 zeigt schematisch ein Ausführungsbeispiel der mikrofluidischen Vorrichtung 100 für eine Sequenzierung von Nukleotidsträngen. Die Vorrichtung 100 umfasst eine Array-Einheit 200 und eine mit der Array-Einheit 200 verbundene Nanostruktur 300.
Die Array-Einheit 200 umfasst ein oder mehrere Gruppen 211, 212 von Arrayzellen. In 1 sind schematisch eine erste Gruppe 211 und eine zweite Gruppe 212 von Arrayzellen dargestellt, wobei jede Gruppe vorzugsweise von Arrayzellen 221, 222, 223, 224 umfasst. Die Array-Einheit kann darüber hinaus aber noch weitere Gruppen von Arrayzellen umfassen. In den Arrayzellen 221, 222, 223, 224 sind vorzugsweise Substanzen 11, 12, 13 für die Durchführung einer quantitativen PCR (qPCR) vorgelagert. Insbesondere umfassen die Arrayzellen jeweils Primerpaare 11, 12 mit Primern einer Majoritätsprimersorte 11 und einer Minoritätsprimersorte 12. Weitere Substanzen 13 umfassen insbesondere ausgewählte Nukleotide beispielsweise gefriergetrocknete Stoffe für den PCR-Ansatz.
Jeweils vier Arrayzellen 221, 222, 223, 224 einer Gruppe 211, 212 enthalten somit jeweils identisch dasselbe Primerpaar 10, 11 für die qPCR. Zusätzlich enthalten diese vier Arrayzellen 221, 222, 223, 224 jeweils eine Nukleotidsorte in vergleichsweise geringer Zahl, beispielsweise im unteren Prozentbereich, mit Stoppeigenschaften, also A*, T*, C* und G* nach Art der Sanger-Sequencing-Methode. Wird während eines PCR-Zyklus ein derartiges Nukleotid mit Stoppeigenschaften in den Vorwärts- oder Rückwärtsstrang eingebaut, kommt es zum Abbruch der PCR und es entsteht ein entsprechendes PCR-Produktfragment einer charakteristischen Länge, das mit dem jeweiligen StoppNukleotid endet. Gemäß der Sanger-Sequencing Methode entstehen so nach einer hinreichend großen Anzahl von PCR-Zyklen alle DNA-Fragmentlängen von Vorwärts- und Rückwärtsstrang, die mit dem jeweils vorgelegten Typ von Stoppnukleotid enden.
Solange die PCR exponentiell abläuft, ist eine Bestimmung der Länge eines vervielfältigen DNA-Fragments uncharakteristisch für die DNA-Sequenz des DNA-Fragments, weil sowohl die PCR-Produkte von Vorwärts- als auch Rückwärtsstrang an allen zum Stoppnukleotid passenden Stellen abbrechen.
Vorzugsweise ist daher die Anzahl der Primer der Majoritätsprimersorte 11 um ein bis zwei Größenordnungen größer als die Anzahl der Primer der Minoritätsprimersorte 12. Solange von beiden Primersorten 11, 12, eine genügend große Zahl vorhanden ist, wirkt sich die Asymmetrie in ihren Anzahlen nicht aus, so dass die PCR exponentiell unter Verbrauch beider Primersorten abläuft und eine große Zahl von PCR-Produkten in kurzer Zeit gebildet werden. Sobald der Minoritätsprimer 12 nicht mehr in ausreichender Zahl zur Verfügung steht, geht die PCR in die lineare Phase der Amplifikation über, es wird also zunehmend nur noch der über den Majoritätsprimer vervielfältigte Strang amplifiziert, beispielsweise der Vorwärtsstrang (im folgenden ausschließliche Betrachtung des Vorwärtsstrangs ohne Beschränkung der Allgemeinheit). Der Einbau von Stoppnukleotiden führt zunehmend zu DNA-Fragmentlängen, die charakteristisch sind für die Sequenz des Vorwärtsstrangs. Während in der exponentiellen Phase der PCR ein uncharakteristischer „Hintergrund“ von Fragmentlängen gebildet wird, entstehen während der linearen Phase der PCR charakteristische Fragmente, die die Information über die Sequenz wiedergeben. Da die PCR als qPCR quantitativ in ihrem Verlauf kontrolliert werden kann, kann auch der Übergang in die lineare Phase und in die „charakteristischen PCR-Zyklen“ eindeutig erkannt werden, so dass der gesamte Prozess wohldefiniert kontrolliert werden kann. Insbesondere kann die qPCR wie oben beschrieben mit Hilfe einer Fluoreszenzmarkierung beispielsweise der Primer effektiv überwacht werden.
Die mit den Arrayzellen 210, 211, 211, 221, 222, 223, 224 verbundene Nanostruktur 300 ist ausgebildet, die Längen der über die PCR vervielfältigten DNA-Fragmente zu bestimmen. 1 zeigt schematisch, dass dazu vorzugsweise einzelne Detektionsstrukturen 321, 322, 323, 324 der Nanostruktur 300 jeweils den einzelnen Arrayzellen 221, 222, 223, 224 derart zugeordnet sind, dass je eine Detektionsstruktur 321, 322, 323, 324 Längen von Nukleotidsträngen aus jeweils einer Arrayzelle 221, 222, 223, 224 bestimmen kann. Mit anderen Worten ist jede Arrayzelle 221, 222, 223, 224 mit einer eigenen Detektionsstruktur 321, 322, 323, 324 verbunden, beispielsweise über mikrofluidische Kanäle 401, 402, 403, 404. Bei den Detektionsstrukturen 321, 322, 323, 324 kann es sich insbesondere um Nanoporen oder Nanokanäle handeln, beispielsweise um Kanäle 303, welche jeweils von zwei Nanoporen als Eintritt und Austritt 301, 302 begrenzt sind.
Die Detektionsstrukturen 321, 322, 323, 324 sind vorzugsweise mit Elektrodengeometrien 311, 312, 313 ausgestattet, um ein Passieren eines DNA-Fragments durch eine Detektionsstruktur 221, 222, 223, 224 durch eine Strom- oder Spannungsänderung erkennbar zu machen. Beispielsweise kommt es dabei jeweils zur Unterbrechung oder Veränderung des Stromflusses, solange ein DNA-Fragment durch die Detektionsstruktur 221, 222, 223, 224, also beispielsweise durch die Nanopore oder den Nanokanal 303 hindurchtritt und dabei die Elektrodengeometrie passiert. Eine Länge des DNA-Fragments kann dabei durch eine Messung der Durchtrittszeiten durch die jeweilige Detektionsstruktur 221, 222, 223, 224 erfolgen. Da jede gemessene Länge jeweils die Position des entsprechenden Stopp-Nukleotids eindeutig identifiziert, ergibt die Summe aller gemessenen Längen aus einer Arrayzelle 221, 222, 223, 224 die Gesamtheit aller Positionen des Stoppnukleotids und die Informationen aus den jeweils vier Arrayzellen 221, 222, 223, 224 eine Gruppe 211, 212 zusammengefasst die jeweilige gesamte Gensequenz für alle vier Stoppnukleotidtypen. Alle Arrayzellen zusammen ergeben somit die Sequenzen aller zu analysierenden DNA-Fragmente. Dabei wird durch die Maximallänge der pro Arrayzellen auftretenden Fragmente (das heißt die Länge des vollen DNA-Strangs) und die Minimallänge der pro Arrayzelle auftretenden Fragmente (das heißt die Länge des Vorwärtsprimer in diesem Beispiel) auch eine in-situ Kalibrierung der Längenskala ermöglich. Ferner kann die Elektrodengeometrie 311, 312, 313 auch zum Befördern der in der Regel elektrisch geladenen DNA-Fragmente verwendet werden. 2 zeigt eine mögliche Ausgestaltung der Nanostruktur 300 mit parallel angeordneten Nanokanälen 303 welche über Elektroden 311, 312 und eine Spannungsquelle 313 unter Spannung gesetzt werden können.
Zur Illustration sei vereinfacht angenommen, dass die qPCR in einer Arrayzelle nach N Zyklen mit exponentieller Amplifikation um den Faktor 2 pro PCR-Zyklus schlagartig in einen linearen Verlauf übergeht mit darauffolgenden M linearen Amplifikationsschritten (in der Realität ist dieser Übergang natürlich „verschmiert“, was aber im Grundsatz für das Verständnis und die qualitative Abschätzung nichts grundlegend verändert).
Nach N exponentiellen und M linearen PCR-Zyklen ist der relative Anteil R der charakteristischen (der „richtigen“) Abbruch-Fragmente: $\begin{matrix} R = \frac{2^{N} - 1 + 2^{N} M}{2 (2^{N} - 1) + 2^{N} M} = \frac{1 + \frac{2^{N} M}{2^{N} - 1}}{2 + \frac{2^{N} M}{2^{N} - 1}} \\ = \frac{1 + \frac{M}{1 - 2^{- N}}}{2 + \frac{M}{1 - 2^{- N}}} \approx \frac{1 + M}{2 + M} \overset{f \ddot{u} r M \to \infty}{\to} 1 \end{matrix}$
Entsprechend ist der Anteil F der nicht-charakteristischen (der „falschen“) Abbruch- Fragmente: $\begin{matrix} F = \frac{2^{N} - 1}{2 (2^{N} - 1) + 2^{N} M} = \frac{11}{2 + \frac{2^{N} M}{2^{N} - 1}} \\ = \frac{1}{2 + \frac{M}{1 - 2^{- N}}} \approx \frac{1}{2 + M} \overset{f \ddot{u} r M \to \infty}{\to} 0 \end{matrix}$
Daraus wird ersichtlich, dass sich mit einer entsprechenden Zahl von linearen PCR-Zyklen von z.B. 10-20 ein gutes Signal-zu-Hintergrundverhältnis erreichen lässt, d.h. die „richtigen“ Fragmentlängen erscheinen demzufolge in der Zählstatistik mit einer 10-20fach höheren Zählrate als die „falschen“ Fragmentlängen.
3 zeigt ein Flussdiagramm zu einem Ausführungsbeispiel des erfindungsgemäßen Verfahrens 600 zur Sequenzierung von Nukleotidsträngen, welches beispielsweise mit einem Ausführungsbeispiel der erfindungsgemäßen Vorrichtung 100 gemäß 1 und 2 durchgeführt werden kann. In einem ersten Schritt 601 des Verfahrens 600 erfolgt die Durchführung der asymmetrischen Polymerase-Kettenreaktion mit der Array-Einheit 200 der Vorrichtung 100 zur Vervielfältigung der Nukleotidstränge nach der Sanger-Sequencing-Methode. In einem zweiten Schritt 602 erfolgt die Bestimmung der Längen der vervielfältigten Nukleotidstränge durch die Nanostruktur 300 der Vorrichtung 100. Vorzugsweise kann die Bestimmung der Längen wie oben beschrieben nach Durchlauf einer vorgegebenen Anzahl von PCR-Zyklen gestartet werden, insbesondere nach Durchlauf einer vorgegebenen Anzahl von Zyklen der linearen PCR. Die PCR und insbesondere die PCR-Zyklen können dabei wie oben ausgeführt mit Hilfe von Fluoreszenzmarkierung überwacht werden.

Claims

Mikrofluidische Vorrichtung (100) für eine Sequenzierung von Nukleotidsträngen umfassend eine Array-Einheit (200) und eine mit der Array-Einheit (200) verbundene Nanostruktur (300), wobei die Array-Einheit (200) Arrayzellen (221, 222, 223, 224) mit Substanzen (11, 12, 13) für eine Polymerase-Kettenreaktion umfasst, wobei die Arrayzellen (221, 222, 223, 224) Nukleotide (13) mit Stoppeigenschaften nach der Sanger-Sequencing-Methode und Primer (11, 12) für eine asymmetrische Polymerase-Kettenreaktion umfassen, und wobei die Nanostruktur (300) ausgebildet ist, Längen von durch die Polymerase-Kettenreaktion gebildeten Nukleotidsträngen zu bestimmen.
Mikrofluidische Vorrichtung (100) nach Anspruch 1, wobei in den Arrayzellen die Primer (11, 12) jeweils Primerpaare (11, 12) mit einer Majoritätsprimersorte (11) und einer Minoritätsprimersorte (12) umfassen, so dass die asymmetrische Polymerase-Kettenreaktion einen exponentiellen Verlauf gefolgt von einem linearen Verlauf aufweist.
Mikrofluidische Vorrichtung (100) nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Nanostruktur (300) Nanoporen (301, 302) und/oder Nanokanäle (303) aufweist.
Mikrofluidische Vorrichtung (100) nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei ein oder mehrere Gruppen (211, 212) von Arrayzellen jeweils vier Arrayzellen (221, 222, 223, 224) umfassen, und wobei zumindest alle Arrayzellen (221, 222, 223, 224) einer Gruppe (211, 212) dieselben Arten von Primern aufweisen.
Mikrofluidische Vorrichtung (100) nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei einzelne Arrayzellen (221, 222, 223, 224) einzelnen Detektionsstrukturen (321, 322, 323, 324) der Nanostruktur (300) derart zugeordnet sind, dass eine Detektionsstruktur (321, 322, 323, 324) Längen von Nukleotidsträngen aus jeweils einer Arrayzelle (221, 222, 223, 224) bestimmen kann.
Mikrofluidische Vorrichtung (100) nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei zwischen einzelnen Arrayzellen (221, 222, 223, 224) und einzelnen Detektionsstrukturen (321, 322, 323, 324) eine elektrische Spannung zur Beförderung und Längenbestimmung der Nukleotidstränge über Elektroden (301, 302, 303) anlegbar ist.
Mikrofluidische Vorrichtung (100) nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei in zumindest einer Arrayzelle (221, 222, 223, 224) ein oder mehrere unterdrückende Primer (13) zur Verhinderung einer Vervielfältigung vorgegebener Spezies während der Polymerase-Kettenreaktion vorgelagert sind.
Verfahren (600) zur Sequenzierung von Nukleotidsträngen mit einer mikrofluidischen Vorrichtung (100), umfassend die Schritte: • Durchführung (601) einer asymmetrischen Polymerase-Kettenreaktion mit einer Array-Einheit (200) der Vorrichtung (100) zur Vervielfältigung der Nukleotidstränge nach der Sanger-Sequencing-Methode. • Bestimmung (602) der Längen der vervielfältigten Nukleotidstränge durch eine Nanostruktur der Vorrichtung (100).
Verfahren (600) nach Anspruch 8, wobei die asymmetrische Polymerase-Kettenreaktion einen exponentiellen Verlauf, insbesondere eine quantitative Polymerase-Kettenreaktion gefolgt von einem linearen Verlauf aufweist.
Verfahren (600) nach Anspruch 9, wobei die asymmetrischen Polymerase-Kettenreaktion überwacht wird, insbesondere mit Hilfe einer Fluoreszenzmarkierung einer oder mehrerer der verwendeten Primer.
Verfahren (600) nach Anspruch 10, wobei der Übergang zwischen exponentieller PCR und linearer PCR erkannt oder überwacht und/oder die Anzahl der linearen PCR-Zyklen überwacht werden und als ein Kriterium für den Start der Fragmentlängenbestimmung durch die Nanostrukturen verwendet wird.