CN112352056A - 用于核苷酸链的纳米结构测序的微流体装置和方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及用于对核苷酸链进行测序的微流体装置（100）和方法（600），所述微流体装置包括阵列装置（200）和与所述阵列装置（200）连接的纳米结构（300），其中所述阵列装置（200）包括具有用于聚合酶链反应的物质（11、12、13）的阵列单元（221、222、223、224），其中所述阵列单元（221、222、223、224）包含根据桑格测序方法具有终止特性的核苷酸（13）和用于不对称聚合酶链反应的引物（11、12），并且其中纳米结构（300）被设计为确定由聚合酶链反应形成的核苷酸链的长度。
Description
背景技术
从现有技术中已知用于确定DNA分子中的核苷酸序列的多种DNA测序方法，特别是根据桑格的双脱氧法，其也称为链终止合成且以下称为桑格测序方法。
在该方法中，在四个在其它方面相同的聚合酶链反应（PCR）批次中，添加部分作为双脱氧核苷三磷酸（ddNTP）的四个碱基中的各一个（即各一个批次具有ddATP、ddCTP、ddGTP或者ddTTP）。这些链终止-ddNTP不具有3'-羟基。如果它们并入新合成的链中，则通过DNA聚合酶的DNA延长不再是可行的，并且产生不同长度的DNA片段，这些片段在每个单独批次中始终以相同的ddNTP为末端（即各批次仅具有A或C或G或T）。可以用探针对这些ddNTP进行放射性标记，以使得可以通过凝胶电泳确定这些DNA片段的长度并通过长度比较来确定核苷酸序列。或者，可以经由“飞行时间”测量通过将所有PCR产物引导通过由纳米孔对界定的通道来进行测序，如例如WO16154337A2中所述。
此外，从现有技术中已知定量PCR（qPCR），其中特别地借助荧光测量可以实时定量地追踪DNA片段的复制。
发明公开
发明优点
在这种背景下，本发明涉及微流体装置，特别是阵列芯片，其组合了聚合酶链反应（PCR）和核苷酸链，特别是DNA片段的测序。该微流体装置可以在此特别是微流体环境的可集成部分，例如是用于集成到芯片实验室环境中，例如微流体筒中的阵列芯片。
该微流体装置包括阵列装置和与该阵列装置连接的纳米结构，其中该阵列装置包括具有用于进行PCR的物质的阵列单元。特别地，可以设置用于进行定量PCR的阵列单元。该阵列单元包含根据桑格测序方法具有终止特性的核苷酸以及用于不对称聚合酶链反应的引物。微流体装置的纳米结构被设计为确定由聚合酶链反应形成的核苷酸链的长度。一些或全部引物可包含用于光学监测PCR的荧光标记。
核苷酸链特别可以是例如由样品准备和样品纯化（例如与预扩增，特别是嵌套式PCR（“巢式PCR”）或基因组扩增（“全基因组扩增”，WGA）组合）获得的DNA部分或DNA片段。在此，这些片段可以例如在阵列装置中以与聚合酶、标准核苷酸（A、T、C、G）和所需盐缓冲物的PCR混合物混合的方式提供。阵列装置可以特别地包含基底，其中该基底具有呈凹槽或凹陷形式的阵列单元，可以在其中进行PCR。该基底可以是微流体技术中常用的基底，其特别是由塑料制成。
不对称聚合酶链反应被理解为特别是这样的PCR，其中与经典PCR相反，在PCR结束后特别是基于数量级而言不产生相同数量的被复制的正向链和反向链。相反，在不对称PCR中，与反向链相比，特别是基于数量级而言产生特别是不同大数量的正向链，反之亦然。特别地，不对称PCR具有指数进程和随后的线性进程，其中在指数进程中，正向链和反向链基本上以相同数量复制，并且在线性进程中，仅正向链或反向链复制。
根据桑格测序方法具有终止特性的核苷酸（终止核苷酸）被理解为特别是双脱氧核糖核苷三磷酸（ddNTP），以使得除脱氧核糖核苷三磷酸（dNTP）以外，可以向各一个PCR批次添加四个ddNTP之一以进行桑格测序方法。
纳米结构尤其可被理解为具有在纳米尺寸范围内的结构单元的结构。特别地，纳米结构可以具有尺寸在纳米范围内的孔和/或通道，其以下称为纳米孔和纳米通道。
本发明装置具有优点，即DNA片段的自动化测序可以定义明确地集成在微流体环境中，特别是在芯片实验室中。通过终止核苷酸的桑格测序方法与通过纳米结构的片段长度确定的组合使得可以无需利用纳米孔或纳米通道直接识别核碱基。相反，PCR产物长度的确定有利地足以间接确定碱基序列，其中该长度尤其可以通过确定通过纳米结构的通过时间来进行，这使得该确定特别稳健。通过PCR与紧接着经由纳米结构的PCR产物长度确定的组合，在需要时还可以有利地无需PCR产物的常用荧光标记。如果设置用于进行定量PCR（qPCR）的阵列单元，则本发明实现了不对称qPCR反应与紧接着用于所产生的PCR产物的长度确定的纳米结构的组合的有利协同作用。qPCR反应的监测（也称为监控）使得可以精确确定从指数到线性PCR阶段的转变，以及在一系列线性扩增过程之后实现通过纳米结构的通过过程的精确起点以及经由通过纳米结构的通过时间对产物进行集成的长度测量。
在本发明的一个特别优选的实施方式中，阵列单元中的引物各自包含具有多数引物类型和少数引物类型的引物对，以使得不对称聚合酶链反应具有指数进程和随后的线性进程。在此，多数引物类型与少数引物类型例如仅在引物的相对数量上不同，以使得基于引物的数量计，多数引物类型相比于少数引物类型而言以优选1-3个数量级，非常优选1-2个数量级占优势。只要存在足够大数量的两种引物类型，其数量的不对称性没有影响，以使得PCR在消耗这两种引物类型的情况下指数进行。一旦少数引物不再以足够的数量可用，PCR就转变到线性扩增阶段，也就是说，仅还有一个链，例如正向链被越来越多地拷贝和复制。优选地，阵列单元的一个或多个组在此各自包括四个阵列单元，其中对于这些组的每一个而言，这些阵列单元具有相同种类的引物。换句话说，各个组的所有阵列单元具有相同种类的引物。出于光学监测PCR的目的，引物可以具有荧光标记。例如，所有引物或仅一些引物可以具有这样的标记。例如，仅多数引物类型的引物具有这样的标记，以甚至在PCR的线性阶段期间也能够监测。或者，多数引物类型的引物和少数引物类型的引物可以具有不同的标记，这有助于观察从指数阶段到线性阶段的转变。或者，仅少数引物类型的引物具有标记。
在阵列单元中，因此优选地存在各自严重不对称数量的对于各自阵列单元或对于各自阵列单元组而言特征性的多数和少数引物（其对于各自特征性DNA片段而言是特异性的）与根据桑格测序方法类型对于各自阵列单元而言特征性的A*、T*、C*或G*型终止核苷酸的组合。根据一个有利的实施方式，当尤其在聚合酶链反应的线性进程期间产生的序列特异性DNA片段（其以各自对于阵列单元而言特征性的终止核苷酸为末端）通过与阵列装置连接的纳米结构时，可以测量电流的变化并因此确定各自DNA片段通过纳米结构的通过时间。因此可以测定所述通过的片段的各自长度。具有相同引物和A*、T*、C*或G*型终止核苷酸（四个阵列单元的每一个中各一个类型）的各四个阵列单元的所有片段长度的总和得出了由所述引物确定的相应DNA片段的整个DNA序列。
在本发明的一个特别有利的扩展实施方式中，在至少一个阵列单元中预先放置一种或多种抑制性引物以阻止在聚合酶链反应期间预定物类的复制。如果目的是检测不同于野生型的突变，则可以有利地添加这种抑制性引物（也称为“钳”），以抑制一些物类，例如未突变的野生型DNA片段的扩增。在此，有利地不必知晓不同于野生型的细节，以使得也可以解码未知的突变。如果PCR反应的反应进程被监测为qPCR，则对于野生型辨别也是有利的。
根据本发明的一个特别有利的扩展实施方式，各个阵列单元被分配给纳米结构的各个检测结构，以使得检测结构可以确定来自各自阵列单元的核苷酸链的长度。优选地，各一个检测结构与阵列单元连接。这具有优点，即可以将由检测结构检测到的PCR产物明确地分配给阵列单元。该检测结构尤其可以是纳米结构的上述纳米孔或纳米通道，或者例如是各自由两个纳米孔界定的通道。
在一个有利的实施方式中，在此可以通过电极在各个阵列单元和各个检测结构之间施加用于运送和确定核苷酸链长度的电压。
本发明的主题还是利用本发明的微流体装置对核苷酸链进行测序的方法。在该方法的第一步骤中，根据桑格测序方法利用所述装置的阵列装置进行不对称聚合酶链反应以复制核苷酸链。在第二步骤中，通过所述装置的纳米结构确定被复制的核苷酸链的长度。
根据该方法的一个有利的扩展实施方式，监测所述聚合酶链反应的进行。在此优选地，所述监测可以借助荧光标记，例如一种或多种所用引物的荧光标记以光学方式进行。如上所述，这有利地允许监测各个PCR循环。特别地，由此可以识别和监测指数PCR和线性PCR之间的转变。此外，线性PCR循环的数量也可以以简单的方式进行监测，其中预定数量的线性PCR循环优选可以用作开始通过纳米结构确定片段长度的标准。换句话说，在预定数量的线性PCR循环之后开始片段长度确定。这具有优点，即可以以简单的方式调节PCR结束时存在的PCR产物量以用于随后的长度确定。
关于本发明方法的优点，也参考本发明装置的上述相应优点及其扩展实施方式和实施方式。
附图简述
本发明的实施例在附图中示意性地示出，并且在下面的描述中进行了详细阐释。对于各附图中所示的且起类似作用的元件使用相同的附图标记，其中省去了所述元件的重复描述。
图1至图2示出了本发明装置的实施例，并且
图3示出了本发明方法的实施例的流程图。
发明实施方案
图1示意性地示出了用于对核苷酸链进行测序的微流体装置100的实施例。装置100包括阵列装置200和与阵列装置200连接的纳米结构300。
阵列装置200包括阵列单元的一个或多个组211、212。在图1中，示意性地示出了阵列单元的第一组211和第二组212，其中各个组优选地包括阵列单元221、222、223、224。但是，阵列装置此外还可包括另外组的阵列单元。在阵列单元221、222、223、224中优选预先放置用于进行定量PCR（qPCR）的物质11、12、13。特别地，阵列单元各自包括具有多数引物类型11和少数引物类型12的引物的引物对11、12。另外的物质13特别包括所选的核苷酸，例如用于PCR批次的冻干物质。
组211、212的各四个阵列单元221、222、223、224因此各自包含用于qPCR的一致相同的引物对10、11。另外，这四个阵列单元221、222、223、224各自包含相对少量，例如在低的百分比范围内的核苷酸类型，其具有终止特性，即根据桑格测序方法类型的A*、T*、C*和G*。如果在PCR循环期间将这种具有终止特性的核苷酸并入正向链或反向链中，则PCR终止，并产生具有特征性长度的相应PCR产物片段，其以各自的终止核苷酸为末端。根据桑格测序方法，因此在足够大量的PCR循环之后产生正向链和反向链的所有DNA片段长度，其以各自预设类型的终止核苷酸为末端。
只要PCR指数进行，则被复制的DNA片段的长度确定对于DNA片段的DNA序列而言是非特征性的，因为正向链和反向链的PCR产物都在与终止核苷酸匹配的所有位置处中止。因此优选地，多数引物类型11的引物的数量比少数引物类型12的引物的数量大1-2个数量级。只要存在足够大数量的两种引物类型11、12，其数量的不对称性没有影响，以使得PCR在消耗这两种引物类型的情况下指数进行，并在短时间内形成大量PCR产物。一旦少数引物12不再以足够的数量可用，PCR就转变到线性扩增阶段，即仅还有通过多数引物复制的链被越来越多地扩增，例如正向链（在下文中，在不对一般性加以限制的情况下仅考虑正向链）。终止核苷酸的并入越来越多地产生DNA片段长度，其对于正向链的序列而言是特征性的。虽然在PCR的指数阶段中形成了片段长度的非特征性“背景”，但在PCR的线性阶段期间产生特征性片段，其描述了关于序列的信息。由于PCR可以作为qPCR在其进程中被定量控制，因此也可以明确地识别进入线性阶段和进入“特征性PCR循环”的转变，从而可以以定义明确地控制整个过程。特别地，可以如上所述借助例如引物的荧光标记来有效地监测qPCR。
与阵列单元210、211、211、221、222、223、224连接的纳米结构300被设计为确定通过PCR复制的DNA片段的长度。图1示意性地示出，为此优选地，纳米结构300的各个检测结构321、322、323、324各自被分配给各个阵列单元221、222、223、224，以使得各一个检测结构321、322、323、324可以确定来自各自阵列单元221、222、223、224的核苷酸链的长度。换句话说，各个阵列单元221、222、223、224例如经由微流体通道401、402、403、404与特有的检测结构321、322、323、324连接。检测结构321、322、323、324可以特别是纳米孔或纳米通道，例如是通道303，其各自由作为入口和出口301、302的两个纳米孔界定。
优选地，检测结构321、322、323、324配备有电极几何体311、312、313，以使得可以通过电流或电压变化来识别DNA片段穿过检测结构221、222、223、224。例如，只要DNA片段通过检测结构221、222、223、224，即例如通过纳米孔或纳米通道303并在此经过电极几何体，则在此各自出现电流的中断或改变。DNA片段的长度可以在此通过测量通过各自检测结构221、222、223、224的通过时间来进行。由于各个测量的长度各自明确地鉴别相应终止核苷酸的位置，因此来自阵列单元221、222、223、224的所有测量长度的总和得出了终止核苷酸的全部所有位置，并且来自组211、212的各四个阵列单元221、222、223的信息总结了所有四种终止核苷酸类型的各自整个基因序列。因此，所有阵列单元一起得出了要分析的所有DNA片段的序列。在此，通过每个阵列单元出现的片段的最大长度（即完整DNA链的长度）和每个阵列单元出现的片段的最小长度（即在该实施例中的正向引物的长度），也能够进行长度标度的原位校准。此外，电极几何体311、312、313也可以用于运送通常带电的DNA片段。图2示出了具有平行布置的纳米通道303的纳米结构300的可能设计，该纳米通道可以经由电极311、312和电压源313处于电压下。
为了说明而简化地认为，在以每个PCR循环指数扩增2倍的N个循环后，阵列单元中的qPCR突然转变到线性进程，随后是M个线性扩增步骤（实际上，这种转变当然是“模糊的”），但原则上，这对于理解和定性评估没有根本改变）。
在N个指数和M个线性PCR循环后，特征性（“正确”）终止片段的相对比例R为：
相应地，非特征性（“错误”）终止片段的比例F为：
由此看出，通过例如10-20的相应数量的线性PCR循环可以实现良好的信背比，即“正确”的片段长度因此出现在计数统计中，其具有比“错误”片段长度高10-20倍的计数率。
图3示出了用于对核苷酸链进行测序的本发明方法600的实施例的流程图，其例如可以利用根据图1和图2的本发明装置100的实施例来进行。在方法600的第一步骤601中，根据桑格测序方法利用装置100的阵列装置200进行不对称聚合酶链反应以复制核苷酸链。在第二步骤602中，通过装置100的纳米结构300确定被复制的核苷酸链的长度。优选地，长度的确定可以如上所述在预定数量的PCR循环进行之后，特别是在预定数量的线性PCR循环进行之后开始。在此可以如上所述借助荧光标记来监测PCR，特别是PCR循环。
Claims (11)
1.用于对核苷酸链进行测序的微流体装置（100），其包括阵列装置（200）和与所述阵列装置（200）连接的纳米结构（300），其中所述阵列装置（200）包括具有用于聚合酶链反应的物质（11、12、13）的阵列单元（221、222、223、224），其中所述阵列单元（221、222、223、224）包含根据桑格测序方法具有终止特性的核苷酸（13）和用于不对称聚合酶链反应的引物（11、12），并且其中纳米结构（300）被设计为确定由聚合酶链反应形成的核苷酸链的长度。
2.根据权利要求1所述的微流体装置（100），其中在所述阵列单元中，所述引物（11、12）各自包含具有多数引物类型（11）和少数引物类型（12）的引物对（11、12），以使得不对称聚合酶链反应具有指数进程和随后的线性进程。
3.根据前述权利要求中任一项所述的微流体装置（100），其中所述纳米结构（300）具有纳米孔（301、302）和/或纳米通道（303）。
4.根据前述权利要求中任一项所述的微流体装置（100），其中阵列单元的一个或多个组（211、212）各自包括四个阵列单元（221、222、223、224），并且其中一组（211、212）的所有阵列单元（221、222、223、224）至少具有相同种类的引物。
5.根据前述权利要求中任一项所述的微流体装置（100），其中各个阵列单元（221、222、223、224）被分配给所述纳米结构（300）的各个检测结构（321、322、323、324），以使得检测结构（321、322、323、324）可以确定来自各自阵列单元（221、222、223、224）的核苷酸链的长度。
6.根据前述权利要求中任一项所述的微流体装置（100），其中可以通过电极（301、302、303）在各个阵列单元（221、222、223、224）和各个检测结构（321、322、323、324）之间施加用于运送和确定核苷酸链长度的电压。
7.根据前述权利要求中任一项所述的微流体装置（100），其中在至少一个阵列单元（221、222、223、224）中预先放置一种或多种抑制性引物（13）以阻止在聚合酶链反应期间预定物类的复制。
8.利用微流体装置（100）对核苷酸链进行测序的方法（600），其包括以下步骤：
·根据桑格测序方法利用装置（100）的阵列装置（200）进行（601）不对称聚合酶链反应以复制核苷酸链；
·通过装置（100）的纳米结构确定（602）被复制的核苷酸链的长度。
9.根据权利要求8所述的方法（600），其中所述不对称聚合酶链反应具有指数进程，特别是定量聚合酶链反应和随后的线性进程。
10.根据权利要求9所述的方法（600），其中监测所述不对称聚合酶链反应，特别是借助一种或多种所用引物的荧光标记。
11.根据权利要求10所述的方法（600），其中识别和监测指数PCR和线性PCR之间的转变，和/或监测线性PCR循环的数量并将其用作开始通过纳米结构确定片段长度的标准。
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