JP2017534277A - 核酸増幅装置およびシステム - Google Patents

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Abstract

本開示は、生物学的アッセイを行うための装置、システム、および方法に関する。特に、本開示は、素早い増幅反応を行うためのマイクロ流体装置、システム、および方法を提供する。

Description

本願は、２０１４年１０月２２日に出願された米国仮出願第６２／０６７，２５８号明細書の優先権を主張する。同出願の全体が、参照により本明細書に組み込まれる。
本開示は、生物学的アッセイを行うための装置、システム、および方法に関する。特に、本開示は、素早い増幅反応を行うためのマイクロ流体装置、システム、および方法を提供する。
核酸増幅反応は、多くの研究、医療、および工業用途に重要である。このような反応は、臨床的および生物学的研究、感染性疾患の検出およびモニタリング、変異の検出、ガンマーカーの検出、環境モニター、遺伝的同定、生体防御用途における病原体の検出等に使用される。例えば、Ｓｃｈｗｅｉｔｚｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１２：２１−２７（２００１）；Ｋｏｃｈ，Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ，３：７４９−７６１（２００４）。特に、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）は、これらの領域の全てにおける用途が見出されている。同用途は、ウイルスおよび細菌検出、ウイルス負荷モニター、希少および／または培養困難病原体の検出、バイオテロ脅威の素早い検出、ガン患者における微小残存病変の検出、食品病原体検査、血液供給スクリーニング等を含む、例えば、Ｍａｃｋａｙ，Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｎｆｅｃｔ．，１０：１９０−２１２（２００４）；Ｂｅｒｎａｒｄ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，４８：１１７８−１１８５（２００２）。ＰＣＲに関して、このような幅広い使用の重要な理由は、その速度および使用の容易さ（典型的には、標準化キットおよび比較的簡易および低コストの器具を使用して数時間以内に行われる）、その感度（多くの場合、サンプル中の数十コピーの標的配列が検出され得る）、およびその堅牢性（低品質のサンプルまたは保存後のサンプル、例えば、法医学サンプルまたは固定組織サンプルが容易に分析される）である。Ｓｔｒａｃｈａｎ ａｎｄ Ｒｅａｄ，Ｈｕｍａｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ２（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９９）。
このような幅広い用途に反映された核酸増幅技術における進歩にも関わらず、例えば、特に感染性疾患検出、微小残存病変検出、生体防御用途等の領域における、速度および感度の更なる改善の必要性が未だに存在する。
米国特許第６，２１０，８９１号明細書 米国特許第６，２５８，５６８号明細書 米国特許第６，８３３，２４６号明細書 米国特許第７，１１５，４００号明細書 米国特許第６，９６９，４８８号明細書 米国特許第５，９１２，１４８号明細書 米国特許第６，１３０，０７３号明細書 米国特許第７，１６９，５６０号明細書 米国特許第７，２８２，３３７号明細書 米国特許第７，４８２，１２０号明細書 米国特許第７，５０１，２４５号明細書 米国特許第６，８１８，３９５号明細書 米国特許第６，９１１，３４５号明細書 米国特許第７，３２９，４９２号明細書
Ｓｃｈｗｅｉｔｚｅｒ ら、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１２：２１−２７（２００１） Ｋｏｃｈ，Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ，３：７４９−７６１（２００４） Ｍａｃｋａｙ，Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｎｆｅｃｔ．，１０：１９０−２１２（２００４） Ｂｅｒｎａｒｄ ら、Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，４８：１１７８−１１８５（２００２） Ｓｔｒａｃｈａｎ ａｎｄ Ｒｅａｄ，Ｈｕｍａｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ２（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９９）
本開示は、生物学的アッセイを行うための装置、システム、および方法に関する。
特に、本開示は、本開示は、素早い生化学的（例えば、増幅）反応を行うためのマイクロ流体装置、システム、および方法を提供する。
例えば、一部の実施形態では、本開示は、生化学アッセイを行うための装置であって、ａ）バネ装填された熱電冷却器（ＴＥＣ）サブアッセンブリ、ｂ）ヒートスプレッダ、ｃ）ローカル信号ブースト電子回路、ｄ）二次熱貯蔵器、およびｅ）ＴＥＣサブアッセンブリを二次熱貯蔵器に接続する可撓性伝導材料の内の１つ以上（例えば、全て）を含む、装置を提供する。一部の実施形態では、ＴＥＣサブアッセンブリは、ペルチェ素子、サーミスタインサートを有するヒートスプレッダ、サーミスタ、熱貯蔵器、保護カラー、バネまたはボールプランジャ、マウントブラケット、または温度測定信号ブースタ回路基板の内の１つ以上を含む。一部の実施形態では、熱貯蔵器は、熱伝導材料（例えば、アルミニウム、鋼、真鍮、鉄、鉛、または銅等の金属）から構成されている。一部の実施形態では、バネは、熱貯蔵器の穴に挿入されている。一部の実施形態では、バネは、ペルチェ素子をブラケットから遠ざけるように押している。一部の実施形態では、ヒートスプレッダは、熱伝導材料（例えば、アルミニウム、鋼、真鍮、鉄、鉛、または銅等の金属）から構成されている。一部の実施形態では、ヒートスプレッダは、金または銀メッキで改質されている。一部の実施形態では、ヒートスプレッダは、切り欠きを含む。一部の実施形態では、サーミスタが、切り欠き内に配置されている。一部の実施形態では、可撓性伝導材料は、銅のワイヤまたはストラップである。
更なる実施形態は、前述の装置のいずれかと、本装置と動作可能に連通しているマイクロ流体カートリッジとを含む、システムを提供する。一部の実施形態では、本システムは、２つの本装置を含み、マイクロ流体カードは、２つの本装置間に挟まれている。一部の実施形態では、マイクロ流体カードは、生化学反応（例えば、増幅反応、シークエンシング反応、およびハイブリダイゼーション反応）を行うための１つ以上の反応チャンバを含む。一部の実施形態では、マイクロ流体カードは、生体適合性接着剤で密封されている。一部の実施形態では、システムは、ソフトウェアおよびコンピュータプロセッサ、並びにユーザインタフェース（例えば、ディスプレイスクリーン）を更に含み、ソフトウェアは、本装置を動作させるように構成されている。一部の実施形態では、ソフトウェアは、マイクロ流体カードと連通している本装置の一部の温度を、増幅反応中に動的に変化させるように構成されている。一部の実施形態では、ソフトウェアは、熱サイクル反応（例えば、ファーストＰＣＲまたはファーストＲＴ−ＰＣＲ）を行うように構成されている。
更なる実施形態は、生化学反応を行う方法であって、本明細書で記載されたシステムを、生化学反応を行うための試薬と接触させることと、本装置を使用して（例えば、熱貯蔵器から二次熱貯蔵器におよび二次熱貯蔵器から熱貯蔵器に熱を伝達させることにより）、この反応の温度を変化させることとを含む、方法を提供する。一部の実施形態では、反応は、増幅反応であり、本装置は、温度を熱サイクルする。一部の実施形態では、本装置は、所望の設定値より高いかまたは低い設定値を維持する。一部の実施形態では、本装置は、設定値を動的に変化させて、目的温度を達成する。一部の実施形態では、反応は、診断アッセイまたはスクリーニングアッセイである。例えば、一部の実施形態では、診断アッセイは、核酸変異を同定するか、または、微生物（例えば、病原微生物）を同定する。
更なる実施形態は、生化学反応を行う方法であって、ａ）本明細書で記載されたシステムを、生化学反応を行うための試薬と接触させることと、ｂ）本装置を使用して、所望の設定値より高いかまたは低い設定値を維持し、設定値を動的に変化させることにより、この反応の温度を変化させ、目的温度に到達することとを含む、方法を提供する。
他の実施形態は、本明細書で記載された装置と、前記装置と動作可能に連通しているマイクロ流体カートリッジとを含み、本明細書で記載されたコンポーネントの内の１つ以上を欠いているシステムに対して、素早い増幅反応の速度若しくは収量を向上させ、または、バックグラウンド信号を減少させるように構成されている、システムを提供する。
更に他の実施形態は、本明細書で記載された装置と、前記装置と動作可能に連通しているマイクロ流体カートリッジと、本装置を使用して、所望の設定値より高いかまたは低い設定値を維持し、設定値を動的に変化させることにより、この反応の温度を変化させ、目的温度に到達するように構成されているコンピュータソフトウェアおよびコンピュータプロセッサとを含む、システムを提供する。
更なる実施形態が、本明細書で記載される。
本開示の例示的な装置に使用されるバネ装填されたＴＥＣサブアッセンブリの模式図を示す。 本開示の例示的な装置に使用される、マイクロ流体カード（ＰＣＲ消耗品）およびＴＥＣサブアッセンブリに対するインタフェースの模式図を示す。 本開示の例示的な装置に使用される、ヒートスプレッダ、ＴＥＣ、および挿入されたサーミスタの分離模式図を示す。 （左側）本開示の例示的な装置に使用される、ＰＣＢ基板およびＴＥＣへの接続、並びにサーミスタの模式図を示す。（中央）保護カラーが示される。（右側）保護カラーが、透明に示される。 ＴＥＣの基本的な熱伝達原理およびＰＣＲリアクター制御の概要を示す。 （左側）２０回のサイクル後に、熱貯蔵器中の多過ぎる熱の蓄積のために失敗した、ＰＣＲサイクルの温度プロファイルｖｓ時間の例を示す。（中央）開位置において実験に使用された試験アッセンブリを示す。（右側）閉じられた試験アッセンブリの写真を示す。 （左側）本開示の例示的な装置に使用される熱橋概念の簡略図を示す。（右側）ＰＣＲの間における銅編組線を有するＴＥＣアッセンブリの熱画像を示す。 （左側）銅編組線を有さないＴＥＣアッセンブリおよび伸長した熱貯蔵器に取り付けられた銅編組線を有するＴＥＣアッセンブリの写真を示す。（中央）ＰＣＲサイクル前の写真における同じ２つのシステムの熱画像を示す。（右側）３５サイクルのファーストＰＣＲが行われた後の同じ２つのＴＥＣアッセンブリを示す。 （左側）温度ｖｓ時間のプロットを示す。（右側）ファーストＰＣＲ反応を動作させるための高過ぎおよび低過ぎる設定温度を使用するサンプルＰＣＲプログラムスクリプトを示す。 （左側）種々のアニーリング温度を生じさせるが、一定の伸長および変性温度を有する、ファーストＰＣＲについての４つの例となるスクリプトを示す。（中央）左側に記載されたＰＣＲプロトコルについての、温度ｖｓ時間の重ね合せプロットを示す。（右側）左側における試験スクリプトに基づいて標準化されたアニーリング時間を有するプロトコルからのシングルプレックスＰＣＲ生成物の電気泳動図を示す。 うまく高度に多重化されたＰＣＲ反応からの電気泳動図を示す。 （左側）標準的なＢＡＤアッセイＰＣＲプロトコルおよび商業的なシステムにおいて開発され、新たに改良されたＰＣＲプロトコルからのアンプリコンと比較して、１０００、１００、および１０コピーのテンプレートについて、本開示の実施形態におけるファーストＰＣＲ反応システムにより生成され、質量分光計に噴霧されたアンプリコンの振幅を示す。（右側）本発明を使用するファーストＰＣＲ（左側のスペクトル）から、および、標準的なＰＣＲから（右側のスペクトル）生成されたアンプリコンの質量スペクトルを示す。 本開示の実施形態における例示的な装置の線図を示す。二次熱貯蔵器（１３）、一次熱貯蔵器（６）、一次熱貯蔵器を二次熱貯蔵器に接続しているストラップ（１２）、ブラケット（９）、および電子基板（１０）が示される。
本開示は、素早い増幅反応を行うための装置、システム、および方法に関する。一部の実施形態では、本装置およびシステムは、マイクロ流体システムおよび／または小型携行機器プラットフォームを含む。
一部の実施形態では、本開示は、（１）バネ装填された熱電冷却器（ＴＥＣ）サブアッセンブリ、（２）一体化された温度センサを有するヒートスプレッダ、（３）ローカル信号ブースト電子回路、（４）二次熱貯蔵器内に熱の方向を変える可撓性伝導材料、および（５）内部温度変化をより速くする低過ぎおよび高過ぎる動的なＴＥＣ設定値の内の１つ以上または全てを含む、装置およびシステムを提供する。本開示の実施形態は、高頻度での分子生物学的システム、例えば、増幅（例えば、ＰＣＲ）システムの超高速ランピングを提供する。これにより、コンパクトな機器設計が可能となり、プラスチックコンポーネントによる金属の置き換えにより、より軽量な携行式の機器が可能となり、機器と消耗品との間の優れた接触が確保される。
Ｉ．装置およびシステム
本開示の実施形態は、素早い熱サイクルまたは温度制御された生化学アッセイを行うための装置およびシステムを提供する。例示的な装置およびシステムは、本明細書に記載される。
例示的なＴＥＣサブアッセンブリ１の概略が、図１および図１３に示される。この図は、素早い増幅を行うための要素を示す。これらのコンポーネントは、例えば、ＴＥＣ自体（例えば、ペルチェ素子）２、サーミスタインサート４を有するヒートスプレッダ３、サーミスタ（またはＲＴＤ）５、熱貯蔵器６、保護カラー７、バネ８、マウントブラケット９、および温度測定信号ブースタ回路基板１０を含む。熱貯蔵器または熱貯蔵器６は、任意の熱伝導材料で形成され得る。同熱伝導材料は、アルミニウム、鋼、真鍮、鉄、または鉛等の金属を含むが、これらに限定されない。一部の実施形態では、その高い熱質量のために、銅が利用される。
一部の実施形態では、バネ８は、熱貯蔵器６における削孔１４内に嵌合し、図２に図示された反応カードとの良好な接触を形成するために、ＴＥＣ／ヒートスプレッダ／熱貯蔵器コンポーネントを、（例えば、器具内に搭載するために）ブラケット９から遠ざかるように押す。バネ装填された態様の装置は、アッセンブリ全体が消耗品表面に対して垂直な、幾らかの範囲の動き（例えば、典型的には、さもなければ上下として知られるＺ方向におけるもの、ただし、アッセンブリは、側方に回転される場合があり、Ｘ若しくはＹ面、「東西」または「南北」方向に可撓性をもって動作する場合もある）を有するのを可能にする。一部の実施形態では、この動きの範囲は、０．１から１００ｍｍであるが、他の範囲が想到される。一部の実施形態では、小さなレベルの範囲の動き（例えば、１から１０ｍｍ）により、消耗品反応カードおよび機器の間で、特別なコンプライアンスが可能となる一方で、高度の耐久性を維持している。すなわち、ヒートスプレッダの表面は、種々の製造およびアッセンブリ実践により作製された部品における典型的な厚みサイズ差を所与とするカード消耗品との良好な接触を構成する。この良好な物理的接触により、動作条件の範囲にわたって、良好な熱接触および改善された熱伝達特性がもたらされる。バネの使用は、移動の度合いを、１つの軸方向に主に制限する。ただし、幾らかのピッチ、回転、およびヨー成分が存在し得る。同成分は、カード表面およびヒートスプレッダ表面が最初に平行でない場合、カードを有するシステムコンポーネントと面一で押すのに役立つ。
一部の実施形態では、圧縮バネは、ボールプランジャにより置き換えられる。ボールプランジャは、バネとは対照的によりいっそう動きを一方向に更に制限し、アッセンブリマウントの利点を有する。一部の実施形態では、熱貯蔵器における削孔がタップされて（例えば、ねじ山加工されて）、ボールプランジャ中に単純なネジを可能にする。このボールプランジャも、幾らかの熱質量を熱貯蔵器に加え、バネ系と比較した場合、熱貯蔵器からブラケットへの熱伝達を増大させる。
ＴＥＣが、例となる反応カード１１（例えば、マイクロ流体カード）を押す方法の概要は、図２に示される。マイクロ流体カード１１は、生化学的または分子生物学的アッセイ（例えば、増幅反応、例えば、ファーストＰＣＲ、逆転写酵素、ＲＴ−ＰＣＲ、ｑＰＣＲ、等温増幅等、シークエンシングアッセイ、およびハイブリダイゼーションアッセイ）を行うのに使用されるチャンバを含む。一部の実施形態では、チャンバは、（例えば、生化学的に適合した接着剤により）密封される。次いで、カードは、器具内に挿入される。次いで、カード１１は、２つのバネ装填されたＴＥＣサブアッセンブリ１間に挟まれる。この場合、底側アッセンブリは、カードを上向きに押し、上側アッセンブリは、カードを下向きに押す。器具およびカードは、器具内でのカードに対する良好な嵌合を適切に提供するように、ＴＥＣアッセンブリ１の両方のバネ８に圧縮が利用されるような方式で設計されている。これにより、コンプライアンスおよび良好な熱伝達が確保される。加えて、接着剤／接着ライナーは、幾らかの適合性を有する。
本開示は、バネにより例示されるが、指向性の機械的力を加える任意のコンポーネント（例えば、機械的エネルギーを蓄える任意の弾性物体）が利用され得る。例としては、張力／伸長バネ、圧縮バネ、張力バネ、一定張力バネ、可変張力バネ、コイルバネ、板バネ、加工バネ、ガスバネ、波形バネ、カンチレバーバネ、バランスバネ、リーフバネ、およびまたはｖ−バネを含むが、これらに限定されない。
ヒートスプレッダ３は、図３に示される。一部の実施形態では、ヒートスプレッダ３は、対象となる集中された領域またはより広い領域に熱を加えるために、ＴＥＣ１自体より大きいかまたは小さい。一部の実施形態では、ヒートスプレッダ３は、高伝導材料（例えば、アルミニウムまたは銅）で形成されており、任意選択により、良好な熱特性を維持しながら、腐食および酸化を防止するのに役立つように、表面改質されている（例えば、金または銀でメッキされている）。
一部の実施形態では、ヒートスプレッダは、ウォータージェット若しくは他のマシニング法または金属射出成型により形成された切り欠き１４を含む。切り欠きにより、サーミスタ５が、ヒートスプレッダ３の内側に配置され、結合されるのが可能となる。これにより、サーミスタ５は、ヒートスプレッダの温度測定をする。ヒートスプレッダ３は、動作中の全体を通して、均一な温度を提供する寸法を有する。サーミスタ５が測定する温度は、ヒートスプレッダ３の全体を通して一定であり、サーミスタ５の配置における微小な差は重要ではない。ヒートスプレッダ３／サーミスタ５の組み合わせにより、スプレッダ上／スプレッダ内の温度の直接的な測定が可能となり、次いで、ＴＥＣ駆動基板へのフィードバック制御を与えるのに使用される。ＴＥＣ１自体は、温度を測定せず／報告しない。次いで、標準的な制御アルゴリズム（例えば、ＰＩ、ＰＩＤ、カスケード）が、ヒートスプレッダ内の温度を制御するのに使用されるため、反応チャンバ内の温度を間接的に制御する。
サーミスタ／ＲＴＤは、典型的には、無線／電子ノイズ干渉を受け得る、非常に小さな信号を生成する。一部の実施形態では、基板は、配線を電子基板１０上での信号処理から短い距離（例えば、５ｃｍ以下、４ｃｍ以下、３ｃｍ以下、２ｃｍ以下、または１ｃｍ以下）に配置することにより、干渉のおそれを制限する。この基板の主な機能は、サーミスタ５またはＲＴＤ回路から生成された小さな信号を取得し、信号を増幅し／増強することである。これにより、もはや外部環境からまたは器具自体の他の電子部品からの干渉を受けない。信頼できる素早い熱サイクルを可能にするこの基板の第２の態様は、有害なインタフェース／物理的な相互作用の問題が顕著に減少され、およびまたは、除去されることである。例えば、一部の実施形態では、ＴＥＣ１およびサーミスタ５は両方とも、非常に細く繊細なワイヤを有する商用既成コンポーネントである。例として、ヒートスプレッダ３は、図４に示されるように、６ｍｍ平方である。それらの繊細なワイヤは、基板に直接はんだ付けされ、基板は、熱貯蔵器に取り付けられる。同熱貯蔵器は、金属の堅い部品である。この技術は、組立工員に、何か比較的大きな掴むものを与え、組立て中での繊細なワイヤにおける応力／歪みを防止し、製造プロセスをより容易にする。この技術は、ランダムなスナッグも防止し、通常の動作中の故障のおそれを減少させる。一部の実施形態では、サブアッセンブリは、ヒートスプレッダ３およびＴＥＣ１上を摺動する保護カラー７も含有する。一部の実施形態では、カラーは、例えば、繊細なワイヤを収容するため、更なる応力および歪みが防止される機構（例えば、一体型チャネル）を含有する。なお、保護カラー７は、ある程度の耐水性／耐飛水性も提供し、電気的短絡を防止するのに役立つ。
カラー７は、任意の適切な材料、プラスチック（例えば、デルリン、ポリプロピレン、アクリル、またはスチレン）および／または、より柔らかい材料、例えば、ゴム若しくはポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）で構成されているが、これらに限定されない。一部の実施形態では、回路基板１０は、標準的なコネクタに簡易的／標準的なリボンケーブルを接続する内蔵ヘッダー（１０ピンヘッダーとして示されるが、１０より多くもまたは少なくもできる）を収容している。基板から測定された出力温度信号は、今や大きいため、この標準的なケーブルの長さは、より有用な機器レイアウトのために長いかまたは短くあることができる。回路基板はまた、制御操作を行い、ＴＥＣ用の駆動電圧および電流を提供する、「メイン基板」に対する簡易的なインタフェースが可能である。
ＰＣＲ反応の温度は、ヒートスプレッダ５における温度測定により間接的に制御される。ヒートスプレッダ５の温度は、ＴＥＣ１により駆動される。ＴＥＣは、熱を熱貯蔵器（例えば、銅ブロック）からＰＣＲ反応に／ＰＣＲ反応から熱貯蔵器に伝達させることにより、ヒートポンプとして機能する。反応カード１１は、熱貯蔵器６から反応カード１１内に熱をくみ出すことにより、より熱くなり、反応カード１１は、反応カード１１から熱貯蔵器６内に熱をくみ出すことにより、より冷たくなる。しかしながら、ＴＥＣは、効率が１００％ではなく、ＴＥＣが、加熱、冷却、または、定常状態の温度制御を行うたびに、排熱（例えば、Ｐ＝ｉ２Ｒ）が生成される。同排熱は、熱貯蔵器に蓄積される。ＴＥＣは、熱貯蔵器から＋／−約３０℃内で、ＰＣＲ反応を維持し／動的に制御し得る。したがって、熱貯蔵器は、好ましくは、加熱および冷却の両方について、極端に速いランプ速度（例えば、２０℃／秒超）を可能にするために、中間の熱状態で維持される。これにより、生化学反応（例えば、ＰＣＲに見出される変性、アニーリング、および伸長工程）に利用される温度変化が達成される。
一部の実施形態では、熱貯蔵器の過熱を防止するために（例えば、図６を参照のこと）、受動的または能動的な温度制御コンポーネントが、装置に含まれる。能動的な冷却は、例えば、ファンの使用により達成されるか、または、別のＴＥＣシステムが、温度を維持するのに利用される。一部の実施形態では、受動的なアプローチが利用され、同アプローチでは、熱貯蔵器６のサイズが大きくなるか、または、材料が、熱貯蔵器の熱質量を大きくするように変更される。
一部の実施形態では、熱貯蔵器は、２つ（またはそれ以上）の連結されたコンポーネントに分割される。この概念は、電気化学分野における「塩橋」に類似する。より小型の能動的な熱貯蔵器６は、ＴＥＣに接続され、排熱ダンプとして機能する別のより大型の二次熱貯蔵器１３が利用される。一部の実施形態では、１つ以上の可撓性金属（例えば、銅）のヒートストラップ１２（あるいは、銅ワイヤ若しくはグラフェンの厚いゲージまたは別の可撓性熱伝導体）が、熱エネルギーを、１つの熱貯蔵器から別のより大型の熱貯蔵器に伝達させるのに使用される。銅ストラップは、優れた熱伝導体であり、望ましくない排熱を、ＴＥＣに接続されているこの第１の熱貯蔵器から除去する。一部の実施形態では、より大型の排熱貯蔵器は、排熱のために特別に設計された銅（または他の材料）の別のブロックである。一部の実施形態では、二次熱貯蔵器は、システム中の別のより大型の熱質量（器具のケース若しくはフレームまたは金属ポンプ）に予め連結している。熱橋として銅ストラップを使用する概要は、図７に示される。
銅ストラップ１２および熱貯蔵器６を２つの連結されたセクション６および１３に分割することは、２つの主な利益を有する。第一は、環境の設計が柔軟であることである。例えば、一部の実施形態では、可撓性の銅ストラップは、容易にボックス内部の他の箇所に向けられ、大型の熱貯蔵器は、ケースを有する器具内の任意の位置に配置される。加えて、主な熱貯蔵器は、熱伝達の法則により受動的に調節される。
一部の実施形態では、本明細書で記載されたシステムは、ＴＥＣに連結された小型の一次熱貯蔵器６を使用する。一次熱貯蔵器６は、素早いＴＥＣ応答を提供し、これにより、素早い生化学（例えば、増幅）反応を提供する。加えて、二次熱貯蔵器１３は、過剰熱スカベンジャーとして機能し、第１の熱貯蔵器を最適な温度近くに維持する。より小型の一次熱貯蔵器６がより熱くなると、ストラップ１２からのエネルギー伝達も増大する（Ｑ＝ＵＡΔＴ）。この受動的な調節スキームは、能動的に動作する部分を必要とせず、更なる電力を必要とせず、携行式機器に非常に望ましい。銅ストラップ１２の可撓性により、上昇および降下によるバネ装填概念により動作するという利点が更に提供される。本開示の開発中に行われた実験中に、可撓性の銅ストラップ１２の付加により、１２０回の連続した完全なファーストＰＣＲサイクルが、失敗せず、サイクル間で停止することなく実行された。ＴＥＣサブアッセンブリの熱画像化写真は、（温度勾配による）銅ストラップからの熱流を示すことが、図７に示される。
ＰＣＲ前およびＰＣＲ中の、銅ヒートストラップを有するＴＥＣサブアッセンブリおよび銅ヒートストラップを有さないＴＥＣサブアッセンブリにおける写真および熱画像が、図８に示される。生化学反応の前に、２つのアッセンブリは、同じ熱エネルギーを有するが、生化学反応が生じると、銅ストラップを有さないＴＥＣサブアッセンブリは、銅編組線を有するＴＥＣサブアッセンブリと比較して、著しく熱い。例えば、図８に示されたシステムでは、プラスチック保護カラー（矢印で示される）は、銅編組線を有するシステムにおいて８０から８５℃であったのと比較して、銅編組線を有さないシステムおいて約１２０から１４０℃であった。銅ストラップを有さないシステムにおける熱貯蔵器も、銅編組線を有するシステムより非常に熱い。このことは、銅編組線が熱貯蔵器を調節し、ファーストＰＣＲに適切な熱管理を達成したことを示している。
一部の実施形態では、装置は、内部温度をより速く動かすために、動的な低過ぎるおよび高過ぎるＴＥＣ設定値を含む。熱伝達の法則により、物体は、冷却および加熱中に漸近的に設定値に近づくであろうことが規定される。目的設定値の５％以内に近づくのには、１分かかる場合があるが、目的設定値の１％以内を達成するのには、システムにより決まる相対時間の更に３０分かかる場合がある。この関係を打破するために、真に所望の設定値より高い設定値を使用し、次いで、加熱された物体がその温度を行き過ぎず、代わりに、目的温度に到達するように動的に変化させるのが解決策である。この種の調節アプローチは、ＰＩＤ制御、より具体的には、カスケード制御スキームにおいて見出された原理に基づいている。例えば、ＭＪサーマルサイクラーにおいて９５から６０℃に冷却する場合、ＰＣＲ反応において温度を制御するのに使用される「ホットブロック」は、実際には、９５℃から６０℃に変化し、内部反応温度は遅れる。本開示の一部の実施形態では、この問題は、ファーストＰＣＲにおいて数秒間（例えば、２から１０秒、３から５秒、または３．２秒若しくは４．６秒）または数秒間（例えば、１０から２０秒）、より低い温度（例えば、４５℃）をプログラムし、次いで、内部ＰＣＲ反応温度が６０℃に達した時点で、アニーリング工程について６０℃に戻すことにより克服される。ファーストＰＣＲを達成するためのこのアプローチの例となる温度ｖｓ時間プロットは、ＰＣＲプログラムを実行するのに使用されるスクリプトと共に、図９において以下に示される。
設定値の動的な切替えは、比較的正確なタイミングで行われるべきである。スクリプトまたはプログラムが、９５℃で変性させ、５５℃でアニーリングさせるように記述された場合には、そのサブルーチンが完了する。図１０に、温度および時間（秒で列記）を有する、４つの例となるスクリプトを示す。これらのスクリプトは、同じ伸長および変性温度を有する、種々のアニーリング温度を与えるように設計された試験プログラムである。温度ｖｓ時間の結果が、中心部にプロットされる。スクリプトは、６０、５５、５２．５、および５０℃それぞれの内部「浸漬温度」を生じさせ、保持するのに成功した。シングルプレックスＰＣＲ実験が、このシステムを使用し、示されたプロトコル（種々のアニーリング温度を有する）により行われ、所望の８６塩基対生成物および望まない５４塩基対を生成した。この実験において、最も低いアニーリング温度である５０℃および５２．５℃のプロトコルにより、最も多量の総生成物および最少量の副生成物が得られた。
本明細書で記載されたシステムは、複数種類のアッセイのための多数のプライマーペアにおいて確認された。本システムでは、ポジティブな結果を伴う、最大２４プレックスのＰＣＲアッセイが確認された。
１５プレックス超のＰＣＲ増幅についての電気泳動図が、以下の図１１に示される。十分な生成物が、成功したアッセイについて生成された。この場合において、種々のトレースは、種々の濃度の再水和凍結乾燥マスターミックスを表わす。
非常にポジティブな結果を伴う各種のプレイマーペアについての実験が行われた。図１２に示された「基準（ｇｏｌｄ ｓｔａｎｄａｒｄ）」の市販のサーマルサイクラーと比較して、本開示の実施形態における装置は、より多くのＰＣＲ産物を生成した。総ＰＣＲ時間は、市販のプラットフォームにおける約２時間２０分と比較して、１５から２０分であった。本開示のファーストＰＣＲシステムおよび市販のシステムより行われた両分析は、１５マイクログラムのヒトＤＮＡバックグラウンドの存在化において完了された。このレベルは、高度の感染（例えば、敗血症）を経験している患者のサンプルの代表例である。これにより、ファーストＰＣＲの堅牢性および特異性が示される。また、図１２にも、プライマーがＣ．アルビカンスからのＤＮＡを増幅するのに設計された、別々の実験についての質量スペクトルデータを示す。本開示の実施形態におけるファーストＰＣＲシステムにより、非常に高い信号対ノイズ比が得られた。
本開示の実施形態における装置、システム、および方法は、素早い生化学アッセイを行うための、小型で、低コストの解決策を提供する。このような装置、システム、および方法は、各種の用途における使用を見出す。例としては、薬剤用途における研究および診断用途、クリニック、ファーストレスポンダ、および軍隊における使用を含むが、これらに限定されない。
一部の実施形態では、ソフトウェアまたはコンピュータプログラムが、（例えば、本明細書で記載された装置を含むシステムの一部として、または、独立した製品として）提供される。一部の実施形態では、ソフトウェアは、本明細書で記載された装置を動作させ、および／または、本明細書で記載された装置を使用して生成されたデータを分析する。例えば、一部の実施形態では、ソフトウェアは、ファーストＰＣＲ反応を行い、結果を表示し、データを分析するためのアルゴリズムを含む。例えば、一部の実施形態では、ソフトウェアは、加熱および冷却工程を制御し、本明細書で記載された装置を使用して設定値を管理するように構成されている。例えば、一部の実施形態では、ソフトウェアは、本装置を使用して、所望の設定値より高いかまたは低い設定値を維持し、設定値を動的に変化させて、目的温度に到達することにより、反応温度を変化させるように構成されている。
一部の実施形態では、ＰＣＲアルゴリズムおよび／または結果は、ユーザインタフェース（例えば、ディスプレイスクリーン）に表示される。一部の実施形態では、ソフトウェアは、コンピュータ、タブレット、またはスマートホン上で実行される。
ＩＩ．方法
本明細書で記載された装置およびシステムは、各種の研究、スクリーニング、および診断法における使用を見出す。例としては、サンプル調製、変異または多型の同定、並びに、微生物（例えば、病原性微生物）の同定および特徴決定を含むが、これらに限定されない。
一部の実施形態では、本明細書で記載された装置およびシステムは、増幅反応における使用を見出す。核酸増幅技術の例示的で非限定的な例は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）、転写媒介増幅（ＴＭＡ）、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、鎖置換増幅（ＳＤＡ）、ｑＰＣＲ、等温ＰＣＲ、および核酸配列ベース増幅（ＮＡＳＢＡ）を含むが、これらに限定されない。当業者であれば、特定の増幅技術（例えば、ＰＣＲ）は、増幅前に、ＲＮＡがＤＮＡに逆転写されることを必要とし（例えば、ＲＴ−ＰＣＲ）、一方、他の増幅技術は、ＲＮＡを直接増幅する（例えば、ＴＭＡおよびＮＡＳＢＡ）ことを認識するであろう。
一部の実施形態では、本明細書で記載された装置およびシステムは、シークエンシング法での使用を見出す。例としては、例えば、連鎖ターミネーター（Ｓａｎｇｅｒ）シークエンシング、色素ターミネーターシークエンシング、およびハイスループットシークエンシング法を含む。これらのシークエンシング法の多くは、当技術分野において周知である。例えば、Ｓａｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７４：５４６３−５４６７（１９９７）；Ｍａｘａｍ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７４：５６０−５６４（１９７７）；Ｄｒｍａｎａｃ，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１６：５４−５８（１９９８）；Ｋａｔｏ，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．２：１９３−２０２（２００９）；Ｒｏｎａｇｈｉ ｅｔ ａｌ．，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２４２：８４−８９（１９９６）；Ｍａｒｇｕｌｉｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ４３７：３７６−３８０（２００５）；Ｒｕｐａｒｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １０２：５９３２−５９３７（２００５）、およびＨａｒｒｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ３２０：１０６−１０９（２００８）；Ｌｅｖｅｎｅ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２９９：６８２−６８６（２００３）；Ｋｏｒｌａｃｈ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １０５：１１７６−１１８１（２００８）；Ｂｒａｎｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２６（１０）：１１４６−５３（２００８）；Ｅｉｄ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ３２３：１３３−１３８（２００９）を参照のこと。これらの文献はそれぞれ、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
次世代シークエンシング（ＮＧＳ）法は、従来のシークエンシング法と比較して、より低コストを目的として、大規模に平行して、ハイスループット戦略の共通する機構を共有している（例えば、Ｖｏｅｌｋｅｒｄｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃｈｅｍ．，５５：６４１−６５８，２００９；ＭａｃＬｅａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，７：２８７−２９６を参照のこと。これらの文献は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。ＮＧＳ法は、テンプレート増幅を典型的に使用するものと、使用しないものとに広く分類され得る。増幅を必要とする方法は、Ｒｏｃｈｅにより４５４技術プラットフォーム（例えば、ＧＳ２０およびＧＳ ＦＬＸ）として商業化されているパイロシークエンシング、Ｉｌｌｕｍｉｎａにより商業化されているＳｏｌｅｘａプラットフォーム、およびＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓにより商業化されているＳｕｐｐｏｒｔｅｄ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｌｉｇａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ（ＳＯＬｉＤ）プラットフォームを含む。一分子シークエンシングとしても既知の非増幅アプローチは、Ｈｅｌｉｃｏｓ ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅｓにより商業化されているＨｅｌｉＳｃｏｐｅプラットフォーム、ＶｉｓｉＧｅｎにより商業化されているエマージングプラットフォーム、Ｏｘｆｏｒｄ Ｎａｎｏｐｏｒｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｌｔｄ．，Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ／Ｉｏｎ Ｔｏｒｒｅｎｔ、およびＰａｃｉｆｉｃ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓそれぞれにより例証される。
パイロシークエンシング（Ｖｏｅｌｋｅｒｄｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃｈｅｍ．，５５：６４１−６５８，２００９；ＭａｃＬｅａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，７：２８７−２９６；米国特許第６，２１０，８９１号明細書；同第６，２５８，５６８号明細書、これらの文献はそれぞれ、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）において、テンプレートＤＮＡは、フラグメント化され、末端修復され、アダプタにライゲートされ、１つのテンプレート分子をアダプタに相補的なオリゴヌクレオチドを有するビーズで捕捉することにより、イン・サイチュにおいてクローン増幅される。１つのテンプレート型を有する各ビーズは、油中水微小胞内に区画分けされる。テンプレートは、エマルジョンＰＣＲと呼ばれる技術を使用してクローン増幅される。エマルジョンは、増幅後に壊され、ビーズは、シークエンシング反応中にフローセルとして機能するピコタイタープレートの個々のウェル内で堆積される。各４つのｄＮＴＰ試薬の規則正しい反復導入は、フローセル中において、シークエンシング酵素および発光レポーター、例えば、ルシフェラーゼの存在下において行う。適切なｄＮＴＰがシークエンシングプライマーの３’端に付加されるイベントにおいて、結果として得られたＡＴＰにより、ウェル内での発光のバーストが生じる。このバーストが、ＣＣＤカメラを使用して記録される。４００塩基以上のリード長を達成することができ、１０６個の配列リードが達成され得る。これにより、最大５億塩基対（Ｍｂ）の配列が得られる。
Ｓｏｌｅｘａ／Ｉｌｌｕｍｉｎａプラットフォーム（Ｖｏｅｌｋｅｒｄｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃｈｅｍ．，５５：６４１−６５８，２００９；ＭａｃＬｅａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，７：２８７−２９６；米国特許第６，８３３，２４６号明細書；同第７，１１５，４００号明細書；同第６，９６９，４８８号明細書、これらの文献はそれぞれ、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）において、シークエンシングデータは、より短い長さのリードの形態で生成される。この方法において、一本鎖フラグメント化ＤＮＡが５’−リン酸化平滑末端を生成するのに末端修復され、続けて、フラグメントの３’端への１つのＡ塩基のＫｌｅｎｏｗ媒介付加がされる。Ａ−付加により、Ｔ−オーバーハングアダプタオリゴヌクレオチドの付加が容易になる。Ｔ−オーバーハングアダプタオリゴヌクレオチドは、その後に、オリゴヌクレオチドアンカーで散りばめられた、フローセル表面上のテンプレート−アダプタ分子を捕捉するのに使用される。アンカーは、ＰＣＲプライマーとして使用されるが、テンプレートの長さおよび他の近くのアンカーオリゴヌクレオチドに対する近さのために、ＰＣＲによる伸長により、隣接するアンカーオリゴヌクレオチドとハイブリダイズして、フローセル表面上にブリッジ構造を形成する、分子の「アーチ形成」がもたらされる。ＤＮＡのこれらのループは、変性され、開裂される。次いで、フォワード鎖が、可逆性色素ターミネーターによりシークエンシングされる。インコーポレートされたヌクレオチドの配列は、インコーポレーション後蛍光の検出により決定される。ここで、各蛍光体およびブロックは、ｄＮＴＰ添加の次のサイクル前に除去される。配列リード長は、３６ヌクレオチドから２５０ヌクレオチド超の範囲であり、出力全体は、分析ラン当たりに、１０億ヌクレオチド対を超える。
ＳＯＬｉＤ技術を使用する核酸分子のシークエンシング（Ｖｏｅｌｋｅｒｄｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃｈｅｍ．，５５：６４１−６５８，２００９；ＭａｃＬｅａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，７：２８７−２９６；米国特許第５，９１２，１４８号明細書；同第６，１３０，０７３号明細書、これらの文献はそれぞれ、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）も、テンプレートのフラグメント化、オリゴヌクレオチドアダプタへのライゲーション、ビーズへの付着、およびエマルジョンＰＣＲによるクローン増幅を含む。これに続けて、テンプレートを有するビーズが、ガラスフローセルの誘導体化表面に固定される。アダプタオリゴヌクレオチドに相補的なプライマーがアニーリングされる。ただし、このプライマーは、３’伸長用に利用するのではなく、代わりに、２つのプローブ特異的塩基、続けて、６つの変性塩基、および４つの蛍光標識の内の１つを含有する照会（ｉｎｔｅｒｒｏｇａｔｉｏｎ）プローブへのライゲーションのための５’リン酸基を提供するのに使用される。ＳＯＬｉＤシステムにおいて、照会プローブは、各プローブの３’端における２つの塩基の１６通りの可能性のある組み合わせと、５’端における４つの蛍光体の内の１つを有する。蛍光色、およびこれによる各プローブの同定は、特定の色−空間コードスキームに対応する。プローブアニーリング、ライゲーション、および蛍光検出の複数回のラウンド（通常、７回）に続けて、変性、および次いで、最初のプライマーに対して塩基１つ分オフセットされたプライマーを使用する２回目のラウンドのシークエンシングが、おこなわれる。この方法において、テンプレート配列は、コンピュータ上で再構築されることができ、テンプレート塩基は、２回照会され、正確度の向上がもたらされる。配列リード長は、平均３５ヌクレオチドであり、出力全体は、シークエンシングラン当たりに、４０億塩基を超える。
特定の実施形態では、ナノポアシークエンシング（例えば、Ａｓｔｉｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２００６ Ｆｅｂ ８；１２８（５）：１７０５−１０を参照のこと。同文献は、参照により本明細書に組み込まれる）が利用される。ナノポアシークエンシングの基礎をなす理論は、ナノポアが導電性流体に浸漬され、電位（電圧）がその間に印加された際に生じるものにより行われるものである。これらの条件下において、ナノポアを通るイオンの伝動によるわずかな電流が観察され得る。電流量は、ナノポアのサイズに過度に敏感である。核酸の各塩基がナノポアを通過した場合、この通過により、４つの塩基それぞれを区別する、ナノポアを通過する電流の大きさに変化が生じる。これにより、ＤＮＡ分子の配列を決定するのが可能となる。
特定の実施形態では、Ｈｅｌｉｃｏｓ ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅｓによるＨｅｌｉＳｃｏｐｅ（Ｖｏｅｌｋｅｒｄｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃｈｅｍ．，５５：６４１−６５８，２００９；ＭａｃＬｅａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，７：２８７−２９６；米国特許第７，１６９，５６０号明細書；同第７，２８２，３３７号明細書；同第７，４８２，１２０号明細書；同第７，５０１，２４５号明細書；同第６，８１８，３９５号明細書；同第６，９１１，３４５号明細書；同第７，５０１，２４５号明細書、これらの文献はそれぞれ、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）が利用される。テンプレートＤＮＡはフラグメント化され、蛍光標識を有する最後のアデノシンにより、３’端においてポリアデニル化される。変性されたポリアデニル化テンプレートフラグメントは、フローセルの表面上において、ポリ（ｄＴ）オリゴヌクレオチドにライゲートされる。捕捉されたテンプレート分子の最初の物理的局在は、ＣＣＤカメラにより記録され、次いで、標識が開裂され、洗浄される。シークエンシングは、ポリメラーゼの添加および蛍光標識ｄＮＴＰ試薬の連続的な添加により達成される。インコーポレーションイベントにより、ｄＮＴＰに対応する蛍光信号がもたらされる。信号は、ｄＮＴＰ添加の各ラウンドの前に、ＣＣＤカメラにより捕捉される。配列リード長は、２５から５０ヌクレオチドの範囲である。ここで、出力全体は、分析ラン当たりに、１０億ヌクレオチドペアを超える。
Ｉｏｎ Ｔｏｒｒｅｎｔ技術は、ＤＮＡの重合中に放出される水素イオンの検出に基づくＤＮＡシークエンシング法である（例えば、Ｓｃｉｅｎｃｅ ３２７（５９７０）：１１９０（２０１０）；米国特許出願公開第２００９００２６０８２号明細書、同第２００９０１２７５８９号明細書、同第２０１００３０１３９８号明細書、同第２０１００１９７５０７号明細書、同第２０１００１８８０７３号明細書、および同第２０１００１３７１４３号明細書を参照のこと。これらの文献は、全ての目的についてその全体が参照により組み込まれる）。マイクロウェルは、シークエンシングされるテンプレートＤＮＡ鎖を含有する。マイクロウェル層の下には、高感度ＩＳＦＥＴイオンセンサがある。全ての層が、ＣＭＯＳ半導体チップ内に含有される。同チップは、電子産業に使用されるのと同様である。ｄＮＴＰが伸長中の相補鎖内にインコーポレートされる際、水素イオンが放出される。同放出により、高感度イオンセンサがトリガーされる。ホモポリマーの繰返しがテンプレート配列に存在する場合、複数のｄＮＴＰ分子が、１回のサイクルにインコーポレートされるであろう。これにより、対応する数の放出された水素と、比例的により大きい電子信号がもたらされる。この技術は、修飾ヌクレオチドまたは光学系が使用されない点において、他のシークエンシング技術とは異なる。Ｉｏｎ Ｔｏｒｒｅｎｔシークエンサーの塩基当たりの正確性は、５０塩基リードについて、約９９．６％である。ここで、ラン当たりに、約１００Ｍｂから１００Ｇｂが生成される。リード長は、１００から３００塩基対である。長さ５リピートのホモポリマー繰返しについての正確性は、約９８％である。イオン半導体シークエンシングの利益は、素早いシークエンシング速度と、小さい先行投資および稼働コストである。
Ｓｔｒａｔｏｓ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，Ｉｎｃ．のシークエンシングは、Ｘｐａｎｄｏｍｅｒの使用を含む。このシークエンシング法は、典型的には、テンプレート指向性合成により生成された娘鎖を提供することを含む。娘鎖は、一般的には、標的核酸の全部または一部の連続的なヌクレオチド配列に対応する配列中に結合された複数のサブユニットを含む。同配列において、個々のサブユニットは、テザー、少なくとも１つのプローブまたはヌクレオ塩基残基、および少なくとも１つの選択的に開裂可能な結合を含む。選択的に開裂可能な結合は開裂されて、娘鎖の複数のサブユニットより長い長さのＸｐａｎｄｏｍｅｒを生成する。Ｘｐａｎｄｏｍｅｒは、典型的には、標的核酸の全てまたは一部における連続的なヌクレオチド配列に対応する配列中の遺伝情報を解析するためのテザーおよびレポーターエレメントを含む。次いで、Ｘｐａｎｄｏｍｅｒのレポーターエレメントが検出される。Ｘｐａｎｄｏｍｅｒ系アプローチに関する更なる詳細は、例えば、２００８年６月１９日に出願された、米国特許出願公開第２００９００３５７７７号明細書、発明の名称「Ｈｉｇｈ Ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｂｙ Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ」に記載されている。同文献は、その全体が本明細書に組み込まれる。
他の新たな一分子シークエンシング法は、ＶｉｓｉＧｅｎプラットフォーム（Ｖｏｅｌｋｅｒｄｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃｈｅｍ．，５５：６４１−５８，２００９；米国特許第７，３２９，４９２号明細書；米国特許出願第１１／６７１９５６号明細書；同第１１／７８１１６６号明細書、これらはそれぞれ、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）を使用する合成によるリアルタイムシークエンシングを含む。同プラットフォームでは、固定され、下準備されたＤＮＡテンプレートが、蛍光性修飾ポリメラーゼおよび蛍光アクセプター分子を使用する鎖伸長を受け、ヌクレオチド付加に基づいて、検出可能な蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）がもたらされる。
一部の実施形態では、本明細書で記載された装置およびシステムは、ハイブリダイゼーションアッセイにおける使用を見出す。核酸ハイブリダイゼーション技術の例示的で非限定的な例は、イン・サイチュハイブリダイゼーション（ＩＳＨ）、マイクロアレイ、およびサザンブロットまたはノーザンブロットを含むが、これらに限定されない。
イン・サイチュハイブリダイゼーション（ＩＳＨ）は、標識された相補的なＤＮＡまたはＲＮＡ鎖をプローブとして使用し、組織の一部若しくは切片に、または、組織が十分小さい場合、組織全体（全組織標本ＩＳＨ）に、特定のＤＮＡまたはＲＮＡ配列を（イン・サイチュで）局在化させる種類のハイブリダイゼーションである。ＤＮＡ ＩＳＨは、染色体の構造を決定するのに使用され得る。ＲＮＡ ＩＳＨは、組織切片または全組織標本内のｍＲＮＡおよび他の転写産物を測定し、局在化するのに使用される。サンプル細胞および組織は、通常、標的となる転写産物を適所に固定し、プローブのアクセスを増大させるのに処理される。プローブは、高温において標的配列にハイブリダイズし、次いで、過剰のプローブは洗浄される。放射能、蛍光、または抗原標識された塩基のいずれかで標識されたプローブは、組織中に局在化され、オートラジオグラフィ、蛍光顕微観察、または免疫組織化学のいずれかを使用してそれぞれ定量される。また、ＩＳＨは、２つ以上の転写産物を同時に検出するのに、放射能または他の非放射能標識で標識された２つ以上のプローブを使用することができる。
一部の実施形態では、ハイブリダイゼーションアッセイは、マイクロアレイである。マイクロアレイは、ＤＮＡマイクロアレイ（例えば、ｃＤＮＡマイクロアレイおよびオリゴヌクレオチドマイクロアレイ）；タンパク質マイクロアレイ；組織マイクロアレイ；トランスフェクションまたは細胞マイクロアレイ；化合物マイクロアレイ；および抗体マイクロアレイを含むが、これらに限定されない。遺伝子チップ、ＤＮＡチップ、またはバイオチップとして一般的に知られているＤＮＡマイクロアレイは、同時に数千の遺伝子についての発現プロファイルまたは発現レベルのモニターの目的で、アレイを形成している固体表面（例えば、ガラス、プラスチック、またはシリコンチップ）に付着した微視的ＤＮＡスポットの収集物である。固定されたＤＮＡセグメントは、プローブとして既知である。数千のプローブが、シングルＤＮＡマイクロアレイに使用され得る。マイクロアレイは、疾患細胞および正常な細胞における遺伝子発現を比較することにより、疾患遺伝子または転写産物（例えば、ｍｉＲ）を同定するのに使用され得る。マイクロアレイは、各種の技術を使用して作製され得る。同技術は、ガラススライド上への先の細いピンによる印刷；予め調製されたマスクを使用するフォトリソグラフィ；動的マイクロミラー装置を使用するフォトリソグラフィ；インクジェット印刷；またはマイクロ電極アレイ上での電気化学を含むが、これらに限定されない。
サザンブロット法およびノーザンブロット法が、特定のＤＮＡまたはＲＮＡ配列それぞれを検出するのに使用される。サンプルから抽出されたＤＮＡまたはＲＮＡは、フラグメント化され、マトリクスゲル上で電気泳動的に分離され、メンブランフィルタにトランスファーされる。フィルタに結合したＤＮＡまたはＲＮＡは、対象となる配列に相補的な標識されたプローブとのハイブリダイゼーションを受ける。フィルタに結合したハイブリダイズされたプローブが検出される。この方法の変形は、リバースノーザンブロット法である。同リバースノーザンブロット法において、メンブランに固定された基質である核酸は、単離されたＤＮＡフラグメントの収集物であり、プローブは、組織から抽出され、標識されたＲＮＡである。
上記明細書で言及された全ての刊行物、特許、特許出願、および受け入れ番号は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。本発明が具体的な実施形態に関して記載されてきたが、クレームされた本発明は、このような具体的な実施形態に不当に限定されるべきでないことを理解されたい。実際に、本発明の記載された組成物および方法の種々の改変および変形例が、当業者であれば明らかであろうし、下記の特許請求の範囲内にあることが意図される。

Claims (34)

  1. 生化学アッセイを行うための装置であって、ａ）バネ装填された熱電冷却器（ＴＥＣ）サブアッセンブリ、ｂ）ヒートスプレッダ、ｃ）ローカル信号ブースト電子回路、ｄ）二次熱貯蔵器、およびｅ）前記ＴＥＣサブアッセンブリを前記二次熱貯蔵器に接続する可撓性伝導材料の内の１つ以上を含む、装置。
  2. 前記ＴＥＣサブアッセンブリが、ペルチェ素子と、サーミスタインサートを有するヒートスプレッダ、サーミスタ、熱貯蔵器、保護カラー、バネまたはボールプランジャ、マウントブラケット、および温度測定信号ブースタ回路基板から選択される１つ以上の更なるコンポーネントとを含む、請求項１に記載の装置。
  3. 前記熱貯蔵器が、熱伝導材料から構成されている、請求項２に記載の装置。
  4. 前記熱伝導材料が、アルミニウム、鋼、真鍮、鉄、鉛、および銅から選択される、請求項３に記載の装置。
  5. 前記バネが、前記熱貯蔵器の穴に挿入されている、請求項２に記載の装置。
  6. 前記バネが、前記ペルチェ素子を前記ブラケットから遠ざけるように押している、請求項５に記載の装置。
  7. 前記ヒートスプレッダが、熱伝導材料から構成されている、請求項２に記載の装置。
  8. 前記熱伝導材料が、アルミニウム、鋼、真鍮、鉄、鉛、および銅から選択される、請求項７に記載の装置。
  9. 前記ヒートスプレッダが、金または銀メッキで改質されている、請求項２に記載の装置。
  10. 前記ヒートスプレッダが、切り欠きを含む、請求項２に記載の装置。
  11. サーミスタが、前記切り欠き内に配置されている、請求項１０に記載の装置。
  12. 前記可撓性伝導材料が、銅ワイヤである、請求項１に記載の装置。
  13. 前記装置が、前記コンポーネントを全て含む、請求項１に記載の装置。
  14. 請求項１から１３のいずれか一項に記載の装置と、前記装置と動作可能に連通しているマイクロ流体カートリッジとを含む、システム。
  15. 前記システムが、２つの前記装置を含み、前記マイクロ流体カードが、前記２つの装置間に挟まれている、請求項１４に記載のシステム。
  16. 前記マイクロ流体カードが、生化学反応を行うための１つ以上の反応チャンバを含む、請求項１４に記載のシステム。
  17. 前記生化学反応が、増幅反応、シークエンシング反応、およびハイブリダイゼーション反応から選択される、請求項１４に記載のシステム。
  18. 前記マイクロ流体カードが、生体適合性接着剤で密封されている、請求項１４に記載のシステム。
  19. 前記システムが、ソフトウェアおよびコンピュータプロセッサを更に含み、前記ソフトウェアが、前記装置を動作させるように構成されている、請求項１３に記載のシステム。
  20. 前記ソフトウェアが、増幅反応中に前記マイクロ流体カードと連通している前記装置の一部の温度を動的に変化させるように構成されている、請求項１９に記載のシステム。
  21. 前記ソフトウェアが、熱サイクル反応を行うように構成されている、請求項２０に記載のシステム。
  22. 前記ソフトウェアが、ファーストＰＣＲを行うように構成されている、請求項２１に記載のシステム。
  23. 生化学反応を行う方法であって、請求項１４から２２のいずれか一項に記載のシステムを、生化学反応を行うための試薬と接触させることと、前記装置を使用して、前記反応の温度を変化させることとを含む、方法。
  24. 前記反応が、増幅反応であり、装置が、前記温度を熱サイクルする、請求項２３に記載の方法。
  25. 前記装置が、所望の設定値より高いかまたは低い設定値を維持する、請求項２３に記載の方法。
  26. 前記装置が、設定値を動的に変化させて、目的温度に到達する、請求項２５に記載の方法。
  27. 前記反応が、診断またはスクリーニングアッセイである、請求項２３に記載の方法。
  28. 前記診断アッセイが、核酸変異を同定するか、または、微生物を同定する、請求項２７に記載の方法。
  29. 前記微生物が、病原性微生物である、請求項２８に記載の方法。
  30. 生化学反応を行う方法であって、ａ）請求項１４から２２のいずれか一項に記載のシステムを、生化学反応を行うための試薬と接触させることと、ｂ）前記装置を使用して、所望の設定値より高いかまたは低い設定値を維持し、設定値を動的に変化させることにより、前記反応の温度を変化させ、目的温度に到達することとを含む、方法。
  31. 請求項１から１３のいずれか一項に記載の装置と、前記装置と動作可能に連通しているマイクロ流体カートリッジとを含み、請求項１の装置のコンポーネントの内の１つ以上を欠いているシステムに対して、素早い増幅反応の速度を向上させるように構成されている、システム。
  32. 請求項１から１３のいずれか一項に記載の装置と、前記装置と動作可能に連通しているマイクロ流体カートリッジとを含み、請求項１の装置のコンポーネントの内の１つ以上を欠いているシステムに対して、素早い増幅反応の収量を増大させるように構成されている、システム。
  33. 請求項１から１３のいずれか一項に記載の装置と、前記装置と動作可能に連通しているマイクロ流体カートリッジとを含み、請求項１の装置のコンポーネントの内の１つ以上を欠いているシステムに対して、素早い増幅反応のバックグラウンド信号を減少させるように構成されている、システム。
  34. 請求項１から１３のいずれか一項に記載の装置と、前記装置と動作可能に連通しているマイクロ流体カートリッジと、前記装置を使用して、所望の設定値より高いかまたは低い設定値を維持し、設定値を動的に変化させることにより、前記反応温度を変化させ、目的温度に到達するように、構成されているコンピュータソフトウェアおよびコンピュータプロセッサとを含む、システム。
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