WO2018172393A1 - Stoffgemisch und verwendung eines stoffgemischs für eine polymerase-kettenreaktion - Google Patents

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WO2018172393A1
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millimolar
chain reaction
polymerase chain
magnesium chloride
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Jochen Hoffmann
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Robert Bosch Gmbh
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    • B01L2300/087—Multiple sequential chambers

Definitions

  • Microfluidic diagnostic systems such as so-called lab-on-a-chip systems allow the automated and integrated implementation of complex fluidic workflows for the specific detection of different molecules.
  • DE 10 2011 017 596 A1 discloses, for example, a lab-on-a-chip system for the detection of nucleic acids from cells of a sample to be entered into the lab-on-a-chip system. In the process, cells in the sample are lysed and their DNA extracted in order subsequently to amplify them by means of a polymerase chain reaction and to detect them on a DNA microarray.
  • the invention relates to a substance mixture for a polymerase chain reaction, in particular for a polymerase chain reaction, in short PCR, in a microfluidic device, wherein the substance mixture has at least 2.5, preferably at least 3 millimolar magnesium chloride.
  • the invention further relates to a microfluidic device with such Mixture of substances, wherein the mixture of substances is in particular preceded in the microfluidic device.
  • molar is meant, in particular, a substance concentration of one mole per liter.
  • molar magnesium chloride can thus be any substance concentration of one mole per liter.
  • a molar amount of 2.5 thousandth moles of magnesium chloride in a volume of one liter of the mixture are understood.
  • the presented mixture of substances has the advantage that a step after a lysis of the cells in the sample of a DNA purification, which
  • a buffering requires can be omitted.
  • sensitivity losses are advantageously avoided in a subsequent detection, for example via a microarray or by means of a quantitative PCR, by a dilution carried out in the course of the DNA purification.
  • lysate ie in particular the mixture of lysed sample and lysis buffer
  • binding buffer ie in particular the binding buffer
  • a solid usually a silica membrane
  • Binding of the total DNA present in the lysate to the surface is normally not possible. This is followed by a washing of the solid followed by a detachment of the still on the surface of the solid
  • DNA purification is therefore usually required to be contained in a mixture used for a thermal, chemical or ultrasonic lysis, ethylenediaminetetraacetic acid, short EDTA, and others To remove or dilute PCR inhibitors after lysis to minimize hindrance to subsequent polymerase chain reaction by EDTA.
  • the substance mixture used for the lysis can be, for example, a buffer solution required for the lysis, also called a lysis buffer.
  • the invention is based on the finding that EDTA binds, in particular complexed, a quantity of magnesium chloride required for the polymerase chain reaction, and thus inactivates it for the subsequent polymerase chain reaction. Due to the minimum amount of magnesium chloride in the mixture for the polymerase chain reaction according to the invention, the amount of magnesium chloride inactivated by EDTA is compensated and sufficient
  • Magnesium chloride provided for the polymerase chain reaction. This has the advantage that a polymerase chain reaction using the
  • Substance mixture immediately after lysis with EDTA lysis buffer can be performed. As mentioned above, therefore, can be performed.
  • the mixture comprises more than 2.5 millimolar
  • Magnesium chloride in particular at least or more than 3 millimolar magnesium chloride, more preferably at least 4 millimolar magnesium chloride. It may also have at least 3.5 or at least 4.5 millimolar magnesium chloride. A maximum amount of 10 millimolar magnesium chloride is preferably sufficient to balance a typically given concentration of EDTA in the lysis buffer. In particular, the mixture of substances may comprise between 3.5 and 4.5 millimolar magnesium chloride, since this
  • Concentration range is sufficient for most polymerase chain reaction applications in combination with commonly available lysis buffers containing EDTA.
  • the substance mixture is in freeze-dried form.
  • the substance mixture is added in a compact and simple manner to a microfluidic device or preferably can be pre-stored in the microfluidic device. It is particularly advantageous here that the freeze-dried substance mixture can be mixed with the entire lysed sample in a simple manner for rehydration of the substance mixture. Due to the above explained
  • the lysed sample does not need to be further processed prior to mixing with the mixture.
  • rehydration of the mixture may optionally be assisted by the additional addition of a liquid, for example by the addition of water.
  • the invention also relates to a mixture, in particular a second mixture, comprising a composition according to the invention for a
  • Inventive mixture comprise a lysis buffer to be used for the lysis of the sample and in particular also the lysed sample.
  • This mixture has the advantage that the inhibiting effect of a present by the lysis buffer high EDTA concentration by a correspondingly high
  • the invention also provides a use of this mixture for a polymerase chain reaction, in particular for a polymerase chain reaction in a microfluidic device,
  • the invention further relates to a use of a substance mixture for a polymerase chain reaction, in particular for a polymerase chain reaction in a microfluidic device, wherein the mixture comprises at least 2.5, preferably at least 3 millimolar magnesium chloride.
  • the mixture can be more than 2.5 millimolar
  • magnesium chloride in particular at least or more than 3
  • Millimolar magnesium chloride most preferably at least 4 millimolar
  • the invention thus also provides a process for carrying out a polymerase chain reaction, in particular a Carrying out a polymerase chain reaction in a microfluidic
  • Device having a mixture of at least 2.5, preferably at least 3 millimolar magnesium chloride.
  • the mixture is preferably mixed with a sample, the sample preferably containing lysed cells.
  • the sample preferably containing lysed cells.
  • the mixture of substances is mixed with a mixture of a sample and a lysis buffer, the mixing preferably taking place after lysis of cells contained in the sample with the aid of the lysis buffer.
  • At least part of the magnesium chloride of the substance mixture is mixed with the sample before or after mixing the sample with a residual amount of the substance mixture.
  • Blending mixture of substances with the sample after lysis of at least a portion of cells of the sample without DNA purification advantageously no DNA purification after lysis and before
  • an amount of magnesium chloride in the substance mixture for the polymerase chain reaction correlates positively with an amount of EDTA in a substance mixture for lysis.
  • the substance mixture for the lysis may in particular be a
  • Magnesium chloride is added to compensate for the inactivation of at least a portion of the magnesium chloride by the EDTA.
  • EDTA millimolar EDTA
  • for each millimolar EDTA in the substance mixture for lysis at least one millimolar, preferably at least 1.5 millimolar, most preferably at least 2.0 millimolar magnesium chloride added to the mixture for the polymerase chain reaction, wherein the mixture for the polymerase chain reaction before addition already comprises at least 2.5 millimolar magnesium chloride.
  • the invention also encompasses a mixture comprising the polymerase chain reaction mixture according to the invention and in particular a substance mixture for lysis, the mixture containing, in addition to a concentration of at least 2.5 millimolar magnesium chloride for each millimolar of EDTA present in the mixture, at least 1 millimolar, preferably at least 1.5 millimolar, more preferably at least 2.0 millimolar Magnesium chloride and additionally comprises at least 2.5 millimolar magnesium chloride.
  • FIG. 1 shows a schematic representation of a substance according to the invention like isch together with a microfluidic device for carrying out a polymerase chain reaction
  • FIG. 2 shows a flow chart of the use according to the invention or of the invention
  • Figure 3 is a schematic diagram of a via a DNA microarray of
  • Microfluidic system performed DNA detection after use of the mixture of substances according to the invention.
  • FIG. 1 shows a section of a microfluidic device 100, which has a first chamber 130 for lysing one in the first chamber 130
  • the first chamber 130 comprises a filter 120 for the accumulation of cells to be lysed, for example bacteria, from the sample 50.
  • the filter may be, for example, a filter of, for example, polytetrafluoroethylene, polyvinylidene fluoride or polycarbonate with pore sizes between 0.025 ⁇ m to 10 ⁇ m between 0.1 ⁇ and 1 ⁇ act.
  • it may be a Merck Millipore® filter such as Isopore TM, Mitex TM, Omnipore TM or Durapore TM.
  • concentration of the cells on the filter 120 may cause lysis,
  • a thermal lysis be carried out with the aid of a lysis buffer containing ethylenediaminetetraacetic acid.
  • Lysis buffer may further comprise, for example, 1% Triton X-100, 0.5% tween 20, 10 mM TRIS-HCL and 1 mM ETDA.
  • the microfluidic device 100 may include a first heater 140 adjacent to the first chamber 130.
  • the first chamber 130 is fluidly connected to a second chamber 180 via a valve 110.
  • the second chamber is fluidly connected to a second chamber 180 via a valve 110.
  • the second chamber is fluidly connected to a second chamber 180 via a valve 110.
  • Magnesium chloride includes.
  • the substance mixture 10 can be stored, for example, in the chamber 180 in the course of the production of the microfluidic device 100 in the chamber 130 in freeze-dried form
  • Mixture 10 in addition to the at least 2.5, preferably at least 3 millimolar magnesium chloride further substances for carrying out a polymerase chain reaction include.
  • a portion of the mixture, in particular the at least 3 millimolar magnesium chloride can be pre-stored separately from a remainder of the mixture 10 in the second chamber 180.
  • Polymerase chain reaction such as GE Healthcare's illustra PuReTaq Ready-To-Go TM, BioLyph LLC's LyoSphere TM or High Fidelity PCR EcoDry TM from Clontech Laboratories, Inc., are mixed with the composition of the invention 10 prior to addition to the first camera 130 or both
  • Mixtures of substances can be juxtaposed in the first chamber 130 side by side.
  • a commercially available substance mixture for a polymerase chain reaction already contains up to 2 millimolar magnesium chloride, so that correspondingly at least 0.5, preferably at least 1 millimolar magnesium chloride must additionally be added.
  • the mixture of lysis buffer and lysed sample can be conveyed, with the valve 110 open, into the second chamber 180 where it is mixed with the preceding substance mixture 10 for the second chamber 180
  • the microfluidic device 100 may have a second one adjacent to the second chamber 180
  • Heating device 150 include.
  • the second chamber 180 may be fluidly connected to a third chamber 190 for detection of DNA sequences amplified via the polymerase chain reaction by means of a microarray 195 provided in the second chamber 180.
  • FIG. 2 shows a flow chart of an embodiment of the invention
  • This exemplary embodiment can be used, for example, in microfluidic
  • a sample is provided, for example by introducing the sample into the first chamber 130 of the microfluidic device 100.
  • lysis of cells contained in the sample takes place with the aid of a lysis buffer.
  • the lysed sample is mixed in a third step 203 with a mixture, wherein the mixture comprises at least 2.5 millimolar magnesium chloride and wherein the
  • Mixture 10 may be upstream of a second chamber 180 of the microfluidic device 100. In this case, the mixture further further
  • a fourth step 204 the polymerase chain reaction takes place, wherein advantageously between the lysis in the second step 202 and the polymerase chain reaction in the fourth step 204 no
  • FIG. 3 shows a schematic diagram 300 of a DNA detection carried out via a DNA microarray of a microfluidic system
  • Bacterium caMRSA8 is sensitive, one intensity each
  • Standard mixture of reagents for a polymerase chain reaction comprising the sample with the lysed bacteria and the lysis buffer in five different individual experiments 321, 322, 323, 324, 325 0.5 millimolar
  • Magnesium chloride 1 millimolar magnesium chloride, 1.5 millimolar
  • Millimolar magnesium chloride is added for further development to an embodiment of the substance mixture according to the invention.
  • the addition of magnesium chloride as cited makes it possible to successfully amplify DNA sequences of the bacterium caMRSA8 via the polymerase chain reaction, the amplification being 2.5 millimolar addition of magnesium chloride compared to the additions of the lower ones

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Abstract

Die Erfindung betritt ein Stoffgemisch (10) und seine Verwendung für eine Polymerase- Kettenreaktion, insbesondere für eine Polymerase- Kettenreaktion in einer mikrofluidischen Vorrichtung (100), wobei das Stoffgemisch (10) mindestens 2,5 Millimolar Magnesiumchlorid umfasst. Ferner betrifft die Erfindung ein Gemisch, insbesondere ein zweites Stoffgemisch, umfassend ein erfindungsgemäßes Stoffgemisch (10) für eine Polymerase, wobei das Gemisch zusätzlich zu einer Konzentration von mindestens 2,5 Millimolar Magnesiumchlorid für jedes in dem Gemisch enthaltene Millimolar an EDTA mindestens 1 Millimolar, bevorzugt mindestens 1,5 Millimolar, ganz bevorzugt mindestens 2,0 Millimolar Magnesiumchlorid umfasst.

Description

Beschreibung Titel
Stoffgemisch und Verwendung eines Stoffgemischs für eine Polymerase- Kettenreaktion
Stand der Technik
Mikrofluidische Diagnosesysteme wie sogenannte Lab-on-a-Chip-Systeme erlauben die automatisierte und integrierte Durchführung komplexer fluidischer Arbeitsabläufe für den spezifischen Nachweis unterschiedlicher Moleküle. Aus der DE 10 2011 017 596 AI ist beispielsweise ein Lab-on-a-Chip-System zum Nachweis von Nukleinsäuren aus Zellen einer in das Lab-on-a-Chip-System einzugebenden Probe bekannt. Dabei werden Zellen in der Probe lysiert und deren DNA extrahiert, um diese anschließend mittels einer Polymerase- Kettenreaktion zu amplifizieren und auf einem DNA-Microarray nachzuweisen.
Die Effektivität der Polymerase-Kettenreaktion und des anschließenden
Nachweis über das DNA-Microarray hängen dabei maßgeblich von einer Qualität der Probenaufbereitung ab.
Offenbarung der Erfindung
Vorteile der Erfindung
Gegenstand der Erfindung ist ein Stoffgemisch für eine Polymerase- Kettenreaktion, insbesondere für eine Polymerase-Kettenreaktion, kurz PCR, in einer mikrofluidischen Vorrichtung, wobei das Stoffgemisch mindestens 2,5, bevorzugt mindestens 3 Millimolar Magnesiumchlorid aufweist. Gegenstand der Erfindung ist ferner eine mikrofluidische Vorrichtung mit einem solchen Stoffgemisch, wobei das Stoffgemisch insbesondere in der mikrofluidischen Vorrichtung vorgelagert ist.
Unter einem Molar ist insbesondere eine Stoffkonzentration von einem Mol pro Liter zu verstehen. Unter 2,5 Millimolar Magnesiumchlorid kann somit
insbesondere eine Stoffmenge von 2,5 Tausendstel Mol Magnesiumchlorid in einem Volumen von einem Liter des Stoffgemisches verstanden werden.
Das vorgestellte Stoffgemisch hat den Vorteil, dass ein nach einer Lyse der Zellen in der Probe üblicher Schritt einer DNA-Aufreinigung, welcher
insbesondere einen Einsatz von Waschpuffern für beispielsweise ein Umpuffern erfordert, entfallen kann. Somit werden vorteilhafterweise Sensitivitätsverluste bei einem nachfolgenden Nachweis, beispielsweise über einen Microarray oder mittels einer quantitiven PCR, durch eine im Zuge der DNA-Aufreinigung erfolgten Verdünnung vermieden. Eine DNA-Aufreinigung umfasst
typischerweise eine Vermischung des Lysats, also insbesondere des Gemischs aus lysierter Probe und Lysepuffer, mit einem Bindepuffer und eine nachfolgende Inkontaktbringen mit einem Feststoff, meist einer Silikamembran, für eine
Bindung von DNA aus dem Lysat mit der Oberfläche des Feststoffs. Eine
Bindung der gesamten in dem Lysat vorhandenen DNA mit der Oberfläche ist normalerweise nicht möglich. Anschließend erfolgt eine Waschung des Feststoffs gefolgt von einer Ablösung der noch an der Oberfläche des Feststoffs
gebundenen DNA mit einem weiteren Puffer, die sogenannte Elution. Eine vollständige Ablösung der gebundenen DNA ist hier normalerweise nicht möglich. Somit ergeben sich sowohl bei der Bindung an den Feststoff als auch bei der nachfolgenden Ablösung Verluste an DNA, was sich negativ auf die Sensitivität eines Nachweises der DNA auswirkt. Im Gegensatz dazu ist es aufgrund der Erfindung vorteilhafterweise möglich, die gesamte lysierte Probe dem erfindungsgemäßen Stoffgemisch unmittelbar zuzugeben und damit die gesamte Probe mit der gesamten darin enthaltenen DNA für eine weitere
Prozessierung in der mikrofluidischen Vorrichtung zu verwenden.
Insbesondere ist eine DNA-Aufreinigung üblicherweise deshalb erforderlich, um in einem für eine thermische, chemische oder Ultraschall-Lyse verwendeten Stoffgemisch enthaltene Ethylendiamintetraessigsäure, kurz EDTA, und andere PCR-Inhibitoren nach der Lyse soweit zu entfernen oder zu verdünnen, um eine Behinderung der nachfolgenden Polymerase-Kettenreaktion durch EDTA zu minimieren. Bei dem für die Lyse verwendeten Stoffgemisch kann es sich beispielsweise um eine für die Lyse erforderlichen Pufferlösung handeln, auch Lysepuffer genannt.
Die Erfindung beruht auf der Erkenntnis, dass EDTA eine für die Polymerase- Kettenreaktion erforderliche Menge an Magnesiumchlorid bindet, insbesondere komplexiert, und somit für die nachfolgende Polymerase-Kettenreaktion inaktiviert. Durch die erfindungsgemäße Mindestmenge an Magnesiumchlorid in dem Stoffgemisch für die Polymerase-Kettenreaktion wird die durch EDTA inaktivierte Menge an Magnesiumchlorid kompensiert und genügend
Magnesiumchlorid für die Polymerase-Kettenreaktion bereitgestellt. Dies hat den Vorteil, dass eine Polymerase-Kettenreaktion unter Verwendung des
Stoffgemisches unmittelbar nach einer Lyse mit EDTA enthaltenden Lysepuffer durchgeführt werden kann. Wie bereits oben erwähnt, können daher
vorteilhafterweise ansonsten erforderliche Zwischenschritte, insbesondere eine DNA-Aufreinigung, zwischen Lyse und Polymerase-Kettenreaktion weggelassen werden.
Vorzugsweise umfasst das Stoffgemisch mehr als 2,5 Millimolar
Magnesiumchlorid, insbesondere mindestens oder mehr als 3 Millimolar Magnesiumchlorid, ganz bevorzugt mindestens 4 Millimolar Magnesiumchlorid. Es kann auch mindestens 3,5 oder mindestens 4,5 Millimolar Magnesiumchlorid aufweisen. Eine maximale Menge von 10 Millimolar Magnesiumchlorid ist vorzugsweiseausreichend, um eine typischerweise gegebene Konzentration von EDTA im Lysepuffer auszugleichen Insbesondere kann das Stoffgemisch zwischen 3,5 und 4,5 Millimolar Magnesiumchlorid umfassen, da dieser
Konzentrationsbereich für die meisten Anwendungen einer Polymerase- Kettenreaktion in Kombination mit üblicherweise erhältlichen Lysepuffern, welche EDTA enthalten, ausreicht.
In einer besonders vorteilhaften Ausgestaltung liegt das Stoffgemisch in gefriergetrockneter Form vor. Dies hat den Vorteil, dass das Stoffgemisch in kompakter und einfacher Weise einer mikrofluidischen Vorrichtung zugegeben oder vorzugsweise in der mikrofluidischen Vorrichtung vorgelagert werden kann. Besonders vorteilhaft ist hierbei, dass das gefriergetrocknete Stoffgemisch mit der gesamten lysierten Probe in einfacher Weise für eine Rehydrierung des Stoffgemisches vermischt werden kann. Aufgrund der oben erläuterten
Kompensierung des inhibitorischen Effekts der EDTA muss die lysierte Probe vor dem Vermischen mit dem Stoffgemisch vorteilhafterweise nicht weiter prozessiert werden. Eine Rehydrierung des Stoffgemisches kann jedoch optional durch zusätzliche Zugabe einer Flüssigkeit unterstützt werden, beispielsweise durch Zugabe von Wasser.
Gegenstand der Erfindung ist auch ein Gemisch, insbesondere ein zweites Stoffgemisch, umfassend ein erfindungsgemäßes Stoffgemisch für eine
Polymerase, wobei das Gemisch zusätzlich zu einer Konzentration von mindestens 2,5 Millimolar Magnesiumchlorid für jedes in dem Gemisch enthaltene Millimolar an EDTA mindestens 1 Millimolar, bevorzugt mindestens
1,5 Millimolar, ganz bevorzugt mindestens 2,0 Millimolar Magnesiumchlorid umfasst. Das erfindungsgemäße Gemisch kann somit neben dem
erfindungsgemäßen Stoffgemisch einen für die Lyse der Probe zu benutzenden Lysepuffer und insbesondere auch die lysierte Probe umfassen. Dieses Gemisch hat den Vorteil, dass die inhibierende Wirkung einer durch den Lysepuffeer vorliegenden hohen EDTA-Konzentration durch eine entsprechend hohe
Konzentration an Magnesiumchlorid wie oben beschrieben kompensiert wird. Gegenstand der Erfindung ist auch eine Verwendung dieses Gemischs für eine Polymerase Kettenreaktion, insbesondere für eine Polymerase- Kettenreaktion in einer mikrofluidischen Vorrichtung,
Gegenstand der Erfindung ist ferner eine Verwendung eines Stoffgemisches für eine Polymerase Kettenreaktion, insbesondere für eine Polymerase- Kettenreaktion in einer mikrofluidischen Vorrichtung, wobei das Stoffgemisch mindestens 2,5, bevorzugt mindestens 3 Millimolar Magnesiumchlorid aufweist.
Wie oben ausgeführt, kann das Stoffgemisch mehr als 2,5 Millimolar
Magnesiumchlorid aufweisen, insbesondere mindestens oder mehr als 3
Millimolar Magnesiumchlorid, ganz bevorzugt mindestens 4 Millimolar
Magnesiumchlorid. Gegenstand der Erfindung ist somit auch ein Verfahren zur Durchführung einer Polymerase- Kettenreaktion, insbesondere einer Durchführung einer Polymerase- Kettenreaktion in einer mikrofluidischen
Vorrichtung mit einem mindestens 2,5, bevorzugt mindestens 3 Millimolar Magnesiumchlorid aufweisenden Stoffgemischs.
Bevorzugt wird das Stoffgemisch mit einer Probe vermischt, wobei die Probe vorzugsweise lysierte Zellen enthält. Wie oben ausgeführt, hat die
erfindungsgemäße Verwendung bzw. das erfindungsgemäße Verfahren den Vorteil, dass der Effekt einer Inaktivierung von Magnesiumchlorid für eine nachfolgende Polymerase- Kettenreaktion durch in der Probe enthaltene EDTA vorteilhafterweise durch die erfindungsgemäße Mindestmenge an
Magnesiumchlorid in dem Stoffgemisch kompensiert wird.
Gemäß einer vorteilhaften Weiterbildung der Erfindung wird das Stoffgemisch mit einem Gemisch aus einer Probe und einem Lysepuffer vermischt, wobei die Vermischung vorzugsweise nach Durchführung einer Lyse von in der Probe enthaltenen Zellen unter Zuhilfenahme des Lysepuffers erfolgt. Dies hat den Vorteil, dass eine sonst übliche DNA-Aufreinigung wie oben beschrieben vermieden werden kann. Somit ist es vorteilhafterweise möglich, die gesamte lysierte Probe dem erfindungsgemäßen Stoffgemisch unmittelbar zuzugeben und damit die gesamte Probe mit der gesamten darin enthaltenen DNA für eine weitere Prozessierung in der mikrofluidischen Vorrichtung zu verwenden.
In einer vorteilhaften Weiterbildung der Erfindung wird zumindest ein Teil des Magnesiumchlorids des Stoffgemischs vor oder nach einem Vermischen der Probe mit einer Restmenge des Stoffgemisches mit der Probe vermischt. Dies hat den Vorteil, dass das erfindungsgemäße Stoffgemisch erst beim Vermischen mit der Probe realisiert wird, und somit das Stoffgemisch nicht vor dem
Vermischen bereits vorbereitet werden muss. Dies hat insbesondere den Vorteil, dass kommerziell erhältliche vorgegebene Stoffgemische für eine Polymerase- Kettenreaktion, welche üblicherweise bis zu 2 Millimolar Magnesiumchlorid bereits enthalten und als PCR-Mastermix bezeichnet werden, durch Zugabe von mindestens 0,5, bevorzugt mehr als 0,5, insbesonders mindestens 1 Millimolar Magnesiumchlorid zum erfindungsgemäßen Stoffgemisch weitergebildet werden können. Vorzugsweise erfolgt das Vermischen des Stoffgemischs mit der Probe nach einer Lyse zumindest eines Teils von in der Probe enthaltenen Zellen. Dabei kann, wie bereits oben ausgeführt, durch bei der Lyse verwendetes EDTA inaktiviertes Magnesiumchlorid durch die Zugabe des Stoffgemischs
vorteilhafterweise ausgeglichen werden
In einer besonders vorteilhaften Weiterbildung der Erfindung erfolgt das
Vermischendes Stoffgemisches mit der Probe nach einer Lyse zumindest eines Teils von Zellen der Probe ohne DNA-Aufreinigung. Insbesondere ist vorteilhafterweise keine DNA-Aufreinigung nach einer Lyse und vor dem
Vermischen mit dem Stoffgemisches und nach folgender Polymerase- Kettenreaktion erforderlich. Damit wird, wie oben beschrieben ein Verlust an Probenmaterial verhindert und eine Ausbeute an Probenmaterial für eine nachfolgende Prozessierung maximiert.
In einer besonders bevorzugten Weiterbildung der Erfindung korreliert eine Menge von Magnesiumchlorid in dem Stoffgemisch für die Polymerase- Kettenreaktion positiv mit einer Menge von EDTA in einem Stoffgemisch für eine Lyse. Bei dem Stoffgemisch für die Lyse kann es insbesondere um eine
Pufferlösung für die Lyse handeln, welches insbesondere nach der Lyse mit dem
Stoffgemisch für die Polymerase-Kettenreaktion vermischt wird Dies hat den Vorteil, dass abhängig von einer Menge von EDTA ausreichend
Magnesiumchlorid zugegeben wird, um die Inaktivierung zumindest eines Teils des Magnesiumchlorids durch das EDTA auszugleichen. Vorzugsweise wird für jedes Millimolar EDTA im Stoffgemisch für die Lyse mindestens ein Millimolar, bevorzugt mindestens 1,5 Millimolar, ganz bevorzugt mindestens 2,0 Millimolar Magnesiumchlorid dem Stoffgemisch für die Polymerase-Kettenreaktion zugegeben, wobei das Stoffgemisch für die Polymerase-Kettenreaktion vor der Zugabe bereits mindestens 2,5 Millimolar Magnesiumchlorid umfasst. Wie oben beschrieben umfasst die Erfindung auch ein Gemisch umfassend das erfindungsgemäße Stoffgemisch für eine Polymerase-Kettenreaktion und insbesondere ein Stoffgemisch für eine Lyse, wobei das Gemisch zusätzlich zu einer Konzentration von mindestens 2,5 Millimolar Magnesiumchlorid für jedes in dem Gemisch enthaltene Millimolar an EDTA mindestens 1 Millimolar, bevorzugt mindestens 1,5 Millimolar, ganz bevorzugt mindestens 2,0 Millimolar Magnesiumchlorid und zusätzlich mindestens 2,5 Millimolar Magnesiumchlorid umfasst.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
Ausführungsbeispiele der Erfindung sind in den Zeichnungen schematisch dargestellt und in der nachfolgenden Beschreibung näher erläutert. Für die in den verschiedenen Figuren dargestellten und ähnlich wirkenden Elemente werden gleiche Bezugszeichen verwendet, wobei auf eine wiederholte Beschreibung der Elemente verzichtet wird.
Es zeigen
Figur 1 eine schematische Darstellung eines erfindungsgemäßen Stoff gern ischs gemeinsam mit einer mikrofluidischen Vorrichtung zur Durchführung einer Polymerase-Kettenreaktion,
Figur 2 ein Flussdiagramm der erfindungsgemäßen Verwendung bzw. des
erfindungsgemäßen Verfahrens und
Figur 3 ein schematisches Diagramm eines über ein DNA-Microarray des
mikrofluidischen Systems durchgeführten DNA-Nachweises nach Verwendung des erfindungsgemäßen Stoffgemisches.
Ausführungsformen der Erfindung
Figur 1 zeigt einen Ausschnitt einer mikrofluidische Vorrichtung 100, welche eine erste Kammer 130 für eine Lyse einer in der ersten Kammer 130
aufgenommenen Probe 50 aufweist. Die erste Kammer 130 umfasst einen Filter 120 zur Akkumulation von zu lysierenden Zellen, beispielsweise Bakterien, aus der Probe 50. Bei dem Filter kann es sich beispielsweise um einen Filter aus beispielsweise Polytetrafluorethylen, Polyvinylidenfluorid oder Polycarbonat mit Porengrößen zwischen 0,025 μηη bis 10 μηη, bevorzugt zwischen 0,1 μηη und 1 μηη handeln. Beispielsweise kann es sich dabei um einen Filter von Merck Millipore® wie Isopore™, Mitex™, Omnipore™ oder Durapore™ handeln. Nach einer Aufkonzentration der Zellen auf dem Filter 120 kann eine Lyse,
beispielsweise eine thermische Lyse, unter Zuhilfenahme eines Lysepuffers durchgeführt werden, welcher Ethylendiamintetraessigsäure enthält. Der
Lysepuffer kann ferner beispielsweise 1 % Triton X-100, 0,5% tween 20, 10 Millimolar TRIS-HCL und 1 Millimolar ETDA umfassen. Für die Durchführung einer thermischen Lyse kann die mikrofluidische Vorrichtung 100 eine an die erste Kammer 130 angrenzende erste Heizeinrichtung 140 umfassen.
Die erste Kammer 130 ist mit einer zweiten Kammer 180 über ein Ventil 110 fluidisch verbunden. In diesem Ausführungsbeispiel weist die zweite Kammer
180 ein Stoffgemisch 10 für die Polymerase- Kettenreaktion auf, wobei das Stoffgemisch mindestens 2,5, bevorzugt mindestens 3 Millimolar
Magnesiumchlorid umfasst. Das Stoffgemisch 10 kann beispielsweise in der Kammer 180 im Zuge der Herstellung der mikrofluidischen Vorrichtung 100 in der Kammer 130 in gefriergetrockneter Form vorgelagert werden Dabei kann das
Stoffgemisch 10 neben dem mindestens 2,5, bevorzugt mindestens 3 Millimolar Magnesiumchlorid weitere Stoffe für die Durchführung einer Polymerase- Kettenreaktion umfassen. Alternativ können ein Teil des Stoffgemischs, insbesondere die mindestens 3 Millimolar Magnesiumchlorid, separat von einem Rest des Stoffgemischs 10 in der zweiten Kammer 180 vorgelagert werden.
Beispielsweise kann ein kommerziell erhältliches Stoffgemisch für eine
Polymerase- Kettenreaktion, wie beispielsweise illustra PuReTaq Ready-To-Go™ von GE Healthcare, LyoSphere™ von BioLyph LLC oder High Fidelity PCR EcoDry™ von Clontech Laboratories, Inc., vor Zugabe in die erste Kamer 130 mit dem erfindungsgemäßen Stoffgemisch 10 vermischt werden oder beide
Stoffgemische können nebeneinander in der ersten Kammer 130 vorgelagert werden. Üblicherweise enthält ein solches kommerziell erhältliches Stoffgemisch für eine Polymerase-Kettenreaktion bereits bis zu 2 Millimolar Magnesiumchlorid, so dass entsprechend mindestens 0,5, bevorzugt mindestens 1 Millimolar Magnesiumchlorid zusätzlich hinzugefügt werden müssen.
Nach der in der ersten Kammer 130 erfolgten Lyse kann das Gemisch aus Lysepuffer und lysierter Probe bei geöffnetem Ventil 110 in die zweite Kammer 180 befördert und dort mit dem vorgelagerten Stoffgemisch 10 für die
anschließende Durchführung der Polymerase-Kettenreaktion vermischt werden, was einem Ausführungsbeispiel des erfindungsgemäßen Gemischs umfassend ein Ausführungsbeispiel des erfindungsgemäßen Stoffgemischs 10 entspricht. Für die Durchführung der Polymerase-Kettenreaktion kann die mikrofluidische Vorrichtung 100 eine an die zweite Kammer 180 angrenzende zweite
Heizeinrichtung 150 umfassen.
Die zweite Kammer 180 kann mit einer dritten Kammer 190 für einen Nachweis von über die Polymerase-Kettenreaktion amplifizierten DNA-Sequenzen mittels eines in der zweiten Kammer 180 vorgesehenen Microarrays 195 fluidisch verbunden sein.
Figur 2 zeigt ein Flussdiagramm eines Ausführungsbeispiels der
erfindungsgemäßen Verwendung bzw. des erfindungsgemäßen Verfahrens 200. Dieses Ausführungsbeispiel kann beispielsweise in der mikrofluidischen
Vorrichtung 100 der Figur 1 durchgeführt werden. In einem ersten Schritt 201 wird eine Probebereitgestellt, beispielsweise durch Einbringen der Probe in die erste Kammer 130 der mikrofluidischen Vorrichtung 100. In einem zweiten Schritt 202 erfolgt eine Lyse von in der Probe enthaltenen Zellen unter Zuhilfenahme eines Lysepuffers. Nach erfolgter Lyse wird die lysierten Probe in einem dritten Schritt 203 mit einem Stoffgemisch vermischt, wobei das Stoffgemisch mindestens 2,5 Millimolar Magnesiumchlorid umfasst und wobei das
Stoffgemisch 10 in einer zweiten Kammer 180 der mikrofluidischen Vorrichtung 100 vorgelagert sein kann. Dabei kann das Stoffgemisch ferner weitere
Substanzen für eine Polymerase-Kettenreaktion umfassen. Alternativ können diese weiteren Substanzen mit der Probe separat mit dem Stoffgemisch vermischt werden. In einem vierten Schritt 204 erfolgt die Polymerase- Kettenreaktion, wobei vorteilhafterweise zwischen der Lyse im zweiten Schritt 202 und der Polymerasen- Kettenreaktion im vierten Schritt 204 keine
Aufreinigung der lysierten Probe durchgeführt werden muss. In einem fünften Schritt 205 werden in der Probe über die Polymerase-Kettenreaktion
vervielfältigte DNA-Abschnitte detektiert, beispielsweiseunter Verwendung eines Microarrays oder mittels einer quantitativen PCR, beispielsweise in der dritten Kammer 190 der mikrofluidischen Vorrichtung 100 aus Figur 1. Figur 3 zeigt ein schematisches Diagramm 300 eines über ein DNA-Microarray eines mikrofluidischen Systems durchgeführten DNA-Nachweises nach
Verwendung des erfindungsgemäßen Stoffgemisches. Für vier verschiedene Sonden 301, 302, 303, 304 des DNA-Microarrays, wobei jede Sonde 301, 302, 303, 304 für einen unterschiedlichen DNA-Abschnitt des gram-positiven
Bakteriums caMRSA8 sensitiv ist, ist jeweils eine Intensität eines
Nachweissignals 310 für fünf unterschiedliche Konzentrationen 321, 322, 323, 324, 325 Magnesiumchlorid in dem für die Polymerase- Kettenreaktion verwendeten Stoffgemisch dargestellt. Für die vor der Polymerase- Kettenreaktion durchgeführte Lyse wurde in diesem Beispiel einer Probe mit ca.
1000 Bakterien ein Lysepuffer verwendet, welcher 1% Octoxinol 9, 0,5%
Polysorbat 20, 10 Millimolar Tris(hydroxymethyl)-aminomethan-Hydrochlorid mit pH-Wert von 8,0 und 1 Millimolar EDTA umfasste. Nach der Lyse wurden dem Stoffgemisch, welches bereits 2 Millimolar Magnesiumchlorid aus einem
Standardgemisch von Reagenzien für eine Polymerase-Kettenreaktion umfasste, umfassend die Probe mit den lysierten Bakterien und dem Lysepuffer in fünf verschiedenen Einzelversuchen 321, 322, 323, 324, 325 0,5 Millimolar
Magnesiumchlorid, 1 Millimolar Magnesiumchlorid, 1,5 Millimolar
Magnesiumchlorid, 2 Millimolar Magnesiumchlorid beziehungsweise 2,5
Millimolar Magnesiumchlorid für die Weiterbildung zu einer Ausführungsform des erfindungsgemäßen Stoffgemischs zugegeben. Wie aus Figur 3 ersichtlich, ermöglicht es die angeführte Zugabe von Magnesiumchlorid, DNA-Sequenzen des Bakteriums caMRSA8 erfolgreich über die Polymerase-Kettenreaktion zu vervielfältigen, wobei die Vervielfältigung bei einer Zugabe von 2,5 Millimolar Magnesiumchlorid verglichen mit den Zugaben der genannten geringeren
Konzentrationen am effektivsten ist. Bereits bei einer Zugabe von 0,5 Millimolar Magnesiumchlorid, so dass das Stoffgemisch insgesamt 2,5 Millimolar
Magnesiumchlorid aufweist, ist der vorteilhafte Effekt der Erfindung zu erkennen. Bevorzugt ist für eine größere Wirkung eine Zugabe von 1 Millimolar
Magnesiumchlorid empfohlen, also insgesamt 3 Millimolar Magenesiumchlorid im
Stoffgemisch. Ganz bevorzugt ist eine Zugabe von mindestens 2 Millimolar Magnesiumchlorid, also insgesamt mindestens 4 Millimolar Magenesiumchlorid im Stoffgemisch. Ohne Zugabe von Magnesiumchlorid wurde kein
Nachweissignal erhalten, was auf eine nicht erfolgreiche Polymerase- Kettenreaktion schließen lässt. Durch die Zugabe von Magnesiumchlorid konnte jedoch die durch EDTA bewirkte Hemmung der Polymerase- Kettenreaktion ohne DNA-Aufreinigung und ohne die Verwendung weiterer Pufferlösungen oder Verdünnungen vorteilhaferweise kompensiert werden.

Claims

Ansprüche
1. Stoffgemisch (10) für eine Polymerase- Kettenreaktion, insbesondere für eine Polymerase- Kettenreaktion in einer mikrofluidischen Vorrichtung (100), dadurch gekennzeichnet, dass das Stoffgemisch (10) mindestens 2,5 Millimolar
Magnesiumchlorid umfasst.
2. Stoffgemisch (10) nach Anspruch 1, wobei das Stoffgemisch (10) mehr als 2,5 Millimolar Magnesiumchlorid, insbesondere mindestens oder mehr als 3 Millimolar Magnesiumchlorid, ganz bevorzugt mindestens 4 Millimolar Magnesiumchlorid umfasst.
3. Stoffgemisch (10) nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Stoffgemisch (10) in gefriergetrockneter Form vorliegt.
4. Gemisch umfassend ein Stoffgemisch (10) für eine Polymerase- Kettenreaktion nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Gemisch zusätzlich zu einer
Konzentration von mindestens 2,5 Millimolar Magnesiumchlorid für jedes in dem Gemisch enthaltene Millimolar an EDTA mindestens 1 Millimolar, bevorzugt mindestens 1,5 Millimolar, ganz bevorzugt mindestens 2,0 Millimolar Magnesiumchlorid umfasst.
5. Verwendung eines Stoffgemischs (10) nach einem der Ansprüche 1 bis 3 oder eines Gemischs nach Anspruch 4 für eine Polymerase- Kettenreaktion, insbesondere für eine Polymerase-Kettenreaktion in einer mikrofluidischen Vorrichtung (100).
6. Verwendung eines Stoffgemischs (10) für eine Polymerase-Kettenreaktion nach Anspruch 5, wobei das Stoffgemisch mit einer Probe (50), insbesondere einer lysierte Zellen enthaltende Probe (50), vermischt wird.
7. Verwendung eines Stoff gern ischs (10) für eine Polymerase- Kettenreaktion nach Anspruch 5 oder 6 , wobei das Stoffgemisch (10) mit einem Gemisch (50) aus einer Probe und einem Lysepuffer vermischt wird, insbesondere nach Durchführung einer Lyse von in der Probe enthaltenen Zellen unter Zuhilfenahme des Lysepuffers.
8. Verwendung eines Stoff gern ischs (10) für eine Polymerase- Kettenreaktion nach einem der Ansprüche 5 bis 7, wobei zumindest ein Teil des Magnesiumchlorids des Stoffgem ischs (10) vor oder nach einem Vermischen der Probe mit einer
Restmenge des Stoffgem ischs (10) mit der Probe vermischt wird.
9. Verwendung eines Stoffgem ischs (10) für eine Polymerase- Kettenreaktion nach einem der Ansprüche 5 bis 8, wobei ein Vermischen des Stoffgem ischs (10) mit der Probe nach einer Lyse zumindest ein Teils von in der Probe (50) enthaltenen Zellen erfolgt.
10. Verwendung eines Stoffgem ischs (10) für eine Polymerase- Kettenreaktion nach einem der Ansprüche 5 bis 9, wobei das Vermischendes Stoffgemischs (10) mit der Probe nach einer Lyse zumindest eines Teils von Zellen der Probe (50) ohne DNA- Aufreinigung erfolgt.
11. Verwendung eines Stoffgemischs (10) für eine Polymerase- Kettenreaktion nach einem der Ansprüche 5 bis 10, wobei eine in dem Stoffgemisch enthaltene Menge von Magnesiumchlorid mit einer Menge von EDTA in einem Stoffgemisch für eine Lyse positiv korreliert, wobei das Stoffgemisch für die Lyse für eine Vermischung mit dem Stoffgemisch (10) für eine Polymerase- Kettenreaktion vorgesehen ist.
12. Verwendung nach Anspruch 11, wobei das Stoffgemisch (10) für eine
Polymerase- Kettenreaktion zusätzlich zur Menge von mindestens 2,5 Millimolar für jedes in dem Stoffgemisch für eine Lyse enthaltene Millimolar an EDTA mindestens 1 Millimolar, bevorzugt mindestens 1,5 Millimolar, ganz bevorzugt mindestens 2,0 Millimolar Magnesiumchlorid Magnesiumchlorid aufweist.
13. Mikrofluidische Vorrichtung (100), wobei in der mikrofluidischen Vorrichtung ein Stoffgemisch (10) nach einem der Ansprüche 1 bis 3 vorgelagert ist.
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