WO2022242931A1 - Verfahren zur aufreinigung von nukleinsäuren, insbesondere in einer mikrofluidischen vorrichtung - Google Patents

Verfahren zur aufreinigung von nukleinsäuren, insbesondere in einer mikrofluidischen vorrichtung Download PDF

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WO2022242931A1
WO2022242931A1 PCT/EP2022/057426 EP2022057426W WO2022242931A1 WO 2022242931 A1 WO2022242931 A1 WO 2022242931A1 EP 2022057426 W EP2022057426 W EP 2022057426W WO 2022242931 A1 WO2022242931 A1 WO 2022242931A1
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transport medium
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filter
washing buffer
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Tanja Maucher
Christian GRUMAZ
Martina BUDDE
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Robert Bosch Gmbh
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
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    • B01L3/5027—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures by integrated microfluidic structures, i.e. dimensions of channels and chambers are such that surface tension forces are important, e.g. lab-on-a-chip
    • B01L3/502761—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures by integrated microfluidic structures, i.e. dimensions of channels and chambers are such that surface tension forces are important, e.g. lab-on-a-chip specially adapted for handling suspended solids or molecules independently from the bulk fluid flow, e.g. for trapping or sorting beads, for physically stretching molecules
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    • B01L2200/00—Solutions for specific problems relating to chemical or physical laboratory apparatus
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    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
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    • B01L2300/06—Auxiliary integrated devices, integrated components
    • B01L2300/0681—Filter

Definitions

  • transport media for viral and bacterial samples in particular have established themselves as clinical standards, which make it possible to transport patient swabs or samples to a diagnostic laboratory without damaging or changing the nucleic acids in the medium.
  • These transport media create a stabilizing environment for the nucleic acids by destroying pathogens, releasing the nucleic acids and inhibiting degrading proteins. They are mainly used when a molecular diagnostic detection of pathogens is to be carried out, but no microbiological multiplication on nutrient media such as agar plates or blood cultures is desired or possible (e.g. for virus detection).
  • eNATTM A widespread transport medium for such a purpose is eNATTM from COPAN.
  • Another example is Roche's cobas® medium.
  • These nucleic acid-stabilizing transport media contain so-called chaotropic salts in high concentrations (e.g. eNATTM: 3.7 M), which disrupt the structure of water, but also of macromolecules dissolved in water, such as proteins or nucleic acids, and can lead to denaturation of the structures.
  • Lipid bilayers such as those found in cellular membranes, can also be denatured. This effect leads to the lysis of a wide variety of cells, such as human cells and bacteria, and also to disruption of the protein envelope of viruses.
  • the classic sample purification process common in a lab-on-chip system comprises cell lysis, binding of the released nucleic acids to a filter frit, washing and subsequent elution of the purified nucleic acids with subsequent (real-time) polymerase chain reaction (PCR for short) and detection reaction, such as described, for example, in the published application DE 102014211 221 A1, can in principle be carried out with these transport media.
  • a so-called lysis or binding buffer is used for cell lysis and binding of the nucleic acids to the filter frit. This buffer is formulated such that the concentration of chaotropic salts in the mixed compound is optimal for binding the nucleic acids to the filter frit.
  • this optimum range is approximately 1.6-2.2 moles per liter (Molar or M for short).
  • this binding buffer usually contains reagents that promote the precipitation of the nucleic acids. These are often other salts (e.g. table salt) or alcohols (e.g. isopropanol). The setting of these chaotropic conditions is essential for the recovery rate of the nucleic acids.
  • wash buffer In a second step, cell and protein residues as well as salts and precipitating agents are removed as completely as possible by using a washing buffer. This is necessary to prevent these substances from inhibiting the detection reaction by a (quantitative real-time) PCR.
  • the formulation of the wash buffer must be chosen carefully in order to sufficiently remove interfering substances without rinsing the nucleic acids from the filter and thus losing them for the detection reaction.
  • a cascade of solutions of different concentrations with chaotropic salts and precipitating agents is often used sequentially instead of a single wash buffer.
  • the nucleic acids are removed from the filter frit with a so-called elution buffer and fed to the detection reaction.
  • a freeze-dried PCR reaction mix is rehydrated with the elution buffer and the nucleic acids it contains, which can then be cycled in a classic PCR temperature program. Disclosure of the Invention Advantages of the Invention
  • the invention relates to a method for purifying nucleic acids.
  • the method can be carried out in particular with a microfluidic device, preferably a so-called lab-on-a-chip, for example with a microfluidic cartridge as described in DE 10 2016 222 075 A1 or DE 10 2016 222 072 A1.
  • nucleic acids are released from a sample in a transport medium due to chaotropic substances in the transport medium.
  • the transport medium can thus be a medium for storing, preserving and/or transporting biological samples, in particular samples of body fluids containing human or animal cells.
  • the transport medium has chaotropic substances, in particular chaotropic salts, for releasing nucleic acids from the cells.
  • the transport media mentioned above are eNATTM or cobas®.
  • the release can take place in particular by lysis of the cells in the sample, with the cells comprising the nucleic acids.
  • the release can include a denaturation of the nucleic acids.
  • Nucleic acids can be understood in particular as meaning ribonucleic acids (RNA for short) or deoxyribonucleic acids (DNA for short).
  • the chaotropic substances can in particular be chaotropic salts, such as barium salts, guanidinium hydrochloride, thiocyanates such as guanidinium thiocyanate, perchlorates such as sodium perchlorate or else sodium chloride.
  • nucleic acids are bound to a filter, with the transport medium being mixed with a first part of a wash buffer to set binding conditions.
  • Mixing creates a binding buffer for binding the nucleic acids to the filter.
  • the filter can be a filter of the microfluidic device in particular.
  • the filter can, for example, on a porous silica membrane.
  • a filter can preferably also be understood to mean a filter frit.
  • the washing buffer can be a buffer or solution customary for the purification of nucleic acids, but preferably without ethanol and the washing buffer preferably has less than 0.1 mol per liter of chaotropic substances, in particular chaotropic salts.
  • Mixing the transport medium with the first part of the washing buffer preferably lowers a concentration of the chaotropic substances for setting the binding conditions, and a binding buffer with a concentration of chaotropic substances between 1.6 and 2.2 mol per liter is preferably created.
  • a binding buffer with a concentration of chaotropic substances between 1.6 and 2.2 mol per liter is preferably created.
  • mixing the transport medium with the first part of the washing buffer preferably creates a mixture which has chaotropic salts with a concentration of between 1.6 and 2.2 moles per liter.
  • the first part of the washing buffer contains highly crosslinked polyalcohols, such as polyethylene glycols, so that the mixture preferably contains these polyalcohols in a proportion of 150 to 200 grams per liter (g/L for short).
  • the washing buffer preferably has a proportion of 200 to 400 g/l of highly crosslinked polyalcohols.
  • the first part of the washing buffer has such an amount of chaotropic substances, preferably chaotropic salts, and preferably highly crosslinked polyalcohols that mixing the first part of the washing buffer with a specified amount of the specified transport medium creates a mixture which is 1.6 to 2.2 moles per liter of chaotropic substances, where the chaotropic substances are preferably chaotropic salts, and 150 to 200 grams per liter of highly crosslinked polyalcohols, where the highly crosslinked polyalcohols are preferably polyethylene glycol.
  • the method according to the invention has the advantage that a binding buffer that would otherwise be required for binding the nucleic acids to the filter can be dispensed with, since this binding buffer is replaced by mixing the transport medium with the first part of the washing buffer.
  • a binding buffer for the inventive mixing of the transport medium with the first part of the wash buffer Binding of the nucleic acids created on the filter when carrying out the method.
  • the resulting elimination of a separate binding buffer advantageously leads to cost savings both in the procurement and formulation of reagents and buffers and in the design and manufacture of a microfluidic device used for this purpose, since space for receiving and pre-storage and thus material can be saved .
  • the purification of the nucleic acids after binding to the filter includes washing the filter with a second part of the washing buffer.
  • This has the advantage that substances remaining on the filter or in the filter chamber, for example cell and protein residues and in particular also salts and precipitating agents, are removed and thus cannot adversely affect the further process. In particular, this allows substances to be removed which would adversely affect the implementation of a polymerase chain reaction.
  • the first part and the second part of the wash buffer can preferably be two parts of the same wash buffer.
  • the nucleic acids are eluted from the filter using an elution buffer.
  • the elution buffer can be a buffer for the elution of nucleic acids that is typical in microfluidics, for example buffered low-salt solutions with a neutral to slightly alkaline pH (for example TE buffer 10 mM TRIS/CI pH 8, 1 mM EDTA) or distilled water.
  • parts of the nucleic acids are amplified after the binding, in particular after the elution, preferably with the aid of a (quantitative real-time) polymerase chain reaction, an isothermal amplification or a ligase chain reaction.
  • a part of the nucleic acids can be understood as meaning a section, also called a sequence, of a nucleic acid, for example a DNA or RNA section.
  • a detection of the duplicated parts can provide evidence of these parts and thus the associated organisms, for example with the aid of (fluorescence) spectroscopy.
  • the invention also relates to a microfluidic kit or microfluidic system comprising a microfluidic device and a transport medium, the transport medium containing chaotropic substances for the release of nucleic acids from a sample and the device being set up to mix a first part of a washing buffer with the transport medium for setting To mix binding conditions for binding the released nucleic acids to a filter of the device.
  • the wash buffer can be stored upstream in the microfluidic device.
  • the transport medium can be a medium as explained above, in particular eNATTM or cobas®.
  • the microfluidic kit can in particular be understood to mean the microfluidic device together with the transport medium, with the transport medium not yet having to be located in the microfluidic device.
  • the transport medium can, for example, be arranged in a vessel, in which case the sample for mixing with the transport medium can also be added to the vessel, for example by inserting a swab containing the sample into the transport medium.
  • the transport medium and the first part of the washing buffer are preferably coordinated with one another in terms of their respective amount, their composition and a concentration of the chaotropic substances such that the transport medium for the release of nucleic acids from a sample and that mixing of the transport medium with the first part of the Washing buffer are set up to set binding conditions for binding the released nucleic acids to the filter
  • binding conditions there are particular binding conditions when the mixture has a concentration of between 1.6 and 2.2 mol per liter of chaotropic substances, preferably chaotropic salts, and very preferably contains 150 to 200 grams per liter of highly crosslinked polyalcohols, wherein the highly crosslinked polyalcohols are preferably polyethylene glycol.
  • the kit in particular the microfluidic device, comprises a second part of the Washing buffer, wherein the second part is designed for washing the filter and the nucleic acids bound to the filter.
  • the second part has the same composition as the first part of the wash buffer.
  • FIG. 2 shows a flow chart of an exemplary embodiment of the method according to the invention.
  • Figures la and lb show an embodiment of the microfluidic kit 200 according to the invention, with which the method 500 according to the invention can be carried out, for example.
  • Figure 2 shows a flowchart 500 for the exemplary embodiment of the method 500 according to the invention described below.
  • the microfluidic kit 200 includes a microfluidic device 100, for example a microfluidic cartridge 100 as part of a lab-on-a-chip device, as described in DE 102016222 075 A1 or DE 102016222 072 A1.
  • a biological sample is introduced into an input chamber 110 of the cartridge 100 in a transport medium 10 via an opening 111 .
  • the biological sample can in particular be a body fluid such as blood, sputum, urine or a smear containing human or animal cells.
  • the transport medium 10 contains chaotropic substances for releasing the nucleic acids from the cells according to a step 501 of the method 500.
  • the transport medium 10 can be eNATTM from the company COPAN or cobas® from the company Roche.
  • the transport medium 10 contains, for example, approximately 3.7 moles per liter (molar or M for short) of guanidinium thiocyanate as a chaotropic salt and a total volume of, for example, 300 microliters (m/_ for short).
  • the wash buffer 20 is preferably a buffer without chaotropic substances or with only a low concentration of chaotropic substances, preferably with a concentration of less than 0.1 M.
  • it is a wash buffer without ethanol, as in EP 2 163 621 A1, and for example comprising polyethylene glycol in a concentration between 100 and 600 g/L as described in DE 10 2014211 221 A1.
  • the cartridge 100 also includes a filter 141 which is fluidically connected to the input chamber 110 and the buffer chamber 120 and which can be arranged in a further chamber 140 (filter chamber 140 for short).
  • a filter 141 which is fluidically connected to the input chamber 110 and the buffer chamber 120 and which can be arranged in a further chamber 140 (filter chamber 140 for short).
  • the released nucleic acids are bound to the filter 141, for which purpose the transport medium 10 is mixed with a first part 21 of the washing buffer 20 to set suitable binding conditions, and the filter 141 mixes this mixture, which now corresponds to a binding buffer 50. is exposed for a period of, for example, 15 to 60 seconds, as shown in Figure lb.
  • the first part 21 of the wash buffer 10 provided for in combination with the transport medium 10 is designed or formulated in such a way that, in addition to setting the Binding conditions after mixing with the transport medium 10 can also be used for the subsequent removal of chaotropic substances and other substances that inhibit the subsequent analysis, in particular for carrying out a (quantitative real-time) polymerase chain reaction, in its function as a washing buffer.
  • the washing buffer is designed in such a way that it contains few or no chaotropic substances and at the same time highly crosslinked polyalcohols such as polyethylene glycols to support the nucleic acid precipitation (for example in the range of 20 to 40% (w/v)), so that it can the washing buffer 20 can advantageously be used both, after mixing with the transport medium 10 to generate the binding buffer, for binding, and as a normal washing buffer for displacing the chaotropic substances in a washing step.
  • highly crosslinked polyalcohols such as polyethylene glycols to support the nucleic acid precipitation
  • eNATTM contains about 3.7 M guanidinium thiocyanate as a chaotropic salt as a main component that helps determine the binding properties for binding the nucleic acids to the filter 141 .
  • 300 microliters of eNATTM are also used to detect a wide variety of pathogens.
  • the final concentration of chaotropic salts for binding the nucleic acids to the filter 141 should be between 1.6 and 2.2M. These suitable binding conditions are achieved by diluting the eNATTM with the first part 21 of the wash buffer 20 if the wash buffer contains no or few chaotropic substances as described above.
  • the filter 141 and the nucleic acids bound to it are washed with a second part 22 of the washing buffer 20 in order to remove residues of the binding buffer 50 and other substances from the sample and the transport medium 10, in particular remaining chaotropic substances remove, which would have an adverse effect on the further procedure.
  • an elution buffer 40 is used to remove the binding conditions and thus to release the nucleic acids from the filter 141.
  • the elution buffer 30 can be placed in a further chamber 130 fluidically connected to the filter chamber 140 (short Elution buffer chamber 130) be upstream.
  • the elution buffer can be a typical buffer for dissolving silica nucleic acids, for example distilled or buffered water, optionally with surfactants, such as polysorbate 80 (Tween® 80).
  • the purification of the nucleic acids is completed in the fourth step 504 and further processing of the nucleic acids can take place in a preferred fifth step 505, for example amplification of parts of the nucleic acids using a (quantitative real-time) polymerase chain reaction, isothermal amplification or a ligase chain reaction in a further chamber 150 (analysis chamber 150 for short) for detecting the nucleic acids and associated pathogens in the sample.
  • a further chamber 150 analysis chamber 150 for short

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Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren (500) zur Aufreinigung von Nukleinsäuren, insbesondere in einer mikrofluidischen Vorrichtung (100), umfassend ein Freisetzen (501) von Nukleinsäuren aus einer Probe durch chaotrope Substanzen in einem Transportmedium (10) und ein Binden (502) der Nukleinsäuren an einen Filter (141), wobei das Transportmedium (10) mit einem ersten Teil (21) eines Waschpuffers (20) zur Einstellung von Bindebedingungen vermischt wird. Ferner betrifft die Erfindung ein Mikrofluidisches Kit (200) zur Durchführung des Verfahrens (500).

Description

Beschreibung
Titel
Verfahren zur Aufreinigung von Nukleinsäuren, insbesondere in einer mikrofluidischen Vorrichtung
Stand der Technik
In der biochemischen und medizinischen Diagnostik haben sich zahlreiche sogenannte Transportmedien für insbesondere virale und bakterielle Proben als klinische Standards etabliert, die es möglich machen, Patientenabstriche oder -proben zu einem Diagnostiklabor zu transportieren, ohne die im Medium befindlichen Nukleinsäuren dabei zu schädigen oder zu verändern. Diese Transportmedien schaffen für die Nukleinsäuren eine stabilisierende Umgebung, indem Pathogene zerstört, die Nukleinsäuren freigesetzt und abbauende Proteine gehemmt werden. Sie werden vor allem dann eingesetzt, wenn ein molekulardiagnostischer Nachweis von Pathogenen durchgeführt werden soll, aber keine mikrobiologische Vermehrung auf Nährmedien wie beispielsweise Agarplatten oder Blutkultur gewünscht oder möglich ist (zum Beispiel bei Virennachweisen).
Ein weit verbreitetes Transportmedium für einen solchen Zweck ist eNAT™ des Unternehmens COPAN. Ein weiteres Beispiel ist das cobas®-Medium des Unternehmens Roche. Diese nukleinsäurenstabilisierenden Transportmedien enthalten sogenannte chaotrope Salze in hohen Konzentrationen (z.B. eNAT™: 3,7 M), welche die Struktur von Wasser, aber auch von in Wasser gelösten Makromolekülen, wie Proteinen oder Nukleinsäuren stören und zur Denaturierung der Strukturen führen können. Auch Lipiddoppelschichten, wie sie in zellulären Membranen Vorkommen, können denaturiert werden. Dieser Effekt führt zur Lyse von Zellen verschiedenster Art, wie humanen Zellen, Bakterien und auch zur Störung der Proteinhülle von Viren. Der klassische in einem Lab-on-Chip-System übliche Proben- aufreinigungsprozess umfassend Zelllyse, Bindung der freigesetzten Nukleinsäuren an eine Filterfritte, Waschen und nachfolgende Elution der gereinigten Nukleinsäuren mit anschließender (Echtzeit-) Polymerase- Kettenreaktion (kurz PCR) und Nachweisreaktion, wie beispielsweise in der Offenlegungsschrift DE 102014211 221 Al beschrieben, kann mit diesen Transportmedien grundsätzlich durchgeführt werden. Für Zelllyse und Bindung der Nukleinsäuren an die Filterfritte wird in einem ersten Schritt dabei ein sogenannter Lyse- oder Bindepuffer verwendet. Dieser Puffer wird so formuliert, dass die Konzentration an chaotropen Salzen in der gemischten Verbindung optimal für die Bindung der Nukleinsäuren an die Filterfritte eingestellt ist. Dieser optimale Bereich beläuft sich etwa auf 1, 6-2,2 Mol pro Liter (kurz Molar oder M). Zusätzlich befinden sich in diesem Bindepuffer meist noch Reagenzien, die die Ausfällung der Nukleinsäuren begünstigen. Häufig sind dies weitere Salze (z.B. Kochsalz) oder Alkohole (z.B. Isopropanol). Die Einstellung dieser chaotropen Verhältnisse sind essentiell für die Wiederfindungsrate der Nukleinsäuren.
In einem zweiten Schritt werden Zell- und Proteinreste und auch Salze und Fällungsagenzien durch den Einsatz eines Waschpuffers möglichst vollständig entfernt. Dies ist notwendig, um eine Hemmung der Nachweisreaktion durch eine (quantitative Echtzeit-) PCR durch diese Substanzen zu verhindern. Dabei ist die Formulierung des Waschpuffers wieder sorgfältig zu wählen, um störende Substanzen ausreichend zu entfernen, ohne die Nukleinsäuren vom Filter zu spülen und damit für die Nachweisreaktion zu verlieren. Oftmals wird eine Kaskade von verschieden konzentrierten Lösungen mit chaotropen Salzen und Fällungsagenzien nacheinander statt eines einzelnen Waschpuffers eingesetzt.
In einem dritten Schritt werden die Nukleinsäuren von der Filterfritte mit einem sogenannten Elutionspuffer gelöst und der Nachweisreaktion zugeführt. Beispielsweise wird dabei mit dem Elutionspuffer und den darin enthaltenen Nukleinsäuren ein gefriergetrockneter PCR-Reaktionsmix rehydriert, welcher im Anschluss in einem klassischen PCR-Temperaturprogramm zykliert werden kann. Offenbarung der Erfindung Vorteile der Erfindung
Vor diesem Hintergrund betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Aufreinigung von Nukleinsäuren. Das Verfahren kann insbesondere mit einer mikrofluidischen Vorrichtung, vorzugsweise einem sogenannten Lab-on-a-Chip durchgeführt werden, beispielsweise mit einer mikrofluidischen Kartusche wie in DE 10 2016 222 075 Al oder DE 10 2016 222 072 Al beschrieben.
In einem ersten Schritt des Verfahrens werden Nukleinsäuren aus einer Probe in einem Transportmedium aufgrund chaotroper Substanzen in dem Transportmedium freigesetzt. Bei dem Transportmedium kann es sich somit um ein Medium zur Aufbewahrung, Konservierung und/oder zum Transport von biologischen Proben handeln, insbesondere für Proben von Körperflüssigkeiten mit menschlichen oder tierischen Zellen. Das Transportmedium weist chaotrope Substanzen, insbesondere chaotrope Salze, zur Freisetzung von Nukleinsäuren aus den Zellen auf. Beispielsweise handelt es sich um die oben genannten Transportmedien eNAT™ oder cobas®. Die Freisetzung kann dabei insbesondere durch eine Lyse der Zellen in der Probe erfolgen, wobei die Zellen die Nukleinsäuren umfassen. Ferner kann die Freisetzung eine Denaturierung der Nukleinsäuren umfassen. Unter Nukleinsäuren können insbesondere Ribonukleinsäuren (kurz RNA) oder Desoxyribonukleinsäuren (kurz DNA) verstanden werden. Bei den chaotropen Substanzen kann es sich insbesondere um chaotrope Salze handeln, wie beispielsweise Bariumsalze, Guanidiniumhydrochlorid, Thiocyanate wie Guanidiniumthiocyanat, Perchlorate wie Natriumperchlorat oder auch Natriumchlorid.
In einem zweiten Schritt des Verfahrens werden Nukleinsäuren an einen Filter gebunden, wobei das Transportmedium mit einem ersten Teil eines Waschpuffers zur Einstellung von Bindebedingungen vermischt wird. Durch die Vermischung entsteht ein Bindepuffer zur Bindung der Nukleinsäuren an den Filter. Bei dem Filter kann es sich um einen Filter der insbesondere mikrofluidischen Vorrichtung handeln. Der Filter kann beispielsweise auf einer porösen Silikamembran basieren. Ferner kann unter einem Filter vorzugsweise auch eine Filterfritte verstanden werden. Bei dem Waschpuffer kann es sich um einen oder eine zur Reinigung von Nukleinsäuren üblichen Puffer beziehungsweise Lösung handeln, bevorzugt jedoch ohne Ethanol und wobei der Waschpuffer vorzugsweise weniger als 0,1 Mol pro Liter an chaotropen Substanzen, insbesondere chaotropen Salzen aufweist. Bevorzugt wird durch das Vermischen des Transportmediums mit dem ersten Teil des Waschpuffers eine Konzentration der chaotropen Substanzen für die Einstellung der Bindebedingungen gesenkt und dabei vorzugsweise ein Bindepuffer mit einer Konzentration von chaotropen Substanzen zwischen 1,6 bis 2,2 Mol pro Liter geschaffen. Bei einer Verwendung von chaotropen Salzen als chaotrope Substanzen wird durch das Vermischen des Transportmediums mit dem ersten Teil des Waschpuffers bevorzugt ein Gemisch geschaffen, das chaotrope Salze mit einer Konzentration zwischen 1,6 bis 2,2 Mol pro Liter aufweist. Ferner weist der erste Teil des Waschpuffers gemäß einer vorteilhaften Ausgestaltung hochvernetzte Polyalkohole, wie beispielsweise Polyethylenglykole, auf, so dass das Gemisch diese Polyalkohole vorzugsweise mit einem Anteil von 150 bis 200 Gramm pro Liter (kurz g/L) aufweist. Bevorzugt weist der Waschpuffer dazu einen Anteil von 200 bis 400 g/L an hochvernetzten Polyalkoholen auf. Mit anderen Worten weist der erste Teil des Waschpuffers eine derartige Menge an chaotropen Substanzen, bevorzugt chaotropen Salzen, und vorzugsweise hochvernetzten Polyalkoholen auf, dass eine Vermischung des ersten Teils des Waschpuffers mit einer vorgegebenen Menge des vorgegebenen Transportmediums ein Gemisch schafft, welches 1,6 bis 2,2 Mol pro Liter an chaotropen Substanzen, wobei es sich bei den chaotropen Substanzen vorzugsweise um chaotrope Salze handelt, und 150 bis 200 Gramm pro Liter an hochvernetzten Polyalkoholen enthält, wobei es sich bei den hochvernetzten Polyalkoholen vorzugsweise um Polyethylenglycol handelt.
Das erfindungsgemäße Verfahren hat den Vorteil, dass auf einen ansonsten erforderlichen Bindepuffer zum Binden der Nukleinsäuren an den Filter verzichtet werden kann, da dieser Bindepuffer durch eine Vermischung des Transportmediums mit dem ersten Teil des Waschpuffers ersetzt wird. Mit anderen Worten wird durch das erfindungsgemäße Vermischen des Transportmediums mit dem ersten Teil des Waschpuffers ein Bindepuffer zum Binden der Nukleinsäuren an den Filter bei Durchführung des Verfahrens geschaffen. Der dadurch ermöglichte Wegfall eines separaten Bindepuffers führt vorteilhafterweise zu einer Einsparung von Kosten sowohl bei der Beschaffung und Formulierung von Reagenzien und Puffern als auch bei der Konstruktion und Herstellung einer dafür verwendeten mikrofluidischen Vorrichtung, da Platz für eine Aufnahme und Vorlagerung und dadurch Material eingespart werden können.
Gemäß einer bevorzugten Weiterbildung der Erfindung umfasst die Aufreinigung der Nukleinsäuren nach dem Binden an den Filter ein Waschen des Filters mit einem zweiten Teil des Waschpuffers. Dies hat den Vorteil, dass auf dem Filter oder in der Filterkammer verbliebene Substanzen, beispielsweise Zell- und Proteinreste und insbesondere auch Salze und Fällungsagenzien, entfernt werden und damit das weitere Verfahren nicht nachteilig beeinflussen können. Insbesondere können dadurch Substanzen entfernt werden, welche die Durchführung einer Polymerase- Kettenreaktion negativ beeinflussen würden. Bei dem ersten Teil und dem zweiten Teil des Waschpuffers kann es sich vorzugsweise um zwei Teile des gleichen Waschpuffers handeln.
Gemäß einer bevorzugten Weiterbildung des Verfahren werden die Nukleinsäuren vom Filter unter Verwendung eines Elutionspuffers eluiert. Bei dem Elutionspuffer kann es sich dabei um einen in der Mikrofluidik typischen Puffer zur Elution von Nukleinsäuren handeln, beispielsweise gepufferte Niedrigsalzlösungen mit neutralem bis leicht alkalischem pH-Wert (zum Beispiel TE-Puffer 10 mM TRIS/CI pH 8, 1 mM EDTA) oder destilliertes Wasser.
In einer besonders vorteilhaften Weiterbildung des Verfahrens erfolgt nach dem Binden, insbesondere nach der Elution eine Vervielfältigung von Teilen der Nukleinsäuren, vorzugsweise mit Hilfe einer (quantitativen Echtzeit-) Polymerase- Kettenreaktion, einer isothermale Amplifikation oder einer Ligase- Kettenreaktion. Unter einem Teil der Nukleinsäuren kann dabei ein Abschnitt, auch Sequenz genannt, einer Nukleinsäure verstanden werden, beispielsweise ein DNA- oder RNA-Abschnitt. Anschließend oder parallel zur Vervielfältigung kann über eine Detektion der vervielfältigten Teile ein Nachweis dieser Teile und damit der zugehörigen Organismen erfolgen, beispielsweise unter Zuhilfenahme von (Fluoreszenz-)Spektroskopie.
Gegenstand der Erfindung ist auch ein mikrofluidisches Kit oder mikrofluidisches System umfassend eine mikrofluidische Vorrichtung und ein Transportmedium, wobei das Transportmedium chaotrope Substanzen zur Freisetzung von Nukleinsäuren aus einer Probe enthält und wobei die Vorrichtung eingerichtet ist, einen ersten Teil eines Waschpuffers mit dem Transportmedium zur Einstellung von Bindebedingungen für ein Binden der freigesetzten Nukleinsäuren an einen Filter der Vorrichtung zu vermischen. Der Waschpuffer kann dabei in der mikrofluidischen Vorrichtung vorgelagert sein. Bei dem Transportmedium kann es sich um ein Medium wie oben erläutert handeln, insbesondere um eNAT™ oder cobas®. Unter dem mikrofluidischen Kit kann insbesondere die mikrofluidsche Vorrichtung gemeinsam mit dem Transportmedium verstanden werden, wobei sich das Transportmedium noch nicht in der mikrofluidischen Vorrichtung befinden muss. Das Transportmedium kann beispielsweise in einem Gefäß angeordnet sein, wobei dem Gefäß auch die Probe zum Vermischen mit dem Transportmedium zugegeben werden kann, beispielsweise über das Einführen eines die Probe enthaltenen Tupfers in das Transportmedium.
Bevorzugt sind das Transportmedium und der erste Teil des Waschpuffers in Bezug auf ihre jeweilige Menge, ihre Zusammensetzung und eine Konzentration der chaotropen Substanzen derart aufeinander abgestimmt, dass das Transportmedium zur Freisetzung von Nukleinsäuren aus einer Probe und dass eine Vermischung des Transportmediums mit dem ersten Teil des Waschpuffers zur Einstellung von Bindebedingungen für ein Binden der freigesetzten Nukleinsäuren an den Filter eingerichtet sind Wie oben beschrieben, liegen insbesondere Bindebedingungen vor, wenn das Gemisch eine Konzentration zwischen 1,6 und 2,2 Mol pro Liter an chaotropen Substanzen, vorzugsweise chaotrope Salze, und ganz bevorzugt 150 bis 200 Gramm pro Liter an hochvernetzten Polyalkoholen enthält, wobei es sich bei den hochvernetzten Polyalkoholen vorzugsweise um Polyethylenglycol handelt.
Gemäß einer besonders bevorzugten Ausgestaltung umfasst das Kit, insbesondere die mikrofluidische Vorrichtung, einen zweiten Teil des Waschpuffers, wobei der zweite Teil zum Waschen des Filters und der an den Filter gebundenen Nukleinsäuren ausgebildet ist. Vorzugsweise hat der zweite Teil die gleiche Zusammensetzung wie der erste Teil des Waschpuffers.
Zu weiteren Ausgestaltungen und Vorteilen des mikrofluidischen Kits oder Systems wird auf die obigen Ausführungen zum Verfahren verwiesen.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
Ausführungsbeispiele der Erfindung sind in den Zeichnungen schematisch dargestellt und in der nachfolgenden Beschreibung näher erläutert. Für die in den verschiedenen Figuren dargestellten und ähnlich wirkenden Elemente werden gleiche Bezugszeichen verwendet, wobei auf eine wiederholte Beschreibung der Elemente verzichtet wird.
Es zeigen
Figuren la, lb Ausführungsbeispiele des erfindungsgemäßen Kits und
Figur 2 ein Flussdiagramm eines Ausführungsbeispiels des erfindungsgemäßen Verfahrens.
Ausführungsformen der Erfindung
Figuren la und lb zeigen ein Ausführungsbeispiel des erfindungsgemäßen mikrofluidischen Kits 200, mit welchem das erfindungsgemäße Verfahren 500 beispielsweise durchgeführt werden kann. Figur 2 zeigt ein Flussdiagramm 500 zum folgend beschriebenen Ausführungsbeispiel des erfindungsgemäßen Verfahren 500.
Das mikrofluidischen Kits 200 umfasst eine mikrofluidische Vorrichtung 100, beispielsweise eine mikrofluidische Kartusche 100 als Teil einer Lab-on-a-Chip- Vorrichtung, wie in DE 102016222 075 Al oder DE 102016222 072 Al beschrieben. Eine biologische Probe wird in einem Transportmedium 10 über eine Öffnung 111 in eine Eingabekammer 110 der Kartusche 100 eingebracht. Bei der biologischen Probe kann es sich insbesondere um eine Körperflüssigkeit wie beispielsweise Blut, Sputum, Urin oder ein Abstrich handeln, welche menschliche oder tierische Zellen enthält.
Das Transportmedium 10 enthält chaotrope Substanzen zur Freisetzung der Nukleinsäuren aus den Zellen gemäß einem Schritt 501 des Verfahrens 500. Insbesondere kann es sich bei dem Transportmedium 10 um eNAT™ des Unternehmens COPAN oder cobas® des Unternehmens Roche handeln. Das Transportmedium 10 enthält beispielsweise ca. 3,7 Mol pro Liter (kurz Molar oder M) Guanidiniumthiocyanat als chaotropes Salz und ein Gesamtvolumen von beispielsweise 300 Mikroliter (kurz m/_).
Wie in Figur la dargestellt, umfasst die Kartusche 100 einen Waschpuffer 20, welcher in einer Kammer 120 (kurz Waschpufferkammer 120) der Kartusche 100 vorgelagert sein kann. Bei dem Waschpuffer 20 handelt es sich vorzugsweise um einen Puffer ohne chaotrope Substanzen oder mit einer nur geringen Konzentration chaotroper Substanzen, vorzugsweise mit einer Konzentration von weniger als 0,1 M. Beispielsweise handelt es sich bei dem um einen Waschpuffer ohne Ethanol, wie in EP 2 163 621 Al beschrieben, und beispielsweise umfassend Polyethylenglykol in einer Konzentration zwischen 100 und 600 g/L wie in DE 10 2014211 221 Al beschrieben.
Die Kartusche 100 umfasst ferner einen mit der Eingabekammer 110 und der Pufferkammer 120 fluidisch verbundenen Filter 141, welcher in einer weiteren Kammer 140 (kurz Filterkammer 140) angeordnet sein kann. Gemäß einem zweiten Schritt 502 des Verfahrens 500 werden die freigesetzten Nukleinsäuren an den Filter 141 gebunden, wozu das Transportmedium 10 mit einem ersten Teil 21 des Waschpuffers 20 zur Einstellung von geeigneten Bindebedingungen vermischt und der Filter 141 diesem Gemisch, welcher nun einem Bindepuffer 50 entspricht, für eine Zeitdauer von beispielsweise 15 bis 60 Sekunden ausgesetzt wird, wie in Figur lb dargestellt. Der für die in Kombination mit dem Transportmedium 10 vorgesehene erste Teil 21 des Waschpuffers 10 ist dabei derart ausgebildet oder formuliert, dass er neben der Einstellung der Bindebedingungen nach erfolgter Vermischung mit dem Transportmedium 10 auch für das anschließende Entfernen von chaotropen Substanzen und sonstiger für die nachfolgende Analyse, insbesondere für die Durchführung einer (quantitativen Echtzeit-)Polymerase-Kettenreaktion, hemmender Substanzen in seiner Funktion als Waschpuffer verwendet werden kann. Insbesondere wird der Waschpuffer, wie oben ausgeführt, so ausgestaltet, dass er wenige oder gar keine chaotropen Substanzen und gleichzeitig hochvernetzte Polyalkohole wie beispielsweise Polyethylenglycole zur Unterstützung der Nukleinsäurenfällung enthält (beispielsweise im Umfang von 20 bis 40 % (w/v)), Damit kann der Waschpuffer 20 vorteilhafterweise sowohl, nach Vermischung mit dem Transportmedium 10 als zur Erzeugung des Bindepuffers, für die Bindung, als auch als gewöhnlicher Waschpuffer zum Verdrängen der chaotropen Substanzen in einem Waschschritt verwendet werden.
Als eine Hauptkomponente, die die Bindungseigenschaften für die Bindung der Nukleinsäuren an den Filter 141 mitbestimmt, enthält eNAT™ etwa 3,7 M Guanidiniumthiocyanat als chaotropes Salz. Beispielsweise werden ferner für den Nachweis verschiedenster Pathogene 300 Mikroliter eNAT™ eingesetzt. Die finale Konzentration an chaotropen Salzen für die Bindung der Nukleinsäuren an den Filter 141 sollte zwischen 1,6 und 2,2 M liegen. Durch Verdünnung des eNAT™ mit dem ersten Teil 21 des Waschpuffers 20 werden diese geeigneten Bindungsbedingungen erzielt, wenn der Waschpuffer wie oben beschrieben keine oder wenig chaotrope Substanzen enthält.
In einem vorzugsweise dritten Schritt 503 des Verfahrens 500 werden der Filter 141 und die darauf gebundenen Nukleinsäuren mit einem zweiten Teil 22 des Waschpuffers 20 gewaschen, um Reste des Bindepuffers 50 und andere Substanzen aus der Probe und dem Transportmedium 10, insbesondere verbliebene chaotrope Substanzen, zu entfernen, welche einen nachteiligen Effekt auf das weitere Verfahren hätten.
In einem vierten Schritt 504 des Verfahrens 500 wird ein Elutionspuffer 40 zur Aufhebung der Bindebedingungen und damit zum Lösen der Nukleinsäuren von dem Filter 141 verwendet. Der Elutionspuffer 30 kann dazu in einer weiteren mit der Filterkammer 140 fluidisch verbundenen Kammer 130 (kurz Elutionspufferkammer 130) vorgelagert sein. Bei dem Elutionspuffer kann es sich um einen typischen Puffer zur Lösung von Nukleinsäuren von Silika handeln, beispielsweise um destilliertes oder gepuffertes Wasser, ggf. mit oberflächenaktiven Substanzen, wie beispielsweise Polysorbat 80 (Tween® 80).
Mit dem vierten Schritt 504 ist die Aufreinigung der Nukleinsäuren abgeschlossen und es kann in einem vorzugsweisen fünften Schritt 505 eine weitere Verarbeitung der Nukleinsäuren erfolgen, beispielsweise eine Vervielfältigung von Teilen der Nukleinsäuren mit Hilfe einer (quantitativen Echtzeit-) Polymerase- Kettenreaktion, einer isothermale Amplifikation oder einer Ligase- Kettenreaktion in einer weiteren Kammer 150 (kurz Analysekammer 150) für einen Nachweis der Nukleinsäuren und damit zugehöriger Pathogene in der Probe.

Claims

Ansprüche
1. Verfahren (500) zur Aufreinigung von Nukleinsäuren, insbesondere in einer mikrofluidischen Vorrichtung (100), umfassend die Schritte:
• Freisetzen (501) von Nukleinsäuren aus einer Probe durch chaotrope Substanzen in einem Transportmedium (10).
• Binden (502) der Nukleinsäuren an einen Filter (141), wobei das Transportmedium (10) mit einem ersten Teil (21) eines Waschpuffers (20) zur Einstellung von Bindebedingungen vermischt wird.
2. Verfahren (500) nach Anspruch 1, umfassend ein Waschen (503) des Filters (141) nach dem Binden der Nukleinsäuren mit einem zweiten Teil (22) des Waschpuffers (20).
3. Verfahren (500) nach Anspruch 1 oder 2, wobei nach dem Binden eine Elution (504) der Nukleinsäuren vom Filter (141) unter Verwendung eines Elutionspuffers (30) erfolgt.
4. Verfahren (500) nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei durch das Vermischen des Transportmediums (10) mit dem ersten Teil (21) des Waschpuffers (20) eine Konzentration der chaotropen Substanzen für die Einstellung der Bindebedingungen gesenkt wird
5. Verfahren (500) nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei durch das Vermischen des Transportmediums (10) mit dem ersten Teil (21) des Waschpuffer (20) ein Gemisch mit einer Konzentration von chaotropen Substanzen, vorzugsweise chaotropen Salzen, zwischen 1,6 bis 2,2 Mol pro Liter geschaffen wird.
6. Verfahren (500) nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei durch das Vermischen des Transportmediums (10) mit dem ersten Teil (21) des Waschpuffer (20) ein Gemisch geschaffen wird, das hochvernetzte Polyalkohole, insbesondere Polyethylenglycole, mit einem Anteil von 150 bis 200 Gramm pro Liter des Gemisches aufweist.
7. Verfahren (500) nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei nach dem Binden (502), insbesondere nach der Elution (504) eine Polymerase- Kettenreaktion, eine isothermale Amplifikation oder eine Ligase- Kettenreaktion zur Vervielfältigung von zumindest einem Teil der Nukleinsäuren erfolgt.
8. Mikrofluidisches Kit (200) umfassend eine mikrofluidische Vorrichtung (100) und ein Transportmedium (10), wobei das Transportmedium (10) chaotrope Substanzen zur Freisetzung von Nukleinsäuren aus einer Probe enthält und wobei die Vorrichtung (100) eingerichtet ist, einen ersten Teil (21) eines Waschpuffers (20) mit dem Transportmedium (10) zur Einstellung von Bindebedingungen für ein Binden der freigesetzten Nukleinsäuren an einen Filter (141) der Vorrichtung (100) zu vermischen.
9. Kit (200) nach Anspruch 8, wobei das Transportmedium (10) und der erste Teil (21) des Waschpuffers (20) in Bezug auf ihre jeweilige Menge, ihre Zusammensetzung und eine Konzentration der chaotropen Substanzen derart aufeinander abgestimmt sind, dass das Transportmedium (10) zur Freisetzung von Nukleinsäuren aus einer Probe und dass eine Vermischung des Transportmediums (10) mit dem ersten Teil (21) des Waschpuffers (20) zur Einstellung von Bindebedingungen für ein Binden der freigesetzten Nukleinsäuren an den Filter (141) eingerichtet sind.
10. Kit (200) nach Anspruch 8 oder 9, wobei ein zweiter Teil (22) des Waschpuffers (20) bevorzugt die gleiche Zusammensetzung wie der erste Teil (21) des Waschpuffers (20) aufweist und wobei der zweite Teil (22) zum Waschen des Filters (141) und der an den Filter (141) gebundenen Nukleinsäuren ausgebildet ist.
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Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1566437A1 (de) * 2004-02-20 2005-08-24 Roche Diagnostics GmbH Adsorption von Nukleinsäuren an eine Festphase
WO2007106579A2 (en) * 2006-03-15 2007-09-20 Micronics, Inc. Integrated nucleic acid assays
EP2163621A1 (de) 2008-09-03 2010-03-17 Qiagen GmbH Verfahren zum Isolieren und Reinigen von Nukleinsäuren
DE102014211221A1 (de) 2014-06-12 2015-12-17 Robert Bosch Gmbh Verfahren zur Anreicherung und/oder Aufreinigung von Nukleinsäuren
DE102016222075A1 (de) 2016-11-10 2018-05-17 Robert Bosch Gmbh Prozessiersystem und Verfahren zur Prozessierung einer mikrofluidischen Kartusche mit einer Prozessiereinheit
DE102016222072A1 (de) 2016-11-10 2018-05-17 Robert Bosch Gmbh Vorrichtung und Verfahren zur geneigten Prozessierung von mikrofluidischen Kartuschen

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1566437A1 (de) * 2004-02-20 2005-08-24 Roche Diagnostics GmbH Adsorption von Nukleinsäuren an eine Festphase
WO2007106579A2 (en) * 2006-03-15 2007-09-20 Micronics, Inc. Integrated nucleic acid assays
EP2163621A1 (de) 2008-09-03 2010-03-17 Qiagen GmbH Verfahren zum Isolieren und Reinigen von Nukleinsäuren
DE102014211221A1 (de) 2014-06-12 2015-12-17 Robert Bosch Gmbh Verfahren zur Anreicherung und/oder Aufreinigung von Nukleinsäuren
DE102016222075A1 (de) 2016-11-10 2018-05-17 Robert Bosch Gmbh Prozessiersystem und Verfahren zur Prozessierung einer mikrofluidischen Kartusche mit einer Prozessiereinheit
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Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
OBINO DANIELE ET AL: "An Overview on Microfluidic Systems for Nucleic Acids Extraction from Human Raw Samples", SENSORS, vol. 21, no. 9, 27 April 2021 (2021-04-27), pages 3058, XP055954238, DOI: 10.3390/s21093058 *

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