DE102008032501A1

DE102008032501A1 - Schnelles Analyseverfahren biologischer Mischproben

Info

Publication number: DE102008032501A1
Application number: DE102008032501A
Authority: DE
Inventors: Ralf Dr. Himmelreich; Eva Holzer
Original assignee: Qiagen GmbH
Current assignee: Qiagen GmbH
Priority date: 2008-07-10
Filing date: 2008-07-10
Publication date: 2010-01-14
Also published as: EP2297361A1; WO2010003493A1; US20110177516A1; JP2011527185A

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft ein schnelles Verfahren zur Amplifikation von Nukleinsäuren aus biologischen Proben, die ein Gemisch verschiedener Zellen oder ein Gemisch von Zellen mit verunreinigenden Komponenten enthalten, bei dem solche Zellen in einer Lyselösung (A) lysiert werden und das Lysat unmittelbar anschließend für die Analyse mithilfe eines Nukleinsäure amplifizierenden Verfahrens eingesetzt werden kann.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein schnelles Verfahren zur Amplifikation von Nukleinsäuren aus biologischen Proben, die ein Gemisch verschiedener Zellen oder ein Gemisch von Zellen mit verunreinigenden Komponenten enthalten, bei dem solche Zellen in einer Lyselösung (A) lysiert werden und das Lysat unmittelbar anschließend für die Analyse mithilfe eines Nukleinsäure amplifizierenden Verfahrens eingesetzt werden kann.
Heutzutage besteht ein hoher Bedarf an schnellen analytischen Verfahren, mithilfe derer genetisches Material untersucht und gegebenenfalls Personen zugeordnet werden kann. Voraussetzung für ein solches Analyseverfahren ist, dass das genetische Material in Form isolierter DNA oder RNA dem Analyseverfahren in einer Weise zugänglich gemacht wird, dass eine analysierbare Menge des genetischen Materials in einer Reinheit zur Verfügung gestellt wird, die ausreicht, um das genetische Material analysieren zu können. Eine solche Analyse findet heutzutage üblicherweise mithilfe einer Polymerasekettenreaktion (PCR) statt, durch die das genetische Material amplifziert wird.
Bereits die PCR selbst stellt ein analytisches Verfahren dar, da durch Auswahl spezifischer Primer das Vorhandensein entsprechender Sequenzen auf der isolierten Nukleinsäure identifiziert werden kann, andererseits kann auch das Amplifikat aus der PCR weiter analytisch untersucht werden.
Es ist wünschenswert, ein kostengünstiges zeitsparendes Verfahren für eine solche Analyse anzuwenden, da häufig größere Mengen verschiedener Proben gleichzeitig bearbeitet werden müssen. Die Polymerasekettenreaktion ist unter geeigneten Bedingungen eine hochselektive und sensitive Methode, kann jedoch bei der Wahl ungeeigneter Bedingungen oder Puffersysteme zu unerwünschten Ergebnissen führen.
Die WO 03/102184 A1 beschreibt ein Verfahren zum Abtrennen nukleinsäurehaltiger Zellen aus einer Mischung verschiedener Zellen oder von Zellen mit Verunreinigungen durch Zugabe eines die Zellen „aggregierenden” Mittels („flocculating agent”), das bevorzugt an eine feste Oberfläche gebunden ist und das anschließende Isolieren von Nukleinsäuren aus den gewonnenen Zellen.
Die US 5,523,231 beschreibt die Isolierung von Nukleinsäuren durch unspezifische Anlagerung der Nukleinsäuren an zugesetzte Kügelchen großer Oberfläche („Beads”) durch Kühlen der Probe und anschließendes Ablösen der Nukleinsäure von den Kügelchen.
Die WO 2006/103094 offenbart ein Verfahren zur Isolierung von Nukleinsäuren aus biologischem Material, wobei durch Einsatz von stickstoffhaltigen Verbindungen in dem Lysepuffer eine verbesserte Ausbeute an Nukleinsäuren erhalten wird.
Es war Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein schnelles Verfahren zur genetischen Analyse biologischer Proben bereitzustellen, in denen Zellen im Gemisch mit anderen Zellen oder mit Verunreinigungen vorliegen, das einfach und schnell durchzuführen ist, bei dem ohne Wechsel des Puffersystems das zu untersuchende genetische Material isoliert werden und ein analytisches Verfahren wie beispielsweise eine Polymerasekettenreaktion durchgeführt werden kann.
Diese Aufgabe wird gelöst durch ein Verfahren gemäß Anspruch 1 und eine Lyselösung (A) gemäß Anspruch 4, wobei bevorzugte Ausführungsformen in den Unteransprüchen wiedergegeben sind.
Die Lyselösung (A) der vorliegenden Erfindung ist auf Basis eines Niedrigsalzpufferlösung, die (a) wenigstens ein nichtionisches Tensid enthält, welches die Lyse der Zellwand der zu untersuchenden biologischen Probe unterstützt und Proteinaggregate auflöst. Hierfür ist grundsätzlich jedes nichtionische Tensid geeignet, welches keinen negativen Einfluss auf die zu untersuchenden Nukleinsäuren hat, bevorzugt werden Tween 20, Tergitol, Triton X-100; Brij-58 und Nonidet-P40 verwendet.
Die Konzentration des nichtionischen Tensids in der eingesetzten Lyselösung (A) beträgt zwischen 0,05 und 5%, bevorzugt zwischen 0,1 und 2%, weiter bevorzugt zwischen 0,2 und 0,8%
Bestandteil (b) der Lösung (A) ist wenigstens ein als Binde- und Verdickungsmittel wirkendes Polymer. Das Polymer wird eingesetzt, um eine Inhibition der nachfolgenden analytischen Verfahren durch durch das unspezifische Komplexieren von potentiellen Inhibitoren zu verhindern. Derartige polymer-basierende Binde- und Verdickungsmittel sind in der Fachwelt bekannt. Bevorzugt im Sinne der Erfindung sind jedoch Polyvinylpyrrolidon, Polyoxazolin, Polyethylenglycol, Polyvinylalkohol; Luvitec (BASF),. Dieses Polymer wird in die Lösung (A) in einer Konzentration im Bereich von 0,05 bis 0,5%; bevorzugt 0,1%–0,2% eingesetzt.
Als weiterer Bestandteil (c) kann in die Lyselösung eine Proteinase eingesetzt werden, bevorzugt wird eine thermophile Proteinase eingesetzt, besonders bevorzugt eine thermophile Proteinase, ausgewählt aus Proteinase K oder Subtilisin. Ganz besonders bevorzugt wird eine thermophile Proteinase K in der Lyselösung verwendet. Die Proteinase wird bevorzugt in einer Menge eingesetzt, dass sie 0,5 bis 10 μUnits, bevorzugt 1,5 bis 4 μUnits (internationale Einheiten) pro Milliliter Lyselösung bereitstellt.
Weitere Bestandteile der Lösung (A) ist eine pH Puffersubstanz mit der Konzentration von 10–20 mM aus der Gruppe Tris; MOPS; HEPES; oder Phosphat. Der pH Wert wird bevorzugt auf 7,5–11 eingestellt. Besonders bevorzugt liegt der pH bei 9.0.
Zusätzlich kann zur Inaktivierung von Nukleinase ein Chelator für divalente Kationen eingesetzt werden. Diese Chelatoren werden in Konzentrationen von 1 mM eingesetzt und werden aus der Gruppe EDTA und EGTA gewählt.
In dem Verfahren zur Analyse der Nukleinsäuren werden in Schritt (i) zunächst die nukleinsäurehaltigen Zellen aus Blut angereichert. Hierzu stehen dem Fachmann verschiedene Verfahren zur Verfügung, die als solche in der Fachwelt grundsätzlich bekannt sind.
Zu solchen geeigneten Verfahren zählen beispielsweise das Lysieren oder Zerstören unerwünschter Zellen im Gemisch, die Zugabe von Oberflächen, an die die zu lysierenden Zellen oder die verunreinigenden Komponenten absorbieren oder binden, Filtration, Sedimentation, eine Selektion oder durch Zentrifugation, oder eine Kombination von mehreren dieser Verfahren, ohne auf diese beschränkt zu sein. Das bevorzugte Ziel dieses Schrittes (i) ist es, die Zellen, die genetisches Material enthalten, von sonstigen Zellen oder verunreinigenden Komponenten zu trennen, bzw. sie gegenüber den sonstigen Komponenten anzureichern.
Als Ausgangsmaterialien, die in das erfindungsgemäße Verfahren eingesetzt werden können, dienen Proben, die neben nukleinsäurehaltigen Zellen noch andere Zellen oder sonstige verunreinigende Komponenten beinhalten. Beispiele für solche biologische Proben sind Vollblut, „Buffy Coats”, Gemische aus Blut mit anderen Materialien, wie z. B. Gewebe, Sperma, Lymphe, Urin, Fäkalien oder ähnliches, sowie Stanzen aus sogenannten Blutkarten. Das erfindungsgemäße Verfahren ist besonders geeignet, wenn es bevorzugt ist, die Zellen, die genetisches Material tragen, von anderen Zellen oder verunreinigenden Komponenten abzutrennen.
In einer bevorzugten Ausführungsform gemäß der Erfindung wird Blutproben zunächst ein Erythrozyten-Lysepuffer (B) zugesetzt, so dass die Erythrozyten in der Probe lysiert werden. Anschließend werden die verbliebenen weißen Blutzellen durch Zentrifugation aus dem Lyseansatz abgetrennt. Der Überstand wird verworfen und die weißen Blutkörperchen stehen der weiteren Bearbeitung unmittelbar zur Verfügung.
Der Lysepuffer (B) dient ausschließlich der Lyse von in Blut enthaltenen Erythrozyten. Hierfür kann jeder in der Fachwelt bekannte Erythrozyten- Lysepuffer verwendet werden, ohne dass die Erfindung hierdurch beschränkt wird. Bevorzugt wird als Lysepuffer ELB1 (320 mM Saccharose; 50 mM Tris/Cl pH 7.5; 5 mM MgCl₂; 1% Triton X-100) oder ELB2 (155 mM NH₄Cl; 10 mM; KHCO₃) eingesetzt.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform wird die Probe mit einer Oberfläche in Kontakt gebracht, an die die zu lysierenden Zellen adsorbieren oder binden. Die übrigen Bestandteile der Probe werden danach durch ein Separationsverfahren weitgehend entfernt. Die Probe wird hierfür mit geeigneten Oberflächen in Kontakt gebracht, an die die Zellen adsorbieren oder binden. Beispiele für Oberflächen, die hierfür geeignet sind, sind kleine Kügelchen, sogenannte Beads, beispielsweise aus Glas, Silica, Polymeren oder beschichtete Beads, bevorzugt magnetische Beads. Es ist aber auch möglich die Oberflächen der Verbrauchsmaterialien wie z. B. Reaktionsgefäße, -Filter, Filtersäulen, Spin-Filtersäulchen, Membranen, Fritten, Glasfasergewebe, Schalen, Röhrchen, (Pipetten)Spitzen oder Wells von Multiwellplatten für die Bindung zu modifizieren. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform werden magnetische Beads verwendet.
Bei der Erythrozytenlyse kann eine Oberfläche in Form von modifizierten Magnetpartikeln eingebracht werden. Die weißen Blutzellen adsorbieren an die Oberflächen und können durch Magnetseparation angereichter werden.
Kügelchen, die für das vorliegende Verfahren geeignet sind, können jeden Typ von bisher bekannten magnetischen Kügelchen umfassen, bei denen ein magnetischer Kern mit einer Glas- oder Polymerbeschichtung überzogen ist, und auf ihrer Oberfläche Gruppen tragen, die eine unspezifische Anlagerung oder Bindung von nukleinsäurehaltigen Zellen an die Kügelchen ermöglichen. Bevorzugt können solche Kügelchen eingesetzt werden, die auf ihrer Oberfläche hydrophil sind, beispielsweise Säuregruppen tragen, bevorzugt Carbonsäuregruppen, Phosphorsäuregruppen oder Schwefelsäuregruppen oder deren Salze, insbesondere bevorzugt Carbonsäuregruppen oder deren Salze, wobei die genannten Gruppen unmittelbar an die Oberfläche gebunden sein können, oder Teil des die Oberflächenbeschichtung bildenden Polymers sein können, über Spacer-Moleküle an die Oberfläche gebunden sein können, oder Teile einer Verbindung sein können, die an die Oberfläche der Kügelchen gebunden sind. In einer bevorzugten Ausführungsform tragen die Kügelchen auf ihrer Oberfläche eine insgesamt schwach negative Gesamtladung, da bei Vorliegen solcher Bedingungen die Zellen besonders wirksam gebunden werden. Eine neutrale bis schwach positive Ladung der Kügelchen ist ebenfalls möglich, wenn auch für das vorliegende Verfahren nicht bevorzugt. Beispiele für geeignete carboxylierte Polymere, die als Beschichtungsmaterial für die Kügelchen geeignet sind und eine für die Erfindung geeignete Oberfläche bereitstellen sind in der deutschen Patentanmeldung DE 10 2005 040 259.3 im Detail beschrieben. Beispiele für Verbindungen, die an die Oberfläche gebunden sein können, sind Glycin, Hydrazin, Asparaginsäure, 6-Aminocapronsäure, NTA (Nitrilotriacetic acid), ,Polyacrylsäure (PAA), Glycerin, Diglyme (Diethylene Glycol Dimethyl Ether), Glyme (Dimethoxyethane), Pentaerythritol, Toluol, oder Kombinationen davon, ohne auf diese beschränkt zu sein. Ebenfalls bevorzugte magnetische Kügelchen sind solche, wie sie in der deutschen Patentanmeldung DE 10 2005 058 979.9 beschrieben sind. Solche geeigneten magnetischen Kügelchen sind auf dem Markt erhältlich.
Weitere Beispiele geeigneter Beads sind Silicabeads, wie z. B. MagAttract Suspension-B, MagAttract Suspension-G (alle von Qiagen).
Die Zellen werden mit den magnetischen Kügelchen ausreichend lange in Kontakt gebracht, d. h. über eine Zeitdauer, die ausreicht, um die Zellen an die Kügelchen binden/sich anlagern zu lassen. Eine solche Zeitdauer sollte mindestens 30 s, bevorzugt mindestens 1 min, weiter bevorzugt mindestens 3 min sein.
Nach der Anlagerung/Bindung der Zellen an die magnetischen Partikel lassen sich die Zellen durch Anlegen eines Magnetfeldes an das Gefäß, in dem sich die Zellen mit den Kügelchen befinden, aus dem die Zellen umgebenden Medium sammeln, bzw. abtrennen. In einer bevorzugten Ausführungsform wird ein Magnet außen an das Gefäß angelegt, in dem sich die Zellen und die Magnetkügelchen befinden und der verbleibende Rest der Probe wird aus dem Gefäß entfernt, beispielsweise abgegossen oder mit Hilfe einer geeigneten Vorrichtung entfernt, beispielsweise mit Hilfe einer Pipette abgezogen. Die Magnetpartikel mit den Zellen können optional in einem geeigneten Waschmedium resuspendiert und dadurch gewaschen werden, wonach wiederum ein Magnetfeld an das Gefäß angelegt wird und das Waschmedium wiederum aus dem Gefäß entfernt wird. Das vorliegende Verfahren stellt dadurch einen besonders schonenden Umgang mit den Zellen bereit.
Nach der Anreicherung der zu lysierenden nukleinsäurehaltigen Zellen in Schritt (i) werden diese Zellen in Schritt (ii) mit einer Lyselösung (A) in Kontakt gebracht, die oben detailliert beschrieben ist. Nach Kontakt der Zellen mit der Lyselösung (A) wird dieser Lyseansatz in Schritt (iii) für eine Zeitdauer von 1 Minute bis 3 Stunden, bevorzugt 2 Minuten bis 1 Stunde, weiter bevorzugt 5 bis 20 min bei einer Temperatur von Raumtemperatur bis unterhalb 100°C, bevorzugt bei wenigstens 60°C, weiter bevorzugt bei wenigstens 70°C und besonders bevorzugt zwischen 75 und 80C inkubiert. Alternativ lässt sich eine zweistufige Inkubation vornehmen. So könnte beispielsweise erst 10 min bei 56°C und nachfolgend 5 min bei 80°C inkubiert werden.
Nach dem Inkubationsschritt (iii) kann in einem optionalen Schritt (iv) der Lyseansatz zentrifugiert werden, um unlösliche Zellbestandteile von den Nukleinsäuren zu trennen, jedoch ist ein solcher Schritt nicht notwendigerweise erforderlich. Wenn wie oben beschrieben Magnetpartikel bei der Erythrozytenlyse zum Einsatz kommen, kann man vor der Entnahme des Lysats zur nachfolgenden Nachweisreaktion eine Magnetseparation vornehmen, um den Übertrag an Magnetpartikeln zu vermeiden.
Beads können im Ansatz verbleiben sollten jedoch bevorzugt möglichst nicht in die Nachweisreaktion verschleppt werden. DNA und RNA liegt frei im Lysat vor, denn das Lysat hat keine Eigenschaften, die eine Nukleinsäurebindung an die Beads unterstützen.
In einem weiteren Schritt (v) werden die so erhaltenen Nukleinsäuren mit einem die Nukleinsäuren amplifizierenden Verfahren vervielfacht. Solche Verfahren sind in der Fachwelt gut bekannt und für die Erfindung nicht limitierend. Ein bevorzugtes Beispiel für ein solches Verfahren ist eine Polymerasekettenreaktion (PCR), gegebenenfalls mit einer vorgeschalteten reversen Transkription (RT-PCR). Die Amplifikation kann mit spezifischen oder unspezifischen Primern erfolgen. Durch die Verwendung mit spezifischen Primern kann entweder eine oder mehrere spezifische Gensequenz(en) aus dem genetischen Material heraus verstärkt werden, oder bei Verwendung von spezifischen Primern gemäß internationalem Standard ein genetischer Fingerabdruck erstellt werden. Darüber hinaus können auch unspezifische Primer verwendet werden, wenn ein Vergleich einer bekannten Probe mit einer unbekannten Probe durchgeführt wird, um den Ursprung der unbekannten Probe zu erforschen.
Die für das Verfahren verwendeten Komponenten können in Form eines Kits bereitgestellt werden, was die Durchführung des Verfahrens vereinfacht. Ein solcher Kit enthält wenigstens die Lyselösung (A) oder deren Ausgangsmaterialien, also die Komponenten (a), (b) und (c) und gegebenenfalls den Niedrigsalzpuffer und eine Anleitung wie und in welchen Mengenverhältnissen diese zusammenzugeben sind, und bevorzugt entweder einen Lysepuffer (B) oder eine feste Oberfläche, an die entweder die zu lysierenden Zellen oder verunreinigende Komponenten adsorbieren oder binden. Außerdem kann der Kit Komponenten enthalten, die für die Durchführung einer PCR geeignet sind.
Ein Vorteil des vorliegenden Verfahrens ist es, dass in wenigen Schritten aus einem Zellgemisch oder einem Gemisch aus verunreinigenden Komponenten mit Zellen, die genetisches Material tragen, genetisches Material in einer Qualität erhalten werden kann, so dass es unmittelbar in einem Amplifikationsverfahren eingesetzt werden kann. Dies erlaubt das gleichzeitige Behandeln einer großen Probenmenge verschiedener Proben zum Untersuchen des darin enthaltenen genetischen Materials, beispielsweise in der Forensik, bei der Identifikation von Personen oder der Zuordnung von Proben, die genetisches Material enthalten, zu Personen, von denen dieses Material stammt.
Ein weiterer Vorteil des hier beschriebenen Verfahrens ist, dass aufgrund der wenigen Bearbeitungsschritte eine Verunreinigung der Proben minimiert werden kann, da insbesondere die gesamte Aufarbeitung der Proben in denselben Gefäßen erfolgt, so dass ein Überführen der zu analysierenden Proben nicht erforderlich ist.
Abbildungen
1 Ergebnisse einer H18 Real Time PCR: Dargestellt sind die gemittelten C(t) Werte von jeweils vier unabhängigen Präparationen mit einer Variante an Lösung (A).
2 β-Actin Real Time PCR Ergebnisse von zwei verschieden Spender Blutproben (Donor 1 und 2) mit verschiedenen Anticoagulantien nummeriert von 1–6 im Vergleich zu QIAamp Blood Mini präparierten Kontrollen (nur mit Anticoagulant 1 durchgeführt; markiert als „1 QA”).
Legende der Anticoagulantien/Blutsammelsysteme: 1) Sarstedt (Monovette) EDTA KE/9 mL; 2) Sarstedt (Monovette) Li-Heparin LH/7,5 mL; 3) Sarstedt (Monovette) Coagulation 9 NC/10 mL; 4) B-D Vacutainer K2E 18 mg/10 mL; 5) B-D Vacutainer 9NC 0,105 M/9 mL; 6) B-D Vacutainer K3E 15% 0,12 mL/10 mL
Beispiele
Beispiel 01 Blut Protokoll im Zweischritt-Verfahren mit Zentrifugation
Blut wird mit einem Erythrozyten Lysepuffer versetzt – wodurch die roten Blutzellen sofort lysieren. Weiße Blutzellen bzw. deren Zellkerne und/oder Mitochondrien werden mittels Zentrifugation präzipitiert. Nach den Waschen der Sediment werden diese mittels Lösung (A) lysiert. Das Lysat kann direkt in PCR Reaktionen eingesetzt werden.

Bei der praktischen Durchführung werden 200 μl Blut zusammen mit 600 μl Erythrozytenlysepuffer (106 mM Saccharose, 16 mM Tris/Cl pH 7.5, 1,6 mM MgCl₂ 0,33% Triton X-100) in ein 1,5 ml Mikroreaktionsgefäß gegeben. Nach dem Verschließen wird das Gefäß 5-mal „über Kopf” gewendet, um die Flüssigkeiten zu vermischen. Nun wird das Gefäß für 20 Sekunden bei 10000 × g zentrifugiert und der Überstand verworfen. Das Sediment wird mit 400 μl Waschpuffer (80 mM Saccharose, 12,5 mM Tris/Cl pH 7.5, 1,25 mM MgCl₂ 0,25% Triton X-100) resuspendiert und erneut durch Zentrifugation (20 sec bei 10000 × g) präzipitiert. Nun wird das Sediment in Lösung (A) resuspendiert und bei 80°C und 1400 rpm für 5 min in einem Eppendorf Thermomixer inkubiert. Das Lysat ist fertig und kann direkt eine PCR eingesetzt werden. Rezepturen der Lösung (A)

A1	A2	A3	G7
0,1% PVP	0,1% PVP	0,1% PVP	-
-	₀ _, _45% _Tween-20	0,45% Tween-20	0,2% Tween 20
0,45% NP-40	-	0,45% NP-40	1 mM EGTA
10 mM Tris pH 7,5	10 mM Tris pH 7,5	-	1 mM EDTA
1 mM EDTA	1 mM EDTA	1 mM EDTA	20 mM Tris pH 10.5
Die Lösungen werden komplettiert durch die Zugabe von 0,5 μl Proteinase K auf 200 μl Puffer

Quantitative PCR (spezifisch für das humane H18 Gen)
Die für H18 spezifische Real Time PCR wurde mit 12,5 μl QIAGEN QuantiTect Probe PCR Mastermix, 0,10 μl H18 Forward Primer (100 μM), 0,10 μl H18 Reverse (100 μM), 0,05 μl H18 Probe (100 μM), 8,75 μl bidest. Wasser und 4,0 μl Lysat-Aliquots durchgeführt. Die Temperaturzyklen waren 15 Minuten bei 95°C und 40 × (15 Sekunden 95°C, 1 Minute bei 60°C). Die Amplifikation wurde jeweils mit Eluaten von 4 einzelnen Nukleinsäurepräparationen durchgeführt.
Ergebnis
Die Ergebnisse der Real Time PCR in 1 beweisen deutlich, dass die Methode sehr gut funktioniert. Ein Aspekt bezüglich der Zusammensetzung des Lösung (A) scheint das Einhalten des pH-Wert Bereichs zu sein. Bei einer ungepufferten Lösung (A)-Variante (A3) wird das Ergebnis deutlich schlechter, während sich bei pH 10,5 (A4) das Ergebnis deutlich verbessert.
Beispiel 02 Blut Protokoll im Zweischritt-Verfahren mit MagBeads
Blut wird mit einem Erythrozyten Lysepuffer versetzt, der gleichzeitig Magnetpartikel mit carboxylierten Oberflächen enthält. Die roten Blutzellen lysieren sofort und die weißen Blutzellen bzw. deren Zellkerne und/oder Mitochondrien binden an die Magnetpartikel und werden mittels Magnetseparation angereichert. Nach dem Waschen der an die Magnetpartikel gebundenen Zellen/Zellfraktionen werden diese mittels Lösung (A) lysiert. Das Lysat kann nach Magnetseparation direkt in PCR Reaktionen eingesetzt werden. Als Vergleichsprozedur wurde das QIAamp Blood Mini Protokoll (QIAGEN GmbH; Hilden) nach Handbuchangaben durchgeführt.
Bei der praktischen Durchführung werden 200 μl Blut zusammen mit 600 μl Erythrozytenlysepuffer (106 mM Saccharose, 16 mM Tris/Cl pH 7.5, 1,6 mM MgCl₂ 0,33% Triton X-100) und 60 μl carboxylierten Magnetpartikel (50 mg/ml) in ein 1,5 ml Mikroreaktionsgefäß gegeben. Nun lässt man das Gefäß für 2 min auf einem Eppendorf Thermomixer bei 1400 rpm schütteln. Das Röhrchen wird in ein Magnetseparations-Gestell gestellt und der Überstand nach vollständiger Separation der Magnetpartikel verworfen. Das Magnetsediment wird nach Zugabe von 500 μl Waschpuffer (80 mM Saccharose, 12,5 mM Tris/Cl pH 7.5, 1,25 mM MgCl₂ 0,25% Triton X-100) durch kurzes vortexen resuspendiert und erneut wird der Überstand nach Magnetseparation verworfen. Nun wird das Sediment in 75 μl Lösung (A) (0,1% PVP, 0,45% Tween-20, 0,45% NP-40, 10mM Tris/CL pH 7,5, 1 mM EDTA) und 0,5 μl Proteinase K resuspendiert und bei 80°C und 1400 rpm für 5 min in einem Eppendorf Thermomixer inkubiert. Das Lysat ist fertig und kann direkt eine PCR eingesetzt werden. Vor der Entnahme wird das Röhrchen bevorzugt auf ein Magnetseparations-Gestell platziert, um ein Transfer von Magnetpartikeln in die PCR zu vermeiden.
Quantitative PCR (spezifisch für das β-Actin Gen)
Die für β-Actin spezifische Real Time PCR wurde mit 12,5 μl QIAGEN QuantiTect Probe PCR Mastermix, 0,10 μl β-actin Forward Primer (100 μM), 0,10 μl β-Actin Reverse Primer (100 μM), 0,05 μl β-Actin Probe (100 μM), 8,75 μl bidest. Wasser und 4,0 μl Lysat-Aliquots durchgeführt. Die Temperaturzyklen waren 15 Minuten bei 95°C und 40 × (15 Sekunden 95°C, 1 Minute bei 60°C). Die Amplifikation wurde jeweils mit Eluaten von 4 einzelnen Nukleinsäurepräparationen durchgeführt.
Ergebnisse
Die Konzentration der präparierten DNA ist vergleichbar mit den mit QIAamp gereinigten Proben. Die Schwankungen der ermittelten Konzentration sind bedingt durch die Blutspender und das verwendete Blutsammelröhrchen mit dem unterschiedlichen Anticoagulant als „normal” zu bewerten. Neben dem zeitlichen Vorteil in der Durchführung zeigt die im Sinne der Erfindung vorgestellte Methode vergleichbare Ergebnisse zu etablierten Referenzmethoden.
ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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Zitierte Patentliteratur

- WO 03/102184 A1 [0005]
- US 5523231 [0006]
- WO 2006/103094 [0007]
- DE 102005040259 [0023]
- DE 102005058979 [0023]

Claims

Verfahren zur Analyse von Nukleinsäuren aus biologischen Proben, die ein Gemisch verschiedener Zellen oder ein Gemisch von Zellen mit verunreinigenden Komponenten enthalten, wobei Zellen enthalten sind, die genetisches Material enthalten, dadurch gekennzeichnet, dass (i) nukleinsäurehaltige Zellen angereichert werden (ii) die Zellen aus Schritt (i) mit einer Lyselösung (A) in Kontakt gebracht wird, die wenigstens folgende Bestandteile enthält: (a) wenigstens ein nichtionisches Tensid, (b) wenigstens ein als Binde- und Verdickungsmittel wirkendes Polymer;; (iii) die Probe in der Lyselösung inkubiert wird; (iv) der Lyseansatz gegebenenfalls zentrifugiert wird; (v) unmittelbar anschließend ein die Nukleinsäuren amplifizierendes Verfahren durchgeführt wird, ohne, dass zwischen Schritt (ii) und Schritt (v) eine Aufreinigung der Nukleinsäuren durchgeführt werden muss.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Lyselösung (A) außerdem (c) eine Proteinase enthält.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Lyselösung (A) außerdem (d) einen Chelator für divalente Kationen enthält.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Lyselösung (A) außerdem (e) eine Puffersubstanz enthält, so dass der pH-Wert 7,5 bis 10,5 beträgt.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Inkubation in Schritt (iii) bei wenigstens 60°C, bevorzugt bei wenigstens 70°C und besonders bevorzugt zwischen 75°C und 80°C durchgeführt wird.
Lyselösung (A) zur Lyse von Zellen einer biologischen Probe, enthaltend (a) wenigstens ein nichtionisches Tensid, (b) wenigstens ein als Bindemittel wirkendes Polymer, und (c) wenigstens eine Proteinase, bevorzugt eine thermophile Proteinase.
Verfahren oder Lösung nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass Bestandteil (a) in Lösung (A) ausgewählt ist aus Tween, Tergitol, Triton X 100, Nonidet, P40, Brij58.
Verfahren oder Lösung nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass Bestandteil (b) in Lösung (A) ausgewählt ist aus Polyvinylpyrrolidon, Polyoxazolin, Polyethylenglycol, Polyvinylalkohol, Luvitec
Verfahren oder Lösung nach einem der Ansprüche 2 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass die Proteinase (c) in Lösung (A) Proteinase K ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass in Schritt (i) die nukleinsäurehaltigen Zellen durch: Lysieren oder Zerstören unerwünschter Zellen; Zugabe von Oberflächen, an die die nukleinsäurehaltigen Zellen oder die verunreinigenden Komponenten adsorbieren oder binden; Zentrifugation; Filtration; Sedimentation; Sezieren; Selektion oder eine Kombination mehrerer dieser Verfahren angereichert werden.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass die biologische Probe Vollblut, Buffy coats, ein Gemisch von Blut mit Urin, Fäkalien, Lymphe oder Gewebe oder eine Stanze aus einer Blutkarte ist und die nukleinsäurehaltigen Zellen, die in Schritt (i) angereichert werden, weiße Blutzellen sind.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, wobei das Amplifizieren der Nukleinsäuren mittels PCR oder RT-PCR erfolgt.
Kit zur Durchführung eines Verfahrens gemäß einem der Ansprüche 1 bis 10, enthaltend wenigstens eine Lyselösung (A) oder deren Komponenten (a), (b) und (c).
Kit gemäß Anspruch 11, außerdem enthaltend einen Lysepuffer (B) oder eine feste Oberfläche, an die entweder die zu lysierenden Zellen oder verunreinigende Komponenten adsorbieren oder binden.