DE202010018524U1

DE202010018524U1 - Blutsammelröhrchen

Info

Publication number: DE202010018524U1
Application number: DE202010018524.6U
Authority: DE
Original assignee: Streck Inc
Current assignee: Streck Inc
Priority date: 2009-01-21
Filing date: 2010-01-20
Publication date: 2017-05-17
Anticipated expiration: 2020-01-21
Also published as: PT2228453T; EP3708676A1; US11634747B2; US20100184069A1; DK2228453T3; DE202010018578U1; ES2617147T3; PL2228453T3; ES2790398T3; EP2228453A1; DK2626438T3; EP2228453B1; EP2626438B1; EP2626438A1; DE202010018545U1; US20240060113A1

Abstract

Blutsammelröhrchen für nichtinvasives pränatales Screening zur Identifizierung fötaler Merkmale, enthaltend: ein Nukleinsäureschutzmittel, welches Glycin, Imidazolidinylharnstoff, Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) und weniger als 1 Gew.-% Formaldehyd enthält; wobei das Schutzmittel verhindert, dass Blutzellen (i) genomische Nukleinsäuren in eine Blutprobe freisetzen und (ii) Nukleaseaktivität erfahren, die fötale Nukleinsäure abbaut.

Description

PRIORITÄTSANSPRUCH
Für die vorliegende Anmeldung wird gemäß §5(1)S.1 GebrMG der für die europäische Patentanmeldung Nr. 13 166 264 (veröffentlicht als EP 2 626 438 A1 ), welche eine Teilanmeldung der europäischen Patentanmeldung Nr. 10 000 518 (veröffentlicht als EP 2 228 453 A1 ) ist, und welche die Priorität des Anmeldedatums der vorläufigen US-Anmeldungen Serien-Nr. 61/146,065, eingereicht am 21. Januar 2009, und 61/227,529, eingereicht am 22. Juli 2009, beansprucht, maßgebende Anmeldetag in Anspruch genommen, wobei diese Anmeldungen hiermit für alle Zwecke voll inhaltlich durch Bezugnahme aufgenommen sind.
GEBIET DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft die pränatale Diagnose fötaler Anomalien und insbesondere die Konservierung fötaler Nukleinsäuren in einer maternen Blutprobe.
STAND DER TECHNIK
Die von Leon et al. 1977 demonstrierte Tatsache, dass zellfreie Plasma-DNA bei Krebspatienten erhöht ist, schuf den Weg für das gegenwärtige Interesse an zellfreier Plasmanukleinsäure bei der Krankheitsdiagnostik. Vor relativ kurzer Zeit wurde von Lo et al. Lancet 350 (1997) 485–487 die Existenz zirkulierender zellfreier fötaler Nukleinsäuren in maternem Plasma nachgewiesen. Seit dieser Arbeit wurde in einer Reihe von Studien demonstriert, dass in maternem Plasma vorliegende zellfreie fötale Nukleinsäuren bei der nichtinvasiven pränatalen Diagnose verwendet werden können.
Die Analyse von Nukleinsäuren können der Vorhersage von Anfälligkeiten von Patienten dienen, indem Chromosomen und entsprechende Gene identifiziert werden, die mögliche krankheitsverwandte Probleme für einen Patienten oder einen Nachkommen eines Patienten darstellen. Die chromosomalen Orte vieler Erbkrankheiten und ebenso der Genotyp bzw. die chromosomale Mutation, der bzw. die der Krankheit entspricht, wurden von der Forschung bereits aufgedeckt. Mit der Bestimmung der genetischen Marker für diese Erbkrankheiten besteht ein Parallelinteresse an der Identifizierung von Patienten, die diese genetischen Merkmale tragen, vor allem wenn sich solche Krankheiten nur bei einem Nachkommen eines Patienten manifestieren. Ferner könnten Erbkrankheiten nur dann ein Kind befallen, falls beide Eltern ein notwendiges Allel tragen. Im Interesse einer Identifizierung des Nachkommen, den möglicherweise ein tödliches oder beeinträchtigendes Erbleiden trifft, sind pränatale Tests immer mehr zur Routine geworden. Allerdings wurden durch die Schwierigkeit bei der Gewinnung des genetischen Materials eines Fötus die Tests für die vielen bekannten genetischen Marker für Erbkrankheiten mit einer Reihe von Barrieren konfrontiert.
Die gründlichsten und genauesten pränatalen Screening-Verfahren für fötale Anomalien beinhalten im Allgemeinen invasive Techniken wie Amniocentese und die Probennahme von Chorion villi. Obgleich sie zuverlässige Ergebnisse liefern, werden diese Verfahrensweisen häufig als Träger eines beträchtlichen potentiellen Risikos von Schwangerschaftskomplikationen aufgrund ihrer invasiven Art betrachtet. In den letzten Jahren führte die Identifizierung fötaler Nukleinsäuren in maternem Blut zu einer umfangreichen Forschung mit einem Schwerpunkt auf der Isolierung solcher fötaler DNA und RNA, um auf eine beliebige Zahl fötaler Anomalien zu testen. Solche Tests werden wünschenswerterweise nur unter Verwendung einer maternen Blutprobe durchgeführt, wodurch die Notwendigkeit der invasiven Testverfahren wegfällt. Unglücklicherweise stellte sich die Isolierung fötaler Nukleinsäuren aus maternen Nukleinsäuren als eine große Herausforderung dar.
Um konsistente und zuverlässige Ergebnisse aus den Tests fötaler Nukleinsäuren in maternem Blut zu erhalten, ist es insbesondere wichtig, sowohl die fötalen Nukleinsäuren von den maternen Nukleinsäuren zu unterscheiden als auch die strukturelle Integrität der fötalen Nukleinsäuren zu bewahren. Traditionell besteht der erste Schritt der Isolierung von zellfreier Nukleinsäure aus Blut in der Gewinnung von entweder Serum oder Plasma und danach der Isolierung der zellfreien Nukleinsäuren im Serum bzw. Plasma. Allerdings eignet sich Serum im Allgemeinen nicht für die Isolierung zellfreier Nukleinsäuren, da Blutgerinnungsvorgänge zelluläre Nukleinsäuren, die zellfreie Plasma-DNA kontaminieren (siehe 1), ebenso wie andere schädliche Stoffe, die die kernhaltigen Blutzellen destabilisieren können, freisetzen. Daher wurden die Bemühungen auch auf Plasma als bevorzugtes Ausgangsmaterial für die Isolierung zellfreier Nukleinsäuren gerichtet. Unter einem solchen Ansatz wurden Anstrengungen unternommen, Plasma von Blut zu trennen, um eine zellfreie Plasmaprobe zu erhalten. Unglücklicherweise handelt es sich hierbei häufig um einen langwierigen und zeitaufwändigen mehrstufigen Prozess, da es wichtig ist, sorgfältig kontrollierte Bedingungen zu verwenden, um ein Aufbrechen der Zellen während der Zentrifugation zu verhindern, wodurch die zellfreien Nukleinsäuren mit zellulären Nukleinsäuren, die während des Aufbrechens freigesetzt werden, kontaminiert werden. Ein weiterer wichtiger Gesichtspunkt ist, dass zelluläre Nukleinsäure aufgrund des Aufbrechens von Zellen während einer ex-vivo-Inkubation im Plasma freigesetzt wird, und zwar typischerweise innerhalb einer relativ kurzen Zeitspanne nach einer Blutentnahme. Sobald die Lyse materner Zellen beginnt, setzen die lysierten maternen Zellen zusätzliche Nukleinsäuren frei, die sich mit den zellfreien fötalen Nukleinsäuren vermischen, und es wird dann zunehmend schwierig, die fötalen Nukleinsäuren für die Tests zu gewinnen. Ferner nehmen die Menge und Gewinnbarkeit verfügbarer zellfreier DNA aufgrund von Abbau (z.B. von Desoxyribonuklease(DNase)- oder Ribonuklease(RNase)-Aktivität) fötaler zellfreier DNA über einen relativ kurzen Zeitraum beträchtlich ab (wodurch der bereits endliche Vorrat an fötaler DNA, der für eine Analyse gewonnen werden kann, verringert wird). Beispielsweise wird erwartet, dass eine unbehandelte Probe nach einem Zeitraum von etwa 36 Stunden hinreichend korrupt ist, dass sie nicht zu einer zuverlässigen oder schlüssigen Analyse führen würde. Somit werden zellfreie Nukleinsäuren wünschenswerterweise isoliert, sobald das Plasma getrennt ist, oder das Plasma kann bei –80°C eingefroren werden, bis die Nukleinsäuren isoliert werden können. Dies bringt ebenfalls praktische Einschränkungen bei der Prozessierung mit sich. Es wäre daher von großem Vorteil, Probenprozessierungstechniken zu entwickeln, mit denen die Menge an fötalen Nukleinsäuren (DNA und/oder RNA), die aus maternem Plasma gewonnen werden können, gesteigert wird, wodurch die Isolierung und das Testen der fötalen Nukleinsäuren zuverlässiger und entsprechend die diagnostischen Möglichkeiten der fötalen Nukleinsäuren verbessert werden.
Zu den allgemein mit der Isolierung zellfreier Nukleinsäuren zusammenhängenden Problemen gehören die zeitaufwändige und mühsame Art herkömmlicher Isolierungsvorschriften sowie die Forderung, dass Blutproben im Bemühen, die Lyse materner Zellen zu vermeiden, sofort verarbeitet werden. Häufig werden materne Blutproben einer sofortigen Behandlung zur Entfernung aller maternen Zellen unterzogen, und das erhaltene Plasma wird eingefroren. Allerdings dauert dieses Verfahren lange, und häufig beginnt die Zelllyse, bevor die Zellen abgetrennt sind. Ferner wirken sich alle Vorschriften zur Abtrennung der maternen Zellen, einschließlich Zentrifugieren der maternen Zellen aus der Probe und Einfrieren des Plasmas, möglicherweise schädigend auf die fötalen Nukleinsäuren aus.
Im Bemühen, diesen Problemen entgegenzutreten und einen Zellabbau zu vermeiden, wurden die Blutproben einer Vorschrift unterzogen, bei der unter anderem die Proben mit Formaldehyd in Kontakt gebracht werden. Formaldehyd wird häufig zur Stabilisierung von Zellmembranen verwendet, und ein Einsatz davon könnte daher die Lyse materner Zellen reduzieren. Man glaubt auch, dass Formaldehyd DNase und RNase hemmt, wodurch die Konservierung und Stabilität der zellfreien fötalen Nukleinsäuren gesteigert wird. Arbeiten von Dhallan et al. JAMA 291 (2004) 1114–1119 konnten eine Abnahme der Zelllyse und einen beträchtlichen Anstieg der Menge an gewinnbaren zellfreien fötalen Nukleinsäuren zeigen. Diesen Daten stehen allerdings andere Arbeiten entgegen, die darauf hindeuten, dass das Formaldehyd nicht den gewünschten Effekt hat. Kürzlich wurde von Zhang et al., Clinical Chimica Acta 397 (2008) 60–64 festgestellt, dass der Effekt von Formaldehyd auf den Prozentanteil fötaler DNA in maternem Plasma von der Prozessierungszeit abhängt, wobei Formaldehyd einen geringen oder keinen Effekt bei Proben hat, die nach 6 Stunden prozessiert werden, jedoch einen beträchtlichen Konservierungseffekt bei Proben aufweist, die nach 36 Stunden prozessiert werden. Insbesondere stellte sich heraus, dass Formaldehyd ausgesetzte und nach 36 Stunden prozessierte Proben eine reduzierte Zelllyse und erhöhte Hemmung von Plasma-DNase-Aktivität aufweisen. Die Verwendung von Formaldehyd für derartige Zwecke wird in den US-Patenten Nr. 7,332,277 und 7,442,506 , hiermit durch Bezugnahme aufgenommen, erörtert.
Das Potential für Unzuverlässigkeit sowie Toxizitätsüberlegungen in Verbindung mit Formaldehydprozessierung machen seine Verwendung für die Konservierung von maternem Plasma nicht wünschenswert. Bei den gegebenen immensen Diskrepanzen bezüglich der Verwendung von Formaldehyd für die Konservierung fötaler DNA-Proben besteht nach wie vor ein Bedarf an einer Prozessierungsvorschrift, mit der eine oder jegliche Kombination von materner Zelllyse und DNase- und/oder RNase-Aktivität in maternen Plasmaproben konsistent reduziert wird. Ferner wird gewünscht, dass eine solche Vorschrift eine erhöhte Probenlagerungszeit vorsieht, so dass Proben einer schwangeren Patientin entnommen werden können und anschließend gelagert oder an einen entfernten Ort zum Testen gesendet werden können, ohne dass eine reduzierte Integrität der fötalen Nukleinsäuren befürchtet werden muss.
Derartige Verfahren für die Stabilisierung, Identifizierung und das Testen fötaler Zellen und/oder Nukleinsäuren, die sich im Blut befinden, sind in einer Reihe von Patentdokumenten behandelt. Siehe allgemein US-Patente Nr. 5,447,842 ; 5,457,024 ; 5,861,253 ; 6,258,540 ; 6,617,170 ; 6,821,789 ; 7,332,277 ; 7,442,506 und US-Patentveröffentlichungen Nr. 2007/0111233 ; 2007/0134658 ; 2007/0202525 ; 2008/0020390 und 2008/0108071 , jeweils hiermit durch Bezugnahme aufgenommen. Ferner ist bereits eine beträchtliche Menge an akademischer Forschung in Bezug auf fötale zellfreie DNA und damit zusammenhängende Themen veröffentlicht worden.
Trotz des oben Gesagten besteht nach wie vor ein Bedarf an Methoden zur Isolierung und Konservierung fötaler Nukleinsäuren, die vereinfacht und weniger zeitaufwändig sind. Ferner ist es wünschenswert, dass mit diesen Methoden die Menge an gewonnener fötaler DNA und RNA aus maternem Plasma erhöht wird (z.B. verglichen mit Methoden, bei denen die vorliegenden Lehren nicht eingesetzt werden), während die Integrität der DNA und RNA beibehalten wird und zuverlässige diagnostische Ergebnisse produziert werden. Bemühungen zur Erhöhung der Zuverlässigkeit und Konsistenz der Analyse fötaler Nukleinsäuren umfassen eine Behandlung einer maternen Blutprobe, so dass die Menge an gewonnener lebensfähiger fötaler DNA und/oder RNA erhöht wird. Die Konzentration in Proben von maternem Plasma gefundener zellfreier fötaler DNA zum Zeitpunkt der Blutentnahme liegt im Allgemeinen im Bereich von 3,4% bis 6,2% der Gesamtmenge der zellfreien DNA, die im Plasma vorliegt, je nach Dauer der Gestation.
Die vorliegende Erfindung behandelt den Bedarf an einem effizienten und konsistenten Verfahren zur Konservierung und zum Testen fötaler Nukleinsäuren von innerhalb maternen Plasmas. Indem ein verbessertes Verfahren zur Reduzierung der Lyse materner Zellen und von Nukleaseaktivität bereitgestellt wird, umfasst die vorliegende Erfindung eine Vorschrift, mit der die Menge an gewinnbaren fötalen Nukleinsäuren erhöht wird, wodurch die diagnostische Zuverlässigkeit der fötalen Nukleinsäuren verbessert wird. Die vorliegende Erfindung hilft bei der Vorbeugung einer Kontamination zellfreier Plasmanukleinsäuren mit zellulären Nukleinsäuren, die aus geschädigten Zellen freigesetzt werden. Die vorliegende Erfindung hilft ferner bei der Hemmung von Nukleaseaktivität zum Schutz der Integrität der zellfreien Plasmanukleinsäure. Durch die Stabilisierung der kernhaltigen Blutzellen in einer Blutprobe ist es nicht mehr notwendig, Plasma sofort nach der Blutentnahme abzutrennen. Ferner kann die vorliegende Erfindung gestatten, dass Blutproben bei Raumtemperatur bis zu etwa 14 Tage gelagert werden, ohne dass sich dies negativ auf die Integrität der im Plasma vorliegenden zellfreien Nukleinsäuren auswirkt und ohne Kontaminieren der Probe mit aus lysierten Zellen stammenden zellulären Nukleinsäuren. Mit der vorliegenden Erfindung kann es auch möglich sein, ein Einfrieren des Plasmas und/oder den Kontakt mit Formaldehyd gänzlich zu vermeiden.
Ein Vorteil der vorliegenden Erfindung besteht in der Möglichkeit für eine im Wesentlichen gleichzeitige Stabilisierung sowohl der kernhaltigen Blutzellen als auch der zellfreien Nukleinsäuren. Dies hilft dabei, die Freisetzung zellulärer genomischer Nukleinsäuren (z.B. materner zellulärer genomischer Nukleinsäuren) in das Plasma zu verhindern und die interessierenden fötalen Nukleinsäuren (und assoziierten Biomarker) weiter zu verdünnen, während ebenso die strukturelle Integrität der fötalen Nukleinsäuren aufrechterhalten wird. Ein zusätzlicher möglicher Vorteil der vorliegenden Erfindung liegt in ihrer Fähigkeit, relative Mengen fötaler Nukleinsäuren zu erhalten. In vivo findet eine konstante Erneuerung der fötalen Nukleinsäuren statt, so dass eine gleichbleibende Menge an fötalen Nukleinsäuren beibehalten wird, doch sinken nach einer Blutentnahme die Mengen an fötaler Nukleinsäure ohne eine Wiederauffüllung. Die Lehren der vorliegenden Erfindung sehen auch die Möglichkeit vor, den Abbau der fötalen Nukleinsäuren nach der Blutentnahme zu stoppen.
KURZE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
In einem ersten Aspekt sieht die vorliegende Erfindung ein nichtinvasives pränatales Screening-Verfahren zur Identifizierung fötaler Merkmale vor. Dabei umfasst das Verfahren die folgenden Schritte: Inkontaktbringen einer entnommenen maternen Blutprobe, die mehrere Blutzellen enthält, mit einem Nukleinsäureschutzmittel in einer Menge und über eine Zeit, die hinreicht, so dass im Wesentlichen verhindert wird, dass die Blutzellen (i) genomische Nukleinsäuren in die Blutprobe freisetzen und (ii) Nukleaseaktivität erfahren, die fötale Nukleinsäure abbaut; Isolieren fötaler Nukleinsäuren aus der maternen Blutprobe; und Analysieren der isolierten fötalen Nukleinsäuren zur Identifizierung eines fötalen Merkmals.
Das Nukleinsäureschutzmittel kann ein Formaldehydfreisetzer-Konservierungsmittel enthalten, wie etwa eines, das aus der aus Diazolidinylharnstoff, Imidazolidinylharnstoff, Dimethoylol-5,5-dimethylhydantoin, Dimethylolharnstoff, 2-Brom-2-nitropropan-1,3-diol, Oxazolidinen, Natriumhydroxymethylglycinat, 5-Hydroxymethoxymethyl-1-1aza-3,7-dioxabicyclo-[3.3.0]octan, 5-Hydroxymethyl-1-1aza-3,7-dioxabicyclo-[3.3.0]octan, 5-Hydroxypoly[methylenoxy]methyl-1-1aza-3,7-Dioxabicyclo[3.3.0]octan, quartärem Adamantin und einer beliebigen Kombination davon bestehenden Gruppe ausgewählt ist. Die Konzentration des Konservierungsmittels vor dem Kontaktierungsschritt kann zwischen etwa 0,1 g/ml und etwa 3 g/ml liegen. Die Konzentration des Konservierungsmittels vor dem Kontaktierungsschritt kann zwischen etwa 0,4 g/ml und etwa 0,8 g/ml liegen. Bei der Konzentration des Konservierungsmittels vor dem Kontaktierungsschritt kann es sich um eine Konzentration handeln, bei der eine Quervernetzung von Nukleinsäuren und Proteinen beobachtet wird, die anhand einer Agarose-Gelelektrophorese gezeigt wird. Die Menge des Konservierungsmittels in einer behandelten Probe kann weniger als etwa 20 mg/ml Blutprobe betragen.
Der Isolierungsschritt kann das Isolieren von Nukleinsäure aus maternem Plasma und Isolieren der fötalen Nukleinsäure in Abwesenheit einer Zelle beinhalten. Der Isolierungsschritt oder/und der Analyseschritt kann bzw. können wenigstens 2 Stunden, 7 Tage oder sogar 14 Tage nach Entnahme der Blutprobe erfolgen. Der Isolierungsschritt oder/und der Analyseschritt kann bzw. können ohne und/oder vor Einfrieren der Blutprobe oder eines ihrer Bestandteile (z.B. auf eine Temperatur, die kälter als etwa –30°C (stärker bevorzugt kälter als etwa –70°C) ist) erfolgen.
Bei der fötalen Nukleinsäure kann es sich um DNA oder/und RNA handeln. Der Analyseschritt oder/und der Isolierungsschritt kann bzw. können einen Schritt des Inkontaktbringens der fötalen Nukleinsäure mit einem Enzym oder/und einem Verstärker umfassen. Der Kontaktierschritt kann in einem Blutsammelröhrchen, in das die Blutprobe gezogen wird, stattfinden (z.B. während die Blutprobe in ein Blutsammelröhrchen kommt). Der Kontaktierschritt kann während der Entnahme der Blutprobe stattfinden. Der Kontaktierschritt kann so hinreichen, dass nach einem Zeitraum von wenigstens 7 Tagen (oder sogar 14 Tagen) nach dem Zeitpunkt der Blutprobenentnahme die Menge an fötaler Nukleinsäure wenigstens etwa 90% der Menge an fötaler Nukleinsäure zum Zeitpunkt der Blutprobenentnahme beträgt. Der Kontaktierschritt kann so hinreichen, dass nach einem Zeitraum von wenigstens 7 Tagen nach dem Zeitpunkt der Entnahme der Blutprobe die Menge an in der Probe vorliegender fötaler Nukleinsäure etwa 100% der Menge an in der Probe vorliegender fötaler Nukleinsäure zum Zeitpunkt der Blutprobenentnahme beträgt. Der Kontaktierschritt kann so hinreichen, dass nach einem Zeitraum von wenigstens etwa 14 Tagen nach dem Zeitpunkt der Blutprobenentnahme die Konzentration an fötaler Nukleinsäure relativ zur Gesamtnukleinsäure in der Blutprobe, die vorhanden ist, wenigstens etwa das 10- bis wenigstens etwa das 50-Fache der Menge an fötaler Nukleinsäure, die in Abwesenheit des Kontaktierschritts vorliegen würde, beträgt.
Das Schutzmittel kann einen Nuklease-Inhibitor umfassen, der aus der aus Diethylpyrocarbonat, Ethanol, Aurintricarbonsäure (ATA), Formamid, Vanadyl-Ribonukleosid-Komplexen, Macaloid, Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA), Proteinase K, Heparin, Hydroxylamin-Sauerstoff-Kupferion, Bentonit, Ammoniumsulfat, Dithiothreitol (DTT), Beta-Mercaptoethanol, Cystein, Dithioerythrit, Tris(2-carboxyethyl)phosphen-Hydrochlorid, einem zweiwertigen Kation wie Mg⁺², Mn⁺², Zn⁺², Fe⁺², Ca⁺², Cu⁺² und einer beliebigen Kombination davon bestehenden Gruppe ausgewählt ist. Das Schutzmittel kann einen Gerinnungshemmer umfassen, der aus der aus Heparin, Ethylendiamintetraessigsäure, Citrat, Oxalat und einer beliebigen Kombination davon bestehenden Gruppe ausgewählt ist. Das Schutzmittel kann ein Konservierungsmittel und einen Gerinnungshemmer umfassen. Das Schutzmittel kann Imidazolidinylharnstoff und Ethylendiamintetraessigsäure umfassen.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
Bei 1 handelt es sich um eine veranschaulichende grafische Darstellung, die die relativen Mengen von als Ergebnis von Zelllecks vorliegender zellulärer DNA in zwei bei Raumtemperatur gelagerten Blutproben in zeitlichem Verlauf zeigt; dabei sieht man eine grafische Auftragung von „DNA-BCT“-Daten, die sich im Wesentlichen vollständig entlang der x-Achse bei einem y-Achsen(0 DNA)-Wert von null (0) erstreckt.
Bei 2 handelt es sich um eine veranschaulichende grafische Darstellung, die die relativen Mengen von als Ergebnis von Lecks männlicher weißer Blutzellen vorliegender Y-Chromosomen-DNA in zwei weiblichen Blutproben im zeitlichen Verlauf zeigt; wiederum sieht man dabei eine grafische Auftragung „zellfreier DNA-BCT“, die sich im Wesentlichen vollständig entlang der x-Achse bei einem y-Achsenwert von null (0) DNA erstreckt.
Bei 3 handelt es sich um eine veranschaulichende grafische Darstellung, die die relativen Mengen von vorhandener zellfreier DNA in Blutproben in zeitlichem Verlauf unter Verwendung von Lambda-DNA als Marker zeigt.
Bei 4 handelt es sich um eine veranschaulichende grafische Darstellung, die die relativen Mengen von vorhandener zellfreier fötaler DNA in zwei Blutproben in zeitlichem Verlauf unter Verwendung der RASSF1A-Promoterregion als Marker zeigt.
Bei 5 handelt es sich um eine veranschaulichende grafische Darstellung, die die relativen Mengen von Plasma-DNA im zeitlichen Verlauf in einer in Standard-K₃EDTA-Röhrchen abgezogenen Blutprobe zeigt. Dabei ist in jedem Kästchendiagramm die Gesamtmenge an zellfreier Plasma-DNA jeweils als Genom-Äquivalente pro Milliliter Plasma (GE/ml) dargestellt. Die Linie im Inneren des Kästchens kennzeichnet den Medianwert. Die Begrenzungen des Kästchens repräsentieren die 75. und 25.
Perzentile. Die oberen bzw. unteren Fehlerbalken bezeichnen die 10. bzw. 90. Perzentile. Die obersten bzw. untersten Punkte kennzeichnen die Maximal- bzw. Minimalwerte. Die y-Achse ist logarithmisch.
Bei 6 handelt es sich um eine veranschaulichende grafische Darstellung, die die relativen Mengen von Plasma-DNA im zeitlichen Verlauf in einer Blutprobe, die in eine Vorrichtung der vorliegenden Lehren abgezogen wurde, zeigt. Dabei ist in jedem Kästchendiagramm die Gesamtmenge an zellfreier Plasma-DNA jeweils als Genom-Äquivalente pro Milliliter Plasma (GE/ml) dargestellt. Die Linie im Inneren des Kästchens bezeichnet den Medianwert.
Die Begrenzungen des Kästchens repräsentieren die 75. und 25. Perzentile. Die oberen bzw. unteren Fehlerbalken bezeichnen die 10. bzw. 90. Perzentile. Die obersten bzw. untersten Punkte kennzeichnen die Maximal- bzw. Minimalwerte. Die y-Achse ist logarithmisch.
Bei 7 handelt es sich um eine veranschaulichende grafische Darstellung, die die relativen Mengen fötaler zellfreier DNA im zeitlichen Verlauf in einer Blutprobe, die in Standard-K₃EDTA-Röhrchen abgezogen wurde, zeigt. Dabei ist in jedem Kästchendiagramm der Prozentanteil zellfreier Plasma-DNA jeweils als Genom-Äquivalente pro Milliliter Plasma (GE/ml) dargestellt. Die Linie im Inneren des Kästchens kennzeichnet den Medianwert. Die Begrenzungen des Kästchens repräsentieren die 75. und 25. Perzentile. Die oberen bzw. unteren Fehlerbalken bezeichnen die 10. bzw. 90. Perzentile. Die obersten bzw. untersten Punkte kennzeichnen die Maximal- bzw. Minimalwerte. Die y-Achse ist logarithmisch. Im zeitlichen Verlauf wird eine statistisch signifikante Abnahme des Prozentanteils fötaler zellfreier DNA lediglich bei K₃EDTA-Röhrchen beobachtet (*P < 0,05, **P ≤ 0,01 im gepaarten t-Test).
Bei 8 handelt es sich um eine veranschaulichende grafische Darstellung, die die relativen Mengen fötaler zellfreier DNA in zeitlichem Verlauf in einer Blutprobe, die in eine Vorrichtung der vorliegenden Lehren abgezogen wurde, zeigt. Bei jedem Kästchendiagramm ist der Prozentanteil zellfreier Plasma-DNA jeweils als Genom-Äquivalente pro Milliliter Plasma (GE/ml) dargestellt. Die Linie im Inneren des Kästchens kennzeichnet den Medianwert. Die Begrenzungen des Kästchens repräsentieren die 75. und 25. Perzentile. Die oberen bzw. unteren Fehlerbalken bezeichnen die 10. bzw. 90. Perzentile. Die obersten bzw. untersten Punkte kennzeichnen die Maximal- bzw. Minimalwerte. Die y-Achse ist logarithmisch. Im zeitlichen Verlauf wird eine statistisch signifikante Abnahme des Prozentanteils fötaler zellfreier DNA lediglich bei K₃EDTA-Röhrchen beobachtet (*P < 0,05, **P ≤ 0,01 im gepaarten t-Test).
Bei 9 handelt es sich um eine veranschaulichende grafische Darstellung, die eine Amplifikation fötaler zellfreier DNA aus maternem Plasma mittels WGA (Whole Genome Amplification) zeigt. Dabei wird eine Portion (ohne Amplifikation) direkt zur Quantifizierung (mittels Echtzeit-PCR) der Y-chromosomalen SRY-Sequenz aus maternem Plasma (eines Indikators für fötale DNA in maternem Plasma) verwendet. Die andere Portion (mit Amplifikation) wird einer WGA unterzogen, wonach eine SRY-Sequenz-Quantifizierung mittels Echtzeit-PCR erfolgt. Mit WGA wird eine 80-fache Anreicherung fötaler zellfreier DNA aus maternem Plasma beobachtet. Zur Auftragung der Standardkurve für die Quantifizierung wird ein Plasmid-DNA-Konstrukt verwendet, das eine Einzelkopie der Y-chromosomalen SRY-Sequenz enthält.
AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG
Im Allgemeinen sieht die vorliegende Erfindung ein Verfahren für pränatales Screening vor, das die Isolierung und Konservierung sich in maternem Blut befindender fötaler Nukleinsäuren beinhaltet. Dabei dient ein einmaliger Konservierungsschritt der Steigerung der Menge an gewinnbaren fötalen Nukleinsäuren, wodurch die diagnostischen Möglichkeiten der fötalen DNA und RNA verbessert werden. Insbesondere wird mit der vorliegenden Erfindung ein Verfahren zur Isolierung fötaler Nukleinsäuren bereitgestellt, das einen Konservierungsschritt enthält, bei dem unter anderem eine materne Blutprobe mit einem Schutzmittel in Kontakt gebracht wird. Bei der Nukleinsäure kann es sich um DNA oder RNA oder eine beliebige Kombination davon handeln. Bei der fötalen Nukleinsäure kann es sich um zellfreie DNA oder RNA handeln. Zu den Proben, aus denen die Nukleinsäuren isoliert werden können, gehören alle maternen Blutproben. Die fötalen Nukleinsäuren können sich in maternem Plasma befinden. Das vorliegend offenbarte Verfahren ermöglicht die effiziente Isolierung und Konservierung fötaler Nukleinsäuren, während eine Verwechselung mit maternen Nukleinsäuren, die aufgrund der Lyse materner Zellen nach Blutentnahme in eine Blutprobe gelangen, vermieden wird.
Das Verfahren für eine verbesserte Isolierung fötaler Nukleinsäuren aus einer maternen Blutprobe beginnt damit, dass eine Blutprobe mit einem Schutzmittel in Kontakt gebracht wird, das einen Wirkstoff zur Erhaltung der Integrität der Komponenten in der Probe enthält. Zu Inhaltsstoffen, die verwendet werden können, zählen, ohne jedoch darauf beschränkt zu sein, Diazolidinylharnstoff, Imidazolidinylharnstoff, Dimethoylol-5,5-dimethylhydantoin, Dimethylolharnstoff, 2-Brom-2-nitropropan-1,3-diol, Oxazolidine, Natriumhydroxymethylglycinat, 5-Hydroxymethoxymethyl-1-1aza-3,7-dioxabicyclo[3.3.0]octan, 5-Hydroxymethyl-1-1aza-3,7-dioxabicyclo[3.3.0]octan, 5-Hydroxypoly[methylenoxy]methyl-1-1aza-3,7-Dioxabicyclo[3.3.0]octan, quartäres Adamantin, 2-Aminoessigsäure oder eine beliebige Kombination davon. Bevorzugte Inhaltsstoffe sind aus der aus Diazolidinylharnstoff (DU), Imidazolidinylharnstoff (IDU) und einer beliebigen Kombination davon bestehenden Gruppe ausgewählt.
Das Schutzmittel kann im Wesentlichen aus dem Wirkstoff bestehen. Dieser kann dabei wenigstens etwa 10 Vol.-%, 50 Vol.-% oder sogar 80 Vol.-% des Schutzmittels ausmachen. Beispielsweise kann die Menge an Wirkstoff im verwendeten Schutzmittel allgemein etwa 100 bis etwa 800 Gramm pro Liter betragen. Die Menge an Wirkstoff im Schutzmittel kann wenigstens etwa 25 Gramm pro Liter oder auch 50 Gramm pro Liter betragen. Die Menge an Wirkstoff im Schutzmittel kann weniger als etwa 1500 Gramm pro Liter oder auch 1200 Gramm pro Liter betragen. Beispielsweise kann das Schutzmittel etwa 0,05 bis etwa 0,4 Gramm eines Formaldehydfreisetzer-Konservierungsmittels (z.B. IDU) pro 0,2 ml des gesamten Schutzmittels umfassen.
Die Schutzmittelzusammensetzung, wie sie bei den gesamten vorliegenden Lehren verwendet wird, ist vorzugsweise weitgehend nicht toxisch. Beispielsweise können die vorliegenden Verfahren (und vorliegend verwendeten Zusammensetzungen) frei von einer separaten Zugabe und/oder Handhabung irgendeiner besonders signifikanten Konzentration (z.B. weniger als etwa 1 Gew.-%, stärker bevorzugt weniger als etwa 2000 ppm (Parts per Million), stärker bevorzugt weniger als etwa 1000 ppm und noch stärker bevorzugt weniger als etwa 500 ppm) an Formaldehyd und/oder Paraformaldehyd vor irgendeinem Kontakt mit einer Blutproduktprobe sein.
Das Schutzmittel kann einen Nuklease-Inhibitor in einer geeigneten Menge enthalten, um eine weitere Abnahme (z.B. um wenigstens etwa 10 Gew.-% und stärker bevorzugt wenigstens etwa 50 Gew.-%) der Qualität und Menge aus der Blutprobe gewinnbarer fötaler Nukleinsäuren durch DNase- und RNase-Aktivität verglichen mit einer Probe, die keinen Nuklease-Inhibitor enthält, zu verhindern. Zu Nuklease-Inhibitoren, die verwendet werden können, gehören, ohne jedoch darauf beschränkt zu sein, Diethylpyrocarbonat, Ethanol, Aurintricarbonsäure (ATA), Formamid, Vanadyl-Ribonukleosid-Komplexe, Macaloid, Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA), Proteinase K, Heparin, Hydroxylamin-Sauerstoff-Kupferion, Bentonit, Ammoniumsulfat, Dithiothreitol (DTT), Beta-Mercaptoethanol, Cystein, Dithioerythrit, Tris(2-carboxyethyl)phosphen-Hydrochlorid oder ein zweiwertiges Kation wie Mg⁺², Mn⁺², Zn⁺², Fe⁺², Ca⁺², Cu⁺² oder eine beliebige Kombination davon. Ferner kann das Schutzmittel weitgehend frei von Guanidiniumsalzen, Natriumdodecylsulfat (SDS) oder eine beliebige Kombination davon sein.
Das erste Inkontaktbringen der Blutprobe kann über einen hinreichenden Zeitraum erfolgen, um die Lyse materner Zellen oder/und Nuklease-Aktivität oder eine beliebige Kombination davon zu hemmen. Das Inkontaktbringen kann über einen Zeitraum von wenigstens etwa 10 Sekunden, stärker bevorzugt wenigstens etwa 1 Minute, noch stärker bevorzugt wenigstens etwa 2 Minuten erfolgen. Das Inkontaktbringen kann über längere Zeiträume erfolgen. Zum Beispiel kann mit dem Inkontaktbringen im Wesentlichen gleichzeitig mit dem Zeitpunkt der Blutentnahme (z.B. innerhalb von weniger als etwa 10 Minuten der Blutentnahme) begonnen werden und es kann bis zum Isolieren, Screenen und/oder Testen von Nukleinsäuren andauern. Der Kontaktierschritt kann auch eingesetzt werden, um eine Probe länger haltbar zu machen. Somit ist es möglich, dass eine Zeitspanne von wenigstens etwa 2 Stunden, stärker bevorzugt wenigstens etwa 6 Stunden, wenigstens etwa 24 Stunden, wenigstens etwa 7 Tagen oder sogar wenigstens etwa 14 Tagen zwischen dem Zeitpunkt der Blutentnahme (die weitgehend gleichzeitig mit dem Kontaktierschritt erfolgen kann) und dem Zeitpunkt jeglichen Testens oder Screening der Probe und/oder Isolierung der Nukleinsäuren liegen kann.
Das Schutzmittel kann einen Wirkstoff in Lösung umfassen. Zu geeigneten Lösungsmitteln zählen Wasser, Salzlösung, Dimethylsulfoxid, Alkohol und Gemische davon. Das Schutzmittel kann Diazolidinylharnstoff (DU) und/oder Imidazolidinylharnstoff (IDU) in einer gepufferten Salzlösung umfassen. Das Schutzmittel kann ferner EDTA und 2-Aminoessigsäure umfassen. Als Alternative kann das Schutzmittel nur ein Fixiermittel (z.B. einen wirksamen Inhaltsstoff) enthalten und von jeglichen weiteren Zusätzen frei sein.
Die Menge eines wirksamen Inhaltsstoffs im Schutzmittel kann allgemein etwa 10 Gew.-% bis etwa 90 Gew.-% betragen. Der wirksame Inhaltsstoff bzw. das Fixiermittel kann etwa 70 Gew.-% bis etwa 90 Gew.-% des Schutzmittels umfassen. Das Schutzmittel kann ferner einen Gerinnungshemmer, wie z.B. etwa 5 Gew.-% bis etwa 20 Gew.-% EDTA enthalten. Das Schutzmittel kann etwa 10 Gew.-% EDTA enthalten. Das Schutzmittel kann etwa 1 Gew.-% bis etwa 40 Gew.-% Nuklease-Inhibitor enthalten.
Die Menge an wirksamem Inhaltsstoff oder Fixiermittel (z.B. dem Formaldehyd-Freisetzer) relativ zur Menge an EDTA kann bei etwa 1 bis etwa 10 Gewichtsteilen (stärker bevorzugt etwa 2 bis etwa 8 Gewichtsteilen) Fixiermittel zu etwa 1 Gewichtsteil EDTA liegen.
Die Menge an Schutzmittel in einem Röhrchen vor der Blutentnahme kann etwa 0,05 bis etwa 1,0 ml und stärker bevorzugt etwa 0,1 bis etwa 0,3 ml betragen.
Die Kombination eines wirksamen Inhaltsstoffs oder Fixiermittels (z.B. des Formaldehyd-Freisetzers) und Gerinnungshemmers im Schutzmittel führt zu einer verbesserten Fähigkeit, die Menge und Qualität fötaler DNA in einer maternen Blutprobe zu erhalten. Diese Ergebnisse werden als unerwartet und besser als Ergebnisse betrachtet, die durch die Verwendung lediglich des Fixiermittels bzw. lediglich des Gerinnungshemmers erhalten wurden. Daher glaubt man, dass ein synergistischer Effekt auftreten kann, wenn ein Fixiermittel und ein Gerinnungshemmer miteinander kombiniert werden. Die vorliegend offenbarten Zusammensetzungen sehen insbesondere die Möglichkeit vor, dass sie die Kombination eines Formaldehyd-Freisetzers und eines Gerinnungshemmers enthalten.
Das Schutzmittel kann sich in einer spezialisierten Vorrichtung befinden, wobei das Schutzmittel bereits in der Vorrichtung vor Zugabe der Blutprobe vorliegt, wie etwa aus der US-Patentveröffentlichung Nr. 2004/0137417 , hiermit durch Bezugnahme aufgenommen, bekannt. Bei der Vorrichtung kann es sich um einen Vakuumsammelbehälter, üblicherweise ein Röhrchen, handeln. Das Röhrchen kann aus einem durchsichtigen Material hergestellt sein, das auch einer Anhaftung der Zellen in einer gegebenen Probe widersteht. Die Innenwand des Röhrchens kann beschichtet oder auf andere Weise behandelt sein, um seine Oberflächeneigenschaften zu verändern, wie etwa um es hydrophober und/oder hydrophiler zu machen, und zwar über die gesamte oder einen Teil seiner Oberfläche. Das Röhrchen kann eine Innenwand aufweisen, die flammgespritzt, einer Corona-Entladung ausgesetzt, plasmabehandelt, beschichtet oder auf andere Weise behandelt wurde. Das Röhrchen kann behandelt werden, indem eine Innenwand mit einer Substanz in Kontakt gebracht wird, so dass die interessierenden Nukleinsäuren einem Anhaften an die Röhrchenwände widerstehen. Die Oberfläche des Röhrchens kann so modifiziert werden, dass sie eine doppelte Funktionalität liefert, bei der gleichzeitig ein angemessenes Gleichgewicht von gewünschter Hydrophilizität und Hydrophobizität bereitgestellt wird, um das Sammeln von Blut, die Verteilung des vorliegend offenbarten Schutzmittels zu gestatten, während einer Anhaftung von Nukleinsäuren an die Innenwand des Blutsammelröhrchens widerstanden wird.
Es ist möglich, dass es sich bei einer Beschichtung um eine funktionalisierte Polymerbeschichtung handeln kann, die ein erstes Polymer und eine oder mehrere zweite monomere und/oder polymere Funktionalitäten enthält, die sich vom ersten Polymer unterscheiden (z.B. chemisch unterscheiden). Die Beschichtung kann ein oder mehrere Copolymere (z.B. Blockcopolymer, Pfropfcopolymer oder anderweitig) enthalten. Beispielsweise kann sie ein Copolymer enthalten, das einen ersten hydrophoben Polymeranteil und einen zweiten hydrophilen Polymeranteil enthält. Bei der Beschichtung kann es sich auch um eine Beschichtung auf Wasserbasis handeln. Die Beschichtung kann gegebenenfalls einen Haftvermittler enthalten. Die Beschichtung kann auf jede geeignete Weise aufgetragen werden und kann dabei auf einen Teil der oder die gesamte Innenfläche des Blutsammelröhrchens durch Sprühen, Eintauchen, Ausstreichen oder auf andere Weise aufgebracht werden. Die Beschichtung kann auch in Gegenwart von Wärme aufgetragen werden. Vorzugsweise bildet jede auf die Innenwand eines Blutsammelröhrchens aufgetragene Beschichtung eine hinreichend dauerhafte Bindung mit dem Glas (z.B. Borsilikatglas) oder anderem Material (z.B. Polymermaterial) des Röhrchens, so dass sie nicht erodiert oder auf andere Weise von der Innenwand entfernt wird. Zu Beispielen für geeignete Polymerbeschichtungen zählen unter anderem siliziumhaltige Polymere (z.B. Silane, Siloxane oder sonstige); Polyolefine wie Polyethylen oder Polypropylen; Polyethylenterephthalat; fluorinierte Polymere (z.B. Polytetrafluorethylen); Polyvinylchlorid, Polystyrol oder eine beliebige Kombination davon. Beispiele für Lehren, die zur Beschichtung einer Innenfläche eines Blutsammelröhrchens eingesetzt werden können, sind in den US-Patenten Nr. 6,551,267 , 6,077,235 , 5,257,633 und 5,213,765 , jeweils durch Bezugnahme aufgenommen, zu finden.
Das wie oben beschriebene Röhrchen kann vorzugsweise einen gerinnungshemmenden Stoff und einen wirksamen Inhaltsstoff, wie etwa ein Fixiermittel, einschließlich, ohne jedoch darauf beschränkt zu sein, der vorliegend offenbarten wirksamen Inhaltsstoffe, enthalten. Das Röhrchen kann auch ferner einen Nuklease-Inhibitor enthalten. Vorzugsweise liegen die im Röhrchen enthaltenen Verbindungen in einer Menge vor, die zur Bewahrung der Morphologie der maternen Zellen und zur Vorbeugung eines Zellabbaus ausreicht, während ebenso schädliche DNase- und RNase-Aktivität innerhalb der fötalen zellfreien Nukleinsäuren verhindert wird. Allerdings kann die Menge an Schutzmittel auch hinreichend klein sein, so dass jegliche nachfolgende Verdünnung der Probe weitgehend vermieden wird und zellfreie Nukleinsäuren in der Probe nicht entscheidend verdünnt werden. Eine Blutprobe kann gleichzeitig mit ihrem Abziehen in das spezialisierte Röhrchen fixiert werden. Das Röhrchen kann auch über einer Außenwand mit einer Schutzbeschichtung (z.B. einer Rückhaltebarriere, die bei der Kontrolle von Glassplittern hilft) beschichtet sein, wie etwa der in US-Patent Nr. 7,419,832 , hiermit durch Bezugnahme aufgenommen, offenbarten. Darüber hinaus kann das Schutzmittel in einem hochviskosen oder weitgehend festen Zustand vorliegen, so dass es sich (beispielsweise) effektiv als eine im Wesentlichen im festen Zustand vorliegende Beschichtung verwenden lässt. Beispiele für derartige im festen Zustand vorliegende Konservierungsstoffe finden sich in der gemeinsam beanspruchten gleichzeitig anhängigen US-Anmeldung Serien-Nr. 12/646,204, eingereicht am 23. Dezember 2009 und für alle Zwecke durch Bezugnahme aufgenommen. Am Schutzmittel lassen sich Techniken zur Entfernung von Flüssigkeit durchführen, um ein im Wesentlichen im festen vorliegendes Schutzmittel zu erhalten. Die Bedingungen zur Flüssigkeitsentfernung können solcherart sein, dass sie zur Abtrennung von wenigstens etwa 50 Gew.-%, wenigstens etwa 75 Gew.-% oder wenigstens etwa 85 Gew.-% der ursprünglichen Menge des ausgebrachten flüssigen Schutzmittels führen. Die Bedingungen zur Flüssigkeitsentfernung können solcherart sein, dass sie zur Entfernung von ausreichend Flüssigkeit führen, so dass die erhaltene Zusammensetzung in Form eines Films, Gels oder einer anderen weitgehend festen oder hochviskosen Schicht vorliegt. Beispielsweise kann sie zu einer weitgehend immobilen Beschichtung führen (vorzugsweise einer Beschichtung, die sich wieder auflösen oder auf andere Weise bei Kontakt mit einer Blutproduktprobe dispergieren lässt). Es besteht die Möglichkeit, dass Lyophilisierung oder andere Techniken zur Realisierung einer weitgehend festen Form des Schutzmittels (z.B. in der Form eines oder mehrerer Pellets) eingesetzt werden können. Somit können die Bedingungen zur Flüssigkeitsentfernung solcherart sein, dass sie zu einem Material führen, das bei Kontakt mit der betrachteten Probe (z.B. einer maternen Blutprobe) das Schutzmittel in der Probe dispergiert und im Wesentlichen Komponenten (z.B. zellfreie Nukleinsäuren) in der Probe konserviert. Die Bedingungen zur Flüssigkeitsentfernung können solcherart sein, dass sie zu einer verbleibenden Zusammensetzung führen, die weitgehend frei von Kristallinität ist; eine Viskosität aufweist, die hinreichend hoch ist, dass die verbleibende Zusammensetzung weitgehend immobil bei Umgebungstemperatur ist (z.B. keinerlei sichtbar nachweisbaren (wie mit dem bloßen Auge zu sehen) Fluss zeigt, wenn sie in einer Lagervorrichtung bei Raumtemperatur bei einer Neigung von wenigstens etwa 45° über wenigstens 1 Stunde gehalten wird); oder beides. Ebenso kann ein Farbstoff eingesetzt werden.
Wie hier erörtert, gestattet das Inkontaktbringen einer maternen Blut- oder Plasmaprobe mit dem Schutzmittel das Lagern der Probe über einen Zeitraum vor dem Isolieren und Testen der fötalen Nukleinsäuren. Stärker bevorzugt kann eine materne Blut- oder Plasmaprobe an einem Ort (z.B. einer Einrichtung des Gesundheitswesens) entnommen, mit dem Schutzmittel in Kontakt gebracht und später an einen anderen entfernten Ort (z.B. ein Labor, wie z.B. eines, das sich in einem separaten Gebäude in einer Entfernung von wenigstens etwa 1 km, 2 km, 3 km oder weiter weg von der Entnahmestelle befindet) für das Nukleinsäureisolierungs- und Testverfahren transportiert werden. Fötale Nukleinsäuren können aus der maternen Blut- oder Plasmaprobe isoliert und auf verschiedene fötale Merkmale (einschließlich, ohne jedoch darauf beschränkt zu sein, chromosomale Anomalien) an dem entfernten Ort getestet werden, wobei die erhaltenen diagnostischen Informationen dann der Stelle der ursprünglichen Blutentnahme mitgeteilt werden können. Das Verfahren zur Isolierung fötaler Nukleinsäuren kann an einem entfernten Ort durchgeführt werden, wobei sich die erhaltenen Informationen zur Identifizierung fötaler Merkmale, einschließlich chromosomaler Anomalien, an einem dritten Ort analysieren lassen. Zudem können die Ergebnisse des Verfahrens zur Isolierung fötaler Nukleinsäuren zur Stelle der ursprünglichen Blutentnahme zurückgeschickt und dort analysiert werden. Die erhaltenen diagnostischen Informationen können dann an einen dritten Ort oder zurück zum entfernten Ort oder zur Stelle der ursprünglichen Blutentnahme geschickt werden.
Die Probe lässt sich zu jeder Zeit nach dem ersten Kontakt der maternen Blut- oder Plasmaprobe mit dem Schutzmittel behandeln, um die zellfreien fötalen Nukleinsäuren, die sich im maternen Blut befinden, zu isolieren. Die Nukleinsäuren können mit einem beliebigen Isolierungsverfahren isoliert werden, einschließlich der in der gemeinsam beanspruchten Anmeldung Serien-Nr. 12/211,990, hiermit durch Bezugnahme aufgenommen, offenbarten Methoden. Vorzugsweise bleiben die maternen Blutzellen im Allgemeinen intakt, so dass materne Nukleinsäuren nicht aus zerbrochenen Blutzellen in die Probe freigesetzt werden, was eine Isolierung der fötalen Nukleinsäuren schwieriger macht. Das Fixiermittel dient der Vorbeugung einer Zelllyse, so dass die materne Zelle intakt bleibt und im Wesentlichen alle maternen Nukleinsäuren intrazellulär bleiben, so dass eine unerwünschte Kontamination der zellfreien fötalen Nukleinsäuren vermieden wird.
Nachdem die fötalen Nukleinsäuren isoliert wurden, können sie getestet werden, um verschiedene fötale Merkmale zu identifizieren, einschließlich, ohne jedoch darauf beschränkt zu sein, Geschlecht des Fötus, Präeklampsie bei der Mutter, Rhesusstatus des Fötus und des Vorliegens jeglicher chromosomaler Anomalien, einschließlich, ohne jedoch darauf beschränkt zu sein, jeglicher chromosomaler Inversionen, Translokationen, Aneuploidien, anderer Mutationen oder einer beliebigen Kombination davon. Die vorliegenden Verfahren sehen somit ferner einen Schritt des Nukleinsäuretestens vor. Das Testen der fötalen Nukleinsäuren kann unter Verwendung eines beliebigen Nukleinsäuretestverfahrens, einschließlich, ohne jedoch darauf beschränkt zu sein, Polymerasekettenreaktion (PCR), reverse-Transkription-Polymerasekettenreaktion (RT-PCR), quantitativer Echtzeit-Polymerasekettenreaktion (Q-PCR), Gelelektrophorese, Kapillarelektrophorese, Massenspektrometrie, Fluoreszenznachweis, Ultraviolettspektrometrie, DNA-Hybridisierung, allelspezifischer Polymerasekettenreaktion, PCA (Polymerase Cycling Assembly), asymmetrischer Polymerasekettenreaktion, LATE-PCR (Linear After The Exponential Polymerase Chain Reaction), Helicase-abhängige Amplifikation (HDA), Hot-Start-Polymerasekettenreaktion, intersequenzspezifischer Polymerasekettenreaktion (ISSR), inverser Polymerasekettenreaktion, ligationvermittelter Polymerasekettenreaktion, methylierungsspezifischer Polymerasekettenreaktion (MSP), Multiplex-Polymerasekettenreaktion, Nested-Polymerasekettenreaktion, Festphasen-Polymerasekettenreaktion oder einer beliebigen Kombination davon, erfolgen.
Ein Aspekt der vorliegenden Lehren sieht ein Verfahren zur Isolierung und zum Testen zellfreier fötaler DNA aus maternem Plasma vor. Dabei kann das Verfahren an einer Einzelprobe oder an einer Vielzahl von Proben (z.B. in einer Multi-Well-Platte) durchgeführt werden. Das Verfahren kann das Inkontaktbringen der maternen Plasmaprobe mit einem Schutzmittel beinhalten. Das Schutzmittel kann ein Fixiermittel wie zuvor erörtert enthalten, so dass die maternen Zellen während des Blutentnahme- und DNA-Isolierungsvorgangs intakt bleiben. Das Schutzmittel kann ferner einen DNase-Inhibitor zur Bewahrung der strukturellen Integrität der fötalen DNA enthalten. Nach Inkontaktbringen der maternen Plasmaprobe mit dem Schutzmittel kann die Probe zum Abtrennen des Plasmas zentrifugiert werden, wobei der Überstand verworfen wird. Indem eine materne Blutprobe mit dem Schutzmittel in Kontakt gebracht wird, ist bei der Blutprobe nicht unbedingt eine sofortige Prozessierung notwendig, und sie kann über einen längeren Zeitraum, wie etwa bis zu etwa 14 Tage oder länger, bei Raumtemperatur gelagert werden. Somit sehen die vorliegenden Erfindungen einen oder mehrere Schritte der Lagerung und/oder des anderweitigen Wartens über einen relativ langen Zeitraum vom Zeitpunkt der Blutentnahme und/oder des Inkontaktbringens bis zum Zeitpunkt des Screening, Testens oder einer anderen Analyse vor. Sobald die Probe prozessiert ist, kann die Zugabe einer entsprechenden Konzentration eines Mittels zur Einleitung einer Fällung (z.B. einer Zusammensetzung von Salz und/oder Alkohol) erfolgen, um das fötale DNA enthaltende Material zu fällen. Eine organische oder andere Verbindung wie etwa ein Phenolderivat oder dergleichen kann zugegeben werden, um eventuell verbliebene Proteinverunreinigungen zu entfernen. Alle Proteinverunreinigungen, die noch verbleiben, können durch Zugabe weiterer Mengen einer organischen oder anderen Verbindung wie etwa eines Phenolderivats oder dergleichen entfernt werden. Nach der Zentrifugation kann Ethanol zugegeben und die Probe wiederum zentrifugiert werden. Eventuell verbliebene Flüssigkeit kann aus der Probe entfernt werden, so dass nur die fötale DNA zurückbleibt. Das fertige Produkt von isolierter fötaler DNA kann dann mit einem Puffer in Kontakt gebracht werden.
Es können ein oder mehrere Inkubationsschritte durchgeführt werden. Die Inkubation kann auf Eis oder bei einer beliebigen Temperatur zwischen –30°C und 70°C erfolgen. Beispielsweise kann eine Probe bei etwa –20°C inkubiert werden. Eine Probe kann auch bei Raumtemperatur gelagert werden und somit weitgehend frostfrei bei der Blutentnahme sein.
Die Zentrifugation kann mit einer geeigneten Geschwindigkeit erfolgen. Beispielsweise wird die Zentrifugation bei etwa 500 bis etwa 20.000 UpM durchgeführt. Die Zentrifugation kann bei etwa 1000 bis 16000 UpM erfolgen. Die Zentrifugation kann bei etwa Raumtemperatur oder kühler durchgeführt werden. Beispielsweise kann sie bei etwa 1–20°C oder noch weiter besonders bei etwa 4–9°C durchgeführt werden. Im Folgenden wird veranschaulicht, wie eine Blutsammelvorrichtung im Sinne der vorliegenden Lehren fötale zellfreie DNA konservieren und dabei helfen kann, den zellfreien DNA-Hintergrund in maternem Plasma bei Umgebungstemperatur zu minimieren. Wie man sehen wird, werden gesunden schwangeren Spenderinnen Blutproben entnommen und in (i) Standard-K₃EDTA(vertrieben unter dem Namen BD Vacutainer^® von Becton Dickinson, Franklin Lakes, New-Jersey)-Blutsammelröhrchen und (ii) Blutsammelröhrchen mit dem hier gelehrten Schutzmittel („dem Schutzmittel der vorliegenden Lehren“) überführt und bei Umgebungstemperatur gehalten. Beispielsweise kann das Schutzmittel der vorliegenden Lehren etwa 500 g/l IDU, etwa 81 g/l Trikalium-EDTA und etwa 47 g/l Glycin enthalten. Das Schutzmittel der vorliegenden Lehren kann in ein Röhrchen gefüllt sein, so dass das Röhrchen etwa 0,20 ml des Schutzmittels enthält. Das das Schutzmittel enthaltende Röhrchen kann etwa 10 ml Patientenblut aufnehmen. Das Patientenblut kann direkt in das das Schutzmittel enthaltende Röhrchen abgezogen werden. Man nimmt an, dass die gezeigten Ergebnisse um etwa ±25% von den beschriebenen über einen Bereich von etwa 300 bis etwa 700 g/l IDU (wobei ähnliche Ergebnisse für andere hier beschriebene Formaldehyd-Freisetzer erwartet werden) und von etwa 60 bis etwa 100 g/l Trikalium-EDTA und etwa 20 bis etwa 60 g/l Glycin variieren. Das Schutzmittel kann grob etwa 6 Gewichtsteile IDU pro etwa 1 Gewichtsteil EDTA und grob etwa 10 Gewichtsteile IDU pro etwa 1 Teil Glycin enthalten. Das Schutzmittel kann etwa 80 Vol.-% IDU, 12,8 Vol.-% Trikalium-EDTA und 7,25 Vol.-% Glycin enthalten. Ein Beispiel für ein im Handel erhältliches Röhrchen im Sinne der vorliegenden Lehren wird unter dem Namen Cell-Free DNA BCT von Streck, Inc., Omaha, Nebraska verkauft.
Für Vergleichszwecke wird ein Blutprobe, die nicht mit den vorliegend offenbarten Zusammensetzungen behandelt wird, zur Plasmatrennung zentrifugiert und zellfreie DNA extrahiert. Zellfreie DNA aus Plasma wird mittels quantitativer Echtzeit-PCR quantifiziert. Diese maternen Blutproben (abgezogen in Standard-K₃EDTA-Röhrchen) zeigen eine gleichbleibende Reduzierung der Menge fötaler zellfreier DNA während eines ausgedehnten Zeitraums (z.B. 36 Stunden, 7 Tage, 2 Wochen usw.) bei Umgebungstemperatur. Umgekehrt zeigt Blut, das in eine Vorrichtung mit dem Schutzmittel der vorliegenden Lehren abgezogen wurde, keine Veränderung der Menge an fötaler zellfreier DNA über den gleichen Zeitraum.
Bei Verwendung von maternem Plasma, das in einer Vorrichtung mit dem Schutzmittel der vorliegenden Lehren über einen ausgedehnten Zeitraum gelagert wurde, kann fötale zellfreie DNA wenigstens 10-fach (z.B. 80-fach) unter Verwendung von WGA (Whole Genome Amplification) am Ende des ausdehnten Zeitraums amplifiziert werden, wobei eine ausreichende Menge an DNA für eine sinnvolle Analyse zur Verfügung steht. Somit ermöglicht die Verwendung des Schutzmittels der vorliegenden Lehren die Konservierung fötaler zellfreier DNA für ausgedehnte Zeiträume ebenso wie eine Minimierung jeglichen nach der Entnahme vorliegenden Hintergrunds an materner zellfreier DNA. Auf diese Weise konserviert lässt sich fötale zellfreie DNA mittels WGA-Technologie zur Herstellung hinreichender Mengen fötaler Nukleinsäuren als Ausgangsmaterial für pränatale diagnostische Tests auf Nukleinsäurebasis amplifizieren.
Für die nachfolgende Diskussion wird eine Vorschrift betrachtet, bei der einige oder alle der folgenden Schritte zum Einsatz kommen und zwar im Anschluss an eine direkte Entnahme einer Blutprobe in ein Vakuum-Blutsammelröhrchen. Im Sinne der vorliegenden Erfindung kann die Blutprobe mit einem Schutzmittel wie den vorliegend beschriebenen Schutzmitteln in Kontakt gebracht werden. Die Prozessierung von Nukleinsäuren für die Analyse kann einen Schritt der Aufreinigung der Nukleinsäuren und der Amplifikation der Nukleinsäuren enthalten.
Proben des behandelten Bluts (z.B. einen und einen halben ml große Portionen Blut) können jeweils periodisch den einzelnen Röhrchen entnommen werden; zellfreie Plasma-DNA kann aufgereinigt werden; Primer und Sonden für die Echtzeit-PCR-Quantifizierung einer oder mehrerer Antikörper- oder Proteinsequenzen (z.B. β-Actin, SRY, RASSF1A und/oder anderer Marker für fötale DNA) können hergestellt werden; Echtzeit-PCR-Quantifizierung einer oder mehrerer Antikörper- oder Proteinsequenzen (z.B. β-Actin, SRY, RASSF1A und/oder anderer Marker für fötale DNA) kann durchgeführt werden; resuspendierte Plasma-DNA kann mit einem Restriktionsenzym behandelt werden; eine Promoterregionsequenz (wie etwa die mit den vorliegend erörterten Fötale-DNA-Markern assoziierten Sequenzen) kann als Universalmarker für fötale DNA verwendet werden; ein geeigneter Amplifikator kann zur Amplifizierung fötaler zellfreier Plasma-DNA, die aus in der Vorrichtung der vorliegenden Lehren gelagertem maternem Blut erhalten wurde, verwendet werden; oder eine statistische Analyse kann durchgeführt werden.
Primer und Sonden für die Echtzeit-PCR-Quantifizierung bestimmter vorliegend erörterter Antikörper- oder Proteinsequenzen (z.B. β-Actin, RASSF1A und/oder anderer Marker für fötale DNA) können gemäß aus dem Stand der Technik bekannten Lehren, z.B. wie bei Chan et al. Clinical Chemistry 52:2211-2218 (2006) (durch Bezugnahme aufgenommen) beschrieben, hergestellt werden. Primer für die geschlechtbestimmende Region des Y-Chromosoms (Y-Chromosomal Sex Determining Region, SRY) können gemäß im Stand der Technik bekannten Lehren, wie z.B. Lee et al., Blood 93:3127-3139 (durch Bezugnahme aufgenommen), hergestellt werden. Eine Beispielsonde, die für die Quantifizierung von SRY-Sequenz verwendet werden kann, ist 6FAM-ATG GCT CTA GAG AAT CCC AGA ATG CGA AAC TCA GAG A-TAMRA. Im Handel erhältliche Primer, Sonden und PCR-Master-Mix (z.B. TaqMan^® Universal PCR-Master-Mix) können von Applied Biosystems, Foster City, CA bezogen werden. Plasmid-DNA-Konstrukte können hergestellt werden, so dass sie jeweils eine Einzelkopie der vorliegend erörterten Antikörper- oder Proteinsequenzen (β-Actin, RASSF1A, SRY und/oder anderer Fötale-DNA-Marker) enthalten. Diese Plasmidkonstrukte können zur Auftragung der Standardkurven verwendet werden.
Nach Resuspension der Plasma-DNA kann das Plasma mit einem Restriktionsenzym (z.B. 25 U BstUI-Restriktionsenzym, erhältlich bei New England Biolabs, Ipswich, MA) gemäß im Stand der Technik bekannten Lehren, wie z.B. bei Chan et al. (2006) beschrieben, behandelt werden.
Nach der Resuspension kann ein geeigneter Amplifikator (z.B. ein QIAGENREPLI-g^® UltraFast Mini-WGA(Whole Genome Amplification)-Kit, erhältlich bei QIAGEN, Inc., Valencia, Kalifornien) für den Schritt der Amplifizierung der fötalen zellfreien Plasma-DNA, die aus in der Vorrichtung der vorliegenden Lehren gelagertem maternem Blut erhalten wurde, verwendet werden. Aufgereinigte zellfreie DNA wird aus einem Volumenplasma (z.B. wenigstens etwa 100 µl oder weniger als etwa 800 µl) wie oben beschrieben hergestellt, jedoch in einem kleinen Volumen (z.B. wenigstens etwa 0,05 µl oder weniger als etwa 10 µl) resuspendiert und unter Verwendung des Kits nach den Anweisungen des Herstellers amplifiziert. Nach der Amplifikation kann die Probe (z.B. etwa 25-fach) vor der PCR-Analyse verdünnt werden.
Bei der Verifizierung der Schutzfähigkeiten der vorliegend offenbarten Zusammensetzungen werden somit Standard-K₃EDTA-Blutsammelröhrchen gegen Röhrchen, die das Schutzmittel der vorliegenden Lehren enthalten, verglichen, das somit eine Zusammensetzung enthält, die kernhaltige Blutzellen stabilisiert und Plasmanukleasen hemmt. In den nachfolgend erörterten Beispielen und Ergebnissen erfolgt die statistische Analyse unter Verwendung von Software, die auf der Tools for Science-Internetseite des Physics Department, College of Saint Benedict Saint John’s University, St. Joseph, Minnesota (http://www.physics.csbsiu.edu/) erhältlich ist. Es wird ein gepaarter t-Test verwendet, wobei P < 0,05 als statistisch signifikant betrachtet wird.
Beispiel 1
Es werden einem weiblichen und einem männlichen Spender Blutproben entnommen. Die weibliche Blutprobe wird in zwei Röhrchen überführt, Röhrchen A mit etwa 500 g/l IDU, etwa 80 g/l Trikalium-EDTA und etwa 50 g/l Glycin und Röhrchen B mit lediglich der Trikalium-EDTA. Beide Röhrchen werden bei Raumtemperatur gelagert. Weiße Blutzellen aus der männlichen Blutprobe werden isoliert und sowohl Röhrchen A als auch B damit dotiert. Aus jedem Röhrchen werden jeweils 3 ml Blut an Tag 0, Tag 1, Tag 2, Tag 3, Tag 4, Tag 7 und Tag 11 entnommen. Jede Probe wird bei Raumtemperatur und 800 g 10 Minuten zentrifugiert und die obere Plasmaschicht jeweils in ein neues Röhrchen überführt und weiter bei 1500 g und Raumtemperatur 10 Minuten zentrifugiert. Die frei zirkulierende DNA in jedem Röhrchen wird dann unter Verwendung des NucleoSpin^® Plasma XS-Kits, erhältlich bei Macherey-Nagel Inc., Bethlehem, Pennsylvania, aufgereinigt. Danach werden die Proben mittels Real Time PCR-Amplifikation eines Fragments des Y-Chromosoms amplifiziert (unter Verwendung von iQ SYBR Green Supermix-Reagenzien, erhältlich bei BIO-RAD Laboratories (Hercules, Kalifornien)). Jegliches Aufreißen der männlichen weißen Blutzellen während der Probenprozessierung führt zu nachweisbarer Y-chromosomaler DNA in der weiblichen Blutprobe. Röhrchen A zeigt kein Vorliegen von Y-chromosomaler DNA in der Plasmaprobe, während die Menge an in Röhrchen B identifizierter Y-chromosomaler DNA mit jeder Messung zunimmt, was ein Aufreißen männlicher weißer Blutzellen in Röhrchen B anzeigt. Die erwarteten Ergebnisse dieses Beispiels sind in 2 grafisch dargestellt, wobei die Tatsache gestützt wird, dass durch Verwendung der vorliegend offenbarten Zusammensetzungen eine Lyse der Blutzellen, mit denen die Proben dotiert wurden, weitgehend verhindert werden kann.
Beispiel 2
Blutproben aus dem gleichen Spender werden in zwei unterschiedliche Arten von Blutsammelröhrchen abgezogen. Ein Röhrchen enthält 500 g/l IDU, 81 g/l Trikalium-EDTA und 47 g/l Glycin. Das andere Röhrchen enthält lediglich Heparin. Alle Proben werden bei 2100 g 30 Minuten bei Raumtemperatur zur Trennung des Plasmas zentrifugiert. Das Plasma wird dann in neue Röhrchen überführt, und die Plasmaröhrchen werden dann mit nichtmenschlicher (Lambda-)DNA dotiert. Die dotierten Proben werden dann bei Raumtemperatur 0, 1, 2, 3, 4, 7, 11 und 14 Tage gelagert. Frei zirkulierende DNA wird unter Verwendung des QIAamp^® DNA Blood Mini Kit, erhältlich bei QIAGEN Inc. (Valencia, CA), aufgereinigt. Aus jeder Plasmaprobe wird DNA extrahiert. Die Proben werden dann mittels Quantitative PCR amplifiziert (unter Verwendung von iQ SYBR Green Supermix-Reagenzien, erhältlich bei BIO-RAD Laboratories (Hercules, Kalifornien), um die Menge an vorliegender Lambda-DNA zu identifizieren. Die Ergebnisse zeigen bei jeder Messung einen konsistenten relativen Prozentanteil an vorliegender Lambda-DNA, was nur auf eine geringe Abnahme, wenn überhaupt, des Prozentanteils zellfreier DNA in den Plasmaproben, die sowohl mit IDU als auch Trikalium-EDTA in Kontakt gebracht wurden, anzeigt. Die Menge an Lambda-DNA nimmt mit jeder nachfolgenden Messung in den Proben, die nur mit Heparin in Kontakt gebracht wurden, ab, was auf eine allmähliche Abnahme des relativen Prozentanteils zellfreier DNA hindeutet. Die erwarteten Ergebnisse dieses Beispiels sind in 3 grafisch dargestellt. Mit diesem Beispiel wird bestätigt, dass die Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung in der Lage sind, die Integrität und Menge von in einer Blutprobe vorliegender DNA zu bewahren.
Beispiel 3
Zwei materne Blutproben aus dem gleichen Spender werden in zwei getrennte Blutsammelröhrchen abgezogen. Ein Röhrchen enthält etwa 500 g/l IDU, etwa 80 g/l Trikalium-EDTA und etwa 50 g/l Glycin. Das andere Röhrchen enthält nur die Trikalium-EDTA. Beide Röhrchen werden bei Raumtemperatur gelagert und jedem Röhrchen jeweils 1 ml-Portionen Blut an Tag 0, Tag 7 und Tag 14 entnommen, und das Plasma wird abgetrennt. Alle Proben werden 10 Minuten bei 800 G und Raumtemperatur zur Trennung des Plasmas zentrifugiert. Das Plasma wird dann in neue Röhrchen überführt und 10 Minuten bei 1500 g und Raumtemperatur zentrifugiert. Frei zirkulierende DNA wird unter Verwendung des NucleoSpin^®PlasmaXS-Kits, erhältlich bei Macherey-Nagel Inc., Bethlehem, Pennsylvania, aufgereinigt. Aus jeder Plasmaprobe wird DNA extrahiert und in jeweils 60 µl Elutionspuffer eluiert. Eine Menge von 32 µl eluierter DNA wird mit 40 U BstU I-Enzym 6 Stunden bei 60° verdaut. Die Proben werden danach mittels Real Time PCR (unter Verwendung von TaqMan^® RT PCR-Reagenzien, erhältlich bei Applied Biosystems, Foster City, Kalifornien) mit Primern für die RASSF1A-Promoterregion amplifiziert. Die Ergebnisse zeigen bei jeder Messung das Vorliegen eines konsistenten relativen Prozentanteils von RASSF1A, was eine geringe, falls überhaupt, Abnahme des Prozentanteils fötaler zellfreier DNA in den maternen Plasmaproben, die mit sowohl IDU als auch Trikalium-EDTA in Kontakt gebracht wurden, anzeigt. Bei jeder nachfolgenden Messung nimmt die Menge an RASSF1A in den Proben, die lediglich mit Trikalium-EDTA in Kontakt gebracht wurden, ab, was auf eine allmähliche Abnahme des relativen Prozentanteils fötaler zellfreier DNA hindeutet. Die Ergebnisse dieses Beispiels sind in 4 grafisch dargestellt.
5 zeigt das erwartete Ergebnis einer ex-vivo-Inkubation von maternem Blut bei Entnahme in Standard-K₃EDTA-Röhrchen hinsichtlich der zellfreien DNA-Konzentration im Plasma. Dabei stellte sich heraus, dass zu Anfang (3 Std.) der Median der zellfreien DNA-Konzentration bei 762 Genom-Äquivalenten pro ml Plasma (GE/ml) liegt, wobei sich die Konzentration mit der Zeit deutlich erhöhte. Verglichen mit dem 3 Std.-Anfangswert werden statistisch signifikante Anstiege der zellfreien DNA-Konzentration bei 24 Std. (P < 0,05), 48 Std. (P < 0,05), 72 Std. (P < 0,05), 7 Tagen (P < 0,05) und 14 Tagen (P ≤ 0,001) beobachtet. Dieser stetige Anstieg kann die Lyse kernhaltiger Blutzellen und die anschließende Freisetzung zellulärer genomischer DNA in das Plasma widerspiegeln, die sich über 14 Tage fortsetzt. In 6 ist der erwartete Effekt der ex-vivo-Inkubation von maternem Blut, das in Röhrchen mit dem Schutzmittel der vorliegenden Lehren abgezogen wurde, auf die zellfreie DNA-Plasmakonzentration veranschaulicht. Hier steigt eine anfängliche mediane zellfreie DNA-Konzentration von 672 GE/ml über den gesamten 14-tägigen Versuchszeitraum nicht signifikant an, was anzeigt, dass eine verbesserte Integrität kernhaltiger Blutzellen beobachtet wird. Nach 3 Std. Inkubation zeigt ein Vergleich der zellfreien DNA-Plasmakonzentration in K₃EDTA-Röhrchen und Röhrchen mit dem Schutzmittel der vorliegenden Lehren einen statistisch signifikanten Unterschied (P < 0,05). Die mittlere zellfreie DNA-Konzentration in K₃EDTA-Röhrchen beträgt 6341 GE/ml, wohingegen sie in den Röhrchen, die das Schutzmittel der vorliegenden Lehren enthalten, bei 680 GE/ml liegt. Die höhere zellfreie Plasma-DNA-Konzentration im K₃EDTA-Röhrchen verglichen mit den Röhrchen, die das Schutzmittel der vorliegenden Lehren enthalten, zeigt an, dass zelluläre DNA durch die Lyse kernhaltiger Blutzellen im Plasma freigesetzt wird.
7 zeigt den erwarteten Effekt einer ex-vivo-Inkubation auf die fötale zellfreie DNA in maternem Plasma im K₃EDTA-Blutsammelröhrchen. Dabei wird eine statistisch signifikante Abnahme des Prozentanteils fötaler zellfreier DNA beobachtet. Dieser Abwärtstrend bei den Medianwerten des Prozentanteils fötaler zellfreier DNA; 4,05, 1,33, 0,45, 0,11, 0,10 bzw. 0,023 (bei 3 Std., 24 Std., 48 Std., 72 Std., 7 Tagen bzw. 14 Tagen), demonstriert, dass es bei K₃EDTA-Röhrchen nicht möglich ist, den Prozentanteil fötaler zellfreier DNA in maternem Plasma auf einem konstanten Niveau zu halten.
8 zeigt den erwarteten Effekt einer ex-vivo-Inkubation auf die fötale zellfreie DNA in maternem Plasma bei Inkontaktkommen mit dem Schutzmittel der vorliegenden Lehren. Hier ändert sich der Prozentanteil fötaler zellfreier DNA beim Trend der Medianwerte nicht signifikant; 6,8, 5,5, 6,2, 6,1, 6,8 bzw. 6,5 bei 3 Std., 24 Std., 48 Std., 72 Std., 7 Tagen bzw. 14 Tagen.
In weiteren Tests wurde Spenderplasma, das positiv auf das Y-Chromosom getestet hatte (Daten nicht gezeigt), für WGA (Whole Genome Amplification) verwendet. Mittels Echtzeit-PCR werden 398 SRY-DNA-Kopien ohne WGA nachgewiesen, wohingegen 32300 SRY-DNA-Kopien nach WGA nachgewiesen werden. Dies stellt eine Anreicherung an fötaler zellfreier DNA um wenigstens das 10-Fache, 20-Fache, 40-Fache oder sogar 80-Fache von maternem Plasma dar, das in einer Vorrichtung mit dem Schutzmittel der vorliegenden Lehren bei Umgebungstemperatur über den gleichen Zeitraum (z.B. 2 Wochen) gelagert worden war (9).
Wie in Bezug auf 5 erörtert, zeigt in Standard-K₃EDTA-Röhrchen gesammeltes maternes Blut einen 7-fachen bzw. 98-fachen Anstieg von zellfreier Gesamt-DNA in maternem Plasma bei 24 Std. bzw. 14 Tagen im Vergleich zu 3 Std. Jedoch ist die zellfreie DNA-Gesamtkonzentration bei Umgebungstemperatur bis zu 14 Tage in maternem Blut konstant, das mit dem Schutzmittel der vorliegenden Lehren in Kontakt gebracht wurde (6). Ohne an eine Theorie gebunden sein zu wollen, deutet dies darauf hin, dass die im Schutzmittel der vorliegenden Lehren vorhandenen Chemikalien in der Lage sind, die kernhaltigen Blutzellen zu fixieren, wodurch mit der Freisetzung zellulärer genomischer DNA in das Plasma assoziierte(r) Apoptose, Zelltod und Zelllyse verhindert werden. Ein Vergleich der zellfreien DNA-Gesamtkonzentrationen in K₃EDTA und der Vorrichtung der vorliegenden Lehren zeigt zum Anfangszeitpunkt (3 Std.) einen statistisch signifikanten Unterschied. Die mittlere zellfreie DNA-Gesamtkonzentration im K₃EDTA-Röhrchen bei 3 Std. beträgt 6341 GE/ml, wohingegen sie in einem Röhrchen mit dem Schutzmittel der vorliegenden Lehren lediglich 680 GE/ml beträgt. Dieser mehrfache (z.B. 9-fache) Anstieg der zellfreien DNA-Gesamtkonzentration in den Proben, die lediglich mit K₃EDTA in Kontakt kamen, im Vergleich zu Proben, die mit dem Schutzmittel der vorliegenden Lehren in Kontakt kamen, kann von einer erhöhten Freisetzung zellulärer genomischer DNA von Apoptose, Tod und Lyse kernhaltiger Blutzellen während Nach-Blutentnahme-ex-vivo-Inkubation und -Probenprozessierung herrühren und kann durch Anwendung der vorliegenden Lehren weitgehend vermieden werden.
7 zeigt den erwarteten Effekt einer ex-vivo-Inkubation (von in K₃EDTA-Röhrchen abgezogenem Blut) auf den Prozentanteil fötaler zellfreier DNA in maternem Blutplasma. Dabei liegt eine statistisch signifikante Abnahme des Prozentanteils fötaler zellfreier DNA im zeitlichen Verlauf vor. Den Hauptbeitrag zu dieser stetigen Abnahme des Prozentanteils fötaler zellfreier DNA dürfte der erhöhte Hintergrund materner zellfreier DNA haben, da ein Abbau fötaler zellfreier DNA durch die Wirkung von Nuklease stattfinden kann. Im Gegensatz dazu kann, wie in 8 dargestellt, der Prozentanteil fötaler zellfreier DNA von maternem Blut, das mit dem Schutzmittel der vorliegenden Lehren in Kontakt kam, bei Umgebungstemperatur weitgehend konstant im zeitlichen Verlauf sein. Man glaubt, dass dieser Schutzeffekt das Ergebnis der im Schutzmittel der vorliegenden Lehren vorhandenen Chemikalien, die Blutzellen stabilisieren, was die Freisetzung zellulärer DNA verhindert, ebenso wie von nukleasehemmender Aktivität, die fötale zellfreie DNA vor Abbau schützt, sein kann. Somit sehen die vorliegenden Lehren vor, dass eine Probe so behandelt wird, dass die schädlichen Effekte von DNase und RNase auf die im Plasma vorliegenden fötalen Nukleinsäuren begrenzt sind.
Wie sich anhand der vorliegend offenbarten Beispiele und Testergebnisse zeigt, stellt in maternem Blutplasma angetroffene fötale zellfreie DNA eine wertvolle Quelle für die nichtinvasive pränatale Diagnostik dar. Allerdings besteht ein Hauptfaktor, der die wirksame Anwendung fötaler zellfreier DNA in pränatalen Tests auf Nukleinsäurebasis beschränkt, darin, dass die in maternem Plasma vorliegende DNA-Gesamtkonzentration größtenteils von der Mutter selbst herrührt. Somit können Proben frei von zellfreier DNA sein, die Apoptose, Zelltod und Lyse kernhaltiger materner Blutzellen zugeschrieben werden kann. Dies kann der Fall nach etwa 4 Stunden nach der Blutentnahme, 6 Stunden nach der Blutentnahme oder sogar 24 Stunden nach Blutentnahme sein.
Ist die Integrität eines DNA-Ziels beeinträchtigt, so wird die DNA-Zielsequenz nicht amplifiziert. Da die meisten der pränatalen diagnostischen Tests auf DNA-Basis von einer anschließenden DNA-Amplifikation abhängen, ist es wichtig, die Integrität seltener DNA-Ziele, wie etwa fötaler fötaler zellfreier DNA, über die gesamten voranalytischen Verfahrensweisen zu schützen. Hier wird der Prozentanteil fötaler zellfreier DNA über quantitative Echtzeit-PCR bestimmt. 8 zeigt, dass der Prozentanteil zellfreier DNA im Wesentlichen bis zu 14 Tage konstant bleibt, und liefert Beweise dafür, dass das Schutzmittel der vorliegenden Lehren die Integrität fötaler zellfreier DNA bei Umgebungstemperatur bis zu 14 Tage schützen kann.
Einer der Faktoren, die die Verwendung fötaler zellfreier DNA in maternem Plasma in der nichtinvasiven pränatalen Diagnostik begrenzen, ist ihr relativ niedriger Spiegel in maternem Plasma. Daher wird fötale zellfreie DNA in maternem Plasma mittels WGA (Whole Genome Amplification) amplifiziert. Eine mit einem männlichen Fötus schwangere Spenderin im ersten Trimester wird über die Amplifizierung der Y-chromosomalen SRY-Regionsequenz identifiziert. Die Amplifikation von von dieser Spenderin erhaltener zellfreier Plasma-DNA mittels WGA und der anschließende Nachweis der Y-chromosomalen SRY-Regionsequenz mittels Echtzeit-PCR zeigen einen mehrfachen (z.B. wenigstens 10-, 20-, 40- oder ~80-fachen) Anstieg der Konzentration fötaler zellfreier DNA (9). Bei Isolierung von zellfreier DNA für WGA aus Blut, das mit dem Schutzmittel der vorliegenden Lehren in Kontakt kam und bei Umgebungstemperatur 14 Tage gelagert wurde, wird erwartet, dass die Ergebnisse starke Hinweise darauf liefern, dass das Schutzmittel der vorliegenden Lehren in der Lage ist, die Integrität langer fötaler zellfreier DNA-Moleküle, die für WGA benötigt werden, zu bewahren.
Diese neuen Methoden können zur Umgehung vieler existierender präanalytischer Probleme verwendet werden, die den Nachweis von fötaler zellfreier DNA in maternem Blut beeinflussen können. Da das Schutzmittel der vorliegenden Lehren kernhaltige Blutzellen stabilisiert und Plasmanukleasen hemmt, ist es möglich, materne Blutproben in einer Vorrichtung mit dem Schutzmittel der vorliegenden Lehren bei Umgebungstemperatur bis zu 14 Tage ohne jegliche Erhöhung der Hintergrundkonzentration materner zellfreier DNA und ohne jegliche Veränderung der Integrität zellfreier DNA zu lagern. Vorliegende Verfahren sehen eine solche Lagerung vor. Die vorliegenden Verfahren sehen ebenso eine Verwendung der Vorrichtung der vorliegenden Lehren zur Entnahme von maternem Blut für nichtinvasive pränatale Diagnostik vor, wenn Blutentnahme und Nukleinsäuretests nicht am gleichen Ort stattfinden. Die vorliegenden Verfahren können somit frei von jeglichen Schritten einer sofortigen Trennung von Plasma nach Blutentnahme und/oder Einfrieren des Plasmas (z.B. bei –80°C) für den Versand sein. Die vorliegenden Verfahren können auch frei von jeglicher Verwendung von Magnetkügelchen oder Partikeln jeglicher Art sein. Die vorliegenden Verfahren können frei von jeglicher Zugabe von Formaldehyd zur Blutprobe unmittelbar nach der Blutentnahme sein.
Die oben erörterten Beispiele und Testergebnisse demonstrieren einen unerwarteten synergistischen Effekt, der nur bei Blutproben auftritt, die mit sowohl einem Fixiermittel als auch einem Gerinnungshemmer oder insbesondere mit IDU, EDTA und Glycin in Kontakt kamen. Materne Blutproben, die nur mit einem Fixiermittel oder nur mit einem Gerinnungshemmer in Kontakt kamen, zeigen nicht die Fähigkeit, die Integrität der maternen Blutzellen oder die Integrität der fötalen Nukleinsäuren zu bewahren. Der kombinierte Effekt des IDU, der EDTA bzw. des Glycins übersteigt bei weitem alle Erwartungen bezogen auf die Wirkung, oder das Fehlen davon, des bzw. der allein verwendeten IDU bzw. EDTA bzw. Glycins.
Es ist ersichtlich, dass Konzentrate oder Verdünnungen der vorliegend genannten Mengen eingesetzt werden können. Dabei bleiben im Allgemeinen die relativen Anteile der genannten Inhaltsstoffe gleich. So erkennt der Fachmann, falls beispielsweise die Lehren 30 Gewichtsteile einer Komponente A und 10 Gewichtsteile einer Komponente B fordern, dass solche Lehren auch eine Lehre der Verwendung von Komponente A und Komponente B in einem relativen Verhältnis von 3:1 bilden. Lehren von Konzentrationen in den Beispielen können innerhalb etwa 25% (oder höher) der angegebenen Werte variieren, wobei ähnliche Ergebnisse erwartet werden. Zudem können solche Zusammensetzungen aus den Beispielen erfolgreich bei den vorliegenden Verfahren zur Isolierung fötaler Nukleinsäuren (z.B. zellfreier fötaler DNA) eingesetzt werden.
Es ist ersichtlich, dass das oben Gesagte lediglich der Veranschaulichung dient. Andere Inhaltsstoffe können in einer der vorliegend offenbarten Zusammensetzungen wie gewünscht eingesetzt werden, um die gewünschten resultierenden Eigenschaften zu erzielen. Zu anderen Inhaltsstoffen, die eingesetzt werden können, gehören beispielsweise Antibiotika, Betäubungsmittel, Antihistamine, Konservierungsmittel, Tenside, Antioxidantien, unkonjugierte Gallensäuren, Schimmelinhibitoren, Nukleinsäuren, Mittel zur pH-Einstellung, Mittel zur Einstellung der Osmolarität oder eine beliebige Kombination davon.
Die vorliegend dargestellten Erläuterungen und Veranschaulichungen sollen andere Fachleute mit der Erfindung, ihren Prinzipien und ihrer praktischen Anwendung bekanntmachen. Der Fachmann kann die Erfindung in ihren zahlreichen Formen so anpassen und anwenden, wie es für die Anforderungen einer bestimmten Verwendung möglicherweise am besten geeignet ist. Dementsprechend sollen die besonderen Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung wie angegeben weder umfassend sein noch die Erfindung beschränken. Der erfindungsgemäße Umfang sollte daher nicht mit Bezug auf die obige Beschreibung, sondern stattdessen mit Bezug auf die beigefügten Ansprüche bestimmt werden, zusammen mit dem vollen Umfang von Äquivalenten, die im Bereich dieser Ansprüche liegen. Die Offenbarung aller Artikel und Literaturangaben, einschließlich Patentanmeldungen und -veröffentlichungen, sind für alle Zwecke durch Bezugnahme aufgenommen. Andere Kombinationen sind ebenso möglich, wie anhand der folgenden Ansprüche ersichtlich ist, und sind hiermit ebenso durch Bezugnahme in diese schriftliche Beschreibung aufgenommen.
ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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Zitierte Patentliteratur

EP 13166264 [0001]
EP 2626438 A1 [0001]
EP 10000518 [0001]
EP 2228453 A1 [0001]
US 7332277 [0008, 0010]
US 7442506 [0008, 0010]
US 5447842 [0010]
US 5457024 [0010]
US 5861253 [0010]
US 6258540 [0010]
US 6617170 [0010]
US 6821789 [0010]
US 2007/0111233 [0010]
US 2007/0134658 [0010]
US 2007/0202525 [0010]
US 2008/0020390 [0010]
US 2008/0108071 [0010]
US 2004/0137417 [0041]
US 6551267 [0042]
US 6077235 [0042]
US 5257633 [0042]
US 5213765 [0042]
US 7419832 [0043]

Zitierte Nicht-Patentliteratur

Leon et al. 1977 [0003]
Lo et al. Lancet 350 (1997) 485–487 [0003]
Dhallan et al. JAMA 291 (2004) 1114–1119 [0008]
Zhang et al., Clinical Chimica Acta 397 (2008) 60–64 [0008]
Chan et al. Clinical Chemistry 52:2211-2218 (2006) [0054]
Lee et al., Blood 93:3127-3139 [0054]
Chan et al. (2006) [0055]

Claims

Blutsammelröhrchen für nichtinvasives pränatales Screening zur Identifizierung fötaler Merkmale, enthaltend: ein Nukleinsäureschutzmittel, welches Glycin, Imidazolidinylharnstoff, Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) und weniger als 1 Gew.-% Formaldehyd enthält; wobei das Schutzmittel verhindert, dass Blutzellen (i) genomische Nukleinsäuren in eine Blutprobe freisetzen und (ii) Nukleaseaktivität erfahren, die fötale Nukleinsäure abbaut.
Röhrchen nach Anspruch 1, wobei das Röhrchen durchsichtig ist und auf einer Innenwand des Röhrchens eine Beschichtung enthält.
Röhrchen nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Röhrchen mit einem siliziumhaltigen Polymer beschichtet ist.
Röhrchen nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Röhrchen Diazolidinylharnstoff enthält.
Röhrchen nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Röhrchen 1 bis 10 Gewichtsteile Imidazolidinylharnstoff zu etwa 1 Gewichtsteil EDTA enthält.
Röhrchen nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Röhrchen etwa 10 Gewichtsteile Imidazolidinylharnstoff pro etwa 1 Teil Glycin enthält.
Röhrchen nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Röhrchen etwa 6 Gewichtsteile Imidazolidinylharnstoff pro etwa 1 Gewichtsteil EDTA enthält.
Röhrchen nach einem der Ansprüche 10 bis 13, wobei das Schutzmittel 5 Gew.-% bis etwa 20 Gew.-% EDTA enthält.
Röhrchen nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei es sich bei dem Röhrchen um einen Vakuumsammelbehälter handelt.
Röhrchen nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei der Röhrcheninhalt an den Transport des Röhrchens von einem ersten Ort zu einem entfernten zweiten Ort ohne Einfrieren des Röhrcheninhalts angepasst ist.
Röhrchen nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Röhrchen ein Lösungsmittel enthält.
Röhrchen nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Röhrchen Wasser enthält.
Röhrchen nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Röhrchen mehrere Blutzellen enthält.
Röhrchen nach einem der Ansprüche 10 bis 12, wobei die Menge des Konservierungsmittels weniger als etwa 20 mg/ml der Blutprobe beträgt.
Röhrchen nach einem der Ansprüche 10 bis 14, wobei das Röhrchen 60 bis 100 g/l EDTA enthält.
Röhrchen nach einem der Ansprüche 10 bis 15, wobei das Röhrchen 300 bis 700 g/l Imidazolidinylharnstoff enthält.
Röhrchen nach einem der Ansprüche 10 bis 16, wobei das Röhrchen 20 bis 60 g/l Glycin enthält.
Röhrchen nach einem der Ansprüche 12 bis 17, wobei das Röhrchen zellfreie fötale Nukleinsäure enthält.
Röhrchen nach einem der Ansprüche 12 bis 18, wobei die mehreren Blutzellen materne Blutzellen umfassen.
Röhrchen nach einem der Ansprüche 12 bis 19, wobei nach 7 Tagen Kontakt zwischen den Blutzellen und dem Schutzmittel das Röhrchen eine Konzentration an zellfreier fötaler DNA von 3,4% bis 6,2% der Gesamtmenge der zellfreien DNA im Röhrchen enthält.