JP2004511251A - 核酸増幅コントロール - Google Patents
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Abstract
Description
(発明の分野)
本発明は、一般的に、生物学的サンプル中のウイルス検出の領域に関する。より詳細には、本発明は、核酸増幅方法によるウイルス検出において、信頼性のあるコントロールとして機能し得る組成物に関する。
【0002】
(関連分野の説明)
生物学的サンプル中のウイルス(例えば、ヒト免疫不全ウイルス(HIV))の存在は、代表的に、間接的な方法によって、すなわち、特定のウイルスまたはウイルス成分に対する抗体を検出することによって、同定される。この検出方法は、微量のウイルスを検出するその能力によって制限される。なぜなら、抗体は、代表的に、ウイルスが体内でかなり増殖するかまたはかなり再生される後まで、検出可能なレベルで出現しないからである。従って、例えば、輸血のための血液供給物をスクリーニングする方法において、既存の間接的な方法は、感染した血液を十分にスクリーニングし得ない。初期段階でウイルス感染を診断するための努力において、生物学的サンプル中のウイルスを検出し、そして定量するために核酸増幅技術が開発されている。このような技術としては、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)、転写媒介増幅(TMA)、核酸のシグナルに基づく増幅(nucleic acid signal based amplification)(NASBA)、およびリガーゼ連鎖反応(LCR)が挙げられる。これらの技術は、ウイルス感染の診断および処置の間に感染個体中に負荷されたウイルスをモニターするのに、有用である。さらに、これらの技術は、輸血前に血液をスクリーニングする場合に、有用である。
【0003】
1999年の春から、American Red CrossおよびAmerica’s Blood Centersの16室の研究室は、非常に初期段階でのウイルス感染を検出するように設計された新規遺伝子試験を用いて、1型ヒト免疫不全ウイルス(HIV)およびC型肝炎ウイルスについてドナー血液を試験し始めた。これらの試験(核酸試験(NAT)を称される)は、血液ドナーの身体が免疫応答を高める前に、少量のウイルスを検出し得る。NATの能力とは、抗体の存在について間接的に試験するよりも、ウイルスゲノム核酸について直接試験することによって感染の存在を検出するその能力である。さらに、NATが臨床検体において50ウイルス粒子という低さで検出し得るという点で、NATは、HIV p24抗原検出アッセイのような他の直接的検出方法よりも、はるかにより感度がよい。NATは、潜在的に、感染の約10日後に血液中のHIVを検出し得る。米国食品医薬品局(FDA)は、血液銀行にNAT試験を始めること、および病院にNATスクリーニングされた血液を使用することを、強く奨励している(Kornmanら,1999,Cancer Control,Volume 6,Number 5)。
【0004】
いくつかの市販のNATキットおよびNATサービスは、HIV、C型肝炎ウイルス(HCV)およびB型肝炎ウイルス(HBV)の試験について利用可能である(例えば、Roche Diagnostics(Indianapolis,IN)、National Genetics Institute,Inc.(Los Angeles,CA)、Bayer Corporation(Tarrytown,NY)およびGen−Probe,Inc.(San Diego,CA)によって販売されるキットおよびサービス)。これらのキットおよび試験サービスは、複数のアッセイを使用し、ここで、最初の工程は、標的核酸の抽出または部分的な精製であり、続いて、その核酸の増幅および検出である。従って、NATに基づく検出のために開発されたポジティブコントロールは:1)感染個体由来の血漿または血清であり、そして2)合成核酸およびクローン化された核酸である。これらのコントロールは、いくつかの欠点を有する。例えば、感染個体由来の血漿または血清は診断手順中の全工程に対して完全な処理コントロールとして機能するが、これは、感染性物質を含み、そして冷蔵庫の温度(2〜8℃)にて安定ではない。合成核酸またはクローン化された核酸は、抽出工程に対するコントロールとしては機能せず、従って、完全な処理コントロールではない。さらに、合成核酸およびクローン化された核酸は、ヌクレアーゼに極度に感受性であり、ゆえに、操作に特別の注意が必要とされる。ヌクレアーゼ耐性「強化(armored)RNA」が開発された。しかし、この強化材料は、インタクトなウイルス粒子内に含まれず、従って、ウイルス感染血漿と同様に抽出されない。従って、強化材料は、抽出処理に対するコントロールとして機能せず、さらにTMAでもLCRでも増幅しない。
【0005】
FDAのThe Center for Biologies Evaluation and Research(CBER)の支部は、HIV NATコントロール材料についてのガイドラインを発表した。このガイドライン(Guidance for Industry,In the Manufacture and Clinical Evaluation of in vitro Tests to Detect Nucleic Acid Sequences of Human Immunodeficiency Viruses Types 1 and 2,BBS,FDA,CBER,1999年12月)は、NATに基づくキットに対するコントロールおよび検定物質の形式および性能についての、FDAの推奨を提供する。これらのガイドラインに従って、コントロール材料は、完全な処理コントロールとして機能するべきであり、すなわち、コントロール材料は、サンプル操作および検出処理の全工程に対するコントロールとして機能するべきである。さらに、このガイドラインのもと、材料は、非感染性であり、かつ十分に検証された微生物に基づくべきである。従って、理想的なコントロールは、超遠心工程、抽出工程、増幅工程、ハイブリダイゼーション工程、定量工程、および可能性のある夾雑の指標を提供するべきである。
【0006】
従って、FDAのガイドラインおよび既存のコントロール材料によって同定された欠点を考慮すると、ウイルス検出技術の領域において、完全な処理コントロールとして機能し得、冷蔵庫の温度で安定であり、そして操作するのに安全であるポジティブコントロールを開発する必要性がある。
【0007】
従って、本発明の目的は、核酸増幅技術による微生物の検出のための、非感染性の完全な処理ポジティブコントロールを提供することである。
【0008】
本発明の別の目的は、本発明の内部コントロールを生成するための方法を提供することである。
【0009】
本発明の別の目的は、核酸増幅技術による微生物の存在について、生物学的サンプルをスクリーニングする方法を提供することである。
【0010】
これらの目的およびさらなる目的が、核酸増幅検出技術においてポジティブコントロール材料として使用される、破壊されていない不活化微生物粒子を含む本発明によって満たされる。コントロール材料は、破壊されていない不活化微生物を含み、そして安定化された血漿マトリックス中に処方され得る。コントロール材料は非感染性であり、不凍保存(例えば、2〜8℃)下で安定であり、そして核酸増幅アッセイにおいて再現性のある結果を生じる。本発明のコントロール材料は、冷蔵庫温度で保存され得る。さらに、このコントロール材料は全微生物粒子を含むので、これは、完全な処理コントロールとして実施され、従って、試験される生物学的サンプルと正に同じ様式で操作され、そして処理される。完全な処理コントロールとして、この材料は、サンプル調製工程中で使用され得、そして検出手順全体を通して保有される。従って、本発明のコントロール材料は、FADガイドラインに適合する品質である。
【0011】
本明細書を通じて引用される参考文献は、本発明を提供する技術状況をより完全に記載するために、本明細書中にその全体が本明細書によって援用される。
【0012】
(発明の要旨)
本発明は、核酸増幅技術のための信頼性のあるコントロールとして機能し得る、ポジティブコントロール材料を提供する。本発明のこのポジティブコントロール材料は、一般的に、非感染性にされたが核酸増幅プロセスおよび検出プロセスを受けやすいように実質的にインタクトな核成分を保持する、ウイルスまたは粒子を含む。
【0013】
従って、本発明は、表面タンパク質および実質的にインタクトな核成分を含む精製された微生物を提供し、ここで、1つ以上の表面タンパク質は、微生物が改変によって非病原性になるように、不可逆的に改変される。
【0014】
本発明はまた、表面タンパク質および実質的にインタクトな核成分を含む精製された微生物を提供し、ここで、1つ以上の表面タンパク質は、この微生物が改変によって非病原性になるように、化合物の共有結合によって非可逆的に改変され、この化合物は、表面タンパク質上の1つ以上の反応部位に対して反応性の1つ以上の官能基を含む。
【0015】
本発明はさらに、表面タンパク質およびインタクトな核成分を含む精製微生物、ならびに生物学的流体を刺激する液体マトリックスを含む組成物を提供し、ここで、1つ以上の表面タンパク質は、微生物が改変によって非病原性になるように、不可逆的に改変される。
【0016】
本発明はまた、表面タンパク質およびインタクトな核成分を含む非病原性の精製微生物を生成し、かつこの微生物が改変によって非病原性になるように、実質的に未改変の核成分を残しながら1つ以上の表面タンパク質を不可逆的に改変するための方法を提供する。
【0017】
本発明はまた、微生物の核成分を増幅することによって、生物学的サンプル中において表面タンパク質を含む微生物を検出する方法を提供し、この方法は、この微生物の精製コントロールサンプルの核成分の増幅を含み、ここで、コントロール微生物の1つ以上の表面タンパク質は、このコントロール微生物が改変によって非病原性になるように、不可逆的に改変される。
【0018】
さらに、本発明は、表面タンパク質を有する微生物の存在について生物学的サンプルを分析するためのキットを提供し、ここで、このキットは、表面タンパク質およびインタクトな核成分を含む精製微生物を含むポジティブコントロール組成物を含み、ここで、1つ以上の表面タンパク質は、この微生物が改変によって非病原性になるように、不可逆的に改変される。
【0019】
本発明の他の特徴および利点が、以下の詳細な説明および上記の特許請求の範囲から明らかである。
【0020】
(発明の詳細な説明)
本発明は、表面タンパク質および実質的にインタクトな核成分を含む精製された微生物を提供し、ここで、1つ以上の表面タンパク質は、この微生物が改変によって非病原性になるように、不可逆的に改変される。
【0021】
本発明の実施において意図される微生物は、病原性であり、かつそれを検出することが病気の検出または処置を補助することになる、微生物である。本明細書中に使用される場合、用語「微生物」は、宿主に感染する微生物の能力を補助または援助する表面タンパク質を含む、任意の感染性の微視的生物を含む。例えば、gp120がHIVウイルスの表面上に存在し、そしてウイルスがそのCD4レセプターへの結合を介して単球およびリンパ球に結合することを可能にするレセプタータンパク質として機能する(Maddonら,1986,Cell,47:333;MacDougalら,1986,Science 231:382;Mooreら,1993,J.Bentz(編),Viral Fusion Mechanisms,CRC Press.Boca Raton,Fla)。別の好ましい実施形態において、微生物はウイルスであっても細胞内寄生虫であってもよい。本明細書中に使用される場合、用語「ウイルス」とは、エンベロープウイルスまたは非エンベロープウイルスのいずれかおよび核材料としてRNAまたはDNAのいずれかを含むウイルスを含むことを意味する。例としては、ヒト免疫不全ウイルス(HIV)、A型肝炎ウイルス、B型肝炎ウイルス、C型肝炎ウイルス、サイトメガロウイルス、ヒトリンパ栄養性ウイルス(human lymphotrophic virus)、エプスタイン−バーウイルス、パルボウイルス、単純疱疹ウイルス、ヒト疱疹ウイルス8が挙げられるが、これらに限定されない。細胞内寄生虫の例としては、Chlamydia trachomatis、Chlamydia psittaci、Rickettsia prowazeki、Rickettsia typhi、Rickettsia rickettsi、Rickettsia sibtricus、Rickettsia conori、Rickettsia australis、Rickettsia akari、Rickettsia tsutsugamushi、Coxiella bumetiおよびRochalimaea quintanaが挙げられるが、これらに限定されない。
【0022】
本発明のコントロール材料の調製のために、所望の微生物が、標準的な方法によって増殖され得る。例えば、HIVウイルスに関して、増殖方法は、米国特許第5,135,864号に開示され、この特許は、HIVの産生および精製を記載する。代替的な供給源として、微生物は、感染した生物学的流体から(例えば、感染動物由来の血液から)単離され得る。この技術は、細胞培養物からウイルスを精製する場合に使用される技術に類似する。Davisら,Microbiology,第2編(Harper & Row,1980)を参照のこと。従って、例えば、B型肝炎およびC型肝炎は、この方法によって感染個体の血液から精製され得る。さらに、所望の微生物の大量生産が、例えば、国立衛生研究所(NIH)のAIDS Research and Reference Reagent Programおよびアメリカンタイプカルチャーコレクション(ATCC)から利用可能である、慢性的に感染した細胞株から誘導され得る。
【0023】
一旦、十分な培養材料が利用可能になると、微生物が当業者に公知の技術を用いて精製され得る。代表的な精製方法は、以下である。微生物精製の最初工程は、細胞および細胞の破片の除去を含む。これは、大きさまたは質量に基づく分離技術(例えば、濾過または低速遠心)によって達成され得る。この後、微生物は、適切な孔サイズを用いたろ過または高速の遠心を用いた精製によって濃縮されて、部分的に精製された微生物調製物を形成し得る。次いで、この部分的に精製された調製物は、超遠心および密度勾配精製技術に供されて、精製された微生物調製物を獲得し得る。続く精製によって得られた大量の精製材料は、一般的に、−70℃で保存され、そして培養技術によってウイルス活性もしくは寄生虫活性について、ならびに当該分野で公知の方法もしくは本明細書中に記載される方法に従う増幅技術によって核酸の完全性について試験され得る。
【0024】
精製後、微生物は、その表面タンパク質の選択的改変によって本発明の方法に従って非病原性にされ、これによって、核成分を実質的にインタクトにしたままで、微生物を非感染性にする。従って、本発明は、非病原性微生物を生成するための方法を提供し、この方法は、表面タンパク質およびインタクトな核成分を含む精製された微生物を提供する工程、ならびに微生物が改変によって非病原性になるように、核成分を実質的に未改変のままで1つ以上の表面タンパク質を不可逆的に改変する工程を包含する。
【0025】
本明細書中に使用される場合、用語「実質的にインタクト」とは、核酸が本明細書中に議論される核酸増幅技術を受けやすいように、改変試薬による分解から十分な核内容物(特に、細胞の核酸内容物)を保存するために、微生物の細胞内成分と改変剤とを最小限に接触させることを考慮する。本明細書中に使用される場合、用語「非病原性」とは、本発明の方法に従う表面タンパク質の改変結果を意味し、この微生物は、その核内容物が実質的にインタクトであるにもかかわらず、細胞を感染し得ず、複製することも疾患を引き起こすこともできない。
【0026】
本発明の好ましい実施形態において、精製された微生物は、この微生物が改変によって非病原性になるように、化合物の共有結合によって改変され、この化合物は、表面タンパク質上の1つ以上の反応部位と反応性である1つ以上の官能基を含む。本明細書中に使用される場合、使用される「化合物」は、表面タンパク質に共有結合し得るか、または微生物上の2つ以上の表面タンパク質を架橋し得る化合物である。表面タンパク質は、代表的に、化合物の共有結合および架橋が可能である、いくつかの反応部位を含む。例えば、アミノ基は、アシル化によって改変され得;スルフヒドリル基は、付加反応およびアルキル化によって改変され得;カルボニル基およびカルボキシル基は、アシル化によって改変され得;そしてアルデヒド基およびヒドロキシル基は、アミノ化および還元性アミノ化によって改変され得る。これらの改変反応のうちの1つ以上が、本発明の非病原性微生物の調製に使用され得る。
【0027】
本発明のこの実施形態に従って、表面タンパク質改変は、一般的に、曝されたアミノ酸残基との反応を介したタンパク質への共有結合を含む。当業者に公知の任意の型の共有結合的な改変または架橋が使用され得るが、アミノ残基、スルフヒドリル残基、およびカルボン酸残基の共有結合的な改変または架橋を使用することが好ましい。例えば、アミノ基を改変する架橋剤としては、グルタルアルデヒドおよびパラホルムアルデヒドが挙げられる。これらの各々は、タンパク質末端由来または内部リジン側鎖のいずれかに由来する求核性遊離アミンによって、pH7より上において直ちに攻撃される。生じる生成物は、タンパク質の遊離アミンを有するシッフ塩基である。グルタルアルデヒドはまた、その反応性アミン残基によって特異的に攻撃されて、高い割合の架橋を導く。
【0028】
そのスルフヒドリル残基を介したタンパク質の改変のための適切な試薬は、不可逆的なスルフヒドリルブロッキング剤であるN−エチルマレイミド(NEM)またはn置換ビスマレイミド架橋剤である。NEMは、安定なチオエーテル結合を形成するスルフヒドリル結合と反応するアルキル化試薬である。この反応は、遊離アミンとの反応を回避するために、pH6.0にて実行され得る。他のスルフヒドリル反応試薬(例えば、ビスマレイミドヘキサン(BMH))もまた、使用され得る。BMHは、活性部位間に6炭素スペーサーを有する、ホモ二官能性架橋剤である。この架橋剤はまた、pH7.0において安定なチオエーテル結合を形成する。
【0029】
別々に好ましい実施形態において、使用され得る化学改変剤は、アルデヒド基のような単一の反応性官能基を含む、単官能性架橋剤を含有する。アルデヒド官能基を含む薬剤の例としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない:ホルマリン(ホルムアルデヒド)、アセトアルデヒド、プロピオンアルデヒド、n−ブチルアルデヒド、ベンズアルデヒド、p−ニトロベンズアルデヒド、p−トルアルデヒド、サリチルアルデヒド、フェニルアセトアルデヒド、2−メチルペンタナール、3−メチルペンタナール、および4−メチルペンタナール。あるいは、この化学改変剤は、以下のような官能基を含み得る:NHSイミデート、イミドエステル、マレイミド、クロロアセチル、フルオロアセチル、ヨードアセチル、ブロモアセチル、アミン、ヒドラジン、カルボジイミド、およびこれらの基の誘導体。好ましい実施形態において、この化学改変剤は、このような反応性官能基の2つ以上を含み、単一の表面タンパク質上の反応部位との複数の共有結合または別個の表面タンパク質の架橋を容易にする。2つの同一の官能基を含む化合物は、本明細書中でホモ二官能性(homobifunctional)構造を有すると呼ばれ、2つの異なる官能基を含む化合物は、ヘテロ二官能性(heterobifunctional)構造を有すると呼ばれる。特に好ましいホモ二官能性試薬としては、以下のようなジアルデヒドが挙げられる:パラホルムアルデヒド、グリオキサール、マロンジアルデヒド、スクシンアルデヒド、アジピンアルデヒド、グルタルアルデヒドおよびフタルアルデヒド。
【0030】
本発明の実施に有用である、いくつかの好ましい架橋剤および二官能性結合剤は、Pierce Chemical Companyから市販されており、そして利用可能な製品文献(この内容は、技術水準を記載するために、本明細書においてその全体が参考として援用される)に記載されている方法に従って使用され得る。このような化合物および一般的な方法の例は、以下の通りである。
【0031】
(N−(β−マレイミドプロピオン酸)ヒドラジド(BMPH))(Pierce Chemical Co.製品番号22297)。BMPHは、スルフヒドリル反応性かつカルボニル反応性のヘテロ二官能性剤である。このヒドラジド基は、アルデヒドを生成するために、酸化後、糖タンパク質および他の糖結合体中の糖残基に共有結合され得る。糖基は、特定のオキシダーゼ(例えば、ガラクトースオキシダーゼ)または過ヨウ素酸ナトリウムによるいずれかの使用によって酸化され得る。糖タンパク質を、0℃において1mMの過ヨウ素酸ナトリウムで処理して、シアル酸基をカルボニルを有するように酸化する。室温(RT)における10mMの過ヨウ素酸ナトリウムとの反応により、ジオールを含む全ての糖上にアルデヒドを生成する。BMPHとこれらのアルデヒドとの反応により、ヒドラゾン結合を生成する。架橋剤のマレイミド末端は、表面タンパク質上のスルフヒドリル基と反応され得る。スルフヒドリルが存在しない場合、これらは、ジスルフィド還元または2−イミノチオランもしくはSATAでのチオール化(thiolation)を介して生成され得る。マレイミドは、pH6.5〜7.5でスルフヒドリル基と反応し、安定なチオエーテル結合を形成する。マレイミド反応は、代表的に、室温にて約2時間、または4℃にて約4時間で完了する。
【0032】
(1−エチル−3−(3−ジメチルアミノプロピル)カルボジイミドヒドロクロリド(CAS#25952−53−8)(EDC))(Pierce Chemical Co.製品番号22980、22981)。EDCは、最初に、カルボキシル基と反応し、そしてアミン反応性中間体(O−アシルイソウレア)を形成する。水溶液を使用する、2工程の結合手順において、この中間体の安定化は、N−ヒドロキシスクシンイミドを使用して達成される。アミンとの反応は、この中間体の加水分解、このカルボキシルの再生、およびN−置換ウレアの遊離を生じる。副反応は、N−アシルウレアの形成であり、これは、通常、タンパク質の疎水性領域に位置するカルボキシルに制限される。
【0033】
(イミドエステル架橋剤)(Pierce Chemical Co.製品番号20660、20663、21667、21666、20700、20665)。ホモ二官能性イミドエステルは、1級アミノ基と反応して、安定な共有結合を形成し得る、2つの同一の基を有する。これらとしては、ジメチルアジポイミデート(DMA)、ジメチルピメルイミデート(DMP)、ジメチルスベルイミデート(DMS)およびジメチル3,3’−ジチオビスプロプリオンイミデート(DTBP)が挙げられる。他の連結化学物質のようではなく、イミドエステルは、タンパク質中の他の求核基に対して最小の架橋反応性を有する。穏やかなアルカリ性のpH(7〜10)において、イミドエステルは、1級アミンとのみ反応して、イミドアミドを形成する。イミドエステル結合は、通常、pH8.5と9.0との間で実施される。イミドエステルは、タンパク質の全体的な電荷に影響を与えないので、他の架橋剤を越える利点を有する。このイミドエステルは、これらが置換する1級アミンと同様に、生理学的pHにおいて正の電荷を有する。イミドエステル反応は、0℃または室温で実施される。なぜならば、高温は、これらの反応の際に、低い収率に寄与し得るからである。ホモ二官能性中間体は、異なる架橋ニーズのために基と基との間の距離を変えて(例えば、タンパク質と高分子錯体との残基間の距離、およびタンパク質間の隣接関係に適合するために)利用可能である。DTBP(チオールが切断可能であるホモ二官能性架橋剤)を、隣接関係を研究するために、これらの架橋剤の切断し得ない形態と結合させて使用する。DMPを、アガロース支持体上に固定したタンパク質Aに抗体を架橋するために使用した。
【0034】
(N−ヒドロキシスクシンイミドエステル(NHS−エステル))(Pierce Chemical Co.製品番号21555、21580、21655、21658、22311、22312、22416、22317、22309、22324、22307、22308)。ジスクシンイミジルスベレート(DSS)は、水不溶性のホモ二官能性NHSエステルであり;ビス(スルホスクシンイミジル)基質(BS3)は、その水溶性アナログである。これらの架橋剤は、切断し得ず、そして細胞表面レセプターに放射標識したリガンドを結合するために広範に使用される。さらなる例としては、以下のようなマレイミド基を有する、マレイミド種が挙げられる:m−マレイミドベンゾイル−N−ヒドロキシスクシンイミドエステル(MBS)、m−マレイミドベンゾイル−N−ヒドロキシスクシンイミドエステル(スルホ−MBS)、スクシンイミジル4−[p−マレイミドフェニル]ブチレート(SMBP)、スルホスクシンイミジル4−[p−マレイミドフェニル]ブチレート(スルホ−SMBP)、N−[γ−マレイミドブチリルオキシ]スクシンイミドエステル(GMBS)、N−[γ−マレイミドブチリルオキシ]スルホスクシンイミドエステル(スルホ−GMBS)、N−[ε−マレイミドカプロイルオキシ]スクシンイミドエステル(EMCS)、およびN−[ε−マレイミドカプロイルオキシ]スルホスクシンイミドエステル(スルホ−EMCS)。
【0035】
1級アミンは、NHS−エステルのための主な標的である。アクセス可能なα−アミン基は、NHS−エステルと反応する、ペプチドおよびタンパク質のN末端上に存在する。しかし、α−アミンは、タンパク質上でまれにしか利用可能でなく、従って、アミノ酸の側鎖との反応は、重要となる。5つのアミノ酸は、側鎖中に窒素を有するが、リジンのε−アミンのみが、NHS−エステルと有意に反応する。共有アミド結合は、NHS−エステル結合試薬が、1級アミンと反応する場合に、形成される。この反応は、N−ヒドロキシスクシンイミドの遊離を生じる。
【0036】
NHS−エステル架橋反応は、リン酸塩、炭酸塩/重炭酸塩、HEPESおよびホウ酸塩の緩衝液中で最も一般的に実施される。他の緩衝液はまた、1級アミンを含まないことを条件として、使用され得る。1級アミンは、Trisの構造中に見出され、TrisをNHSエステル反応に対して許容不可能な緩衝液にする。中性〜塩基性のpHにおいて、大過剰のTrisが、反応をクエンチする目的で反応の最後に添加され得る。グリシンは、同様な様式で使用され得る1級アミンである。
【0037】
NHS−エステルは、1級アミンに対して本質的に同一の反応性を有する2つの別個のクラス(水溶性形態および不水溶性形態)に広範に分類され得る。水溶性NHS−エステルの溶解度は、N−ヒドロキシスクシンイミド環上のスルホネート(−SO3−)基に起因する。スルホン化NHS−エステルの架橋剤は、ナトリウム塩として供給され、そして10mMの濃度まで水溶性である。
【0038】
N−ヒドロキシスクシンイミドエステル結合試薬の非スルホン化形態は、水溶性ではない。これらの化合物は、まず、有機溶媒中に溶解され、次いで水性反応混合物に添加される。水不溶性NHS−エステル架橋剤は、荷電した基を有さない。この架橋剤は、親油性であり、従って膜透過性である。この架橋剤は、細胞内結合および膜内結合のために有用である。
【0039】
水不溶性NHS−エステルは、有機溶媒(例えば、DMSOまたはDMF)中に溶解され得る。次いで、この架橋剤溶液を、この水性反応性混合物に添加し、その最終容積は、10%までの有機溶媒を含む。架橋剤は、乳状の濁った溶液の外観によって示されるような高濃度の溶液になり始める。架橋はなお、このような条件下で生じ得るが、このプロトコールは、NHS−エステルの完全な溶解を確実にするために改変され得る。例えば、この水相は、さらなる有機溶媒で補充され得る。
【0040】
マレイミド基は、反応性混合物のpHが6.5と7.5との間に保たれる場合、スルフヒドリル基に対して最も選択的である。pH7において、スルフヒドリルとマレイミドとの反応の速度は、アミンとの反応よりも1000倍速い。このpHの範囲を越えると、1級アミンとの反応速度は、より顕著となる。マレイミドは、ヨードアセトアミドのように、チロシン、ヒスチジンまたはメチオニンと反応しない。マレイミド基と反応したスルフヒドリルとの間の安定なチオエーテル結合が、形成され、これにより、生理学的条件下で、切断され得ない。マレイミドの非反応性マレアミック酸(maleamic acid)への加水分解は、特にpH8.0より上で、チオールの改変で完了し得る。加水分解は、チオール結合の前または後に生じ得る。
【0041】
β−メルカプトエタノール、ジチオトレイトール、メルカプトエチルアミン、システイン、および他のチオール化合物は、結合の前に除去されなければならない。過剰なマレイミドは、システインまたはβ−メルカプトエタノールのような遊離チオールの添加によって、インキュベート期間の終わりにクエンチされ得る。EDTAは、ジスルフィドの再酸化を防止するために結合緩衝液中に含まれ得る。
【0042】
(1,4−ビス−マレイミドブタン(BMB))(Pierce Chemical Co.製品番号22331)。BMBは、中間の長さのスルフヒドリル反応性ホモ二官能性架橋剤である。この架橋剤のマレイミド末端は、表面タンパク質上のスルフヒドリル基と反応し得る。スルフヒドリルが存在しない場合、これらは、ジスルフィド還元または2−イミノチオランもしくはSATAでのチオール化を介して生成される。マレイミドは、pH6.5〜7.5で−SH基と反応し、安定なチオエーテル結合を形成する。マレイミド反応は、室温にて約2時間、または4℃にて約4時間で完了する。
【0043】
架橋剤または結合剤との反応後、この反応は、適切な薬剤(例えば、共有結合により改変された反応基中に含まれるのと同一の反応基を有する薬剤)を使用することによってクエンチされる。例えば、グリシンは、パラホルムアルデヒドでの架橋をクエンチするために使用され得る。
【0044】
精製されたウイルスはまた、タンパク質上のカルボン酸残基にアミノ酸を結合させることによって不活化され得る。結合剤の例としては、活性なアルデヒド中間体を形成するために、タンパク質上にある、糖ヒドロキシルおよび末端カルボン酸を酸化する過ヨウ素酸ナトリウムである。次いで、この活性化された基を、グリシンまたはリジンの形態で上昇したpHで求核試薬に曝露し、これにより、アミノ酸のタンパク質への不可逆的な結合を生じ得る。結合プロトコールを最適化するために、結合時間、温度、および振盪速度を変えることは、十分に当業者の範囲内である。
【0045】
別の好ましい実施形態において、この微生物は、市販の方法によって表面タンパク質を酵素により消化することによって、非病原性にされ得る。表面タンパク質の改変のために使用され得る酵素としては、以上が挙げられるが、これらに限定されない:ブロメライン、キモトリプシン、クロストリパン(clostripain)、コラゲナーゼ、エラスターゼ、フィシン、カリクレイン、メタロエンドペプチダーゼ、プロテイナーゼ、アミノペプチダーゼ、カルボキシペプチダーゼ、第Xa因子、パパイン、キモパパイン、ペプシン、黄色ブドウ球菌プロテアーゼ(V−8株)、またはトリプシン(単独または組み合わせのいずれか)。本発明のこの局面において、微生物の表面タンパク質を少なくとも部分的に消化して、この微生物を非病原性にするのに十分であり、微生物の核酸含有量を実質的にインタクトで維持する、条件および期間で、この微生物は、反応混合物中で酵素調製物と反応される。このような反応のための酵素溶液を調製する方法およびこの反応を実施する方法は、当業者に公知であり、そして手引きは、The Worthington Enzyme Manual(Worthington Biochemical Corporation)のような教科書において見出され得る。
【0046】
任意の特定の酵素の選択は、入手可能性、使用し易さ、および基質特異性のような因子(これらの各々は、当業者によって評価され得る)に依存し得る。反応は、微生物が酵素に曝される時間の長さによって、または酵素インヒビターとの反応をクエンチすることによって制御され得る。例えば、パパインおよび同様にキモパパインは、複数のペプチド結合およびエステル結合を加水分解し、そして例えば、システイン、スルフィド、およびスルファイトによって活性化され、そしてスルフヒドリル試薬(重金属を含む)、カルボニル試薬、およびアスコルビン酸のような試薬の添加によって阻害される。キモトリプシン(アミドおよび感受性のアミノ酸のエステルに対して容易に作用するエンドペプチダーゼ)は、芳香族アミノ酸を含む結合に対して特異性を有し、そしてロイシル、メチオニル、アスパラギニル、およびグルタミルの残基の結合の加水分解を触媒する。この酵素は、例えば、重金属、および有機リン化合物によって阻害される。トリプシン(タンパク分解性酵素)は、アルギニンまたはリジンのカルボキシ基と別のアミノ酸のアミノ基との間のペプチド結合の加水分解を触媒し、そして例えば、有機リン化合物、ベンジル4−グアニジノベンゾエート(4−guanidiobenzoate)および4’−ニトロベンジル4−グアニジノベンゾエートによって阻害される。ペプシンは、種々のペプチド結合の加水分解を触媒するエンドペプチダーゼであり、そしてフェニルアシルブロミド、脂肪族アルコール、およびジフェニルジアゾメタンによって阻害される。
【0047】
上記の手順によって不活化されたウイルス性物質は、最終の反応混合物中に存在する他の材料から分離される。これは、標準的な精製技術によって達成され、これには、透析、ゲル濾過およびタンジェンタル(tangential)濾過が挙げられるが、これらに限定されない。最終の精製された不活化調製物を、当業者に公知の方法によって活性ウイルスの存在について試験し得る。活性ウイルスについて試験する従来の方法は、ウイルスが複製する能力について試験することである。例えば、HIVについて、この試験は、培養培地中でHIV p24抗原の産生をモニタリングすることによってなされ得る。本発明の精製された不活化微生物は、2〜8℃のような不凍結温度で貯蔵され得る。
【0048】
本発明は、表面タンパク質およびインタクトな核成分を含む、精製された微生物を含む物質(ここで、1つ以上の表面タンパク質は、不可逆的に改変され、これにより、この微生物が非病原性にされる)および液体マトリクスの組成物をさらに提供する。従って、ポジティブコントロール物質として調製される場合、この精製された不活化微生物は、好ましくは、生物学的サンプルが分析される流体に対応する安定化された生物学的流体を含む、液体マトリクスに懸濁される。このような流体としては、血清、血漿、線維素除去された血漿、安定化された血漿プール、脳脊髄液(CSF)、尿、唾液、精液および痰が挙げられるが、これらに限定されない。あるいは、液体マトリクスは、生物学的な流体をシミュレートするために処方される合成マトリクスを含み得る。合成の生物学的流体を調製する方法は、当該分野で周知である。さらに、この液体マトリクスは、抗酸化剤、緩衝塩、保存剤および抗生物質のような添加物、糖(単糖類および多糖類)のようなマトリクス安定性賦形剤、タンパク質(アルブミン、オボアルブミン、γグロブリン、赤血球溶解物、カゼイン、乾燥粉ミルク、および/または他の血清タンパク質を含む)、ポリビニルピロリジン、ポリ−1−リジン、およびメチル化ウシ血清アルブミン(BSA)のような合成安定剤を含み得る。この液体マトリクスはまた、例えば、スクロースおよびマンノースの添加によって、凍結乾燥での長期間の保存性および安定性のために改変され得る。
【0049】
さらに、本発明は、表面タンパク質を有する微生物の存在について生物学的なサンプルを分析するためのキットを提供し、ここで、このキットは、表面タンパク質および実質的にインタクトな核成分を含む、精製された微生物のサンプルを含む、ポジティブコントロール組成物を含み、ここで、1つ以上の表面タンパク質は、非可逆的に改変され、これにより、この微生物が非病原性にされる。好ましい実施形態において、このキットは、上記のような液体マトリクス中に、非病原性微生物コントロールを含む。本発明の実施において、このキットは、当業者に公知の核酸増幅技術を行うのに必要なさらなる材料を含み得る。さらに、本発明は、核酸増幅技術に使用される現存のキットおよびサービスに、本発明の非病原性微生物の追加を含むことが意図される。このようなキットおよびサービスとしては、以下が挙げられるが、これらに限定されない:Roche Diagnostics(Indianapolis,IN)(COBAS AMPLICORの商品名)によって市販されているキットおよびサービス、National Genetics Institute,Inc.(Los Angeles,CA)、Bayer Corporation(Tarrytown,NY)およびGen−Probe,Inc.(San Diego,CA)により市販されているNATスクリーニングサービス。
【0050】
本発明の非感染性の不活化コントロール材料は、核酸増幅技術の全プロセスに関してポジティブコントロールとして役立つ。例えば、不活化HIVウイルスを含む、本発明のコントロール材料は、(1)サンプルの調製(カオトロピック(chaotrophic)塩/溶媒抽出物)、(2)必要な場合、cDNAを産生するためのRNAの逆転写、(3)核酸の増幅、および(4)増幅された核酸の検出の工程を介して処理され得る。
【0051】
従って、本発明はまた、微生物の核成分の増幅によって、生物学的サンプル中での表面タンパク質を含む微生物を検出する方法を提供し、この方法は、本発明の精製したコントロール物質の核成分を増幅する工程を包含する。好ましい実施形態において、この方法は、以下の工程を包含する:(a)本発明の非病原性微生物コントロールを微生物サンプルに添加して、対応する微生物の存在について試験するサンプルを調製する工程;(b)増幅される標的核酸を抽出する工程;(c)標的核酸を増幅する工程;(d)この増幅された標的核酸を検出可能に標識された増幅された核酸プローブとハイブリダイズさせる工程;(e)このハイブリダイズされた標的核酸を検出する工程。このような個々の方法の工程は、当業者に周知である。例えば、標的核酸の増幅は、RNAをcDNAに逆転写した後、DNAまたはRNAをポリメラーゼ連鎖反応(PCR)することによって達成され得る。ハイブリダイゼーションおよび検出は、例えば、アルカリホスファターゼ標識された核酸プローブの使用によって、またはエネルギー移動法(energy transfer methodology)を用いたアンプリコンの検出によって達成され得る。特に好ましい実施形態において、この方法は、生物学的サンプル中に含まれる標的核酸を定量する工程をさらに包含し得る。
【0052】
本発明の実施において、この方法は、スクリーニング方法(注入または移植の前に、生物学的な流体をスクリーニングするような方法)、診断ツール(病原性微生物を有すると疑われる個体からの生物学的流体を、このような微生物の存在について分析するツール)または治療モニタリングツール(感染の処置を受けている患者からの生物学的なサンプルを、微生物の存在およびその量について分析するツール)として使用され得る。
【0053】
本発明の種々の実施形態および利点は、以下に示される実施例からより良好に理解されるが、これらは、例示を意図するものであって、限定を意図するものではない。
【0054】
(実施例1)
この実施例は、精製されたHIV粒子の大規模製造を記載する。慢性的に感染された細胞株(BP−1と称する)を使用して、このウイルスを提供した。この細胞株は、元のH−9細胞株の高産生性改変体であり、そしてDr.Bernard Poieszによって提供された。この細胞株を、FBSおよび抗生物質(ペニシリンおよびストレプトマイシン)を補充したRPMI−1640培地中に維持した。各細胞株のマスター細胞バンク(MCB)および作用細胞バンク(WCB)を樹立し、そして生物製剤の製造に対して認容されたUSFDAガイドラインに従って、維持した。代表的にMCBは、30〜50バイアルの凍結細胞を有する。MCBのバイアルを解凍し、培養において増殖させ、そして30〜50バイアルの、WCBを構成する凍結細胞を調製するために使用する。MCBおよびWCBを、安全な液体窒素容器内に貯蔵し、そして追跡可能性を確実にするために、対数を維持する。
【0055】
HIV製造のために、細胞株のWCBバイアルを解凍し、そしてRPMI−1640、ウシ胎仔血清(FBS)および抗生物質を含む培養において増殖させた。最初に、細胞を固定的細胞培養フラスコ内で、1リットルの容量に達するまで増殖させた。この時点で、細胞を、1つのボトルあたり1リットルの培養流体を含む2リットルのローラーバッフルに移し、そして60〜70のローラーボトルの製造規模に達するまで、さらに増殖させた。ローラーボトル培養物を、書面の標準操作手順に従って維持し、そして慣用的な試験を行って、マイコプラスマおよび他の外来性因子を確認した。
【0056】
一旦、培養物が製造規模に達したら、ローラーボトルを1週間に1度採取した。代表的に、各培養物の90%を採取したが、これは、採取の時点の細胞密度によってわずかに変動し得る。採取された細胞培養物を、2つの濾過ループからなる二重流路の接線流システム内で処理した。第1のループは、10平方フィートの0.45μmの膜を使用して、細胞および細胞砕片を除去し、そして第2の流路は、10平方フィートの300Kdのカットオフ膜を使用して、ウイルスを含む培養上清を濃縮した。このシステムを、tris緩衝化生理食塩水で2回洗浄し、そしてウイルスを含む上清を、約2リットルに濃縮した。
【0057】
ウイルスを、超遠心分離(30,000×g)によって、濃縮した上清から単離した。ペレット化したウイルスを、50mlのtris緩衝化生理食塩水に再懸濁させた。次いで、この物質を、1.2リットルの22〜66%のスクロースの直線勾配で装填し、そしてウイルスを密度勾配超遠心分離によって精製した。ビリオンを含む勾配画分を、屈折率によって同定し、そしてプールした画分を、tris緩衝化生理食塩水で希釈し、そしてビリオンを再度ペレット化させた。次いで、ビリオンを、リン酸緩衝化生理食塩水に再懸濁させた。
【0058】
生存可能なウイルスの増殖および精製を含む、全ての製造活性を、生物学的レベル3(BL−3)の実験室内で実施した。これらの手順によって生じた液体廃棄物を、次亜塩素酸塩(hypoclorite)または活性化ヨウ素で処理し、その後、市の下水に排出した。固体廃棄物を、オートクレーブによって処理し、その後、BL−3実験室から移動させた。
【0059】
(実施例2)
この実施例は、表面タンパク質を架橋することによる、本発明により精製されたウイルスの不活化の1つの方法を記載する。説明として、ビリオンエンベロープタンパク質の、パラホルムアルデヒド(組織および細胞の調製のために通常使用される固定性物質)との架橋を試験した。生物学的流体中でのウイルスの不活化のために、この固定性物質の滴定を、CDCによって推奨される濃度より高濃度および低濃度で実施した(1992年5月8日/41(RR−8);001 CDC Guidelines for the Performance of CD4+ T−Cell Determinations in Persons with Human Immunodeficiency Virus Infection)。最初に、精製したウイルスを2〜8℃で6〜8時間ゆっくりと解凍して、ウイルスの溶解を最小にした。次に、氷上のままで、ウイルスを冷PBSで、約1×1010コピー/mL(cp/mL)の最終濃度に希釈した。次いで、希釈したウイルスを4つの異なる5mlのアリコートに分割し、そして新たに調製したパラホルムアルデヒドを、それぞれに0.625、1.25、2.5、または5%のいずれかの最終濃度で添加した。次いで、これらの反応混合物を、穏やかに揺らしながら、2〜8℃で60分間インキュベートした。この反応をクエンチするために、1mLの0.5Mグリシン(pH7.4)を添加し、そして残余の全てのパラホルムアルデヒドと反応させた。グリシンの添加後、この反応物を2〜8℃で2時間、穏やかに揺らした。グリシンおよび任意の過剰のクエンチされていない固定性物質を除去するために、次いで、各反応混合物を、1LのPBS(pH7.4、2〜8℃)に対して4回交換して透析した(10〜14K分子量カットオフ)。次いで、透析したウイルスを15mLのチューブに移し、そして3,000×gで10分間遠心分離して、任意の沈澱したウイルスをペレット化させた。次いで、各上清のサンプルを、細胞培養において、感染性ウイルスの存在について試験した。
【0060】
残余の不活化ウイルスを、以下からなる安定化した血漿マトリックスで滴定した:リン酸緩衝化生理食塩水(pH7.4)中の、4%クエン酸ナトリウム中に収集したヒト起源の血漿、1mL EDTA、1U/mLリボヌクレアーゼインヒビター(ヒト胎盤)、0.09% NaN3、1mMジチオトレイトール、0.05%ゲンタマイシン。他のウイルスに対してこのマトリックスを最適化するために、1種以上の添加剤が削除され得る。
【0061】
(実施例3)
実施例2に記載されたように産生した改変ウイルスを試験して、このプロセスがウイルスを不活化したことを確認した。説明として、American Type Culture Collectionから入手したCEM細胞株を、ウイルス感染性研究についての宿主細胞として使用した。この株を使用することの利点は、インビトロHIV感染の確立が、比較的少ないビリオンを必要とすること、およびこの感染が、細胞溶解性ではなくむしろ慢性的であり、分析を容易にすることである。これらの研究のために、ZeptoMetrix HIV p24 Antigen EIA(ZeptoMetrix,Buffalo NY)を使用して、感染を検出および追跡する。
【0062】
CEM細胞を、10%FBSを含むRPMI−1640中で、24ウェルプレート内で培養する。細胞を、1ml容量で1ウェル当たり105細胞でプレートし、そして種々のウイルス(処理されたか処理されていないかのいずれか)の希釈物100μlを、個々のウェルに添加する。培養物に、週に2回、50%培地交換を与え、そして培養上清を、HIV p24についてアッセイする。全ての培養物が、最初はHIV p24を含む。しかし、ウイルスが非感染性である培養物においては、HIV p24レベルは経時的に低下し、最終的にバックグラウンドレベルに達する。感染性のビリオンを含む培養物は、経時的に増加するレベルのHIV p24を示し、非感染性ウイルスを含む培養物に対する感染性ウイルスを含む培養物の容易な識別を可能にする。従って、ウイルスの異なる希釈物を使用して得られた結果を比較することによって、感染性HIVのいかに多くの対数が、所定の処置手順によって不活化されたかを推定し得る。
【0063】
表1は、精製されたHIVが異なる濃度のパラホルムアルデヒドで60分間処理された実験からのデータを要約する。ここで、HIVのアリコートをとり、そして0.625%、1.25%、2.5%または5.0%のパラホルムアルデヒドで処理した。次いで、処理されたウイルスの異なる希釈物(1:8,000、1:80,000、および1:800,000)を、CEM細胞の培養物に入れ、そしてp24アッセイを、接種の3日後、7日後、10日後、および14日後に、培養上清において実施した。データを、培養上清におけるHIV p24タンパク質のpg/mlとして表す。p24アッセイに対する標準曲線は、7.8pg/ml〜125pg/mlで直線である。7.8pg/ml未満のHIV p24濃度を「<7.8pg/ml」で表して、このアッセイの感度を示し、そしてこのアッセイは125pg/mlより上では非直線であるので、125pg/mlより高い値を「>125pg/ml」で表す。
【0064】
【表1A】
【0065】
【表1B】
【0066】
【表1C】
【0067】
【表1D】
【0068】
処理されていないウイルスは、14日の期間の間の全ての培養物におけるHIV p24の存在を証拠とする場合、全ての培養物において、試験した全ての希釈物で、増殖した。他方で、パラホルムアルデヒドでのウイルスの処理は、14日目までに培養上清において、検出不可能な量のp24を生じた。3日目、7日目および10日目に検出され得たHIV p24 Agのレベルは、14日の期間にわたってこれらのレベルが次第に低下することを証拠とする場合、不活化したウイルスを培養物に添加したことに起因した。表2は、ウイルスが架橋剤と共にインキュベートされる曝露時間(分)に従って、本発明の不活化方法の効果を示す。
【0069】
【表2A】
【0070】
【表2B】
【0071】
【表2C】
【0072】
【表2D】
【0073】
(実施例4)
本実施例は、表面タンパク質の酵素消化によって本発明のコントロール材料を調製する方法を提供する。精製したウイルス(例えば、実施例1のように生成される)を、Hankの緩衝化生理食塩水中、0.25%ウシトリプシンおよび0.1% EDTAを含有する混合物において、37℃にて約2時間、インキュベートする。インキュベートの終わりに、この反応を、等量の胎仔ウシ血清を添加することによって止める。次いで、材料を公知の技術に従って精製し、そして非病原性を、実施例3に記載のような方法によって確認する。
【0074】
(実施例5)
本実施例は、このウイルス核酸がインタクトであり、その結果、実施例3に記載される不活化手順に従って増幅できることを実証する。説明のように、化学的に不活化したHIVがPCRによってなお検出されるか否かを試験するために、実験を実施した。COBAS AmpliScreen HIV−1 Monitorアッセイ(Roche)(HIV RNAコピー数を定量化する臨床キットに基づくPCR)を使用した。これらの実験を、安定化した血漿形成において、実施例3に記載される不活化反応からの材料を滴定することによって実施した。次いで、DNAse、RNAseおよび発熱物質を含まないPCRチューブ(Chasma Scientific,Cambridge,MA)に分注した。HIV RNAコピー数の定量化を、Roche COBASアッセイを用いて、低温凍結ウイルスのサンプル上で決定した。サンプルを、1:1000に希釈し、そしてデータをこの希釈でのコピー数として表す。このデータを、以下の表3にまとめる。
【0075】
【表3】
【0076】
(実施例6)
いくつかの架橋試薬を、種々の濃度での不活化HIVにおけるこれらの効力について試験した。表4に、本実験において使用した材料(これらの濃度、体積、分子量および質量)を列挙する。
【0077】
【表4】
【0078】
希釈前のHIV緩衝液を調製するために、生存するHIVを解かし、そして氷上に置く。1つの希釈において、0.5mLのHIVを、20mLのPBS緩衝液に添加し、次いで穏やかに混合し、そして氷上に貯蔵する。別の希釈において、0.5mLのHIVを、20mLのMBS緩衝液に添加し、次いで穏やかに混合し、そして氷上に貯蔵する。
【0079】
架橋反応のために、表5(DNAサンプルについて)および6(BMBサンプルについて)の通り、HIVを架橋試薬および/または希釈物(PBSもしくはMES)の1つと結合させ、そして室温にて2時間、穏やかに混合した(x、y、zローテイター)。この反応を、0.5mL(0.5M)のグリシンの添加によって室温にて1時間クエンチした(表5および6に示す)。次いで、2.4mLの反応混合溶液を、PD−10 Desaltingカラム(生理食塩水で予め平衡化した)に添加した。このウイルスを、3.5mLの生理食塩水を用いて溶出した。
【0080】
【表5】
【0081】
BMPHとの架橋のために、HIVを、最初に過ヨウ素酸Naで予め処理して炭水化物を酸化した。過ヨウ素酸NaおよびHIVを結合させ、そして30分間、暗所にてインキュベートした。BMPHと架橋させるために、BMPHを予め処理したHIVに添加し、そして室温にて2時間穏やかに混合した。この反応を、0.5mL(0.5M)のグリシンの添加によってクエンチした。室温にて1時間インキュベートした。2.5mLの反応混合溶液を、Desaltingカラムに添加し、3.5mLの生理食塩水で溶出し、次いで0.5mL画分にアリコートした。HIVを、脱繊維素血漿プールを用いて1:10に希釈した。表7に材料と試験した量を列挙する。
【0082】
【表6】
【0083】
EDCとの架橋のために、HIVをグリシンと結合させ、そして2分間混合した。EDCを水に添加し、滴定し、次いで900μLを反応混合溶液に添加し、そして室温にて2時間インキュベートした。この反応混合溶液を、Desaltingカラムで精製し、3.5mLの生理食塩水で溶出し、次いで0.5mL画分にアリコートした。HIVを、脱繊維素血漿プールを用いて1:10に希釈した。表8に材料と試験した量を列挙する。
【0084】
【表7】
【0085】
このようにして、生成したコントロール材料を、実施例5に記載のRoche Cobas HIV−1 Monitorアッセイにおいて試験した。結果を表9に記載する。
【0086】
【表8】
【0087】
*Roche Cobas HIV−1 Monitorアッセイ(範囲400〜750,000 cp/mL)
**NHP=脱繊維素した正常ヒト血漿
He−異種の2つの機能
Ho−相同な2つの機能
I−イミドエステル
M−マレイミド(maleimide)
H−ヒドリジド
C−カルボジイミド
SH−スルフヒドリル
CO−カルボニル(アルデヒド)
(実施例7)
(B型肝炎ウイルスの不活化)
本実施例において、本発明の方法を、パラホルムアルデヒドを用いるB型肝炎ウイルスの不活化に適用する。精製したウイルス(本明細書中に記載されるように調製した)を、実施例2に記載の方法を用いて不活化した。HBV不活化の研究において、倫理的懸念、アベイラビリティーおよびコストは、HBV不活化研究におけるチンパンジーの使用を制限するので、アヒルのB型肝炎ウイルス(DHBV)を、ヒトB型肝炎ウイルス(HHBV)の代理として使用した。このモデルは、宿主として初代アヒル肝細胞(PDH)を使用する(Pughら、1999)。本発明者らは、先の手順(BerryおよびFriend、1969、Seglen、1976、PughおよびSummers、1989、Pughら、2000、Tuttlemanら、1986)からの改変を用いて、一週齢未満の血清反応陰性のホワイトペキンの雛アヒル(Anas dornesticus)からPDHを単離し、そして維持した。簡単に言うと、アヒルをCO2に曝露することによって安楽死させ、肝臓を、2つの溶液(各約200mL)を用いて、心房を経由して2回灌流した。第一の溶液は、0.5mmol/L EGTA、2mmol/L Hepes(pH7.45)および50ug/mL ペニシリンおよびストレプトマイシン(Biofluids,Rockville,MD)を補充したSWIMのS−77培地(Sigma)から構成した。第2の溶液は、2.5mmol/L CaCl2、0.5mgのコラゲナーゼ/mL(I型、Sigma、St.Louis)および50ug/mLペニシリンおよびストレプトマイシンを補充したSWIMのS−77培地を含有する。これらの灌流液を、約15mL/分で、蠕動ポンプを用いて投与し、そして灌流(perftisate)の温度を肝臓で37℃に維持するように調節した。この肝臓を取り出し、鋏で細かくして、完全L−15培地(Biofluids,Rockville,MD)(0.05%(w/v)炭酸ナトリウム(Biofluids)、1mmol/Lグルタミン(Biofluids)、20mmol/L HEPES(Biofluids)、50ug/mLペニシリンおよびストレプトマイシン(Biofluids)、I(g/mLインスリン(Sigma、St.Luois)および10(moi/Lヒドロコルチゾン−ヘミスクシナート(Sigma)を補充した)中に肝細胞が分散するように25mLピペットを用いて繰り返し混合した。細胞を滅菌したガーゼによって濾過し、50×gで4分間遠心分離し、そして生じた細胞ペレットをL−15培地で3回洗浄し、そしてL−15培地に再懸濁した。12ウェルプレートに、約2mLの細胞懸濁(約105細胞)を播種した。プレートした細胞上の培地を、2日ごとに吸引し、新しいL−15培地に置き換えた。
【0088】
4週齢の先天的に感染したアヒルの雛の血清を、これらの実験において使用するウイルスの供給源として用いた。処理したDHBVおよびコントロールDHBVスパイクした赤血球サンプルを、L−15培地において10倍に連続希釈し、続いて1mL体積を、4連でPDH単層に接種した。感染した培養物を、ウイルスの付着および侵入のために37℃+20℃、5+1%CO2で一晩、インキュベートした。次いで、接種材料を取り除き、細胞の単層を完全L−15培地で1回洗浄し、過剰な赤血球を除去し、次いで各細胞に約2mLの新しいL−15培地をかぶせた。感染した単層を、さらに10〜14日間、37+20℃、5+1%CO2で、培地を2日ごとに交換してインキュベートした。
【0089】
本発明者らは、DHBV感染したアヒル肝細胞の存在をIFAによって検出した。簡単に述べると、PDH単層から、培地を吸引によって除去し、そして単層を1〜2mlのリン酸緩衝化生理食塩水(PBS)で5〜10分間振とうして洗浄した。次いで、洗浄溶液を吸引によって除去し、そして1〜2mLの−20+2℃のエタノールに置き換えた。エタノールで覆ったサンプルを、エタノールを除去する前に2〜48時間、4+1℃にて固定した。その後、1〜2mL PBSで洗浄し、攪拌した単層を室温で少なくとも2時間、各ウェルに対して0.5%胎仔ウシ血清を含有するPBS中、0.25mLの抗DHBVモノクローナル抗体(DHVBエンベロープ(1H.1)のプレ(pre)−Sドメインに対する(Pughら、1995))(1:2希釈)を用いてインキュベートした。この抗体溶液を吸引によって除去し、そして一次抗体染色した単層をPBSで洗浄した。洗浄溶液を除去した後、0.5%胎仔ウシ血清を含有するPBS中、0.25mLのヤギ抗マウスIgG−FITC(フルオレセインイソチオシアナート結合体)(Jackson ImmnuroResearch Laboratories,Inc.、West Grove.PA)(1:200希釈)を各ウェルに添加し、そして室温にて2時間攪拌させながらインキュベートした。二次抗体を吸引によって除去し、蛍光(flourescently)染色した単層をPBSで洗浄した。PBSの除去後、逆にしたウェルを、Nikon Diaphot顕微鏡を用いるUV光学顕微鏡法によって試験し、1つ以上のDHBV表面抗原陽性肝細胞を含む乾燥した単層を陽性とスコアした。ウイルス力価を、ReedおよびMuench法(1938)を用いて、蛍光(flourescence)焦点形成単位用量50のスカーリングによって決定した。
【0090】
表10に示すように、ウイルス感染細胞は、試験したサンプルのどれにも検出されなかった。
【0091】
(表10)
(周囲の室温(20℃)での60分間の懸濁における、アヒルB型肝炎ウイルス(DHBV)の不活化に対するパラホルムアルデヒドの影響)
【0092】
【表9】
【0093】
*FFFUD50/ML=ReedおよびMuench(1938)による決定として、蛍光焦点形成単位用量50。(+)FFFUの存在または(−)FFFUの非存在。
+、DHBV感染細胞検出;−、DHBV感染細胞非検出。
【0094】
(実施例8)
(ウシのウイルス性下痢ウイルス(BVDV)の不活化)
本実施例において、ウシのウイルス性下痢ウイルス(BVDV)(1生物型(CPE)、1遺伝子型)宿主:Madin−Darbyウシ腎臓(MDBK)細胞を、実施例2において議論した方法に従って、不活化した。
【0095】
ウシのウイルス性下痢ウイルス(BVDV)(1生物型(CPE)、1遺伝子型)を、Madin−Darbyウシ腎臓(MDBK)細胞を感染させるこれらの研究において使用した。感染性BVDVをアッセイするための手順は、以下の差異を伴ってDHBV(上を参照)に記載したのと同じであった:2.5%パラホルムアルデヒドを用いて、試験およびコントロールBVDVサンプルの両方を処理した後、反応を0.5Mグリシンでクエンチした。これらのサンプル(0.5mL)を、プレ(pre)−スパンセファクリル(sephacryl)カラム中にロードした。このカラムを、4分間、1000rpmで回転させた。このサンプルを、カラムから無菌的に取り出し、次いで10倍連続希釈を最小必須培地(MEM)に調製した。そして組織培養プレートに播種した宿主細胞の単層上に、37±2℃および5±1%CO2にて1時間吸着させた。吸着後、この単層を、EBSSで洗浄し、新しいMEMで置換し、そして37±2℃および5±1%CO2にて5〜7日間接種した。感染性ウイルスの存在を、以下に記載のように決定した:インキュベーション後、このプレートをPBSで3回洗浄し、TCグレードアルコールで固定し、そしてブタポリクローナル抗BVDV結合体化抗体を用いて染色した。染色したプレートを、Nikon Diaphot顕微鏡を用いるUV顕微鏡法を用いてスコアし、1つ以上のBVDV表面抗原陽性肝細胞を含む単層を、陽性とスコアした。1希釈あたり4つのウェルを接種し、そして結果を、ReedおよびMunch(1938)によって算出したFFFUD50として記録した。
【0096】
表11に示すように、ウイルス感染した細胞は試験したサンプルのどれにも検出されなかった。
【0097】
(表11)
(周囲の室温(20℃)での60分間の懸濁における、ウシのウイルス性下痢ウイルス(BVDV)の不活化に対するパラホルムアルデヒドの影響)
【0098】
【表10】
【0099】
*FFFUD50/ML=ReedおよびMuench(1938)により決定される、蛍光焦点形成単位用量50。(+)FFFUの存在または(−)FFFUの非存在。
表の脚注:+、BVDV感染細胞検出;−、BVDV感染細胞非検出。
【0100】
(参考文献)
Pugh JC,Summers JW.Infection and uptake of duck hepatitis B virus by duck hepatocytes maintained in the presence of dimethyl sulfoxide.Virology 1989;172:564−572.
Pugh,J.C.,Ijaz,M.K.,Suchmann D.B.Use of surrogate models for testing efficacy of disinfectants against Hepatitis B virus.Am J Infect Cont 1999;27:373−6.Pugh,J.C.,Suchmann,D.B.,Ijaz,M.K.Hepatitis B virus efficacy testing:Qualificaton of an avian Hepadavirus in vitro system that uses primary duck hepatocyte cultures. 10th International Symposium on Viral Hepatitis and Liver Diseases.Atlanta.USA,2000,Abstract B 139.
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Reed,L.,Muench,H.A.A simple method of estimating fifty percent end points.Am J of Hyg 1938;27:493−497。
【0101】
本発明は、本明細書中に詳細に記載されるが、本実施例は説明の目的のみのために提供されることが理解されるべきである。当業者に明らかである本発明の実施形態の他の改変は、本発明の範囲内であることが意図され、上記の特許請求の範囲に、より完全に規定される。
Claims (69)
- 表面タンパク質および実質的にインタクトな核成分を含む精製微生物であって、ここで1つ以上の該表面タンパク質は、該微生物が非病原性を与えられるように不可逆的に改変されている、精製微生物。
- 表面タンパク質および実質的にインタクトな核成分を含む精製微生物であって、ここで1つ以上の該表面タンパク質は、1つ以上の反応性官能基を含む化合物と該表面タンパク質の1つ以上の反応性部位との共有結合によって、該微生物が非病原性を与えられるように不可逆的に改変されている、精製微生物。
- 前記化合物が単一の反応性官能基を含む、請求項2に記載の精製微生物。
- 請求項3に記載の精製微生物であって、前記化合物が、ホルムアルデヒド、アセトアルデヒド、パラホルムアルデヒド、プロピオンアルデヒド、n−ブチルアルデヒド、ベンズアルデヒド、p−ニトロベンズアルデヒド、p−トルアルデヒド、サリチルアルデヒド、フェニルアセトアルデヒド、2−メチルペンタナール、3−メチルペンタナールおよび4−メチルペンタナールからなる群より選択される、精製微生物。
- 前記化合物がパラホルムアルデヒドである、請求項4に記載の精製微生物。
- 前記化合物が2つ以上の反応性官能基を含む、請求項2に記載の精製微生物。
- 前記化合物がジアルデヒドである、請求項6に記載の精製微生物。
- 請求項7に記載の精製微生物であって、前記ジアルデヒドが、グルタルアルデヒド、グリオキサール、マロンジアルデヒド、スクシンアルデヒド、アジポアルデヒドおよびフタルアルデヒドからなる群より選択される、精製微生物。
- 請求項6に記載の精製微生物であって、前記化合物が、NHSイミデート、マレイミド、クロロアセチル、フルオロアセチル、ヨードアセチル、ブロモアセチル、アミン、およびヒドラジドからなる群より選択される少なくとも1つの官能基を含む、精製微生物。
- 表面タンパク質および実質的にインタクトな核成分を含む精製微生物であって、ここで1つ以上の該表面タンパク質が、酵素による少なくとも部分的な消化によって、該微生物が非病原性を与えられるように不可逆的に改変される、精製微生物。
- 請求項10に記載の精製微生物であって、前記酵素が、ブロメリン、キモトリプシン、クロストリパイン、コラゲナーゼ、エラスターゼ、フィシン、カリクレイン、メタロエンドペプチダーゼ、プロテイナーゼK、アミノペプチダーゼM、カルボキシペプチダーゼY、Xa因子、パパイン、キモパパイン、ペプシン、黄色ブドウ球菌プロテアーゼ(V−8菌株)、トリプシンおよびそれらの混合物からなる群より選択される、精製微生物。
- 組成物であり、以下:
(a)表面タンパク質およびインタクトな核成分を含む精製微生物であって、1つ以上の該表面タンパク質は、該微生物が非病原性を与えられるように不可逆的に改変されている、精製微生物;ならびに
(b)液体マトリックス
を含む、組成物。 - 前記液体マトリックスが凍結乾燥に適するように改変されている、請求項12に記載の組成物。
- 前記微生物がウイルスである、請求項1に記載の精製微生物。
- 請求項14に記載の精製ウイルスであって、該ウイルスが、ヒト免疫不全ウイルス、C型肝炎ウイルス、B型肝炎ウイルス、サイトメガロウイルス、ヒトリンパ栄養性ウイルス、エプスタイン−バーウイルス、パルボウイルス、単純疱疹ウイルス、ヒト疱疹ウイルス8およびA型肝炎ウイルスからなる群より選択される、精製ウイルス。
- 前記微生物が細胞内寄生生物である、請求項1に記載の精製微生物。
- 請求項16に記載の精製細胞内寄生生物であって、該細胞内寄生生物が、Chlamydia trachomatis、Chlamydia psittaci、Rickettsia prowazeki、Rickettsia typhi、Rickettsia rickettsi、Rickettsia sibtricus、Rickettsia conori、Rickettsia australis、Rickettsia akari、Rickettsia tsutsugamushi、Coxiella bumetiおよびRochalimaea quintanaからなる群より選択される、精製細胞内寄生生物。
- 非病原性微生物を産生する方法であって、(a)表面タンパク質およびインタクトな核成分を含む精製微生物を与える工程、および(b)該微生物が非病原性を与えられるように、該核成分を実質的に未改変に残したまま、1つ以上の表面タンパク質を不可逆的に改変する工程を含む、方法。
- 請求項18に記載の方法であって、工程(a)が、1つ以上の反応性官能基を含む化合物を、前記表面タンパク質の1つ以上の反応性部位と共有結合させる工程を含む、方法。
- 前記化合物が単一の反応性官能基を含む、請求項19に記載の方法。
- 請求項20に記載の方法であって、前記化合物が、ホルムアルデヒド、アセトアルデヒド、プロピオンアルデヒド、n−ブチルアルデヒド、ベンズアルデヒド、p−ニトロベンズアルデヒド、p−トルアルデヒド、サリチルアルデヒド、フェニルアセトアルデヒド、2−メチルペンタナール、3−メチルペンタナールおよび4−メチルペンタナールからなる群より選択される、方法。
- 前記化合物が2つ以上の反応性官能基を含む、請求項20に記載の方法。
- 前記化合物がパラホルムアルデヒドである、請求項22に記載の方法。
- パラホルムアルデヒドが5%以下の濃度で用いられる、請求項23に記載の方法。
- 前記化合物がジアルデヒドである、請求項22に記載の方法。
- 請求項25に記載の方法であって、前記ジアルデヒドが、グルタルアルデヒド、グリオキサール、マロンジアルデヒド、スクシンアルデヒド、アジポアルデヒドおよびフタルアルデヒドからなる群より選択される、方法。
- 請求項19に記載の方法であって、前記化合物は、NHSイミデート、マレイミド、クロロアセチル、フルオロアセチル、ヨードアセチル、ブロモアセチル、アミン、およびヒドラジドからなる群より選択される少なくとも1つの官能基を含む、方法。
- 請求項19に記載の方法であって、工程(a)が、酵素による、1つ以上の表面タンパク質の少なくとも部分的な消化を含む、方法。
- 請求項28に記載の方法であって、前記酵素が、ブロメリン、キモトリプシン、クロストリパイン、コラゲナーゼ、エラスターゼ、フィシン、カリクレイン、メタロエンドペプチダーゼ、プロテイナーゼK、アミノペプチダーゼM、カルボキシペプチダーゼY、Xa因子、パパイン、キモパパイン、ペプシン、黄色ブドウ球菌プロテアーゼ(V−8菌株)、トリプシンおよびそれらの混合物からなる群より選択される、方法。
- 前記微生物がウイルスである、請求項19に記載の方法。
- 請求項30に記載の方法であって、前記ウイルスが、ヒト免疫不全ウイルス、C型肝炎ウイルス、B型肝炎ウイルス、サイトメガロウイルス、ヒトリンパ栄養性ウイルス、エプスタイン−バーウイルス、パルボウイルス、単純疱疹ウイルス、ヒト疱疹ウイルス8およびA型肝炎ウイルスからなる群より選択される、方法。
- 前記微生物が細胞内寄生生物である、請求項19に記載の方法。
- 請求項32に記載の方法であって、前記寄生生物が、Chlamydia trachomatis、Chlamydia psittaci、Rickettsia prowazeki、Rickettsia typhi、Rickettsia rickettsi、Rickettsia sibtricus、Rickettsia conori、Rickettsia australis、Rickettsia akari、Rickettsia tsutsugamushi、Coxiella bumetiおよびRochalimaea quintanaからなる群より選択される、方法。
- 生物学的サンプル中の表面タンパク質を有する微生物の、該微生物の核成分の増幅による検出方法であって、該方法が、該生物学的サンプルへの精製コントロール微生物の添加を含み、該コントロール微生物が非病原性を与えられるように、該コントロール微生物の1つ以上の表面タンパク質が不可逆的に改変されている、方法。
- 請求項34に記載の方法であって、該コントロール微生物が、1つ以上の反応性官能基を含む化合物と、前記表面タンパク質の1つ以上の反応性部位との共有結合によって不可逆的に改変されている、方法。
- 該化合物が単一の反応性官能基を含む、請求項35に記載の方法。
- 請求項36に記載の方法であって、前記化合物が、ホルムアルデヒド、アセトアルデヒド、プロピオンアルデヒド、n−ブチルアルデヒド、ベンズアルデヒド、p−ニトロベンズアルデヒド、p−トルアルデヒド、サリチルアルデヒド、フェニルアセトアルデヒド、2−メチルペンタナール、3−メチルペンタナールおよび4−メチルペンタナールからなる群より選択される、方法。
- 前記化合物が2つ以上の反応性官能基を含む、請求項35に記載の方法。
- 前記化合物がパラホルムアルデヒドである、請求項38に記載の方法。
- 前記化合物がジアルデヒドである、請求項38に記載の方法。
- 請求項40に記載の方法であって、前記ジアルデヒドが、グルタルアルデヒド、グリオキサール、マロンジアルデヒド、スクシンアルデヒド、アジポアルデヒドおよびフタルアルデヒドからなる群より選択される、方法。
- 請求項36に記載の方法であって、前記化合物が、NHSイミデート、マレイミド、クロロアセチル、フルオロアセチル、ヨードアセチル、ブロモアセチル、アミン、およびヒドラジドからなる群より選択される少なくとも1つの官能基を含む、方法。
- 請求項34に記載の方法であって、前記コントロール微生物が、1つ以上の前記表面タンパク質の酵素による少なくとも部分的な消化によって不可逆的に改変される、方法。
- 請求項43に記載の方法であって、前記酵素が、ブロメリン、キモトリプシン、クロストリパイン、コラゲナーゼ、エラスターゼ、フィシン、カリクレイン、メタロエンドペプチダーゼ、プロテイナーゼK、アミノペプチダーゼM、カルボキシペプチダーゼY、Xa因子、パパイン、キモパパイン、ペプシン、黄色ブドウ球菌プロテアーゼ(V−8菌株)、トリプシンおよびそれらの混合物からなる群より選択される、方法。
- 前記微生物がウイルスである、請求項34に記載の方法。
- 請求項45に記載の方法であって、前記ウイルスが、ヒト免疫不全ウイルス、C型肝炎ウイルス、B型肝炎ウイルス、サイトメガロウイルス、ヒトリンパ栄養性ウイルス、エプスタイン−バーウイルス、パルボウイルス、単純疱疹ウイルス、ヒト疱疹ウイルス8およびA型肝炎ウイルスからなる群より選択される、方法。
- 前記微生物が細胞内寄生生物である、請求項34に記載の方法。
- 請求項47に記載の方法であって、前記寄生生物が、Chlamydia trachomatis、Chlamydia psittaci、Rickettsia prowazeki、Rickettsia typhi、Rickettsia rickettsi、Rickettsia sibtricus、Rickettsia conori、Rickettsia australis、Rickettsia akari、Rickettsia tsutsugamushi、Coxiella bumetiおよびRochalimaea quintanaからなる群より選択される、方法。
- 表面タンパク質を有する微生物の存在について生物学的サンプルを分析するキットであって、該キットが、表面タンパク質およびインタクトな核成分を含む該微生物の精製サンプルを含むポジティブコントロール組成物を含み、1つ以上の表面タンパク質が、該微生物が非病原性を与えられるように不可逆的に改変されている、キット。
- 請求項49に記載のキットであって、前記ポジティブコントロール組成物中の前記微生物の前記表面タンパク質が、1つ以上の反応性官能基を含む化合物と該表面タンパク質の1つ以上の反応性部位との共有結合によって不可逆的に改変されている、キット。
- 前記化合物が単一の反応性官能基を含む、請求項50に記載のキット。
- 請求項51に記載のキットであって、前記化合物が、ホルムアルデヒド、アセトアルデヒド、プロピオンアルデヒド、n−ブチルアルデヒド、ベンズアルデヒド、p−ニトロベンズアルデヒド、p−トルアルデヒド、サリチルアルデヒド、フェニルアセトアルデヒド、2−メチルペンタナール、3−メチルペンタナールおよび4−メチルペンタナールからなる群より選択される、キット。
- 前記化合物が2つ以上の反応性官能基を含む、請求項51に記載のキット。
- 前記化合物がパラホルムアルデヒドである、請求項53に記載のキット。
- 前記化合物がジアルデヒドである、請求項53に記載のキット。
- 請求項55に記載のキットであって、前記ジアルデヒドが、グルタルアルデヒド、グリオキサール、マロンジアルデヒド、スクシンアルデヒド、アジポアルデヒドおよびフタルアルデヒドからなる群より選択される、キット。
- 請求項51に記載のキットであって、前記化合物が、NHSイミデート、マレイミド、クロロアセチル、フルオロアセチル、ヨードアセチル、ブロモアセチル、アミン、およびヒドラジドからなる群より選択される少なくとも1つの官能基を含む、キット。
- 請求項50に記載のキットであって、前記ポジティブコントロール組成物中の前記微生物の前記表面タンパク質が、1つ以上の該表面タンパク質の酵素による少なくとも部分的な消化によって不可逆的に改変されている、キット。
- 請求項58に記載のキットであって、前記酵素が、ブロメリン、キモトリプシン、クロストリパイン、コラゲナーゼ、エラスターゼ、フィシン、カリクレイン、メタロエンドペプチダーゼ、プロテイナーゼK、アミノペプチダーゼM、カルボキシペプチダーゼY、Xa因子、パパイン、キモパパイン、ペプシン、黄色ブドウ球菌プロテアーゼ(V−8菌株)、トリプシンおよびそれらの混合物からなる群より選択される、キット。
- 前記微生物がウイルスである、請求項50に記載のキット。
- 請求項60に記載のキットであって、前記ウイルスが、ヒト免疫不全ウイルス、C型肝炎ウイルス、B型肝炎ウイルス、サイトメガロウイルス、ヒトリンパ栄養性ウイルス、エプスタイン−バーウイルス、パルボウイルス、単純疱疹ウイルス、ヒト疱疹ウイルス8およびA型肝炎ウイルスからなる群より選択される、キット。
- 前記微生物が細胞内寄生生物である、請求項50に記載のキット。
- 請求項62に記載のキットであって、前記寄生生物が、Chlamydia trachomatis、Chlamydia psittaci、Rickettsia prowazeki、Rickettsia typhi、Rickettsia rickettsi、Rickettsia sibtricus、Rickettsia conori、Rickettsia australis、Rickettsia akari、Rickettsia tsutsugamushi、Coxiella bumetiおよびRochalimaea quintanaからなる群より選択される、キット。
- 生物学的サンプルにおける核酸増幅技術による表面タンパク質を含む微生物の検出方法であって、該方法は、該生物学的サンプル中のポジティブ内部コントロールの同時増幅を含み、ここで該ポジティブ内部コントロールは、請求項1に記載の精製微生物を含む、方法。
- 生物学的サンプルにおける核酸増幅技術による表面タンパク質を含む微生物の検出方法であって、該方法は、該生物学的サンプル中のポジティブ内部コントロールの同時増幅を含み、ここで該ポジティブ内部コントロールは、請求項2に記載の精製微生物を含む、方法。
- 生物学的サンプルにおける核酸増幅技術による表面タンパク質を含む微生物の検出方法であって、該方法は、該生物学的サンプル中のポジティブ内部コントロールの同時増幅を含み、ここで該ポジティブ内部コントロールは、請求項10に記載の精製微生物を含む、方法。
- 前記微生物の核成分の増幅による、生物学的サンプル中の表面タンパク質を含む微生物の検出方法であって、該方法は、(a)対応する微生物の存在について試験される生物学的サンプルへの、請求項1に記載の精製微生物の添加、(b)増幅される標的核酸を抽出する工程、(c)標的核酸を増幅する工程、および(d)増幅された該標的核酸を検出する工程を含む、方法。
- 前記微生物の核成分の増幅による、生物学的サンプル中の表面タンパク質を含む微生物の検出方法であって、該方法は、(a)対応する微生物の存在について試験される生物学的サンプルへの、請求項2に記載の精製微生物の添加、(b)増幅される標的核酸を抽出する工程、(c)標的核酸を増幅する工程、および(d)増幅された該標的核酸を検出する工程を含む、方法。
- 前記微生物の核成分の増幅による、生物学的サンプル中の表面タンパク質を含む微生物の検出方法であって、該方法は、(a)対応する微生物の存在について試験される生物学的サンプルへの、請求項10に記載の精製微生物の添加、(b)増幅される標的核酸を抽出する工程、(c)標的核酸を増幅する工程、および(d)増幅された該標的核酸を検出する工程を含む、方法。
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