JP2007185200A - 核酸増幅コントロール - Google Patents

Abstract

【課題】酸増幅方法によるウイルス検出において、信頼性のあるコントロールとして機能し得る組成物などの提供。
【解決手段】核酸増幅のためのポジティブコントロールとして非病原性の微生物を含む組成物を製造するための方法であって、（ａ）表面タンパク質およびインタクトな核成分を含む精製した微生物を提供するための工程（ｂ）該核成分を実質的にインタクトに保ちつつ１以上の表面タンパク質を不可逆的に改変して、しれによって該微生物が非病原性となる工程；および（ｃ）生物学的流体または合成生物学的流体を含む液体マトリックスに該微生物を懸濁する工程を包含し、ここで、該組成物は、核酸増検出試験においてポジティブ内部コントロールとして有用である、方法。
【選択図】なし

Description

（発明の分野）
本発明は、一般的に、生物学的サンプル中のウイルス検出の領域に関する。よ
り詳細には、本発明は、核酸増幅方法によるウイルス検出において、信頼性のあ
るコントロールとして機能し得る組成物に関する。

（関連分野の説明）
生物学的サンプル中のウイルス（例えば、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ））
の存在は、代表的に、間接的な方法によって、すなわち、特定のウイルスまたは
ウイルス成分に対する抗体を検出することによって、同定される。この検出方法
は、微量のウイルスを検出するその能力によって制限される。なぜなら、抗体は
、代表的に、ウイルスが体内でかなり増殖するかまたはかなり再生される後まで
、検出可能なレベルで出現しないからである。従って、例えば、輸血のための血
液供給物をスクリーニングする方法において、既存の間接的な方法は、感染した
血液を十分にスクリーニングし得ない。初期段階でウイルス感染を診断するため
の努力において、生物学的サンプル中のウイルスを検出し、そして定量するため
に核酸増幅技術が開発されている。このような技術としては、ポリメラーゼ連鎖
反応（ＰＣＲ）、転写媒介増幅（ＴＭＡ）、核酸のシグナルに基づく増幅（ｎｕ
ｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｓｉｇｎａｌ ｂａｓｅｄ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏ
ｎ）（ＮＡＳＢＡ）、およびリガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）が挙げられる。これら
の技術は、ウイルス感染の診断および処置の間に感染個体中に負荷されたウイル
スをモニターするのに、有用である。さらに、これらの技術は、輸血前に血液を
スクリーニングする場合に、有用である。

１９９９年の春から、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｒｅｄ ＣｒｏｓｓおよびＡｍｅｒ
ｉｃａ’ｓ Ｂｌｏｏｄ Ｃｅｎｔｅｒｓの１６室の研究室は、非常に初期段階
でのウイルス感染を検出するように設計された新規遺伝子試験を用いて、１型ヒ
ト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）およびＣ型肝炎ウイルスについてドナー血液を試
験し始めた。これらの試験（核酸試験（ＮＡＴ）を称される）は、血液ドナーの
身体が免疫応答を高める前に、少量のウイルスを検出し得る。ＮＡＴの能力とは
、抗体の存在について間接的に試験するよりも、ウイルスゲノム核酸について直
接試験することによって感染の存在を検出するその能力である。さらに、ＮＡＴ
が臨床検体において５０ウイルス粒子という低さで検出し得るという点で、ＮＡ
Ｔは、ＨＩＶ ｐ２４抗原検出アッセイのような他の直接的検出方法よりも、は
るかにより感度がよい。ＮＡＴは、潜在的に、感染の約１０日後に血液中のＨＩ
Ｖを検出し得る。米国食品医薬品局（ＦＤＡ）は、血液銀行にＮＡＴ試験を始め
ること、および病院にＮＡＴスクリーニングされた血液を使用することを、強く
奨励している（Ｋｏｒｎｍａｎら，１９９９，Ｃａｎｃｅｒ Ｃｏｎｔｒｏｌ，
Ｖｏｌｕｍｅ ６，Ｎｕｍｂｅｒ ５）。

いくつかの市販のＮＡＴキットおよびＮＡＴサービスは、ＨＩＶ、Ｃ型肝炎ウ
イルス（ＨＣＶ）およびＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）の試験について利用可能で
ある（例えば、Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ（Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉ
ｓ，ＩＮ）、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｉｎ
ｃ．（Ｌｏｓ Ａｎｇｅｌｅｓ，ＣＡ）、Ｂａｙｅｒ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ
（Ｔａｒｒｙｔｏｗｎ，ＮＹ）およびＧｅｎ−Ｐｒｏｂｅ，Ｉｎｃ．（Ｓａｎ
Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）によって販売されるキットおよびサービス）。これらのキッ
トおよび試験サービスは、複数のアッセイを使用し、ここで、最初の工程は、標
的核酸の抽出または部分的な精製であり、続いて、その核酸の増幅および検出で
ある。従って、ＮＡＴに基づく検出のために開発されたポジティブコントロール
は：１）感染個体由来の血漿または血清であり、そして２）合成核酸およびクロ
ーン化された核酸である。これらのコントロールは、いくつかの欠点を有する。
例えば、感染個体由来の血漿または血清は診断手順中の全工程に対して完全な処
理コントロールとして機能するが、これは、感染性物質を含み、そして冷蔵庫の
温度（２〜８℃）にて安定ではない。合成核酸またはクローン化された核酸は、
抽出工程に対するコントロールとしては機能せず、従って、完全な処理コントロ
ールではない。さらに、合成核酸およびクローン化された核酸は、ヌクレアーゼ
に極度に感受性であり、ゆえに、操作に特別の注意が必要とされる。ヌクレアー
ゼ耐性「強化（ａｒｍｏｒｅｄ）ＲＮＡ」が開発された。しかし、この強化材料
は、インタクトなウイルス粒子内に含まれず、従って、ウイルス感染血漿と同様
に抽出されない。従って、強化材料は、抽出処理に対するコントロールとして機
能せず、さらにＴＭＡでもＬＣＲでも増幅しない。

ＦＤＡのＴｈｅ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｌｏｇｉｅｓ Ｅｖａｌｕａ
ｔｉｏｎ ａｎｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（ＣＢＥＲ）の支部は、ＨＩＶ ＮＡＴコ
ントロール材料についてのガイドラインを発表した。このガイドライン（Ｇｕｉ
ｄａｎｃｅ ｆｏｒ Ｉｎｄｕｓｔｒｙ，Ｉｎ ｔｈｅ Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒ
ｅ ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ ｉｎ ｖｉｔｒ
ｏ Ｔｅｓｔｓ ｔｏ Ｄｅｔｅｃｔ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｓｅｑｕｅ
ｎｃｅｓ ｏｆ Ｈｕｍａｎ Ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ Ｖｉｒｕｓ
ｅｓ Ｔｙｐｅｓ １ ａｎｄ ２，ＢＢＳ，ＦＤＡ，ＣＢＥＲ，１９９９年１
２月）は、ＮＡＴに基づくキットに対するコントロールおよび検定物質の形式お
よび性能についての、ＦＤＡの推奨を提供する。これらのガイドラインに従って
、コントロール材料は、完全な処理コントロールとして機能するべきであり、す
なわち、コントロール材料は、サンプル操作および検出処理の全工程に対するコ
ントロールとして機能するべきである。さらに、このガイドラインのもと、材料
は、非感染性であり、かつ十分に検証された微生物に基づくべきである。従って
、理想的なコントロールは、超遠心工程、抽出工程、増幅工程、ハイブリダイゼ
ーション工程、定量工程、および可能性のある夾雑の指標を提供するべきである
。

従って、ＦＤＡのガイドラインおよび既存のコントロール材料によって同定さ
れた欠点を考慮すると、ウイルス検出技術の領域において、完全な処理コントロ
ールとして機能し得、冷蔵庫の温度で安定であり、そして操作するのに安全であ
るポジティブコントロールを開発する必要性がある。

従って、本発明の目的は、核酸増幅技術による微生物の検出のための、非感染
性の完全な処理ポジティブコントロールを提供することである。

本発明の別の目的は、本発明の内部コントロールを生成するための方法を提供
することである。

本発明の別の目的は、核酸増幅技術による微生物の存在について、生物学的サ
ンプルをスクリーニングする方法を提供することである。

これらの目的およびさらなる目的が、核酸増幅検出技術においてポジティブコ
ントロール材料として使用される、破壊されていない不活化微生物粒子を含む本
発明によって満たされる。コントロール材料は、破壊されていない不活化微生物
を含み、そして安定化された血漿マトリックス中に処方され得る。コントロール
材料は非感染性であり、不凍保存（例えば、２〜８℃）下で安定であり、そして
核酸増幅アッセイにおいて再現性のある結果を生じる。本発明のコントロール材
料は、冷蔵庫温度で保存され得る。さらに、このコントロール材料は全微生物粒
子を含むので、これは、完全な処理コントロールとして実施され、従って、試験
される生物学的サンプルと正に同じ様式で操作され、そして処理される。完全な
処理コントロールとして、この材料は、サンプル調製工程中で使用され得、そし
て検出手順全体を通して保有される。従って、本発明のコントロール材料は、Ｆ
ＡＤガイドラインに適合する品質である。

本明細書を通じて引用される参考文献は、本発明を提供する技術状況をより完
全に記載するために、本明細書中にその全体が本明細書によって援用される。

本発明によって、以下が提供される：
（１） 表面タンパク質および実質的にインタクトな核成分を含む精
製微生物であって、ここで１つ以上の該表面タンパク質は、該微生物が非病原性
を与えられるように不可逆的に改変されている、精製微生物。
（２） 表面タンパク質および実質的にインタクトな核成分を含む精
製微生物であって、ここで１つ以上の該表面タンパク質は、１つ以上の反応性官
能基を含む化合物と該表面タンパク質の１つ以上の反応性部位との共有結合によ
って、該微生物が非病原性を与えられるように不可逆的に改変されている、精製
微生物。
（３） 前記化合物が単一の反応性官能基を含む、項目２に記載の
精製微生物。
（４） 項目３に記載の精製微生物であって、前記化合物が、ホル
ムアルデヒド、アセトアルデヒド、パラホルムアルデヒド、プロピオンアルデヒ
ド、ｎ−ブチルアルデヒド、ベンズアルデヒド、ｐ−ニトロベンズアルデヒド、
ｐ−トルアルデヒド、サリチルアルデヒド、フェニルアセトアルデヒド、２−メ
チルペンタナール、３−メチルペンタナールおよび４−メチルペンタナールから
なる群より選択される、精製微生物。
（５） 前記化合物がパラホルムアルデヒドである、項目４に記載
の精製微生物。
（６） 前記化合物が２つ以上の反応性官能基を含む、項目２に記
載の精製微生物。
（７） 前記化合物がジアルデヒドである、項目６に記載の精製微
生物。
（８） 項目７に記載の精製微生物であって、前記ジアルデヒドが
、グルタルアルデヒド、グリオキサール、マロンジアルデヒド、スクシンアルデ
ヒド、アジポアルデヒドおよびフタルアルデヒドからなる群より選択される、精
製微生物。
（９） 項目６に記載の精製微生物であって、前記化合物が、ＮＨ
Ｓイミデート、マレイミド、クロロアセチル、フルオロアセチル、ヨードアセチ
ル、ブロモアセチル、アミン、およびヒドラジドからなる群より選択される少な
くとも１つの官能基を含む、精製微生物。
（１０） 表面タンパク質および実質的にインタクトな核成分を含む
精製微生物であって、ここで１つ以上の該表面タンパク質が、酵素による少なく
とも部分的な消化によって、該微生物が非病原性を与えられるように不可逆的に
改変される、精製微生物。
（１１） 項目１０に記載の精製微生物であって、前記酵素が、ブ
ロメリン、キモトリプシン、クロストリパイン、コラゲナーゼ、エラスターゼ、
フィシン、カリクレイン、メタロエンドペプチダーゼ、プロテイナーゼＫ、アミ
ノペプチダーゼＭ、カルボキシペプチダーゼＹ、Ｘａ因子、パパイン、キモパパ
イン、ペプシン、黄色ブドウ球菌プロテアーゼ（Ｖ−８菌株）、トリプシンおよ
びそれらの混合物からなる群より選択される、精製微生物。
（１２） 組成物であり、以下：
（ａ）表面タンパク質およびインタクトな核成分を含む精製微生物であって、
１つ以上の該表面タンパク質は、該微生物が非病原性を与えられるように不可逆
的に改変されている、精製微生物；ならびに
（ｂ）液体マトリックス
を含む、組成物。
（１３） 前記液体マトリックスが凍結乾燥に適するように改変され
ている、項目１２に記載の組成物。
（１４） 前記微生物がウイルスである、項目１に記載の精製微生
物。
（１５） 項目１４に記載の精製ウイルスであって、該ウイルスが
、ヒト免疫不全ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、サイトメガロ
ウイルス、ヒトリンパ栄養性ウイルス、エプスタイン−バーウイルス、パルボウ
イルス、単純疱疹ウイルス、ヒト疱疹ウイルス８およびＡ型肝炎ウイルスからな
る群より選択される、精製ウイルス。
（１６） 前記微生物が細胞内寄生生物である、項目１に記載の精
製微生物。
（１７） 項目１６に記載の精製細胞内寄生生物であって、該細胞
内寄生生物が、Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ、Ｃｈｌａｍｙｄ
ｉａ ｐｓｉｔｔａｃｉ、Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ ｐｒｏｗａｚｅｋｉ、Ｒｉｃ
ｋｅｔｔｓｉａ ｔｙｐｈｉ、Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ ｒｉｃｋｅｔｔｓｉ、Ｒ
ｉｃｋｅｔｔｓｉａ ｓｉｂｔｒｉｃｕｓ、Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ ｃｏｎｏｒ
ｉ、Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ ａｕｓｔｒａｌｉｓ、Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ ａｋ
ａｒｉ、Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ ｔｓｕｔｓｕｇａｍｕｓｈｉ、Ｃｏｘｉｅｌｌ
ａ ｂｕｍｅｔｉおよびＲｏｃｈａｌｉｍａｅａ ｑｕｉｎｔａｎａからなる群
より選択される、精製細胞内寄生生物。
（１８） 非病原性微生物を産生する方法であって、（ａ）表面タン
パク質およびインタクトな核成分を含む精製微生物を与える工程、および（ｂ）
該微生物が非病原性を与えられるように、該核成分を実質的に未改変に残したま
ま、１つ以上の表面タンパク質を不可逆的に改変する工程を含む、方法。
（１９） 項目１８に記載の方法であって、工程（ａ）が、１つ以
上の反応性官能基を含む化合物を、前記表面タンパク質の１つ以上の反応性部位
と共有結合させる工程を含む、方法。
（２０） 前記化合物が単一の反応性官能基を含む、項目１９に記
載の方法。
（２１） 項目２０に記載の方法であって、前記化合物が、ホルム
アルデヒド、アセトアルデヒド、プロピオンアルデヒド、ｎ−ブチルアルデヒド
、ベンズアルデヒド、ｐ−ニトロベンズアルデヒド、ｐ−トルアルデヒド、サリ
チルアルデヒド、フェニルアセトアルデヒド、２−メチルペンタナール、３−メ
チルペンタナールおよび４−メチルペンタナールからなる群より選択される、方
法。
（２２） 前記化合物が２つ以上の反応性官能基を含む、項目２０
に記載の方法。
（２３） 前記化合物がパラホルムアルデヒドである、項目２２に
記載の方法。
（２４） パラホルムアルデヒドが５％以下の濃度で用いられる、請
求項２３に記載の方法。
（２５） 前記化合物がジアルデヒドである、項目２２に記載の方
法。
（２６） 項目２５に記載の方法であって、前記ジアルデヒドが、
グルタルアルデヒド、グリオキサール、マロンジアルデヒド、スクシンアルデヒ
ド、アジポアルデヒドおよびフタルアルデヒドからなる群より選択される、方法
。
（２７） 項目１９に記載の方法であって、前記化合物は、ＮＨＳ
イミデート、マレイミド、クロロアセチル、フルオロアセチル、ヨードアセチル
、ブロモアセチル、アミン、およびヒドラジドからなる群より選択される少なく
とも１つの官能基を含む、方法。
（２８） 項目１９に記載の方法であって、工程（ａ）が、酵素に
よる、１つ以上の表面タンパク質の少なくとも部分的な消化を含む、方法。
（２９） 項目２８に記載の方法であって、前記酵素が、ブロメリ
ン、キモトリプシン、クロストリパイン、コラゲナーゼ、エラスターゼ、フィシ
ン、カリクレイン、メタロエンドペプチダーゼ、プロテイナーゼＫ、アミノペプ
チダーゼＭ、カルボキシペプチダーゼＹ、Ｘａ因子、パパイン、キモパパイン、
ペプシン、黄色ブドウ球菌プロテアーゼ（Ｖ−８菌株）、トリプシンおよびそれ
らの混合物からなる群より選択される、方法。
（３０） 前記微生物がウイルスである、項目１９に記載の方法。
（３１） 項目３０に記載の方法であって、前記ウイルスが、ヒト
免疫不全ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、サイトメガロウイル
ス、ヒトリンパ栄養性ウイルス、エプスタイン−バーウイルス、パルボウイルス
、単純疱疹ウイルス、ヒト疱疹ウイルス８およびＡ型肝炎ウイルスからなる群よ
り選択される、方法。
（３２） 前記微生物が細胞内寄生生物である、項目１９に記載の
方法。
（３３） 項目３２に記載の方法であって、前記寄生生物が、Ｃｈ
ｌａｍｙｄｉａ ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ、Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｐｓｉｔｔａ
ｃｉ、Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ ｐｒｏｗａｚｅｋｉ、Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ ｔ
ｙｐｈｉ、Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ ｒｉｃｋｅｔｔｓｉ、Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ
ｓｉｂｔｒｉｃｕｓ、Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ ｃｏｎｏｒｉ、Ｒｉｃｋｅｔｔ
ｓｉａ ａｕｓｔｒａｌｉｓ、Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ ａｋａｒｉ、Ｒｉｃｋｅ
ｔｔｓｉａ ｔｓｕｔｓｕｇａｍｕｓｈｉ、Ｃｏｘｉｅｌｌａ ｂｕｍｅｔｉお
よびＲｏｃｈａｌｉｍａｅａ ｑｕｉｎｔａｎａからなる群より選択される、方
法。
（３４） 生物学的サンプル中の表面タンパク質を有する微生物の、
該微生物の核成分の増幅による検出方法であって、該方法が、該生物学的サンプ
ルへの精製コントロール微生物の添加を含み、該コントロール微生物が非病原性
を与えられるように、該コントロール微生物の１つ以上の表面タンパク質が不可
逆的に改変されている、方法。
（３５） 項目３４に記載の方法であって、該コントロール微生物
が、１つ以上の反応性官能基を含む化合物と、前記表面タンパク質の１つ以上の
反応性部位との共有結合によって不可逆的に改変されている、方法。
（３６） 該化合物が単一の反応性官能基を含む、項目３５に記載
の方法。
（３７） 項目３６に記載の方法であって、前記化合物が、ホルム
アルデヒド、アセトアルデヒド、プロピオンアルデヒド、ｎ−ブチルアルデヒド
、ベンズアルデヒド、ｐ−ニトロベンズアルデヒド、ｐ−トルアルデヒド、サリ
チルアルデヒド、フェニルアセトアルデヒド、２−メチルペンタナール、３−メ
チルペンタナールおよび４−メチルペンタナールからなる群より選択される、方
法。
（３８） 前記化合物が２つ以上の反応性官能基を含む、項目３５
に記載の方法。
（３９） 前記化合物がパラホルムアルデヒドである、項目３８に
記載の方法。
（４０） 前記化合物がジアルデヒドである、項目３８に記載の方
法。
（４１） 項目４０に記載の方法であって、前記ジアルデヒドが、
グルタルアルデヒド、グリオキサール、マロンジアルデヒド、スクシンアルデヒ
ド、アジポアルデヒドおよびフタルアルデヒドからなる群より選択される、方法
。
（４２） 項目３６に記載の方法であって、前記化合物が、ＮＨＳ
イミデート、マレイミド、クロロアセチル、フルオロアセチル、ヨードアセチル
、ブロモアセチル、アミン、およびヒドラジドからなる群より選択される少なく
とも１つの官能基を含む、方法。
（４３） 項目３４に記載の方法であって、前記コントロール微生
物が、１つ以上の前記表面タンパク質の酵素による少なくとも部分的な消化によ
って不可逆的に改変される、方法。
（４４） 項目４３に記載の方法であって、前記酵素が、ブロメリ
ン、キモトリプシン、クロストリパイン、コラゲナーゼ、エラスターゼ、フィシ
ン、カリクレイン、メタロエンドペプチダーゼ、プロテイナーゼＫ、アミノペプ
チダーゼＭ、カルボキシペプチダーゼＹ、Ｘａ因子、パパイン、キモパパイン、
ペプシン、黄色ブドウ球菌プロテアーゼ（Ｖ−８菌株）、トリプシンおよびそれ
らの混合物からなる群より選択される、方法。
（４５） 前記微生物がウイルスである、項目３４に記載の方法。
（４６） 項目４５に記載の方法であって、前記ウイルスが、ヒト
免疫不全ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、サイトメガロウイル
ス、ヒトリンパ栄養性ウイルス、エプスタイン−バーウイルス、パルボウイルス
、単純疱疹ウイルス、ヒト疱疹ウイルス８およびＡ型肝炎ウイルスからなる群よ
り選択される、方法。
（４７） 前記微生物が細胞内寄生生物である、項目３４に記載の
方法。
（４８） 項目４７に記載の方法であって、前記寄生生物が、Ｃｈ
ｌａｍｙｄｉａ ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ、Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｐｓｉｔｔａ
ｃｉ、Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ ｐｒｏｗａｚｅｋｉ、Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ ｔ
ｙｐｈｉ、Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ ｒｉｃｋｅｔｔｓｉ、Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ
ｓｉｂｔｒｉｃｕｓ、Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ ｃｏｎｏｒｉ、Ｒｉｃｋｅｔｔ
ｓｉａ ａｕｓｔｒａｌｉｓ、Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ ａｋａｒｉ、Ｒｉｃｋｅ
ｔｔｓｉａ ｔｓｕｔｓｕｇａｍｕｓｈｉ、Ｃｏｘｉｅｌｌａ ｂｕｍｅｔｉお
よびＲｏｃｈａｌｉｍａｅａ ｑｕｉｎｔａｎａからなる群より選択される、方
法。
（４９） 表面タンパク質を有する微生物の存在について生物学的サ
ンプルを分析するキットであって、該キットが、表面タンパク質およびインタク
トな核成分を含む該微生物の精製サンプルを含むポジティブコントロール組成物
を含み、１つ以上の表面タンパク質が、該微生物が非病原性を与えられるように
不可逆的に改変されている、キット。
（５０） 項目４９に記載のキットであって、前記ポジティブコン
トロール組成物中の前記微生物の前記表面タンパク質が、１つ以上の反応性官能
基を含む化合物と該表面タンパク質の１つ以上の反応性部位との共有結合によっ
て不可逆的に改変されている、キット。
（５１） 前記化合物が単一の反応性官能基を含む、項目５０に記
載のキット。
（５２） 項目５１に記載のキットであって、前記化合物が、ホル
ムアルデヒド、アセトアルデヒド、プロピオンアルデヒド、ｎ−ブチルアルデヒ
ド、ベンズアルデヒド、ｐ−ニトロベンズアルデヒド、ｐ−トルアルデヒド、サ
リチルアルデヒド、フェニルアセトアルデヒド、２−メチルペンタナール、３−
メチルペンタナールおよび４−メチルペンタナールからなる群より選択される、
キット。
（５３） 前記化合物が２つ以上の反応性官能基を含む、項目５１
に記載のキット。
（５４） 前記化合物がパラホルムアルデヒドである、項目５３に
記載のキット。
（５５） 前記化合物がジアルデヒドである、項目５３に記載のキ
ット。
（５６） 項目５５に記載のキットであって、前記ジアルデヒドが
、グルタルアルデヒド、グリオキサール、マロンジアルデヒド、スクシンアルデ
ヒド、アジポアルデヒドおよびフタルアルデヒドからなる群より選択される、キ
ット。
（５７） 項目５１に記載のキットであって、前記化合物が、ＮＨ
Ｓイミデート、マレイミド、クロロアセチル、フルオロアセチル、ヨードアセチ
ル、ブロモアセチル、アミン、およびヒドラジドからなる群より選択される少な
くとも１つの官能基を含む、キット。
（５８） 項目５０に記載のキットであって、前記ポジティブコン
トロール組成物中の前記微生物の前記表面タンパク質が、１つ以上の該表面タン
パク質の酵素による少なくとも部分的な消化によって不可逆的に改変されている
、キット。
（５９） 項目５８に記載のキットであって、前記酵素が、ブロメ
リン、キモトリプシン、クロストリパイン、コラゲナーゼ、エラスターゼ、フィ
シン、カリクレイン、メタロエンドペプチダーゼ、プロテイナーゼＫ、アミノペ
プチダーゼＭ、カルボキシペプチダーゼＹ、Ｘａ因子、パパイン、キモパパイン
、ペプシン、黄色ブドウ球菌プロテアーゼ（Ｖ−８菌株）、トリプシンおよびそ
れらの混合物からなる群より選択される、キット。
（６０） 前記微生物がウイルスである、項目５０に記載のキット
。
（６１） 項目６０に記載のキットであって、前記ウイルスが、ヒ
ト免疫不全ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、サイトメガロウイ
ルス、ヒトリンパ栄養性ウイルス、エプスタイン−バーウイルス、パルボウイル
ス、単純疱疹ウイルス、ヒト疱疹ウイルス８およびＡ型肝炎ウイルスからなる群
より選択される、キット。
（６２） 前記微生物が細胞内寄生生物である、項目５０に記載の
キット。
（６３） 項目６２に記載のキットであって、前記寄生生物が、Ｃ
ｈｌａｍｙｄｉａ ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ、Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｐｓｉｔｔ
ａｃｉ、Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ ｐｒｏｗａｚｅｋｉ、Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ
ｔｙｐｈｉ、Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ ｒｉｃｋｅｔｔｓｉ、Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉ
ａ ｓｉｂｔｒｉｃｕｓ、Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ ｃｏｎｏｒｉ、Ｒｉｃｋｅｔ
ｔｓｉａ ａｕｓｔｒａｌｉｓ、Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ ａｋａｒｉ、Ｒｉｃｋ
ｅｔｔｓｉａ ｔｓｕｔｓｕｇａｍｕｓｈｉ、Ｃｏｘｉｅｌｌａ ｂｕｍｅｔｉ
およびＲｏｃｈａｌｉｍａｅａ ｑｕｉｎｔａｎａからなる群より選択される、
キット。
（６４） 生物学的サンプルにおける核酸増幅技術による表面タンパ
ク質を含む微生物の検出方法であって、該方法は、該生物学的サンプル中のポジ
ティブ内部コントロールの同時増幅を含み、ここで該ポジティブ内部コントロー
ルは、項目１に記載の精製微生物を含む、方法。
（６５） 生物学的サンプルにおける核酸増幅技術による表面タンパ
ク質を含む微生物の検出方法であって、該方法は、該生物学的サンプル中のポジ
ティブ内部コントロールの同時増幅を含み、ここで該ポジティブ内部コントロー
ルは、項目２に記載の精製微生物を含む、方法。
（６６） 生物学的サンプルにおける核酸増幅技術による表面タンパ
ク質を含む微生物の検出方法であって、該方法は、該生物学的サンプル中のポジ
ティブ内部コントロールの同時増幅を含み、ここで該ポジティブ内部コントロー
ルは、項目１０に記載の精製微生物を含む、方法。
（６７） 前記微生物の核成分の増幅による、生物学的サンプル中の
表面タンパク質を含む微生物の検出方法であって、該方法は、（ａ）対応する微
生物の存在について試験される生物学的サンプルへの、項目１に記載の精製微
生物の添加、（ｂ）増幅される標的核酸を抽出する工程、（ｃ）標的核酸を増幅
する工程、および（ｄ）増幅された該標的核酸を検出する工程を含む、方法。
（６８） 前記微生物の核成分の増幅による、生物学的サンプル中の
表面タンパク質を含む微生物の検出方法であって、該方法は、（ａ）対応する微
生物の存在について試験される生物学的サンプルへの、項目２に記載の精製微
生物の添加、（ｂ）増幅される標的核酸を抽出する工程、（ｃ）標的核酸を増幅
する工程、および（ｄ）増幅された該標的核酸を検出する工程を含む、方法。
（６９） 前記微生物の核成分の増幅による、生物学的サンプル中の
表面タンパク質を含む微生物の検出方法であって、該方法は、（ａ）対応する微
生物の存在について試験される生物学的サンプルへの、項目１０に記載の精製
微生物の添加、（ｂ）増幅される標的核酸を抽出する工程、（ｃ）標的核酸を増
幅する工程、および（ｄ）増幅された該標的核酸を検出する工程を含む、方法。

（発明の要旨）
本発明は、核酸増幅技術のための信頼性のあるコントロールとして機能し得る
、ポジティブコントロール材料を提供する。本発明のこのポジティブコントロー
ル材料は、一般的に、非感染性にされたが核酸増幅プロセスおよび検出プロセス
を受けやすいように実質的にインタクトな核成分を保持する、ウイルスまたは粒
子を含む。

従って、本発明は、表面タンパク質および実質的にインタクトな核成分を含む
精製された微生物を提供し、ここで、１つ以上の表面タンパク質は、微生物が改
変によって非病原性になるように、不可逆的に改変される。

本発明はまた、表面タンパク質および実質的にインタクトな核成分を含む精製
された微生物を提供し、ここで、１つ以上の表面タンパク質は、この微生物が改
変によって非病原性になるように、化合物の共有結合によって非可逆的に改変さ
れ、この化合物は、表面タンパク質上の１つ以上の反応部位に対して反応性の１
つ以上の官能基を含む。

本発明はさらに、表面タンパク質およびインタクトな核成分を含む精製微生物
、ならびに生物学的流体を刺激する液体マトリックスを含む組成物を提供し、こ
こで、１つ以上の表面タンパク質は、微生物が改変によって非病原性になるよう
に、不可逆的に改変される。

本発明はまた、表面タンパク質およびインタクトな核成分を含む非病原性の精
製微生物を生成し、かつこの微生物が改変によって非病原性になるように、実質
的に未改変の核成分を残しながら１つ以上の表面タンパク質を不可逆的に改変す
るための方法を提供する。

本発明はまた、微生物の核成分を増幅することによって、生物学的サンプル中
において表面タンパク質を含む微生物を検出する方法を提供し、この方法は、こ
の微生物の精製コントロールサンプルの核成分の増幅を含み、ここで、コントロ
ール微生物の１つ以上の表面タンパク質は、このコントロール微生物が改変によ
って非病原性になるように、不可逆的に改変される。

さらに、本発明は、表面タンパク質を有する微生物の存在について生物学的サ
ンプルを分析するためのキットを提供し、ここで、このキットは、表面タンパク
質およびインタクトな核成分を含む精製微生物を含むポジティブコントロール組
成物を含み、ここで、１つ以上の表面タンパク質は、この微生物が改変によって
非病原性になるように、不可逆的に改変される。

本発明の他の特徴および利点が、以下の詳細な説明および上記の特許請求の範
囲から明らかである。

（発明の詳細な説明）
本発明は、表面タンパク質および実質的にインタクトな核成分を含む精製され
た微生物を提供し、ここで、１つ以上の表面タンパク質は、この微生物が改変に
よって非病原性になるように、不可逆的に改変される。

本発明の実施において意図される微生物は、病原性であり、かつそれを検出す
ることが病気の検出または処置を補助することになる、微生物である。本明細書
中に使用される場合、用語「微生物」は、宿主に感染する微生物の能力を補助ま
たは援助する表面タンパク質を含む、任意の感染性の微視的生物を含む。例えば
、ｇｐ１２０がＨＩＶウイルスの表面上に存在し、そしてウイルスがそのＣＤ４
レセプターへの結合を介して単球およびリンパ球に結合することを可能にするレ
セプタータンパク質として機能する（Ｍａｄｄｏｎら，１９８６，Ｃｅｌｌ，４
７：３３３；ＭａｃＤｏｕｇａｌら，１９８６，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３１：３８
２；Ｍｏｏｒｅら，１９９３，Ｊ．Ｂｅｎｔｚ（編），Ｖｉｒａｌ Ｆｕｓｉｏ
ｎ Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ．Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ，Ｆｌ
ａ）。別の好ましい実施形態において、微生物はウイルスであっても細胞内寄生
虫であってもよい。本明細書中に使用される場合、用語「ウイルス」とは、エン
ベロープウイルスまたは非エンベロープウイルスのいずれかおよび核材料として
ＲＮＡまたはＤＮＡのいずれかを含むウイルスを含むことを意味する。例として
は、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、Ａ型肝炎ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、
Ｃ型肝炎ウイルス、サイトメガロウイルス、ヒトリンパ栄養性ウイルス（ｈｕｍ
ａｎ ｌｙｍｐｈｏｔｒｏｐｈｉｃ ｖｉｒｕｓ）、エプスタイン−バーウイル
ス、パルボウイルス、単純疱疹ウイルス、ヒト疱疹ウイルス８が挙げられるが、
これらに限定されない。細胞内寄生虫の例としては、Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｔｒ
ａｃｈｏｍａｔｉｓ、Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｐｓｉｔｔａｃｉ、Ｒｉｃｋｅｔｔ
ｓｉａ ｐｒｏｗａｚｅｋｉ、Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ ｔｙｐｈｉ、Ｒｉｃｋｅ
ｔｔｓｉａ ｒｉｃｋｅｔｔｓｉ、Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ ｓｉｂｔｒｉｃｕｓ
、Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ ｃｏｎｏｒｉ、Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ ａｕｓｔｒａ
ｌｉｓ、Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ ａｋａｒｉ、Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ ｔｓｕｔ
ｓｕｇａｍｕｓｈｉ、Ｃｏｘｉｅｌｌａ ｂｕｍｅｔｉおよびＲｏｃｈａｌｉｍ
ａｅａ ｑｕｉｎｔａｎａが挙げられるが、これらに限定されない。

本発明のコントロール材料の調製のために、所望の微生物が、標準的な方法に
よって増殖され得る。例えば、ＨＩＶウイルスに関して、増殖方法は、米国特許
第５，１３５，８６４号に開示され、この特許は、ＨＩＶの産生および精製を記
載する。代替的な供給源として、微生物は、感染した生物学的流体から（例えば
、感染動物由来の血液から）単離され得る。この技術は、細胞培養物からウイル
スを精製する場合に使用される技術に類似する。Ｄａｖｉｓら，Ｍｉｃｒｏｂｉ
ｏｌｏｇｙ，第２編（Ｈａｒｐｅｒ ＆ Ｒｏｗ，１９８０）を参照のこと。従
って、例えば、Ｂ型肝炎およびＣ型肝炎は、この方法によって感染個体の血液か
ら精製され得る。さらに、所望の微生物の大量生産が、例えば、国立衛生研究所
（ＮＩＨ）のＡＩＤＳ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｒｅ
ａｇｅｎｔ Ｐｒｏｇｒａｍおよびアメリカンタイプカルチャーコレクション（
ＡＴＣＣ）から利用可能である、慢性的に感染した細胞株から誘導され得る。

一旦、十分な培養材料が利用可能になると、微生物が当業者に公知の技術を用
いて精製され得る。代表的な精製方法は、以下である。微生物精製の最初工程は
、細胞および細胞の破片の除去を含む。これは、大きさまたは質量に基づく分離
技術（例えば、濾過または低速遠心）によって達成され得る。この後、微生物は
、適切な孔サイズを用いたろ過または高速の遠心を用いた精製によって濃縮され
て、部分的に精製された微生物調製物を形成し得る。次いで、この部分的に精製
された調製物は、超遠心および密度勾配精製技術に供されて、精製された微生物
調製物を獲得し得る。続く精製によって得られた大量の精製材料は、一般的に、
−７０℃で保存され、そして培養技術によってウイルス活性もしくは寄生虫活性
について、ならびに当該分野で公知の方法もしくは本明細書中に記載される方法
に従う増幅技術によって核酸の完全性について試験され得る。

精製後、微生物は、その表面タンパク質の選択的改変によって本発明の方法に
従って非病原性にされ、これによって、核成分を実質的にインタクトにしたまま
で、微生物を非感染性にする。従って、本発明は、非病原性微生物を生成するた
めの方法を提供し、この方法は、表面タンパク質およびインタクトな核成分を含
む精製された微生物を提供する工程、ならびに微生物が改変によって非病原性に
なるように、核成分を実質的に未改変のままで１つ以上の表面タンパク質を不可
逆的に改変する工程を包含する。

本明細書中に使用される場合、用語「実質的にインタクト」とは、核酸が本明
細書中に議論される核酸増幅技術を受けやすいように、改変試薬による分解から
十分な核内容物（特に、細胞の核酸内容物）を保存するために、微生物の細胞内
成分と改変剤とを最小限に接触させることを考慮する。本明細書中に使用される
場合、用語「非病原性」とは、本発明の方法に従う表面タンパク質の改変結果を
意味し、この微生物は、その核内容物が実質的にインタクトであるにもかかわら
ず、細胞を感染し得ず、複製することも疾患を引き起こすこともできない。

本発明の好ましい実施形態において、精製された微生物は、この微生物が改変
によって非病原性になるように、化合物の共有結合によって改変され、この化合
物は、表面タンパク質上の１つ以上の反応部位と反応性である１つ以上の官能基
を含む。本明細書中に使用される場合、使用される「化合物」は、表面タンパク
質に共有結合し得るか、または微生物上の２つ以上の表面タンパク質を架橋し得
る化合物である。表面タンパク質は、代表的に、化合物の共有結合および架橋が
可能である、いくつかの反応部位を含む。例えば、アミノ基は、アシル化によっ
て改変され得；スルフヒドリル基は、付加反応およびアルキル化によって改変さ
れ得；カルボニル基およびカルボキシル基は、アシル化によって改変され得；そ
してアルデヒド基およびヒドロキシル基は、アミノ化および還元性アミノ化によ
って改変され得る。これらの改変反応のうちの１つ以上が、本発明の非病原性微
生物の調製に使用され得る。

本発明のこの実施形態に従って、表面タンパク質改変は、一般的に、曝された
アミノ酸残基との反応を介したタンパク質への共有結合を含む。当業者に公知の
任意の型の共有結合的な改変または架橋が使用され得るが、アミノ残基、スルフ
ヒドリル残基、およびカルボン酸残基の共有結合的な改変または架橋を使用する
ことが好ましい。例えば、アミノ基を改変する架橋剤としては、グルタルアルデ
ヒドおよびパラホルムアルデヒドが挙げられる。これらの各々は、タンパク質末
端由来または内部リジン側鎖のいずれかに由来する求核性遊離アミンによって、
ｐＨ７より上において直ちに攻撃される。生じる生成物は、タンパク質の遊離ア
ミンを有するシッフ塩基である。グルタルアルデヒドはまた、その反応性アミン
残基によって特異的に攻撃されて、高い割合の架橋を導く。

そのスルフヒドリル残基を介したタンパク質の改変のための適切な試薬は、不
可逆的なスルフヒドリルブロッキング剤であるＮ−エチルマレイミド（ＮＥＭ）
またはｎ置換ビスマレイミド架橋剤である。ＮＥＭは、安定なチオエーテル結合
を形成するスルフヒドリル結合と反応するアルキル化試薬である。この反応は、
遊離アミンとの反応を回避するために、ｐＨ６．０にて実行され得る。他のスル
フヒドリル反応試薬（例えば、ビスマレイミドヘキサン（ＢＭＨ））もまた、使
用され得る。ＢＭＨは、活性部位間に６炭素スペーサーを有する、ホモ二官能性
架橋剤である。この架橋剤はまた、ｐＨ７．０において安定なチオエーテル結合
を形成する。

別々に好ましい実施形態において、使用され得る化学改変剤は、アルデヒド基
のような単一の反応性官能基を含む、単官能性架橋剤を含有する。アルデヒド官
能基を含む薬剤の例としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：ホ
ルマリン（ホルムアルデヒド）、アセトアルデヒド、プロピオンアルデヒド、ｎ
−ブチルアルデヒド、ベンズアルデヒド、ｐ−ニトロベンズアルデヒド、ｐ−ト
ルアルデヒド、サリチルアルデヒド、フェニルアセトアルデヒド、２−メチルペ
ンタナール、３−メチルペンタナール、および４−メチルペンタナール。あるい
は、この化学改変剤は、以下のような官能基を含み得る：ＮＨＳイミデート、イ
ミドエステル、マレイミド、クロロアセチル、フルオロアセチル、ヨードアセチ
ル、ブロモアセチル、アミン、ヒドラジン、カルボジイミド、およびこれらの基
の誘導体。好ましい実施形態において、この化学改変剤は、このような反応性官
能基の２つ以上を含み、単一の表面タンパク質上の反応部位との複数の共有結合
または別個の表面タンパク質の架橋を容易にする。２つの同一の官能基を含む化
合物は、本明細書中でホモ二官能性（ｈｏｍｏｂｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ）構造
を有すると呼ばれ、２つの異なる官能基を含む化合物は、ヘテロ二官能性（ｈｅ
ｔｅｒｏｂｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ）構造を有すると呼ばれる。特に好ましいホ
モ二官能性試薬としては、以下のようなジアルデヒドが挙げられる：パラホルム
アルデヒド、グリオキサール、マロンジアルデヒド、スクシンアルデヒド、アジ
ピンアルデヒド、グルタルアルデヒドおよびフタルアルデヒド。

本発明の実施に有用である、いくつかの好ましい架橋剤および二官能性結合剤
は、Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙから市販されており、そ
して利用可能な製品文献（この内容は、技術水準を記載するために、本明細書に
おいてその全体が参考として援用される）に記載されている方法に従って使用さ
れ得る。このような化合物および一般的な方法の例は、以下の通りである。

（Ｎ−（β−マレイミドプロピオン酸）ヒドラジド（ＢＭＰＨ））（Ｐｉｅｒ
ｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．製品番号２２２９７）。ＢＭＰＨは、スルフヒ
ドリル反応性かつカルボニル反応性のヘテロ二官能性剤である。このヒドラジド
基は、アルデヒドを生成するために、酸化後、糖タンパク質および他の糖結合体
中の糖残基に共有結合され得る。糖基は、特定のオキシダーゼ（例えば、ガラク
トースオキシダーゼ）または過ヨウ素酸ナトリウムによるいずれかの使用によっ
て酸化され得る。糖タンパク質を、０℃において１ｍＭの過ヨウ素酸ナトリウム
で処理して、シアル酸基をカルボニルを有するように酸化する。室温（ＲＴ）に
おける１０ｍＭの過ヨウ素酸ナトリウムとの反応により、ジオールを含む全ての
糖上にアルデヒドを生成する。ＢＭＰＨとこれらのアルデヒドとの反応により、
ヒドラゾン結合を生成する。架橋剤のマレイミド末端は、表面タンパク質上のス
ルフヒドリル基と反応され得る。スルフヒドリルが存在しない場合、これらは、
ジスルフィド還元または２−イミノチオランもしくはＳＡＴＡでのチオール化（
ｔｈｉｏｌａｔｉｏｎ）を介して生成され得る。マレイミドは、ｐＨ６．５〜７
．５でスルフヒドリル基と反応し、安定なチオエーテル結合を形成する。マレイ
ミド反応は、代表的に、室温にて約２時間、または４℃にて約４時間で完了する
。

（１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドヒドロク
ロリド（ＣＡＳ＃２５９５２−５３−８）（ＥＤＣ））（Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅ
ｍｉｃａｌ Ｃｏ．製品番号２２９８０、２２９８１）。ＥＤＣは、最初に、カ
ルボキシル基と反応し、そしてアミン反応性中間体（Ｏ−アシルイソウレア）を
形成する。水溶液を使用する、２工程の結合手順において、この中間体の安定化
は、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドを使用して達成される。アミンとの反応は、
この中間体の加水分解、このカルボキシルの再生、およびＮ−置換ウレアの遊離
を生じる。副反応は、Ｎ−アシルウレアの形成であり、これは、通常、タンパク
質の疎水性領域に位置するカルボキシルに制限される。

（イミドエステル架橋剤）（Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．製品番
号２０６６０、２０６６３、２１６６７、２１６６６、２０７００、２０６６５
）。ホモ二官能性イミドエステルは、１級アミノ基と反応して、安定な共有結合
を形成し得る、２つの同一の基を有する。これらとしては、ジメチルアジポイミ
デート（ＤＭＡ）、ジメチルピメルイミデート（ＤＭＰ）、ジメチルスベルイミ
デート（ＤＭＳ）およびジメチル３，３’−ジチオビスプロプリオンイミデート
（ＤＴＢＰ）が挙げられる。他の連結化学物質のようではなく、イミドエステル
は、タンパク質中の他の求核基に対して最小の架橋反応性を有する。穏やかなア
ルカリ性のｐＨ（７〜１０）において、イミドエステルは、１級アミンとのみ反
応して、イミドアミドを形成する。イミドエステル結合は、通常、ｐＨ８．５と
９．０との間で実施される。イミドエステルは、タンパク質の全体的な電荷に影
響を与えないので、他の架橋剤を越える利点を有する。このイミドエステルは、
これらが置換する１級アミンと同様に、生理学的ｐＨにおいて正の電荷を有する
。イミドエステル反応は、０℃または室温で実施される。なぜならば、高温は、
これらの反応の際に、低い収率に寄与し得るからである。ホモ二官能性中間体は
、異なる架橋ニーズのために基と基との間の距離を変えて（例えば、タンパク質
と高分子錯体との残基間の距離、およびタンパク質間の隣接関係に適合するため
に）利用可能である。ＤＴＢＰ（チオールが切断可能であるホモ二官能性架橋剤
）を、隣接関係を研究するために、これらの架橋剤の切断し得ない形態と結合さ
せて使用する。ＤＭＰを、アガロース支持体上に固定したタンパク質Ａに抗体を
架橋するために使用した。

（Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＮＨＳ−エステル））（Ｐｉｅｒ
ｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．製品番号２１５５５、２１５８０、２１６５５
、２１６５８、２２３１１、２２３１２、２２４１６、２２３１７、２２３０９
、２２３２４、２２３０７、２２３０８）。ジスクシンイミジルスベレート（Ｄ
ＳＳ）は、水不溶性のホモ二官能性ＮＨＳエステルであり；ビス（スルホスクシ
ンイミジル）基質（ＢＳ^３）は、その水溶性アナログである。これらの架橋剤は
、切断し得ず、そして細胞表面レセプターに放射標識したリガンドを結合するた
めに広範に使用される。さらなる例としては、以下のようなマレイミド基を有す
る、マレイミド種が挙げられる：ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシス
クシンイミドエステル（ＭＢＳ）、ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシ
スクシンイミドエステル（スルホ−ＭＢＳ）、スクシンイミジル４−［ｐ−マレ
イミドフェニル］ブチレート（ＳＭＢＰ）、スルホスクシンイミジル４−［ｐ−
マレイミドフェニル］ブチレート（スルホ−ＳＭＢＰ）、Ｎ−［γ−マレイミド
ブチリルオキシ］スクシンイミドエステル（ＧＭＢＳ）、Ｎ−［γ−マレイミド
ブチリルオキシ］スルホスクシンイミドエステル（スルホ−ＧＭＢＳ）、Ｎ−［
ε−マレイミドカプロイルオキシ］スクシンイミドエステル（ＥＭＣＳ）、およ
びＮ−［ε−マレイミドカプロイルオキシ］スルホスクシンイミドエステル（ス
ルホ−ＥＭＣＳ）。

１級アミンは、ＮＨＳ−エステルのための主な標的である。アクセス可能なα
−アミン基は、ＮＨＳ−エステルと反応する、ペプチドおよびタンパク質のＮ末
端上に存在する。しかし、α−アミンは、タンパク質上でまれにしか利用可能で
なく、従って、アミノ酸の側鎖との反応は、重要となる。５つのアミノ酸は、側
鎖中に窒素を有するが、リジンのε−アミンのみが、ＮＨＳ−エステルと有意に
反応する。共有アミド結合は、ＮＨＳ−エステル結合試薬が、１級アミンと反応
する場合に、形成される。この反応は、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドの遊離を
生じる。

ＮＨＳ−エステル架橋反応は、リン酸塩、炭酸塩／重炭酸塩、ＨＥＰＥＳおよ
びホウ酸塩の緩衝液中で最も一般的に実施される。他の緩衝液はまた、１級アミ
ンを含まないことを条件として、使用され得る。１級アミンは、Ｔｒｉｓの構造
中に見出され、ＴｒｉｓをＮＨＳエステル反応に対して許容不可能な緩衝液にす
る。中性〜塩基性のｐＨにおいて、大過剰のＴｒｉｓが、反応をクエンチする目
的で反応の最後に添加され得る。グリシンは、同様な様式で使用され得る１級ア
ミンである。

ＮＨＳ−エステルは、１級アミンに対して本質的に同一の反応性を有する２つ
の別個のクラス（水溶性形態および不水溶性形態）に広範に分類され得る。水溶
性ＮＨＳ−エステルの溶解度は、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド環上のスルホネ
ート（−ＳＯ_３−）基に起因する。スルホン化ＮＨＳ−エステルの架橋剤は、ナ
トリウム塩として供給され、そして１０ｍＭの濃度まで水溶性である。

Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル結合試薬の非スルホン化形態は、水溶
性ではない。これらの化合物は、まず、有機溶媒中に溶解され、次いで水性反応
混合物に添加される。水不溶性ＮＨＳ−エステル架橋剤は、荷電した基を有さな
い。この架橋剤は、親油性であり、従って膜透過性である。この架橋剤は、細胞
内結合および膜内結合のために有用である。

水不溶性ＮＨＳ−エステルは、有機溶媒（例えば、ＤＭＳＯまたはＤＭＦ）中
に溶解され得る。次いで、この架橋剤溶液を、この水性反応性混合物に添加し、
その最終容積は、１０％までの有機溶媒を含む。架橋剤は、乳状の濁った溶液の
外観によって示されるような高濃度の溶液になり始める。架橋はなお、このよう
な条件下で生じ得るが、このプロトコールは、ＮＨＳ−エステルの完全な溶解を
確実にするために改変され得る。例えば、この水相は、さらなる有機溶媒で補充
され得る。

マレイミド基は、反応性混合物のｐＨが６．５と７．５との間に保たれる場合
、スルフヒドリル基に対して最も選択的である。ｐＨ７において、スルフヒドリ
ルとマレイミドとの反応の速度は、アミンとの反応よりも１０００倍速い。この
ｐＨの範囲を越えると、１級アミンとの反応速度は、より顕著となる。マレイミ
ドは、ヨードアセトアミドのように、チロシン、ヒスチジンまたはメチオニンと
反応しない。マレイミド基と反応したスルフヒドリルとの間の安定なチオエーテ
ル結合が、形成され、これにより、生理学的条件下で、切断され得ない。マレイ
ミドの非反応性マレアミック酸（ｍａｌｅａｍｉｃ ａｃｉｄ）への加水分解は
、特にｐＨ８．０より上で、チオールの改変で完了し得る。加水分解は、チオー
ル結合の前または後に生じ得る。

β−メルカプトエタノール、ジチオトレイトール、メルカプトエチルアミン、
システイン、および他のチオール化合物は、結合の前に除去されなければならな
い。過剰なマレイミドは、システインまたはβ−メルカプトエタノールのような
遊離チオールの添加によって、インキュベート期間の終わりにクエンチされ得る
。ＥＤＴＡは、ジスルフィドの再酸化を防止するために結合緩衝液中に含まれ得
る。

（１，４−ビス−マレイミドブタン（ＢＭＢ））（Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉ
ｃａｌ Ｃｏ．製品番号２２３３１）。ＢＭＢは、中間の長さのスルフヒドリル
反応性ホモ二官能性架橋剤である。この架橋剤のマレイミド末端は、表面タンパ
ク質上のスルフヒドリル基と反応し得る。スルフヒドリルが存在しない場合、こ
れらは、ジスルフィド還元または２−イミノチオランもしくはＳＡＴＡでのチオ
ール化を介して生成される。マレイミドは、ｐＨ６．５〜７．５で−ＳＨ基と反
応し、安定なチオエーテル結合を形成する。マレイミド反応は、室温にて約２時
間、または４℃にて約４時間で完了する。

架橋剤または結合剤との反応後、この反応は、適切な薬剤（例えば、共有結合
により改変された反応基中に含まれるのと同一の反応基を有する薬剤）を使用す
ることによってクエンチされる。例えば、グリシンは、パラホルムアルデヒドで
の架橋をクエンチするために使用され得る。

精製されたウイルスはまた、タンパク質上のカルボン酸残基にアミノ酸を結合
させることによって不活化され得る。結合剤の例としては、活性なアルデヒド中
間体を形成するために、タンパク質上にある、糖ヒドロキシルおよび末端カルボ
ン酸を酸化する過ヨウ素酸ナトリウムである。次いで、この活性化された基を、
グリシンまたはリジンの形態で上昇したｐＨで求核試薬に曝露し、これにより、
アミノ酸のタンパク質への不可逆的な結合を生じ得る。結合プロトコールを最適
化するために、結合時間、温度、および振盪速度を変えることは、十分に当業者
の範囲内である。

別の好ましい実施形態において、この微生物は、市販の方法によって表面タン
パク質を酵素により消化することによって、非病原性にされ得る。表面タンパク
質の改変のために使用され得る酵素としては、以上が挙げられるが、これらに限
定されない：ブロメライン、キモトリプシン、クロストリパン（ｃｌｏｓｔｒｉ
ｐａｉｎ）、コラゲナーゼ、エラスターゼ、フィシン、カリクレイン、メタロエ
ンドペプチダーゼ、プロテイナーゼ、アミノペプチダーゼ、カルボキシペプチダ
ーゼ、第Ｘａ因子、パパイン、キモパパイン、ペプシン、黄色ブドウ球菌プロテ
アーゼ（Ｖ−８株）、またはトリプシン（単独または組み合わせのいずれか）。
本発明のこの局面において、微生物の表面タンパク質を少なくとも部分的に消化
して、この微生物を非病原性にするのに十分であり、微生物の核酸含有量を実質
的にインタクトで維持する、条件および期間で、この微生物は、反応混合物中で
酵素調製物と反応される。このような反応のための酵素溶液を調製する方法およ
びこの反応を実施する方法は、当業者に公知であり、そして手引きは、Ｔｈｅ
Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ Ｅｎｚｙｍｅ Ｍａｎｕａｌ（Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏ
ｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）のような教科書におい
て見出され得る。

任意の特定の酵素の選択は、入手可能性、使用し易さ、および基質特異性のよ
うな因子（これらの各々は、当業者によって評価され得る）に依存し得る。反応
は、微生物が酵素に曝される時間の長さによって、または酵素インヒビターとの
反応をクエンチすることによって制御され得る。例えば、パパインおよび同様に
キモパパインは、複数のペプチド結合およびエステル結合を加水分解し、そして
例えば、システイン、スルフィド、およびスルファイトによって活性化され、そ
してスルフヒドリル試薬（重金属を含む）、カルボニル試薬、およびアスコルビ
ン酸のような試薬の添加によって阻害される。キモトリプシン（アミドおよび感
受性のアミノ酸のエステルに対して容易に作用するエンドペプチダーゼ）は、芳
香族アミノ酸を含む結合に対して特異性を有し、そしてロイシル、メチオニル、
アスパラギニル、およびグルタミルの残基の結合の加水分解を触媒する。この酵
素は、例えば、重金属、および有機リン化合物によって阻害される。トリプシン
（タンパク分解性酵素）は、アルギニンまたはリジンのカルボキシ基と別のアミ
ノ酸のアミノ基との間のペプチド結合の加水分解を触媒し、そして例えば、有機
リン化合物、ベンジル４−グアニジノベンゾエート（４−ｇｕａｎｉｄｉｏｂｅ
ｎｚｏａｔｅ）および４’−ニトロベンジル４−グアニジノベンゾエートによっ
て阻害される。ペプシンは、種々のペプチド結合の加水分解を触媒するエンドペ
プチダーゼであり、そしてフェニルアシルブロミド、脂肪族アルコール、および
ジフェニルジアゾメタンによって阻害される。

上記の手順によって不活化されたウイルス性物質は、最終の反応混合物中に存
在する他の材料から分離される。これは、標準的な精製技術によって達成され、
これには、透析、ゲル濾過およびタンジェンタル（ｔａｎｇｅｎｔｉａｌ）濾過
が挙げられるが、これらに限定されない。最終の精製された不活化調製物を、当
業者に公知の方法によって活性ウイルスの存在について試験し得る。活性ウイル
スについて試験する従来の方法は、ウイルスが複製する能力について試験するこ
とである。例えば、ＨＩＶについて、この試験は、培養培地中でＨＩＶ ｐ２４
抗原の産生をモニタリングすることによってなされ得る。本発明の精製された不
活化微生物は、２〜８℃のような不凍結温度で貯蔵され得る。

本発明は、表面タンパク質およびインタクトな核成分を含む、精製された微生
物を含む物質（ここで、１つ以上の表面タンパク質は、不可逆的に改変され、こ
れにより、この微生物が非病原性にされる）および液体マトリクスの組成物をさ
らに提供する。従って、ポジティブコントロール物質として調製される場合、こ
の精製された不活化微生物は、好ましくは、生物学的サンプルが分析される流体
に対応する安定化された生物学的流体を含む、液体マトリクスに懸濁される。こ
のような流体としては、血清、血漿、線維素除去された血漿、安定化された血漿
プール、脳脊髄液（ＣＳＦ）、尿、唾液、精液および痰が挙げられるが、これら
に限定されない。あるいは、液体マトリクスは、生物学的な流体をシミュレート
するために処方される合成マトリクスを含み得る。合成の生物学的流体を調製す
る方法は、当該分野で周知である。さらに、この液体マトリクスは、抗酸化剤、
緩衝塩、保存剤および抗生物質のような添加物、糖（単糖類および多糖類）のよ
うなマトリクス安定性賦形剤、タンパク質（アルブミン、オボアルブミン、γグ
ロブリン、赤血球溶解物、カゼイン、乾燥粉ミルク、および／または他の血清タ
ンパク質を含む）、ポリビニルピロリジン、ポリ−１−リジン、およびメチル化
ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）のような合成安定剤を含み得る。この液体マトリ
クスはまた、例えば、スクロースおよびマンノースの添加によって、凍結乾燥で
の長期間の保存性および安定性のために改変され得る。

さらに、本発明は、表面タンパク質を有する微生物の存在について生物学的な
サンプルを分析するためのキットを提供し、ここで、このキットは、表面タンパ
ク質および実質的にインタクトな核成分を含む、精製された微生物のサンプルを
含む、ポジティブコントロール組成物を含み、ここで、１つ以上の表面タンパク
質は、非可逆的に改変され、これにより、この微生物が非病原性にされる。好ま
しい実施形態において、このキットは、上記のような液体マトリクス中に、非病
原性微生物コントロールを含む。本発明の実施において、このキットは、当業者
に公知の核酸増幅技術を行うのに必要なさらなる材料を含み得る。さらに、本発
明は、核酸増幅技術に使用される現存のキットおよびサービスに、本発明の非病
原性微生物の追加を含むことが意図される。このようなキットおよびサービスと
しては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎ
ｏｓｔｉｃｓ（Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）（ＣＯＢＡＳ ＡＭＰＬＩＣ
ＯＲの商品名）によって市販されているキットおよびサービス、Ｎａｔｉｏｎａ
ｌ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｉｎｃ．（Ｌｏｓ Ａｎｇｅｌｅ
ｓ，ＣＡ）、Ｂａｙｅｒ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｔａｒｒｙｔｏｗｎ，ＮＹ
）およびＧｅｎ−Ｐｒｏｂｅ，Ｉｎｃ．（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）により市
販されているＮＡＴスクリーニングサービス。

本発明の非感染性の不活化コントロール材料は、核酸増幅技術の全プロセスに
関してポジティブコントロールとして役立つ。例えば、不活化ＨＩＶウイルスを
含む、本発明のコントロール材料は、（１）サンプルの調製（カオトロピック（
ｃｈａｏｔｒｏｐｈｉｃ）塩／溶媒抽出物）、（２）必要な場合、ｃＤＮＡを産
生するためのＲＮＡの逆転写、（３）核酸の増幅、および（４）増幅された核酸
の検出の工程を介して処理され得る。

従って、本発明はまた、微生物の核成分の増幅によって、生物学的サンプル中
での表面タンパク質を含む微生物を検出する方法を提供し、この方法は、本発明
の精製したコントロール物質の核成分を増幅する工程を包含する。好ましい実施
形態において、この方法は、以下の工程を包含する：（ａ）本発明の非病原性微
生物コントロールを微生物サンプルに添加して、対応する微生物の存在について
試験するサンプルを調製する工程；（ｂ）増幅される標的核酸を抽出する工程；
（ｃ）標的核酸を増幅する工程；（ｄ）この増幅された標的核酸を検出可能に標
識された増幅された核酸プローブとハイブリダイズさせる工程；（ｅ）このハイ
ブリダイズされた標的核酸を検出する工程。このような個々の方法の工程は、当
業者に周知である。例えば、標的核酸の増幅は、ＲＮＡをｃＤＮＡに逆転写した
後、ＤＮＡまたはＲＮＡをポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）することによって達
成され得る。ハイブリダイゼーションおよび検出は、例えば、アルカリホスファ
ターゼ標識された核酸プローブの使用によって、またはエネルギー移動法（ｅｎ
ｅｒｇｙ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｍｅｔｈｏｄｏｌｏｇｙ）を用いたアンプリコン
の検出によって達成され得る。特に好ましい実施形態において、この方法は、生
物学的サンプル中に含まれる標的核酸を定量する工程をさらに包含し得る。

本発明の実施において、この方法は、スクリーニング方法（注入または移植の
前に、生物学的な流体をスクリーニングするような方法）、診断ツール（病原性
微生物を有すると疑われる個体からの生物学的流体を、このような微生物の存在
について分析するツール）または治療モニタリングツール（感染の処置を受けて
いる患者からの生物学的なサンプルを、微生物の存在およびその量について分析
するツール）として使用され得る。

本発明の種々の実施形態および利点は、以下に示される実施例からより良好に
理解されるが、これらは、例示を意図するものであって、限定を意図するもので
はない。

（実施例１）
この実施例は、精製されたＨＩＶ粒子の大規模製造を記載する。慢性的に感染
された細胞株（ＢＰ−１と称する）を使用して、このウイルスを提供した。この
細胞株は、元のＨ−９細胞株の高産生性改変体であり、そしてＤｒ．Ｂｅｒｎａ
ｒｄ Ｐｏｉｅｓｚによって提供された。この細胞株を、ＦＢＳおよび抗生物質
（ペニシリンおよびストレプトマイシン）を補充したＲＰＭＩ−１６４０培地中
に維持した。各細胞株のマスター細胞バンク（ＭＣＢ）および作用細胞バンク（
ＷＣＢ）を樹立し、そして生物製剤の製造に対して認容されたＵＳＦＤＡガイド
ラインに従って、維持した。代表的にＭＣＢは、３０〜５０バイアルの凍結細胞
を有する。ＭＣＢのバイアルを解凍し、培養において増殖させ、そして３０〜５
０バイアルの、ＷＣＢを構成する凍結細胞を調製するために使用する。ＭＣＢお
よびＷＣＢを、安全な液体窒素容器内に貯蔵し、そして追跡可能性を確実にする
ために、対数を維持する。

ＨＩＶ製造のために、細胞株のＷＣＢバイアルを解凍し、そしてＲＰＭＩ−１
６４０、ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）および抗生物質を含む培養において増殖させた
。最初に、細胞を固定的細胞培養フラスコ内で、１リットルの容量に達するまで
増殖させた。この時点で、細胞を、１つのボトルあたり１リットルの培養流体を
含む２リットルのローラーバッフルに移し、そして６０〜７０のローラーボトル
の製造規模に達するまで、さらに増殖させた。ローラーボトル培養物を、書面の
標準操作手順に従って維持し、そして慣用的な試験を行って、マイコプラスマお
よび他の外来性因子を確認した。

一旦、培養物が製造規模に達したら、ローラーボトルを１週間に１度採取した
。代表的に、各培養物の９０％を採取したが、これは、採取の時点の細胞密度に
よってわずかに変動し得る。採取された細胞培養物を、２つの濾過ループからな
る二重流路の接線流システム内で処理した。第１のループは、１０平方フィート
の０．４５μｍの膜を使用して、細胞および細胞砕片を除去し、そして第２の流
路は、１０平方フィートの３００Ｋｄのカットオフ膜を使用して、ウイルスを含
む培養上清を濃縮した。このシステムを、ｔｒｉｓ緩衝化生理食塩水で２回洗浄
し、そしてウイルスを含む上清を、約２リットルに濃縮した。

ウイルスを、超遠心分離（３０，０００×ｇ）によって、濃縮した上清から単
離した。ペレット化したウイルスを、５０ｍｌのｔｒｉｓ緩衝化生理食塩水に再
懸濁させた。次いで、この物質を、１．２リットルの２２〜６６％のスクロース
の直線勾配で装填し、そしてウイルスを密度勾配超遠心分離によって精製した。
ビリオンを含む勾配画分を、屈折率によって同定し、そしてプールした画分を、
ｔｒｉｓ緩衝化生理食塩水で希釈し、そしてビリオンを再度ペレット化させた。
次いで、ビリオンを、リン酸緩衝化生理食塩水に再懸濁させた。

生存可能なウイルスの増殖および精製を含む、全ての製造活性を、生物学的レ
ベル３（ＢＬ−３）の実験室内で実施した。これらの手順によって生じた液体廃
棄物を、次亜塩素酸塩（ｈｙｐｏｃｌｏｒｉｔｅ）または活性化ヨウ素で処理し
、その後、市の下水に排出した。固体廃棄物を、オートクレーブによって処理し
、その後、ＢＬ−３実験室から移動させた。

（実施例２）
この実施例は、表面タンパク質を架橋することによる、本発明により精製され
たウイルスの不活化の１つの方法を記載する。説明として、ビリオンエンベロー
プタンパク質の、パラホルムアルデヒド（組織および細胞の調製のために通常使
用される固定性物質）との架橋を試験した。生物学的流体中でのウイルスの不活
化のために、この固定性物質の滴定を、ＣＤＣによって推奨される濃度より高濃
度および低濃度で実施した（１９９２年５月８日／４１（ＲＲ−８）；００１
ＣＤＣ Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ ｏ
ｆ ＣＤ４＋ Ｔ−Ｃｅｌｌ Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎｓ ｉｎ Ｐｅｒｓ
ｏｎｓ ｗｉｔｈ Ｈｕｍａｎ Ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ Ｖｉｒｕ
ｓ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ）。最初に、精製したウイルスを２〜８℃で６〜８時間
ゆっくりと解凍して、ウイルスの溶解を最小にした。次に、氷上のままで、ウイ
ルスを冷ＰＢＳで、約１×１０^１０コピー／ｍＬ（ｃｐ／ｍＬ）の最終濃度に希
釈した。次いで、希釈したウイルスを４つの異なる５ｍｌのアリコートに分割し
、そして新たに調製したパラホルムアルデヒドを、それぞれに０．６２５、１．
２５、２．５、または５％のいずれかの最終濃度で添加した。次いで、これらの
反応混合物を、穏やかに揺らしながら、２〜８℃で６０分間インキュベートした
。この反応をクエンチするために、１ｍＬの０．５Ｍグリシン（ｐＨ７．４）を
添加し、そして残余の全てのパラホルムアルデヒドと反応させた。グリシンの添
加後、この反応物を２〜８℃で２時間、穏やかに揺らした。グリシンおよび任意
の過剰のクエンチされていない固定性物質を除去するために、次いで、各反応混
合物を、１ＬのＰＢＳ（ｐＨ７．４、２〜８℃）に対して４回交換して透析した
（１０〜１４Ｋ分子量カットオフ）。次いで、透析したウイルスを１５ｍＬのチ
ューブに移し、そして３，０００×ｇで１０分間遠心分離して、任意の沈澱した
ウイルスをペレット化させた。次いで、各上清のサンプルを、細胞培養において
、感染性ウイルスの存在について試験した。

残余の不活化ウイルスを、以下からなる安定化した血漿マトリックスで滴定し
た：リン酸緩衝化生理食塩水（ｐＨ７．４）中の、４％クエン酸ナトリウム中に
収集したヒト起源の血漿、１ｍＬ ＥＤＴＡ、１Ｕ／ｍＬリボヌクレアーゼイン
ヒビター（ヒト胎盤）、０．０９％ ＮａＮ_３、１ｍＭジチオトレイトール、０
．０５％ゲンタマイシン。他のウイルスに対してこのマトリックスを最適化する
ために、１種以上の添加剤が削除され得る。

（実施例３）
実施例２に記載されたように産生した改変ウイルスを試験して、このプロセス
がウイルスを不活化したことを確認した。説明として、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙ
ｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎから入手したＣＥＭ細胞株を、ウ
イルス感染性研究についての宿主細胞として使用した。この株を使用することの
利点は、インビトロＨＩＶ感染の確立が、比較的少ないビリオンを必要とするこ
と、およびこの感染が、細胞溶解性ではなくむしろ慢性的であり、分析を容易に
することである。これらの研究のために、ＺｅｐｔｏＭｅｔｒｉｘ ＨＩＶ ｐ
２４ Ａｎｔｉｇｅｎ ＥＩＡ（ＺｅｐｔｏＭｅｔｒｉｘ，Ｂｕｆｆａｌｏ Ｎ
Ｙ）を使用して、感染を検出および追跡する。

ＣＥＭ細胞を、１０％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ−１６４０中で、２４ウェルプレ
ート内で培養する。細胞を、１ｍｌ容量で１ウェル当たり１０^５細胞でプレート
し、そして種々のウイルス（処理されたか処理されていないかのいずれか）の希
釈物１００μｌを、個々のウェルに添加する。培養物に、週に２回、５０％培地
交換を与え、そして培養上清を、ＨＩＶ ｐ２４についてアッセイする。全ての
培養物が、最初はＨＩＶ ｐ２４を含む。しかし、ウイルスが非感染性である培
養物においては、ＨＩＶ ｐ２４レベルは経時的に低下し、最終的にバックグラ
ウンドレベルに達する。感染性のビリオンを含む培養物は、経時的に増加するレ
ベルのＨＩＶ ｐ２４を示し、非感染性ウイルスを含む培養物に対する感染性ウ
イルスを含む培養物の容易な識別を可能にする。従って、ウイルスの異なる希釈
物を使用して得られた結果を比較することによって、感染性ＨＩＶのいかに多く
の対数が、所定の処置手順によって不活化されたかを推定し得る。

表１は、精製されたＨＩＶが異なる濃度のパラホルムアルデヒドで６０分間処
理された実験からのデータを要約する。ここで、ＨＩＶのアリコートをとり、そ
して０．６２５％、１．２５％、２．５％または５．０％のパラホルムアルデヒ
ドで処理した。次いで、処理されたウイルスの異なる希釈物（１：８，０００、
１：８０，０００、および１：８００，０００）を、ＣＥＭ細胞の培養物に入れ
、そしてｐ２４アッセイを、接種の３日後、７日後、１０日後、および１４日後
に、培養上清において実施した。データを、培養上清におけるＨＩＶ ｐ２４タ
ンパク質のｐｇ／ｍｌとして表す。ｐ２４アッセイに対する標準曲線は、７．８
ｐｇ／ｍｌ〜１２５ｐｇ／ｍｌで直線である。７．８ｐｇ／ｍｌ未満のＨＩＶ
ｐ２４濃度を「＜７．８ｐｇ／ｍｌ」で表して、このアッセイの感度を示し、そ
してこのアッセイは１２５ｐｇ／ｍｌより上では非直線であるので、１２５ｐｇ
／ｍｌより高い値を「＞１２５ｐｇ／ｍｌ」で表す。

処理されていないウイルスは、１４日の期間の間の全ての培養物におけるＨＩＶ
ｐ２４の存在を証拠とする場合、全ての培養物において、試験した全ての希釈
物で、増殖した。他方で、パラホルムアルデヒドでのウイルスの処理は、１４日
目までに培養上清において、検出不可能な量のｐ２４を生じた。３日目、７日目
および１０日目に検出され得たＨＩＶ ｐ２４ Ａｇのレベルは、１４日の期間
にわたってこれらのレベルが次第に低下することを証拠とする場合、不活化した
ウイルスを培養物に添加したことに起因した。表２は、ウイルスが架橋剤と共に
インキュベートされる曝露時間（分）に従って、本発明の不活化方法の効果を示
す。

（実施例４）
本実施例は、表面タンパク質の酵素消化によって本発明のコントロール材料を
調製する方法を提供する。精製したウイルス（例えば、実施例１のように生成さ
れる）を、Ｈａｎｋの緩衝化生理食塩水中、０．２５％ウシトリプシンおよび０
．１％ ＥＤＴＡを含有する混合物において、３７℃にて約２時間、インキュベ
ートする。インキュベートの終わりに、この反応を、等量の胎仔ウシ血清を添加
することによって止める。次いで、材料を公知の技術に従って精製し、そして非
病原性を、実施例３に記載のような方法によって確認する。

（実施例５）
本実施例は、このウイルス核酸がインタクトであり、その結果、実施例３に記
載される不活化手順に従って増幅できることを実証する。説明のように、化学的
に不活化したＨＩＶがＰＣＲによってなお検出されるか否かを試験するために、
実験を実施した。ＣＯＢＡＳ ＡｍｐｌｉＳｃｒｅｅｎ ＨＩＶ−１ Ｍｏｎｉ
ｔｏｒアッセイ（Ｒｏｃｈｅ）（ＨＩＶ ＲＮＡコピー数を定量化する臨床キッ
トに基づくＰＣＲ）を使用した。これらの実験を、安定化した血漿形成において
、実施例３に記載される不活化反応からの材料を滴定することによって実施した
。次いで、ＤＮＡｓｅ、ＲＮＡｓｅおよび発熱物質を含まないＰＣＲチューブ（
Ｃｈａｓｍａ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）に分注した
。ＨＩＶ ＲＮＡコピー数の定量化を、Ｒｏｃｈｅ ＣＯＢＡＳアッセイを用い
て、低温凍結ウイルスのサンプル上で決定した。サンプルを、１：１０００に希
釈し、そしてデータをこの希釈でのコピー数として表す。このデータを、以下の
表３にまとめる。

（実施例６）
いくつかの架橋試薬を、種々の濃度での不活化ＨＩＶにおけるこれらの効力に
ついて試験した。表４に、本実験において使用した材料（これらの濃度、体積、
分子量および質量）を列挙する。

希釈前のＨＩＶ緩衝液を調製するために、生存するＨＩＶを解かし、そして氷
上に置く。１つの希釈において、０．５ｍＬのＨＩＶを、２０ｍＬのＰＢＳ緩衝
液に添加し、次いで穏やかに混合し、そして氷上に貯蔵する。別の希釈において
、０．５ｍＬのＨＩＶを、２０ｍＬのＭＢＳ緩衝液に添加し、次いで穏やかに混
合し、そして氷上に貯蔵する。

架橋反応のために、表５（ＤＮＡサンプルについて）および６（ＢＭＢサンプ
ルについて）の通り、ＨＩＶを架橋試薬および／または希釈物（ＰＢＳもしくは
ＭＥＳ）の１つと結合させ、そして室温にて２時間、穏やかに混合した（ｘ、ｙ
、ｚローテイター）。この反応を、０．５ｍＬ（０．５Ｍ）のグリシンの添加に
よって室温にて１時間クエンチした（表５および６に示す）。次いで、２．４ｍ
Ｌの反応混合溶液を、ＰＤ−１０ Ｄｅｓａｌｔｉｎｇカラム（生理食塩水で予
め平衡化した）に添加した。このウイルスを、３．５ｍＬの生理食塩水を用いて
溶出した。

ＢＭＰＨとの架橋のために、ＨＩＶを、最初に過ヨウ素酸Ｎａで予め処理して
炭水化物を酸化した。過ヨウ素酸ＮａおよびＨＩＶを結合させ、そして３０分間
、暗所にてインキュベートした。ＢＭＰＨと架橋させるために、ＢＭＰＨを予め
処理したＨＩＶに添加し、そして室温にて２時間穏やかに混合した。この反応を
、０．５ｍＬ（０．５Ｍ）のグリシンの添加によってクエンチした。室温にて１
時間インキュベートした。２．５ｍＬの反応混合溶液を、Ｄｅｓａｌｔｉｎｇカ
ラムに添加し、３．５ｍＬの生理食塩水で溶出し、次いで０．５ｍＬ画分にアリ
コートした。ＨＩＶを、脱繊維素血漿プールを用いて１：１０に希釈した。表７
に材料と試験した量を列挙する。

ＥＤＣとの架橋のために、ＨＩＶをグリシンと結合させ、そして２分間混合し
た。ＥＤＣを水に添加し、滴定し、次いで９００μＬを反応混合溶液に添加し、
そして室温にて２時間インキュベートした。この反応混合溶液を、Ｄｅｓａｌｔ
ｉｎｇカラムで精製し、３．５ｍＬの生理食塩水で溶出し、次いで０．５ｍＬ画
分にアリコートした。ＨＩＶを、脱繊維素血漿プールを用いて１：１０に希釈し
た。表８に材料と試験した量を列挙する。

このようにして、生成したコントロール材料を、実施例５に記載のＲｏｃｈｅ
Ｃｏｂａｓ ＨＩＶ−１ Ｍｏｎｉｔｏｒアッセイにおいて試験した。結果を
表９に記載する。

^＊Ｒｏｃｈｅ Ｃｏｂａｓ ＨＩＶ−１ Ｍｏｎｉｔｏｒアッセイ（範囲４００
〜７５０，０００ ｃｐ／ｍＬ）
^＊＊ＮＨＰ＝脱繊維素した正常ヒト血漿
Ｈｅ−異種の２つの機能
Ｈｏ−相同な２つの機能
Ｉ−イミドエステル
Ｍ−マレイミド（ｍａｌｅｉｍｉｄｅ）
Ｈ−ヒドリジド
Ｃ−カルボジイミド
ＳＨ−スルフヒドリル
ＣＯ−カルボニル（アルデヒド）
（実施例７）
（Ｂ型肝炎ウイルスの不活化）
本実施例において、本発明の方法を、パラホルムアルデヒドを用いるＢ型肝炎
ウイルスの不活化に適用する。精製したウイルス（本明細書中に記載されるよう
に調製した）を、実施例２に記載の方法を用いて不活化した。ＨＢＶ不活化の研
究において、倫理的懸念、アベイラビリティーおよびコストは、ＨＢＶ不活化研
究におけるチンパンジーの使用を制限するので、アヒルのＢ型肝炎ウイルス（Ｄ
ＨＢＶ）を、ヒトＢ型肝炎ウイルス（ＨＨＢＶ）の代理として使用した。このモ
デルは、宿主として初代アヒル肝細胞（ＰＤＨ）を使用する（Ｐｕｇｈら、１９
９９）。本発明者らは、先の手順（ＢｅｒｒｙおよびＦｒｉｅｎｄ、１９６９、
Ｓｅｇｌｅｎ、１９７６、ＰｕｇｈおよびＳｕｍｍｅｒｓ、１９８９、Ｐｕｇｈ
ら、２０００、Ｔｕｔｔｌｅｍａｎら、１９８６）からの改変を用いて、一週齢
未満の血清反応陰性のホワイトペキンの雛アヒル（Ａｎａｓ ｄｏｒｎｅｓｔｉ
ｃｕｓ）からＰＤＨを単離し、そして維持した。簡単に言うと、アヒルをＣＯ_２
に曝露することによって安楽死させ、肝臓を、２つの溶液（各約２００ｍＬ）を
用いて、心房を経由して２回灌流した。第一の溶液は、０．５ｍｍｏｌ／Ｌ Ｅ
ＧＴＡ、２ｍｍｏｌ／Ｌ Ｈｅｐｅｓ（ｐＨ７．４５）および５０ｕｇ／ｍＬ
ペニシリンおよびストレプトマイシン（Ｂｉｏｆｌｕｉｄｓ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌ
ｅ，ＭＤ）を補充したＳＷＩＭのＳ−７７培地（Ｓｉｇｍａ）から構成した。第
２の溶液は、２．５ｍｍｏｌ／Ｌ ＣａＣｌ_２、０．５ｍｇのコラゲナーゼ／ｍ
Ｌ（Ｉ型、Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ）および５０ｕｇ／ｍＬペニシリンお
よびストレプトマイシンを補充したＳＷＩＭのＳ−７７培地を含有する。これら
の灌流液を、約１５ｍＬ／分で、蠕動ポンプを用いて投与し、そして灌流（ｐｅ
ｒｆｔｉｓａｔｅ）の温度を肝臓で３７℃に維持するように調節した。この肝臓
を取り出し、鋏で細かくして、完全Ｌ−１５培地（Ｂｉｏｆｌｕｉｄｓ，Ｒｏｃ
ｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）（０．０５％（ｗ／ｖ）炭酸ナトリウム（Ｂｉｏｆｌｕｉ
ｄｓ）、１ｍｍｏｌ／Ｌグルタミン（Ｂｉｏｆｌｕｉｄｓ）、２０ｍｍｏｌ／Ｌ
ＨＥＰＥＳ（Ｂｉｏｆｌｕｉｄｓ）、５０ｕｇ／ｍＬペニシリンおよびストレ
プトマイシン（Ｂｉｏｆｌｕｉｄｓ）、Ｉ（ｇ／ｍＬインスリン（Ｓｉｇｍａ、
Ｓｔ．Ｌｕｏｉｓ）および１０（ｍｏｉ／Ｌヒドロコルチゾン−ヘミスクシナー
ト（Ｓｉｇｍａ）を補充した）中に肝細胞が分散するように２５ｍＬピペットを
用いて繰り返し混合した。細胞を滅菌したガーゼによって濾過し、５０×ｇで４
分間遠心分離し、そして生じた細胞ペレットをＬ−１５培地で３回洗浄し、そし
てＬ−１５培地に再懸濁した。１２ウェルプレートに、約２ｍＬの細胞懸濁（約
１０５細胞）を播種した。プレートした細胞上の培地を、２日ごとに吸引し、新
しいＬ−１５培地に置き換えた。

４週齢の先天的に感染したアヒルの雛の血清を、これらの実験において使用す
るウイルスの供給源として用いた。処理したＤＨＢＶおよびコントロールＤＨＢ
Ｖスパイクした赤血球サンプルを、Ｌ−１５培地において１０倍に連続希釈し、
続いて１ｍＬ体積を、４連でＰＤＨ単層に接種した。感染した培養物を、ウイル
スの付着および侵入のために３７℃＋２０℃、５＋１％ＣＯ_２で一晩、インキュ
ベートした。次いで、接種材料を取り除き、細胞の単層を完全Ｌ−１５培地で１
回洗浄し、過剰な赤血球を除去し、次いで各細胞に約２ｍＬの新しいＬ−１５培
地をかぶせた。感染した単層を、さらに１０〜１４日間、３７＋２０℃、５＋１
％ＣＯ_２で、培地を２日ごとに交換してインキュベートした。

本発明者らは、ＤＨＢＶ感染したアヒル肝細胞の存在をＩＦＡによって検出し
た。簡単に述べると、ＰＤＨ単層から、培地を吸引によって除去し、そして単層
を１〜２ｍｌのリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）で５〜１０分間振とうして洗
浄した。次いで、洗浄溶液を吸引によって除去し、そして１〜２ｍＬの−２０＋
２℃のエタノールに置き換えた。エタノールで覆ったサンプルを、エタノールを
除去する前に２〜４８時間、４＋１℃にて固定した。その後、１〜２ｍＬ ＰＢ
Ｓで洗浄し、攪拌した単層を室温で少なくとも２時間、各ウェルに対して０．５
％胎仔ウシ血清を含有するＰＢＳ中、０．２５ｍＬの抗ＤＨＢＶモノクローナル
抗体（ＤＨＶＢエンベロープ（１Ｈ．１）のプレ（ｐｒｅ）−Ｓドメインに対す
る（Ｐｕｇｈら、１９９５））（１：２希釈）を用いてインキュベートした。こ
の抗体溶液を吸引によって除去し、そして一次抗体染色した単層をＰＢＳで洗浄
した。洗浄溶液を除去した後、０．５％胎仔ウシ血清を含有するＰＢＳ中、０．
２５ｍＬのヤギ抗マウスＩｇＧ−ＦＩＴＣ（フルオレセインイソチオシアナート
結合体）（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｎｕｒｏＲｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔ
ｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．、Ｗｅｓｔ Ｇｒｏｖｅ．ＰＡ）（１：２００希釈）を各
ウェルに添加し、そして室温にて２時間攪拌させながらインキュベートした。二
次抗体を吸引によって除去し、蛍光（ｆｌｏｕｒｅｓｃｅｎｔｌｙ）染色した単
層をＰＢＳで洗浄した。ＰＢＳの除去後、逆にしたウェルを、Ｎｉｋｏｎ Ｄｉ
ａｐｈｏｔ顕微鏡を用いるＵＶ光学顕微鏡法によって試験し、１つ以上のＤＨＢ
Ｖ表面抗原陽性肝細胞を含む乾燥した単層を陽性とスコアした。ウイルス力価を
、ＲｅｅｄおよびＭｕｅｎｃｈ法（１９３８）を用いて、蛍光（ｆｌｏｕｒｅｓ
ｃｅｎｃｅ）焦点形成単位用量５０のスカーリングによって決定した。

表１０に示すように、ウイルス感染細胞は、試験したサンプルのどれにも検出
されなかった。

（表１０）
（周囲の室温（２０℃）での６０分間の懸濁における、アヒルＢ型肝炎ウイル
ス（ＤＨＢＶ）の不活化に対するパラホルムアルデヒドの影響）

^＊ＦＦＦＵＤ_５０／ＭＬ＝ＲｅｅｄおよびＭｕｅｎｃｈ（１９３８）による決定
として、蛍光焦点形成単位用量５０。（＋）ＦＦＦＵの存在または（−）ＦＦＦ
Ｕの非存在。
＋、ＤＨＢＶ感染細胞検出；−、ＤＨＢＶ感染細胞非検出。

（実施例８）
（ウシのウイルス性下痢ウイルス（ＢＶＤＶ）の不活化）
本実施例において、ウシのウイルス性下痢ウイルス（ＢＶＤＶ）（１生物型（
ＣＰＥ）、１遺伝子型）宿主：Ｍａｄｉｎ−Ｄａｒｂｙウシ腎臓（ＭＤＢＫ）細
胞を、実施例２において議論した方法に従って、不活化した。

ウシのウイルス性下痢ウイルス（ＢＶＤＶ）（１生物型（ＣＰＥ）、１遺伝子
型）を、Ｍａｄｉｎ−Ｄａｒｂｙウシ腎臓（ＭＤＢＫ）細胞を感染させるこれら
の研究において使用した。感染性ＢＶＤＶをアッセイするための手順は、以下の
差異を伴ってＤＨＢＶ（上を参照）に記載したのと同じであった：２．５％パラ
ホルムアルデヒドを用いて、試験およびコントロールＢＶＤＶサンプルの両方を
処理した後、反応を０．５Ｍグリシンでクエンチした。これらのサンプル（０．
５ｍＬ）を、プレ（ｐｒｅ）−スパンセファクリル（ｓｅｐｈａｃｒｙｌ）カラ
ム中にロードした。このカラムを、４分間、１０００ｒｐｍで回転させた。この
サンプルを、カラムから無菌的に取り出し、次いで１０倍連続希釈を最小必須培
地（ＭＥＭ）に調製した。そして組織培養プレートに播種した宿主細胞の単層上
に、３７±２℃および５±１％ＣＯ_２にて１時間吸着させた。吸着後、この単層
を、ＥＢＳＳで洗浄し、新しいＭＥＭで置換し、そして３７±２℃および５±１
％ＣＯ_２にて５〜７日間接種した。感染性ウイルスの存在を、以下に記載のよう
に決定した：インキュベーション後、このプレートをＰＢＳで３回洗浄し、ＴＣ
グレードアルコールで固定し、そしてブタポリクローナル抗ＢＶＤＶ結合体化抗
体を用いて染色した。染色したプレートを、Ｎｉｋｏｎ Ｄｉａｐｈｏｔ顕微鏡
を用いるＵＶ顕微鏡法を用いてスコアし、１つ以上のＢＶＤＶ表面抗原陽性肝細
胞を含む単層を、陽性とスコアした。１希釈あたり４つのウェルを接種し、そし
て結果を、ＲｅｅｄおよびＭｕｎｃｈ（１９３８）によって算出したＦＦＦＵＤ
_５０として記録した。

表１１に示すように、ウイルス感染した細胞は試験したサンプルのどれにも検
出されなかった。

（表１１）
（周囲の室温（２０℃）での６０分間の懸濁における、ウシのウイルス性下痢
ウイルス（ＢＶＤＶ）の不活化に対するパラホルムアルデヒドの影響）

^＊ＦＦＦＵＤ_５０／ＭＬ＝ＲｅｅｄおよびＭｕｅｎｃｈ（１９３８）により決定
される、蛍光焦点形成単位用量５０。（＋）ＦＦＦＵの存在または（−）ＦＦＦ
Ｕの非存在。
表の脚注：＋、ＢＶＤＶ感染細胞検出；−、ＢＶＤＶ感染細胞非検出。

（参考文献）
Ｐｕｇｈ ＪＣ，Ｓｕｍｍｅｒｓ ＪＷ．Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｕｐ
ｔａｋｅ ｏｆ ｄｕｃｋ ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｂ ｖｉｒｕｓ ｂｙ ｄｕ
ｃｋ ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅｓ ｍａｉｎｔａｉｎｅｄ ｉｎ ｔｈｅ ｐｒｅ
ｓｅｎｃｅ ｏｆ ｄｉｍｅｔｈｙｌ ｓｕｌｆｏｘｉｄｅ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ
１９８９；１７２：５６４−５７２．
Ｐｕｇｈ，Ｊ．Ｃ．，Ｉｊａｚ，Ｍ．Ｋ．，Ｓｕｃｈｍａｎｎ Ｄ．Ｂ．Ｕｓ
ｅ ｏｆ ｓｕｒｒｏｇａｔｅ ｍｏｄｅｌｓ ｆｏｒ ｔｅｓｔｉｎｇ ｅｆ
ｆｉｃａｃｙ ｏｆ ｄｉｓｉｎｆｅｃｔａｎｔｓ ａｇａｉｎｓｔ Ｈｅｐａ
ｔｉｔｉｓ Ｂ ｖｉｒｕｓ．Ａｍ Ｊ Ｉｎｆｅｃｔ Ｃｏｎｔ １９９９；
２７：３７３−６．Ｐｕｇｈ，Ｊ．Ｃ．，Ｓｕｃｈｍａｎｎ，Ｄ．Ｂ．，Ｉｊａ
ｚ，Ｍ．Ｋ．Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｂ ｖｉｒｕｓ ｅｆｆｉｃａｃｙ ｔｅｓ
ｔｉｎｇ：Ｑｕａｌｉｆｉｃａｔｏｎ ｏｆ ａｎ ａｖｉａｎ Ｈｅｐａｄａ
ｖｉｒｕｓ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｓｙｓｔｅｍ ｔｈａｔ ｕｓｅｓ ｐｒｉｍ
ａｒｙ ｄｕｃｋ ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ ｃｕｌｔｕｒｅｓ． １０ｔｈ Ｉ
ｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ ｏｎ Ｖｉｒａｌ Ｈｅｐａ
ｔｉｔｉｓ ａｎｄ Ｌｉｖｅｒ Ｄｉｓｅａｓｅｓ．Ａｔｌａｎｔａ．ＵＳＡ
，２０００，Ａｂｓｔｒａｃｔ Ｂ １３９．
Ｂｅｒｒｙ，Ｍ．Ｎ．，Ｆｒｉｅｎｄ，Ｄ．Ｓ．Ｈｉｇｈ−ｙｉｅｌｄ ｐｒ
ｅｐａｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｉｓｏｌａｔｅｄ ｒａｔ ｌｉｖｅｒ ｐａｒｅ
ｎｃｈｙｍａｌ ｃｅｌｌｓ．Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ １９６９；４３
：５０６−５２０．
Ｓｅｇｌｅｎ，Ｐ．Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｉｓｏｌａｔｅｄ ｒａ
ｔ ｌｉｖｅｒ ｃｅｌｌｓ．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ １９７１
；３：２９−８３．
Ｐｕｇｈ，Ｊ．Ｃ．，Ｄｉ，Ｑ．Ｕ．，Ｍａｓｏｎ Ｗ．Ｓ．，Ｓｉｍｍｏｎ
ｓ Ｈ．Ｓｕｓｕｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｙ ｔｏ ｄｕｃｋ ｈｅｐａｔｉｔｉ
ｓ Ｂ ｖｉｒｕｓ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ｉｓ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉ
ｔｈ ｔｈｅ ｐｒｅｓｅｎｃｅ ｏｆ ｃｅｌｌ ｓｕｒｆａｃｅ ｒｅｃｅ
ｐｔｏｒ ｓｉｔｅｓ ｔｈａｔ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔｌｙ ｂｉｎｄ ｖｉｒ
ｕｓ ｐａｒｔｉｃｌｅｓ．Ｊ Ｖｉｒｏｌ １９９５；６９：４８１４−２２
．
Ｒｅｅｄ，Ｌ．，Ｍｕｅｎｃｈ，Ｈ．Ａ．Ａ ｓｉｍｐｌｅ ｍｅｔｈｏｄ
ｏｆ ｅｓｔｉｍａｔｉｎｇ ｆｉｆｔｙ ｐｅｒｃｅｎｔ ｅｎｄ ｐｏｉｎ
ｔｓ．Ａｍ Ｊ ｏｆ Ｈｙｇ １９３８；２７：４９３−４９７。

本発明は、本明細書中に詳細に記載されるが、本実施例は説明の目的のみのた
めに提供されることが理解されるべきである。当業者に明らかである本発明の実
施形態の他の改変は、本発明の範囲内であることが意図され、上記の特許請求の
範囲に、より完全に規定される。

Claims (3)

1. 核酸増幅のためのポジティブコントロールとして非病原性の微生物を含む組成物を製造するための方法であって、
   （ａ）表面タンパク質およびインタクトな核成分を含む精製した微生物を提供するための工程
   （ｂ）該核成分を実質的にインタクトに保ちつつ１以上の表面タンパク質を不可逆的に改変して、しれによって該微生物が非病原性となる工程；および
   （ｃ）生物学的流体または合成生物学的流体を含む液体マトリックスに該微生物を懸濁する工程
   を包含し、ここで、該組成物は、核酸増検出試験においてポジティブ内部コントロールとして有用である、方法。
2. 核酸増幅技術によって生物学的サンプル中で微生物を検出するための方法であって、
   該方法は、
   該生物学的サンプル中のポジティブコントロールの共増幅
   を包含し、該ポジティブコントロールは、表面タンパク質および実質的にインタクトな核成分を含む精製した微生物を含み、
   ここで、１以上の表面タンパク質が、該タンパク質上の１以上の反応性部位への１以上の反応性官能基を含む化合物との共有結合により不可逆的に改変されて、その結果、該微生物が非病原性となる、
   方法。
3. 本願明細書に記載されるような、核酸増幅コントロール。