JP2003514523A - エキソソーム分離によって精製hcvrnaを調製するための方法 - Google Patents
エキソソーム分離によって精製hcvrnaを調製するための方法Info
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Abstract
Description
型肝炎ウイルス(HCV)に感染した個体の血漿からエキソソーム(exoso
me)と呼ばれる粒子を分離する工程、およびこれらのエキソソーム粒子からR
NAを抽出する工程を包含する。
参考として完全に援用される。
00アミノ酸のポリタンパク質をコードする単一のオープンリーディングフレー
ムを有する、約10000ヌクレオチドの陽性センスRNAウイルスである。こ
のウイルスの構造は、組換えDNA技術によって解明されているが(欧州特許出
願EP−A−0318216および欧州特許出願EP−A−0388232)、
このウイルス自体は、単離されておらず、そしてこのポリタンパク質のタンパク
質分解によって生じた種々のウイルスタンパク質の機能のみが、同様のゲノム構
造の他の同様のウイルスとの類似性によって推測されている(Chooら、PN
AS USA(1991)88:2451−2455)。
、植物および哺乳動物細胞)において発現される、組換え形態で全て入手可能で
ある(Chien,D.Y.ら、PNAS USA(1992)89:1001
1−10015およびSpaetc,R.R.らVirology(1992)
188:819−830)。
けた、HCVポリタンパク質のアミノ酸192〜383および384〜750に
対応する)2つのタンパク質が、標的細胞へのウイルスの結合を担う、ウイルス
エンベロープの外側のタンパク質であることが示唆されている。
れる。HCV感染についてのただ1つの信頼性のある動物モデルは、チンパンジ
ーである。HCV生活環の研究は、有効な細胞培養系を欠いていることによって
制限されてきた。さらに、血漿および肝臓のような生物学的材料からHCVを精
製するための試みは、失敗されてきた。
/05513)において、本出願人らは、HCVレセプターを保持する細胞を同
定するためにフローサイトメトリーを使用する方法を記載する。本出願人らは、
組換えE2エンベロープタンパク質で細胞を標識することによって、フローサイ
トメトリーを使用して、E2に特異的に結合し得、そして従って、HCVレセプ
ターを潜在的に保持し得る細胞を単離することによって、細胞を選別することが
可能であることを示した。
/09349)において、本出願人らは、HCVのE2エンベロープタンパク質
に結合し得るタンパク質を同定した。
/18198)において、本出願人らは、HCVに対するレセプターをコードす
るDNAのクローニングを報告した。このDNAは、公知の細胞タンパク質CD
81をコードする遺伝子に対応する。
Aゲノムの簡単な調製を可能にする方法について、高い必要性が存続する。これ
は、このウイルスの生物学への研究の進行を非常に促進し、そしてC型肝炎感染
に関連する疾患の処置および予防において効果的な治療薬および診断薬の設計を
加速する。
分離する工程およびこのエキソソーム粒子からRNAを抽出する工程を包含する
、HCVの調製のための方法を提供する。好ましくは、このエキソソーム粒子は
、HCVに感染した個体の血漿から分離される。
に結合し、そしてこれらの粒子において富化されることが発見された。従って、
これらの粒子の精製は、複雑な精製手順も高価な精製手順も必要とすることなく
、HCV RNAの有意な量を簡単に調製することを可能にする。
イトーシスの(endocytic)区画の、形質膜との融合から生じる細胞内
オルガネラである。これらの区画は、抗原提示細胞(APC)に存在し、そして
細胞内MHCクラスII分子の大部分の局在性についての部位を形成することが
示された(Neefjesら、1990)。MIICは、内部膜小胞およびシー
トを有するエンドサイトーシス小胞であり、そしてMHCクラスII分子がペプ
チドを結合する細胞内部位を示すと考えられる(Hardingら、1993)
。MIICは、おそらくその制限されている膜の内側小胞形成から生じる内部小
胞(エキソソーム)を含む。MIICが形質膜と融合し、MHCクラスII分子
をこの構造へ挿入する場合、エキソソームは、細胞外空間へと放出される。
単球およびマクロファージ)に由来する細胞培養培地中に見出されている(Ra
posoら、1996)。これらのエキソソームは、Geuzeおよび共同研究
者らにより特徴付けられ(Escola、1998)、そしていくつかの表面分
子(特定の4回貫通膜タンパク質(tetraspanin membrane
protein)を含む)において選択的に富化されることが見出された。
たは任意の液体が意味される。適切な液体としては、血液のような体液、および
細胞がインビトロで培養された増殖培地が挙げられる。
細胞株の細胞培養上清から調製され得る。このような細胞株は、HCVに感染し
た患者から単離され、そしてインビトロで増殖された個々の細胞から増殖され得
る。
から単離され得る。血液から血漿を分離するための技術は、当業者に明らかであ
る。
かりやすい任意の動物であり得る。適切な動物としては、霊長類、好ましくは高
等霊長類(例えば、チンパンジーおよびヒト)が挙げられる。もっとも好ましく
は、エキソソームは、ヒト患者から調製される。
清から調製され得る。例としては、分画遠心分離(differential
centrifugation)による調製、および以下で議論される免疫化学
の技術を用いる調製が挙げられる。好ましくは、エキソソームは、Raposo
ら(1996)の技術に従って、分画遠心分離により調製される。
離して、エキソソームが富化されたペレットを与える工程、およびこのエキソソ
ームからRNAを単離する工程の一連の工程を包含する、HCV RNAの調製
のための方法を提供する。
工程は、約200×gでの最初の遠心分離、次いで、約500×g、約2000
×g、約10000×g、そして約70000×gの遠心分離を伴う。
有量の程度を評価し、従って、エキソソーム調製物の純度を測定するために分析
され得る。この調製プロセスは、このようにして最適化され得る。エキソソーム
含有量を分析するために適切な1つの技術は、SDS−PAGEおよびエキソソ
ーム粒子に特異的なマーカーであるタンパク質に対する抗体を用いたウエスタン
ブロッティングによるものである。CD81および/またはCD82に対する抗
体は、この点において特に適切である。これらの一次抗体のエキソソームへの結
合は、例えば、この一次抗体に結合する標識した二次抗体を用いて評価され得る
。例えば、抗CD81モノクローナル抗体が一次抗体として用いられ得、その一
方で、標識した抗マウスIgGは、二次抗体として用いられ得る。
に調製され得る。細胞培養物を最初に200×gで10分間遠心分離し、そして
細胞を回収し、ペレットP1とする。除去した上清を500×gで10分間2回
遠心分離する;この2つのペレットをプールし、そしてペレットP2とする。上
清を、2000×gで2回、15分間連続的に遠心分離し(プールしたペレット
をペレットP3とする)、10000×gで30分間1回遠心分離し(回収した
ペレットをP4とする)、70000×gで60分間遠心分離する(ペレットP
5を得る)。次いで、各ペレットのサンプルを、SDS−PAGEおよび抗CD
81モノクローナル抗体、続いてペルオキシダーゼ標識抗マウスIgGを用いた
ウエスタンブロットにより分析する。
れ得る。これらの技術はまた、分画遠心分離とともに、エキソソームのより純粋
な調製物を与えるために用いられ得る。
認識する抗体でコーティングしたビーズとともにインキュベートされ得る。例え
ば、抗CD81および/または抗CD82抗体は、この点で用いられ得る。当業
者に明らかなように、磁性ビーズ(例えば、Dynabeads,Dynal,
Oslo,Norwayにより製造される磁性ビーズ)またはポリスチレンビー
ズ(例えば、Pierceにより作製されるポリスチレンビーズ)は、本発明の
この実施形態において特に適切である。エキソソームの精製のための他の代替方
法としては、スクロース密度勾配の使用またはオルガネラ電気泳動が挙げられる
(Tulpら、1994)。
HCV粒子は、エキソソームと会合し得るか、またはエキソソーム中に含まれる
。RNAは、当業者に明らかなように、任意の適切な技術によりエキソソームか
ら調製され得る。RNA抽出のための適切な方法は、当該分野で周知である(例
えば、Sambrookら(1989)Molecular Cloning:
a laboratory manual;Cold Spring Harb
or Pressを参照のこと)。Qiagenにより販売されるウイルス抽出
キットのような市販のRNA抽出キット(このウイルス抽出キットは、細胞非含
有体液からウイルス核酸の精製を可能にするシリカゲルベースのスピンカラムを
用いる)は、便宜上用いられ得る。
。好ましくは、このHCV粒子は、上記の方法のいずれか1つに従って調製され
る。HCV粒子の調製に伴う技術的困難性に起因して、精製したHCV粒子の組
成物は、未だに生成されていない。従って、本発明の方法は、精製したHCV粒
子の調製を初めて可能にする。従って、本発明の方法は、HCV粒子およびタン
パク質の生化学的および生物物理学的特徴付けを初めて可能にする。
適用において用いられ得る。このような適用としては、HCVに感染した個体の
診断、予防および処置、ならびに治療において有用な薬剤の開発および設計、こ
の疾患およびその進行の予防および診断が挙げられる。
が提供され、この方法は、この個体から細胞の調製物を得る工程、その細胞上清
からエキソソーム粒子を調製する工程、およびHCV RNAおよびタンパク質
の存在についてこのエキソソーム粒子を試験する工程を包含する。好ましくは、
その個体から得られた細胞の調製物は、血漿調製物である。
使用するエキソソームの分離に特に関して、ここで例示のためにより詳細に記載
される。詳細の改変が、本発明の範囲から逸脱することなくなされ得ることが、
理解される。
よびHuH7)およびEBV形質転換B細胞株を含む)から単離した。まず、細
胞培養物を200×gで10分間遠心分離した。そして回収した細胞はペレット
P1を示す。除去した上清を500×gで10分間2回遠心分離し;この2つの
ペレットをプールした。これはペレットP2を示す。上清を2回2000×gで
15分間(プールしたペレットをP3と呼ぶ)、1回10000×gで30分間
(回収したペレットはペレットP4を示す)、そして1回70000×gで60
分間(ペレットP5を生じる)、連続して遠心分離した。
1モノクローナル抗体を使用し、続いてペルオキシダーゼ標識抗マウスIgGを
使用するウエスタンブロットにおいて、分析した。ペレットP5が、エキソソー
ムが富化された画分であることが見出された(図1を参照のこと)。本発明者ら
は、いくつかの細胞株(肝細胞癌細胞株(HepG2およびHuH7)およびE
BV形質転換B細胞株を含む)からエキソソームを単離した。
ll勾配上での血液分離後に回収した希釈血漿を、上記の分画遠心分離プロトコ
ルに従って処理し、そしてエキソソームを、抗CD81モノクローナル抗体(m
Ab)または抗CD82モノクローナル抗体を使用しそしてペルオキシダーゼ標
識抗マウスIgGを使用するウエスタンブロットによって可視化した。健常個体
の血漿中にエキソソームが存在することが、見出された(図2を参照のこと)。
ズとの一晩インキュベーションによって、70000×gでの遠心分離工程の前
に上清からエキソソームを単離することにも成功した。抗CD81コートビーズ
により捕捉したエキソソーム(図3を参照のこと)または抗CD82コートビー
ズにより捕捉したエキソソーム(図4を参照のこと)を、Laemmli緩衝液
を用いて2回抽出し、そしてSDS−PAGEおよびウエスタンブロッティング
によって検出した。
富化されたHCV感染患者の血漿から単離し得る。この実験アプローチは以下の
通りである。
遠心分離プロトコルに従って処理する。10000×gでの遠心分離工程から回
収したエキソソーム富化上清を、抗CD81コート磁気ビーズとともに一晩イン
キュベートする。あるいは、2つの清澄(clearing)工程の後、HCV
感染血漿を、抗CD81コート磁気ビーズとの一晩インキュベーションの前に、
20000×gで遠心分離し得る。次いで、磁気ビーズを、50mM Tris
−HCl(pH8.0)、1mM EDTA、および100mM NaCl(T
EN)緩衝液中の1% BSAにおいて磁気分離によって3回洗浄し、そしてウ
イルスRNAを、Viral Extraction Kit(Qiagen)
を用いて抽出する。HCV RNAについての定量的RT−PCRを、以前(P
ileriら、1998)に記載されたように実施する。
riら、1998)に記載されたようなポリスチレンビーズ(1/4インチ直径
)の使用を含む)を試験し得る。
に富む。
用する、反復遠心分離工程あるいはヒトCD81またはCD82分子に対するモ
ノクローナル抗体での免疫選択のいずれかによる、HCV感染患者の血液からの
エキソソームの首尾よい単離を確認する。次いで、エキソソームを、Laemm
li緩衝液に抽出し、そしてCD81(エキソソーム中に富むマーカー)を、S
DS−PAGEおよびウエスタンブロッティングによって可視化した(図5を参
照のこと)。この作業は、HCV患者の血液からのエキソソーム調製物中のCD
81タンパク質の存在を確認する。
量的RT PCRを使用して検出された(以下の表を参照のこと)。
遠心分離プロトコルに従って処理した。10000×gでのこの遠心分離工程か
ら収集したエキソソーム富化上清を、抗CD81または抗CD82でコートした
磁気ビーズ(20μgの精製モノクローナル抗体/2.5×107の磁気ビーズ
(Dynal))と共に一晩インキュベートした。次いで、磁気ビーズを、磁気
分離によってリン酸緩衝液中1%BSAで3回洗浄し、そしてウイルスRNAを
、Trizol試薬(Life Technology)を用いて抽出した。
(Pileriら、1998)。
20121−20127. Harding C.V.およびGeuze H.J.(1993)J.Imm
unol.151:3988−3998. Neefjes J.J.ら(1990)Cell 61:171−183. Pileri P.ら(1998)Science 282:938−941
. Raposo G.ら(1996)J.Exp.Med.183:1161−
1172. Tulp A.ら(1994)Nature 369:120−126.。
精製を示す、ウエスタンブロットを示す。
エスタンブロットを示す。
す、ウエスタンブロットを示す。
す、ウエスタンブロットを示す。
を示す。
Claims (16)
- 【請求項1】 精製HCV RNAを調製するための方法であって、HCV
に感染した細胞培養物の上清からエキソソーム粒子を分離する工程、および該エ
キソソーム粒子からRNAを抽出する工程を包含する、方法。 - 【請求項2】 前記エキソソーム粒子が、C型肝炎ウイルスに感染した個体
の血漿から分離される、請求項1に記載の方法。 - 【請求項3】 前記エキソソーム粒子が、分画遠心分離によって前記細胞培
養上清から調製される、請求項1または請求項2に記載の方法。 - 【請求項4】 前記細胞培養上清を、抗体でコートしたビーズと共にインキ
ュベートする工程をさらに包含する、請求項3に記載の方法。 - 【請求項5】 前記エキソソーム粒子が、前記細胞培養上清を抗体でコート
したビーズと共にインキュベートすることによって、前記細胞培養上清から調製
される、請求項1または請求項2に記載の方法。 - 【請求項6】 前記抗体が、抗CD81抗体または抗CD82抗体である、
請求項4または請求項5に記載の方法。 - 【請求項7】 前記ビーズが、磁気ビーズである、請求項4〜6のいずれか
1項に記載の方法。 - 【請求項8】 前記ビーズが、ポリスチレンビーズである、請求項4〜6の
いずれか1項に記載の方法。 - 【請求項9】 前記HCV RNAが、ウイルス抽出キットを使用して、前
記エキソソーム粒子から抽出される、請求項1〜8のいずれか1項に記載の方法
。 - 【請求項10】 前記エキソソーム粒子が、CD81タンパク質に富む、請
求項1〜9のいずれか1項に記載の方法。 - 【請求項11】 前記細胞培養物が、ヒト細胞培養物である、請求項1〜1
0のいずれか1項に記載の方法。 - 【請求項12】 個体をHCVに感染していると診断する方法であって、該
個体から細胞の調製物を得る工程、該細胞上清からエキソソーム粒子を調製する
工程、および該エキソソーム粒子をHCV RNAおよびタンパク質の存在につ
いて試験する工程を包含する、方法。 - 【請求項13】 前記細胞の調製物が、血漿調製物である、請求項12に記
載の方法。 - 【請求項14】 精製HCV粒子の調製物。
- 【請求項15】 請求項1〜13のいずれか1項に記載の方法に従って調製
された、精製HCV粒子の調製物。 - 【請求項16】 HCVの診断、処置または予防における、請求項14また
は請求項15に記載の精製HCV粒子調製物の使用。
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