JP6759182B2 - 微小小胞体を単離する方法、および生体試料から核酸を抽出する方法 - Google Patents
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Description
本発明は、無細胞DNAおよび/または無細胞DNAと少なくとも微小小胞体由来のRNAを含む核酸を含む生体試料から核酸を単離する新規な方法およびキット、ならびに前記微小小胞体および/または前記生体試料から核酸を抽出する新規な方法およびキットを提供する。
本願は、2014年7月9日に提出された米国特許仮出願第62/022,538号、2014年11月14日に提出された米国特許仮出願第62/079,763号、および2015年5月27日に提出された米国特許仮出願第62/166,890号の優先権を主張するものであり、それぞれ、その全内容を参照により本明細書に組み込む。
細胞から放出される膜小胞を総称して微小小胞体と言う。様々な細胞源に由来する微小小胞体は、タンパク質成分および脂質成分について広く研究が行われている。近年、微小小胞体はまた、ゲノムDNA、cDNA、ミトコンドリアDNA、マイクロRNA(miRNA)、およびメッセンジャーRNA(mRNA)を含むDNAおよびRNAの両方を含むことが分かった。
本発明は、表面にDNA、DNAおよびRNA、および/または微小小胞体を捕捉し、次いで前記微小小胞体を溶解して核酸、特に微小小胞体に含まれるRNAを放出させ、前記捕捉表面から前記DNAおよび/またはDNAと少なくともRNAを含む核酸を溶出させて無細胞DNA(「cfDNA」、循環DNAとしても知られる)を単離する方法、および/または試料からcfDNAと少なくとも微小小胞体由来のRNAを含む核酸を合わせて単離する方法を提供する。当業者には自明であるが、前記微小小胞体画分はまた、DNAも含む。したがって、前記微小小胞体画分の溶解によりRNAおよびDNAの両方が放出される。さらに、単離されたDNAは、各種供給源(ヌクレオソームおよびその他の無細胞DNA供給源などが挙げられるが、これらに限定されない)のいずれかに由来する可能性がある。
本発明は、表面にDNAおよび微小小胞体を捕捉し、次いで前記微小小胞体を溶解して核酸、特に前記微小小胞体に含まれるRNAを放出させて、前記捕捉表面からDNAおよび/またはDNAおよび少なくともRNAを含む核酸を溶解させて、前記微小小胞体から無細胞DNA(cfDNA)および/またはcfDNAおよび少なくともRNAを含む核酸を単離する方法を提供する。微小小胞体は、細胞の外へ、真核細胞から放出される、あるいは細胞膜から出芽して放出される。これらの膜小胞は、サイズが不均質であり、直径が約10nm〜約5000nmの範囲に渡る。本明細書では、直径が0.8μm未満の細胞から放出されるすべての膜小胞をまとめて「微小小胞体」と言う。これら微小小胞体としては、微小小胞体、微小小胞状粒子、プロスタソーム、デキソソーム、テキソソーム、エクトソーム、オンコソーム、アポトーシス小体、レトロウイルス状粒子、およびヒト内因性レトロウイルス(HERV)粒子が挙げられる。当該分野では、細胞内多胞体のエキソサイトーシス(開口放出)によって放出される小さい微小小胞体(直径が約10〜1000nm、30〜200nmであることが多い)を「微小小胞体」と言う。
核酸の抽出
核酸生体指標の検出
生体試料から微小小胞体を単離するためのキット
実施例1では、血漿試料からすべてのDNAを単離するEX052法の能力を示す。なお、本明細書に示す図のいくつかでは、様々な用語を用いて本明細書でEX052と称する単離方法に対するその前駆的な方法を識別している。例えば、図によっては、旧EX052、EX052.1、およびその変種などの用語が含まれる。これらの初期バージョンは、単に比較のために、開示のEX052法を用いて達成される単離の方が優れていることを示すために提供されている。用語EX052.2の使用は、単一管でRNAおよびDNA抽出を行うEX052法のことである。
がん患者の血液中の循環核酸は、医学研究では非常に関心が高い。というのは、組織生検材料を必要とせずに患者の疾病状態および治療の選択肢に関する情報が得られる可能性があるからである。変異の分析に生体液を用いることを探求する如何なる診断試験にも、循環血液中の腫瘍由来の変異の捕捉を最大にすることができる基盤技術(プラットフォーム)が必要である。血漿は、少なくとも核酸の2つの無細胞源を含む。その1つは循環無細胞DNA(cfDNA)で、アポトーシス細胞または壊死細胞から生じる。もう1つのRNAは、エキソソーム(exoRNA)を含む細胞外小胞に閉じ込められている。細胞外小胞は体内で細胞により活発に分泌される。生体液中の核酸の総量は非常に限られており、腫瘍変異はRNAおよびDNAの両方に反映されるので、RT−定量PCRによる有効な下流の処理およびNGS(次世代配列決定)による標的再配列決定に十分な少ない体積で血漿試料からexoRNAおよびcfDNAをすべて共単離する方法が考案された。
本発明をその詳細な説明と合わせて記載したが、上述の記載は、添付の請求項の範囲によって規定される本発明の範囲を例示する意図であって、本発明の範囲を限定する意図ではない。その他の側面、利点、および修正は以下の範囲内に含まれる。
Claims (34)
- (a)生体試料に由来する無細胞DNAおよび微小小胞体を捕捉表面または表面内に保持するのに十分な条件で前記生体試料を前記捕捉表面と接触させる工程、ここで、前記捕捉表面は、四級アンモニウムR−CH2−N+(CH3)3で官能化された陰イオン交換体である膜、または正に帯電しかつ四級アンモニウムR−CH2−N+(CH3)3で官能化された膜である、
(b)前記無細胞DNAおよび前記微小小胞体を前記捕捉表面または表面内に保持したまま、前記捕捉表面をフェノール系溶解試薬と接触させて、前記DNAおよびRNAを前記試料から放出させて均質液を生成する工程、および
(c)前記均質液から前記DNA、前記RNA、または前記DNAおよびRNAの両方を抽出する工程、
を含む、生体試料からDNAおよびRNAを抽出する方法。 - 前記均質液にクロロホルムを添加することを更に含む、請求項1に記載の方法。
- 前記膜は、四級アンモニウムR−CH2−N+(CH3)3で官能化された陰イオン交換体である、請求項1に記載の方法。
- 前記膜は、更に正に帯電している、請求項3に記載の方法。
- 前記膜の孔径は、少なくとも3μmである、請求項1に記載の方法。
- 前記捕捉表面は、互いに直接隣接した3つの膜を含む、請求項1に記載の方法。
- 前記3つの膜は、互いに同一である、請求項6に記載の方法。
- 各膜は、正に帯電している、請求項7に記載の方法。
- 各膜は、四級アンモニウムR−CH2−N+(CH3)3で官能化された陰イオン交換体である、請求項7に記載の方法。
- 各膜は、正に帯電し、かつ四級アンモニウムR−CH2−N+(CH3)3で官能化された陰イオン交換体である、請求項7に記載の方法。
- 前記生体試料は血漿または血清である、請求項1に記載の方法。
- 前記生体試料は0.2mLから4mLの体積を有する、請求項11に記載の方法。
- 前記生体試料は、尿、脳脊髄液、または細胞培地の上澄みである、請求項1に記載の方法。
- 工程(a)は、前記生体試料を前記捕捉表面と接触させる前後に濾過して前記生体試料を処理する工程をさらに含む、請求項1に記載の方法。
- 前記濾過は、0.8μmのフィルターを用いて行われる、請求項14に記載の方法。
- 工程(a)は、前記生体試料を前記捕捉表面と接触させた後に、遠心分離工程をさらに含む、請求項1に記載の方法。
- 工程(a)は、前記生体試料を前記捕捉表面に接触させた後に、前記捕捉表面を洗浄することをさらに含む、請求項1または請求項16に記載の方法。
- 工程(b)は、前記捕捉表面を前記フェノール系溶解試薬と接触させた後に、遠心分離工程をさらに含む、請求項1に記載の方法。
- 前記均質液にクロロホルムを添加する前に前記均質液に対照を添加することをさらに含む、請求項2に記載の方法。
- 前記方法は、工程(c)からの抽出物をエタノールで調整する工程(d)、前記エタノールで調整した抽出物をシリカカラムに結合させる工程(e)、および前記抽出物を前記シリカカラムから溶出させる工程(f)をさらに含む、請求項1に記載の方法。
- (a)生体試料に由来する無細胞DNAおよび微小小胞体を捕捉表面または表面内に保持するのに十分な条件で前記生体試料を捕捉表面と接触させる工程、ここで、前記捕捉表面は、四級アンモニウムR−CH2−N+(CH3)3で官能化された陰イオン交換体である1種以上のビーズ、または正に帯電しかつ四級アンモニウムR−CH2−N+(CH3)3で官能化された1種以上のビーズである、
(b)前記無細胞DNAおよび前記微小小胞体を前記捕捉表面または表面内に保持したまま、前記捕捉表面をフェノール系溶解試薬と接触させて、前記試料から前記DNAおよびRNAを放出させて、均質液を生成する工程、および
(c)前記均質液から前記DNA、前記RNA、または前記DNAおよびRNAの両方を抽出する工程、
を含む、生体試料からDNAおよびRNAを抽出する方法。 - 前記均質液にクロロホルムを添加することを更に含む、請求項21に記載の方法。
- 1種以上のビーズは、四級アンモニウムR−CH2−N+(CH3)3で官能化された陰イオン交換体である、請求項21に記載の方法。
- 前記1種以上のビーズは、更に正に帯電している、請求項23に記載の方法。
- 前記生体試料は血漿または血清である、請求項21に記載の方法。
- 前記生体試料は、0.2mLから4mLの体積を有する、請求項21に記載の方法。
- 前記生体試料は、尿、脳脊髄液、または細胞培地の上澄みである、請求項21に記載の方法。
- 工程(a)は、前記生体試料を前記捕捉表面と接触させる前後に濾過して前記生体試料を処理する工程をさらに含む、請求項21に記載の方法。
- 前記濾過は、0.8μmのフィルターを用いて行われる、請求項28に記載の方法。
- 工程(a)は、前記生体試料を前記捕捉表面と接触させた後に、遠心分離工程をさらに含む、請求項21に記載の方法。
- 工程(a)は、前記生体試料を前記捕捉表面と接触させた後に、前記捕捉表面を洗浄することをさらに含む、請求項21または請求項30に記載の方法。
- 工程(b)は、前記捕捉表面を前記フェノール系溶解試薬に接触させた後に、遠心分離工程をさらに含む、請求項21に記載の方法。
- 工程(c)は、前記均質液にクロロホルムを添加する前に前記均質液に対照を添加することをさらに含む、請求項21に記載の方法。
- 前記方法は、工程(c)からの抽出物をエタノールで調節する工程(d)、前記エタノールで調節した抽出物をシリカカラムに結合させる工程(e)、および前記抽出物を前記シリカカラムから溶出させる工程(f)をさらに含む、請求項21に記載の方法。
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