ES2762677T3 - Métodos para aislar microvesículas y extracción de ácidos nucleicos de muestras biológicas - Google Patents

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Daniel Enderle
Aparna Ramachandran
Haoheng Yan
Emily Berghoff
Tai-Fen Wei
Mikkel Noerholm
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Abstract

Un método para extraer ADN y ARN de una muestra biológica que comprende: (a) proporcionar una muestra biológica; (b) poner en contacto la muestra biológica con una superficie de captura en condiciones suficientes para retener ADN libre de células y microvesículas de la muestra biológica sobre o en la superficie de captura, en la que la superficie de captura comprende una membrana o una o más perlas que son intercambiadores de aniones con la función amonio cuaternario R-CH2-N+(CH3)3, o una membrana o una o más perlas que están cargadas positivamente y con la función amonio cuaternario R-CH2-N+(CH3)3; (c) poner en contacto la superficie de captura con un reactivo de lisis a base de fenol mientras el ADN libre de células y las microvesículas están sobre o en la superficie de captura, liberando así el ADN y el ARN de la muestra y produciendo un homogeneizado; y (d) extraer el ADN, el ARN, o tanto el ADN como el ARN del homogeneizado.

Description

DESCRIPCIÓN
Métodos para aislar microvesículas y extracción de ácidos nucleicos de muestras biológicas
Campo de la invención
Se proporcionan métodos y kits novedosos para aislar ácidos nucleicos de muestras biológicas, incluyendo ADN libre de células y/o ADN libre de células y ácidos nucleicos que incluyen al menos ARN de microvesículas, y para extraer ácidos nucleicos de las microvesículas y/o de las muestras biológicas.
Antecedentes
Las vesículas de la membrana que se desprenden de las células se denominan colectivamente microvesículas. Las microvesículas de diversas fuentes celulares se han estudiado ampliamente con respecto al contenido de proteínas y lípidos. Recientemente, se ha descubierto que las microvesículas también contienen ADN y ARN, incluidos ADN genómico, ADNc, ADN mitocondrial, microARN (miARN) y ARN mensajero (ARNm).
Debido a la información genética y proteómica contenida en las microvesículas desprendidas por las células, la investigación actual se refiere a la utilización de microvesículas para obtener una mayor comprensión del estado de estas células, por ejemplo, el estado de una enfermedad o la predisposición a una enfermedad. Además, la investigación actual también se refiere a la utilización de ADN libre de células para obtener más información sobre el estado de las células.
Por consiguiente, existe la necesidad por métodos para aislar ADN libre de células y para aislar microvesículas de muestras biológicas y métodos para extraer ácidos nucleicos de alta calidad para el diagnóstico preciso de condiciones médicas y enfermedades.
Sumario de la invención
En un primer aspecto de la presente invención, se proporciona un método para extraer ADN y ARN de una muestra biológica que comprende: (a) proporcionar una muestra biológica; (b) poner en contacto la muestra biológica con una superficie de captura en condiciones suficientes para retener el ADN libre de células y las microvesículas de la muestra biológica en o sobre la superficie de captura, en donde la superficie de captura comprende una membrana o una o más perlas cargadas, un membrana o una o más perlas que son un intercambiador de aniones que contiene la función amonio cuaternario R-CH2-N+(CH3)3, o una membrana o una o más perlas que está positivamente cargadas y que contiene la función amonio cuaternario R-CH2-N+(CH3)3 ; (c) poner en contacto la superficie de captura con un reactivo de lisis a base de fenol mientras el ADN libre de células y las microvesículas están sobre o en la superficie de captura, liberando así el ADN y el ARN de la muestra y produciendo un homogeneizado; y (d) extraer el ADN, el ARN, o tanto el ADN como el ARN del homogeneizado.
Las realizaciones preferidas de la invención en cualquiera de sus diversos aspectos son como se describe a continuación o como se define en las reivindicaciones subordinadas.
Breve descripción de las figuras
La Figura 1 es un esquema que demuestra un protocolo de aislamiento de ARN y ADN para aislar una fracción de microvesícula, liberar los ácidos nucleicos de la microvesícula y extraer ARN y ADN utilizando dos protocolos separados.
La Figura 2 es un esquema que demuestra un protocolo de aislamiento de ARN y ADN para aislar una fracción de microvesícula, liberar los ácidos nucleicos de la microvesícula y extraer ARN y ADN utilizando un único protocolo. La Figura 3 es un gráfico que muestra el efecto de la concentración de cloroformo en la separación de fases para aislar el ARN y el ADN de la microvesícula en una única extracción, como lo demuestra la detección de ARN y ADN de BRAF de tipo silvestre.
La Figura 4 es un gráfico que muestra el efecto de la concentración de cloroformo en la separación de fases para aislar el ARN y el ADN de la microvesícula en una única extracción, como lo demuestra la detección de ARN y ADN de GAPDH.
La Figura 5 es un gráfico que muestra que el ajuste del pH en la separación de fases influye en la extracción y detección del ADN.
La Figura 6 es un gráfico que muestra el efecto de la valoración del volumen de muestra de líquido cefalorraquídeo (CSF) en la extracción y detección de ARN de microvesículas.
La Figura 7 es un gráfico que muestra la comparación de la detección de objetivos de ARN de microvesícula a partir de métodos de aislamiento por ultracentrifugación y EXO60.
La Figura 8 es un gráfico que muestra la comparación de la detección de objetivos de ARN de microvesícula a partir de métodos de aislamiento por ultracentrifugación y EXO60 para diferentes muestras de CSF de pacientes. Las muestras de pacientes se designan mediante la ID del paciente. Se utilizaron diferentes volúmenes de muestra. (*) Indica una muestra post mortem.
La Figura 9 es un gráfico que muestra el efecto del volumen de muestra de CSF (0,25 mL, 0,5 mL, 1,0 mL y 2,0 mL) sobre diferentes métodos de aislamiento y extracción de ARN de microvesículas. UC (ultracentrifugación), uCSC (método de filtración de orina) y EXO60.
La Figura 10 es una serie de gráficos del bioanalizador que representan los perfiles de ARN de la extracción de 2 muestras de orina diferentes utilizando el protocolo EXO70 en comparación con el método de células madre circulantes en orina (uCSC).
La Figura 11 es un gráfico que muestra la correlación entre la detección de ARN después del aislamiento y la extracción por EXO70 en comparación con el método de orinaCSC.
La Figura 12 es dos gráficos que muestran la detección de diferentes objetivos de ARN después del aislamiento y extracción mediante el método EXO70 o uCSC. El ARN se extrajo y analizó a partir de la fracción de microvesícula aislada (EXO70 o uCSC) y la fracción de flujo o sobrenadante después del aislamiento (flujo de EXO70 o flujo de uCSC). (a ) objetivos de ARNm; (B) objetivos de miARN.
Las Figuras 13-223 son una serie de gráficos e ilustraciones que representan la sensibilidad y especificidad de los métodos de aislamiento y extracción de ADN y ARN con EXO52, junto con las comparaciones con los kits de aislamiento de ácido nucleico circulante disponibles comercialmente, denominados en el presente documento CNAkits disponibles comercialmente.
La Figura 13 es una representación esquemática de estudios diseñados para evaluar la extracción de ADN con y sin tubos PLG.
Las Figuras 14, 15, 16 y 17 son una serie de gráficos que representan la extracción de ADN con y sin tubos PLG utilizando un método inicial de aislamiento de ADN/ARN (EXO52.1) y kits disponibles comercialmente.
Las Figuras 18 y 19 son una serie de gráficos que representan la extracción de ADN utilizando métodos de la divulgación frente a un kit de extracción de ácido nucleico circulante comercialmente disponible.
La Figura 20 es un gráfico que representa el efecto de la valoración con cloroformo en el aislamiento de ARN y ADN de la fase fenólica.
La Figura 21 es una representación esquemática de estudios diseñados para evaluar el efecto de la valoración con cloroformo en el aislamiento de ARN y el aislamiento de ADN de la fase fenólica en tubos PLG.
Las Figuras 22, 23, 24, 25 y 26 son una serie de gráficos que representan los efectos de la valoración con cloroformo en el aislamiento de ARN (Figura 22), aislamiento de ARN y ADN (Figuras 23, 24) y aislamiento de ADN (Figuras 25, 26).
La Figura 27 es un gráfico que representa el aislamiento de ADN usando el protocolo RNeasy (sin tubo PLG) y la valoración con cloroformo.
La Figura 28 es una representación esquemática de estudios diseñados para evaluar el aislamiento de ADN sin tubos PLG y con una valoración con cloroformo.
Las Figuras 29, 30 y 31 son una serie de gráficos que representan el aislamiento de ADN usando el protocolo RNeasy (sin tubo PLG) y la valoración con cloroformo.
La Figura 32 es un gráfico que representa que la adición ajustada de cloroformo aísla conjuntamente ADN y ARN. La Figura 33 es una representación esquemática de estudios diseñados para evaluar el aislamiento de ADN sin tubos PLG y con una valoración con cloroformo.
Las Figuras 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43 y 44 son una serie de gráficos que representan el aislamiento de ADN utilizando el protocolo RNeasy (sin tubo PLG) y la valoración con cloroformo.
La Figura 45 es un gráfico que representa el efecto de los cambios de pH en la separación de fases en el aislamiento de ADN.
La Figura 46 es una representación esquemática de estudios diseñados para evaluar el aislamiento de ADN de la fase acuosa con una valoración de pH.
La Figura 47 es una representación esquemática del método de preparación de la solución de acondicionamiento de pH.
La Figura 48 es un gráfico que representa curvas de amplificación Nala para ARN y ADN aislados.
Las Figuras 49, 50, 51, 52, 53 y 54 son una serie de gráficos que representan el efecto de la valoración del pH en el aislamiento del ADN de la fase acuosa.
La Figura 55 es un gráfico que representa que la adición de cloroformo es el factor predominante para determinar el contenido de ADN de la fase acuosa.
La Figura 56 es un gráfico que representa que la señal de ARN no se ve afectada por la adición de aislamiento de ADN.
La Figura 57 es una representación esquemática de estudios diseñados para evaluar el aislamiento de ADN de la fase acuosa con una valoración con cloroformo y con o sin adición de solución de pH.
La Figura 58 es una representación esquemática del método de preparación de solución de acondicionamiento de pH. Las Figuras 59, 60, 61,62, 63, 64, 65, 66, 67 y 68 son una serie de gráficos que representan el efecto de la valoración con cloroformo con y sin adición de solución de pH en el aislamiento de ADN de la fase acuosa.
La Figura 69 es un gráfico que representa el efecto de una etapa de centrifugación con Qiazol a 4 °C o temperatura ambiente sobre el aislamiento de ARN usando un kit comercialmente disponible.
La Figura 70 es un gráfico que representa el efecto de una etapa de centrifugación con Qiazol a 4 °C o temperatura ambiente sobre los métodos de la divulgación.
Las Figuras 71 y 72 son una representación esquemática y una visión general de los estudios diseñados para evaluar el aislamiento de ARN utilizando un kit comercialmente disponible con una etapa de centrifugación con Qiazol a 4 °C o temperatura ambiente.
Las Figuras 73, 74 y 75 son una serie de gráficos que representan el efecto de una etapa de centrifugación con Qiazol a 4 °C o temperatura ambiente en un kit comercialmente disponible.
Las Figuras 76 y 77 son una representación esquemática y una visión general de los estudios diseñados para evaluar el aislamiento de ARN utilizando el método EXO52 con una etapa de centrifugación con Qiazol a 4 °C o temperatura ambiente.
Las Figuras 78 y 79 son una serie de gráficos que representan el efecto de una etapa de centrifugación con Qiazol a 4 °C o temperatura ambiente sobre los métodos de la divulgación.
La Figura 81 es una representación esquemática de estudios diseñados para evaluar el efecto de los volúmenes variables de etanol entre 1,5x y 2,6x.
Las Figuras 81 y 82 son una serie de gráficos que representan el efecto de los volúmenes variables de etanol entre 1,5x y 2,6x en el aislamiento de ADN y ARN.
La Figura 83 es un gráfico que representa los resultados de la digestión de ProtK a temperatura ambiente antes de la etapa de unión.
La Figura 84 es una representación esquemática de estudios diseñados para evaluar la digestión de ProtK a temperatura ambiente antes de la etapa de unión.
Las Figuras 85 y 86 son una serie de gráficos que representan los resultados de la digestión de ProtK a temperatura ambiente antes de la etapa de unión.
La Figura 87 es un gráfico que representa que la capacidad de carga es superior a 8 mL de plasma.
La Figura 88 es un gráfico que representa que el flujo no tiene un punto de penetración de hasta 8 mL de plasma. La Figura 89 es un gráfico que representa una capacidad de unión diferente para exosomas y nucleosomas.
La Figura 90 es una representación esquemática de estudios diseñados para evaluar la capacidad de carga.
La Figura 91 es un gráfico que representa diferentes capacidades de unión para exosomas y nucleosomas.
Las Figuras 92 y 93 son una serie de gráficos que representan que la capacidad de carga es superior a 8 mL de plasma.
La Figura 94 es un gráfico que representa que el flujo no tiene un punto de penetración de hasta 8 mL de plasma. Las Figuras 95, 96 y 97 son una serie de gráficos que representan el efecto de variar el volumen de carga de plasma en el aislamiento de ADN y ARN.
La Figura 98 es un gráfico que representa que el flujo no tiene un punto de ruptura de hasta 8 mL de plasma.
Las Figuras 99 y 100 son una serie de gráficos que representan el efecto de variar el volumen de carga de plasma en el aislamiento de ADN y ARN.
Las Figuras 101, 102, 103, 104, 105 y 106 son una serie de gráficos que representan diferentes capacidades de unión para exosomas y nucleosomas.
Las Figuras 107 y 108 son una serie de gráficos que representan el aislamiento de ADN libre de células (ADNlc) usando diferentes técnicas de aislamiento que incluyen los métodos de divulgación y los kits disponibles comercialmente.
La Figura 109 es una representación esquemática de estudios diseñados para comparar el aislamiento de ADNlc usando métodos de la divulgación con kits disponibles comercialmente.
Las Figuras 110 y 111 son una representación esquemática y una descripción general de los estudios diseñados para comparar el aislamiento de ADNlc usando diferentes técnicas de aislamiento, incluidos los métodos de la divulgación y los kits disponibles comercialmente.
Las Figuras 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122 y 123 son una serie de gráficos que representan el aislamiento de ADNlc utilizando diferentes técnicas de aislamiento que incluyen los métodos de divulgación y los kits disponibles comercialmente.
Las Figuras 124, 125, 126, 127 y 128 son una serie de gráficos y tablas que representan una comparación del número de copias de ADNlc usando diferentes técnicas de aislamiento que incluyen métodos de divulgación y kits disponibles comercialmente.
Las Figuras 129, 130 y 131 son una representación esquemática y descripciones generales de estudios diseñados para evaluar el uso del kit AllPrep Micro para el análisis posterior de ADN y ARN aislados.
Las Figuras 132, 133, 134, 135 y 136 son una serie de gráficos que representan el uso del kit AllPrep Micro para el análisis posterior de ADN y ARN aislados.
Las Figuras 137 y 138 son una serie de gráficos que representan el aislamiento de ADN libre de células (ADNlc) usando diferentes técnicas de aislamiento que incluyen los métodos de divulgación y los kits disponibles comercialmente.
La Figura 139 es una representación esquemática de estudios diseñados para comparar ADNlc aislado utilizando los métodos de la divulgación y kits disponibles comercialmente.
Las Figuras 140, 141, 142, 143, 144, 145 y 146 son una serie de gráficos que representan el aislamiento de ADN libre de células (ADNlc) utilizando diferentes técnicas de aislamiento que incluyen los métodos de la divulgación y los kits disponibles comercialmente.
Las Figuras 147, 148 y 149 son representaciones esquemáticas de estudios diseñados para comparar ADNlc aislado usando los métodos de la divulgación y los kits disponibles comercialmente.
Las Figuras 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169 y 170 son una serie de gráficos que representan ADN libre de células (ADNlc) utilizando diferentes técnicas de aislamiento, incluidos los métodos de la divulgación y los kits disponibles comercialmente.
La Figura 171 es una serie de gráficos que representan que los métodos de la divulgación superan constantemente a los kits de cNA disponibles comercialmente.
Las Figuras 172, 173 y 174 son representaciones esquemáticas de estudios diseñados para comparar ADNlc aislado utilizando los métodos de la divulgación y los kits disponibles comercialmente.
Las Figuras 175, 176, 177, 178, 179, 180, 181, 182, 183, 184, 185, 186, 187, 188, 189, 190, 191, 192, 193, 194, 195 y 196 son una serie de gráficos que representan el aislamiento de ADN libre de células (ADNIc) utilizando diferentes técnicas de aislamiento, incluidos los métodos de la divulgación y los kits disponibles comercialmente.
La Figura 197 es un gráfico que representa el efecto de múltiples etapas separadas de elución de Qiazol en el aislamiento de ADN y ARN.
La Figura 198 es una representación esquemática de estudios diseñados para evaluar el aislamiento de ADN y ARN utilizando múltiples etapas de elución de Qiazol.
Las Figuras 199, 200, 201 y 202 son una serie de gráficos que representan el efecto de múltiples etapas separadas de elución de Qiazol en el aislamiento de ADN y ARN.
La Figura 203 es una representación esquemática de estudios diseñados para evaluar el aislamiento de ADN y ARN utilizando múltiples etapas de elución de Qiazol.
Las Figuras 204, 205 y 206 son una serie de gráficos que representan el efecto de múltiples etapas separadas de elución de Qiazol sobre el aislamiento de ADN y ARN.
La Figura 207 es un gráfico que representa el efecto de las etapas de carga doble de RNeasy con precipitación de etanol sobre el aislamiento de ADN y ARN.
Las Figuras 208 y 209 son una representación esquemática y una visión general de los estudios diseñados para evaluar el aislamiento de ADN y ARN utilizando etapas de carga doble de RNeasy con precipitación de etanol. Las Figuras 210 y 211 son una serie de gráficos que representan el efecto de las etapas de carga doble de RNeasy con precipitación de etanol sobre el aislamiento de ADN y ARN.
La Figura 212 es un gráfico que representa el efecto de diferentes columnas posteriores en el aislamiento de ADN y ARN.
La Figura 213 es una representación esquemática de estudios diseñados para evaluar el aislamiento de ADN y ARN utilizando diferentes columnas posteriores.
Las Figuras 214, 215, 216 y 217 son una serie de gráficos que representan el efecto de diferentes columnas posteriores sobre el aislamiento de a Dn y ARN.
La Figura 219 es una representación esquemática de estudios diseñados para evaluar el aislamiento de ADN y ARN utilizando múltiples etapas de elución de RNeasy.
Las Figuras 220, 221, 222 y 223 son una serie de gráficos que representan el efecto de múltiples etapas de elución de RNeasy sobre el aislamiento de ADN y ARN.
La Figura 224 es una serie de gráficos que representan la distribución de tamaños de los ácidos nucleicos en plasma. El aislamiento completo de ácido nucleico de 1 mL de plasma se sometió a digestión con RNasa A ("ADNlc"), digestión con DNasa I ("ARNexo") o tratamiento simulado ("EXO52"). Después de la limpieza de la reacción, la distribución de tamaños de los ácidos nucleicos presentes en el aislamiento se midió mediante un ensayo Bioanalyzer Pico 6000. La Figura 225 es un gráfico que representa el aislamiento secuencial de ácidos nucleicos a partir de 2 mL de plasma sanguíneo. El plasma sanguíneo de un donante sano normal se pasó a través de una columna de EXO52 y el material que quedó en el flujo se aisló utilizando un kit exoRNeasy (ARN) comercialmente disponible o un kit de ácido nucleico circulante (ADN) comercialmente disponible. El rendimiento global se compara con EXO52 (ARN ADN) usando (RT)-qPCR contra los genes BRAF, KRAS y 18S en función de la CT delta. Las barras de error representan tres aislamientos replicados.
La Figura 226 es una serie de gráficos que representan ARNexo y ADNci, ambos contribuyen sustancialmente a los ácidos nucleicos totales recogidos del plasma sanguíneo. Se aisló 1 mL de plasma de donantes sanos utilizando el kit exoRNeasy (ARN) comercialmente disponible o un aislamiento con EXO52 con una etapa de transcripción inversa (ARN ADN) o sin (ADN). La cuantificación absoluta por RT-qPCR se presenta como un diagrama de caja e indica la mediana del número de copias por mL de plasma con donantes individuales graficados como formas.
Las Figuras 227 y 228 son una serie de gráficos que representan la capacidad de los métodos EXO52 proporcionados en este documento para capturar los ácidos nucleicos circulantes totales. Los métodos EXO52 se compararon con un kit de aislamiento de ADN de ácido nucleico circulante comercialmente disponible.
Descripción detallada de la invención
En este documento se proporcionan métodos para aislar ADN libre de células (ADNlc) y/o ADNlc y ácidos nucleicos que incluyen al menos a Rn de microvesículas capturando el ADN y las microvesículas a una superficie, lisando posteriormente las microvesículas para liberar los ácidos nucleicos, particularmente ARN, contenidos en ellas, y eluyendo el ADN y/o ADN y ácidos nucleicos incluyendo al menos ARN de la superficie de captura. Las células eucariotas desprenden las microvesículas, o brotan de la membrana plasmática, hacia el exterior de la célula. Estas vesículas de la membrana son de tamaño heterogéneo con diámetros que varían de aproximadamente 10 nm a aproximadamente 5000 nm. Todas las vesículas de la membrana desprendidas por células de <0,8 pm de diámetro se denominan en el presente documento colectivamente "microvesículas". Estas microvesículas incluyen microvesículas, partículas tipo a microvesículas, prostasomas, dexosomas, texosomas, ectosomas, oncosomas, cuerpos apoptóticos, partículas tipo a retrovirus y partículas de retrovirus endógeno humano (HERV). Las microvesículas pequeñas (aproximadamente de 10 a 1000 nm, y más a menudo de 30 a 200 nm de diámetro) que se liberan por exocitosis de cuerpos multivesiculares intracelulares se denominan en la técnica como "microvesículas".
Los métodos actuales para aislar ADN y/o ADN y ácidos nucleicos que incluyen al menos ARN de microvesículas incluyen ultracentrifugación, ultrafiltración, por ejemplo, usando filtros de 100 kD, técnicas de precipitación de polímeros y/o filtración basada en el tamaño. Sin embargo, existe la necesidad de métodos alternativos que sean eficientes y efectivos para aislar microvesículas y, opcionalmente, extraer los ácidos nucleicos contenidos en ellas, preferiblemente ARN de microvesículas, para su uso en una variedad de aplicaciones, incluidos fines de diagnóstico.
Los métodos y/o kits de aislamiento y extracción proporcionados en el presente documento denominados métodos y/o kits de aislamiento de ADN y/o ADN y ARN con EXO52 utilizan un proceso de purificación con base en una columna de centrifugación utilizando una membrana de afinidad que se une al ADN libre de células y/o a microvesículas. Los métodos y los kits de la divulgación permiten la capacidad de procesar grandes cantidades de muestras clínicas en paralelo, utilizando volúmenes de 0,2 a 4 mL en una sola columna. El ADN libre de células aislado usando el procedimiento EXO52 es altamente puro. El ARN aislado es altamente puro, protegido por una membrana vesicular hasta la lisis, y las vesículas intactas se pueden eluir de la membrana de EXO52. El procedimiento EXO52 es capaz de agotar sustancialmente todo el ADN libre de células de la entrada de plasma, y es igual o mejor en rendimiento de ADN en comparación con los kits de aislamiento de ADN circulante disponibles comercialmente. El procedimiento EXO52 es capaz de agotar sustancialmente todo el ARNm de la entrada de plasma, y es igual o mejor en el rendimiento de ARNm /miARN en comparación con la ultracentrifugación o la lisis directa. A diferencia de los kits disponibles comercialmente y/o los métodos de aislamiento anteriores, los métodos y/o kits EXO52 enriquecen la fracción unida a microvesículas de miARN y son fácilmente escalables a grandes cantidades de material de entrada. Esta capacidad de escalar permite la investigación de transcripciones interesantes y poco abundantes. En comparación con otros productos disponibles comercialmente en el mercado, los métodos y kits de la divulgación proporcionan capacidades únicas que se demuestran con los ejemplos proporcionados en el presente documento.
Los métodos y kits EXO52 aíslan y extraen ácidos nucleicos, por ejemplo, ADN y/o ADN y ácidos nucleicos que incluyen al menos ARN de una muestra biológica usando el siguiente procedimiento general. Primero, la muestra, que incluye el ADNlc y la fracción de microvesículas, se une a un filtro de membrana y se lava el filtro. Luego, se usa un reactivo con base en fenol para realizar la lisis de membrana y la liberación de los ácidos nucleicos, por ejemplo, ADN y/o ADN y ARN. La extracción con cloroformo se realiza utilizando tubos PLG, seguido de acondicionamiento con etanol. Los ácidos nucleicos, por ejemplo, ADN y/o ADN y ARN, se unen a una columna de sílice, se lavan y luego se eluyen. Los ácidos nucleicos extraídos, por ejemplo, ADN y/o ADN y ARN, pueden luego analizarse adicionalmente, por ejemplo, usando cualquiera de una variedad de ensayos posteriores.
El método puede incluir las siguientes etapas. El filtro está contenido en la columna de centrifugación. Antes de la adición del reactivo de lisis, la muestra se une a un filtro de membrana en una columna de centrifugación, y la columna de centrifugación se centrifuga durante 1 minuto a aproximadamente 500 x g. El flujo se descarta, se agrega un tampón a la columna de centrifugación, y la columna de centrifugación se centrifuga nuevamente durante 5 minutos a aproximadamente 5000 x g para eliminar el volumen residual de la columna. El flujo se descarta después de este segunda centrifugación. La columna de centrifugación se pone en contacto con el reactivo de lisis a base de fenol y se centrifuga durante 5 minutos a aproximadamente 5000 x g para recoger el homogeneizado que contiene las microvesículas lisadas y el ADNc capturado. El tampón de lisis puede ser un tampón de lisis basado en fenol. Por ejemplo, el tampón de lisis es el reactivo de lisis QIAzol® (Qiagen). El homogeneizado se somete luego a aislamiento y extracción de ácido nucleico. Un control para la eficacia del aislamiento de ARN, tal como, por ejemplo, Q-beta o cualquier otro control descrito en el presente documento, puede introducirse en el homogeneizado antes del aislamiento y extracción de ácido nucleico.
El ácido nucleico puede aislarse de acuerdo con las siguientes etapas. Después de la adición del reactivo de lisis, se agrega cloroformo al homogeneizado, y la solución se mezcla vigorosamente durante un breve período de tiempo. Se pueden agregar 350 pL de cloroformo al homogeneizado. La solución se centrifuga luego durante 5 minutos a 12.000 x g a 4 °C. La fase acuosa superior se transfiere luego a un nuevo tubo de recolección, y se añaden 2 volúmenes de etanol al 100% a la fase acuosa superior, y la solución se mezcla. La solución puede procesarse luego utilizando cualquiera de una variedad de métodos reconocidos en la técnica para aislar y/o extraer ácidos nucleicos.
Los ácidos nucleicos aislados, por ejemplo, ADN y/o ADN y ARN, pueden someterse a un análisis posterior usando cualquiera de una variedad de ensayos posteriores. La detección combinada de ADN y ARN puede usarse para aumentar la sensibilidad para mutaciones accionables Existen múltiples fuentes potenciales de mutaciones detectables en los ácidos nucleicos circulantes. Por ejemplo, las células tumorales vivas son una fuente potencial de ARN y ADN aislado de la fracción de microvesículas de una muestra, y las células tumorales moribundas son fuentes potenciales de fuentes de ADN libre de células como, por ejemplo, ADN de vesículas apoptóticas y ADN libre de células de células tumorales necróticas. Como los ácidos nucleicos mutados son relativamente infrecuentes en circulación, la maximización de la sensibilidad de detección se vuelve muy importante. El aislamiento combinado de ADN y ARN brinda información clínica integral para evaluar la progresión de la enfermedad y la respuesta del paciente a la terapia. Sin embargo, en contraste con los métodos y kits proporcionados en el presente documento, los kits disponibles comercialmente para detectar ácidos nucleicos circulantes solo pueden aislar ADNlc del plasma, es decir, de las células moribundas. Como se muestra en las Figuras 227-228, EXO52 capturó todo el ADNlc, y EXO52 detectó significativamente más copias combinando ARNexo y ADNlc frente a ADNlc solo. Los expertos en la técnica apreciarán que más copias de una mutación u otro biomarcador conducen a una mayor sensibilidad y precisión en la identificación de mutaciones y otros biomarcadores.
Como se usa en el presente documento, el término "ácidos nucleicos" se refiere a ADN y ARN. Los ácidos nucleicos pueden ser monocatenarios o bicatenarios. En algunos casos, el ácido nucleico es el ADN. En algunos casos, el ácido nucleico es ARN. El ARN incluye, entre otros, ARN mensajero, ARN de transferencia, ARN ribosómico, ARN no codificante, microARN y elementos HERV.
Como se usa en el presente documento, el término "muestra biológica" se refiere a una muestra que contiene materiales biológicos tales como ADN, ARN y proteínas.
La muestra biológica puede comprender adecuadamente un fluido corporal de un sujeto. Los fluidos corporales pueden ser fluidos aislados de cualquier parte del cuerpo del sujeto, como, por ejemplo, una ubicación periférica, que incluye, entre otros, sangre, plasma, suero, orina, esputo, líquido raquídeo, líquido cefalorraquídeo, líquido pleural, aspirados de pezón, líquido linfático, líquido de las vías respiratoria, intestinal y genitourinaria, líquido lagrimal, saliva, leche materna, líquido del sistema linfático, semen, líquido del sistema intraorgánico, líquido ascítico, líquido quístico tumoral, líquido amniótico y sobrenadante de cultivo celular, y combinaciones de los mismos. Las muestras biológicas también pueden incluir muestras fecales o cecales, o sobrenadantes aislados de las mismas.
La muestra biológica puede comprender adecuadamente el sobrenadante de cultivo celular.
La muestra biológica puede comprender adecuadamente una muestra de tejido de un sujeto.
La muestra de tejido puede aislarse de cualquier parte del cuerpo del sujeto.
Un volumen de muestra adecuado de un fluido corporal está, por ejemplo, en el intervalo de aproximadamente 0,1 mL a aproximadamente 30 mL de fluido. El volumen de líquido puede depender de algunos factores, por ejemplo, el tipo de líquido utilizado. Por ejemplo, el volumen de muestras de suero puede ser de aproximadamente 0,1 mL a aproximadamente 4 mL, preferiblemente de aproximadamente 0,2 mL a 4 mL. El volumen de muestras de plasma puede ser de aproximadamente 0,1 mL a aproximadamente 4 mL, preferiblemente de 0,5 mL a 4 mL. El volumen de las muestras de orina puede ser de aproximadamente 10 mL a aproximadamente 30 mL, preferiblemente de aproximadamente 20 mL.
Mientras que los ejemplos proporcionados en este documento usan muestras de plasma, el experto en la materia apreciará que estos métodos son aplicables a una variedad de muestras biológicas. Los métodos y kits de la divulgación son adecuados para usar con muestras derivadas de un sujeto humano. Los métodos y kits de la divulgación son adecuados para usar con muestras derivadas de un sujeto humano. Además, los métodos y kits de la divulgación también son adecuados para usar con muestras derivadas de un sujeto humano. Los métodos y kits de la divulgación son adecuados para usar con muestras derivadas de un sujeto no humano como, por ejemplo, un roedor, un primate no humano, un animal de compañía (por ejemplo, gato, perro, caballo), y/o un animal de granja (por ejemplo, pollo).
El término "sujeto" pretende incluir a todos los animales que se muestran o se espera que tengan partículas que contienen ácido nucleico. En particular, el sujeto es un mamífero, un primate humano o no humano, un perro, un gato, un caballo, una vaca, otros animales de granja o un roedor (por ejemplo, ratones, ratas, conejillos de Indias, etc.). Un sujeto humano puede ser un ser humano normal sin anomalías observables, por ejemplo, una enfermedad. Un sujeto humano puede ser un ser humano con anomalías observables, por ejemplo, una enfermedad. Las anomalías observables pueden ser observadas por el propio ser humano o por un profesional médico. El término "sujeto", "paciente" e "individuo" se usan indistintamente en el presente documento.
Mientras que los ejemplos de trabajo proporcionados en el presente documento usan una membrana como superficie de captura, debe entenderse que el formato de la superficie de captura, por ejemplo, perlas o un filtro (también denominado en el presente documento membrana), no afecta la capacidad de los métodos proporcionados en el presente documento para capturar eficientemente microvesículas de una muestra biológica.
Mientras que los ejemplos proporcionados en el presente documento usan cloroformo durante la etapa de extracción, los expertos en la materia apreciarán que cualquier producto químico que realice la misma tarea que el cloroformo durante la extracción de ácido nucleico puede usarse en los métodos proporcionados en el presente documento. A modo de ejemplo no limitativo, los productos químicos adecuados para su uso en la etapa de extracción incluyen diclorometano, tolueno, hexano, MTBE y acetato de etilo (EtOAc).
Una amplia gama de superficies son capaces de capturar microvesículas de acuerdo con los métodos proporcionados en el presente documento, pero no todas las superficies capturarán microvesículas (algunas superficies no capturan nada).
La presente descripción también describe un dispositivo para aislar y concentrar microvesículas de muestras biológicas o clínicas usando piezas de plástico desechables y equipos de centrifugación. Por ejemplo, el dispositivo comprende una columna que comprende una superficie de captura (es decir, un filtro de membrana), un soporte que asegura la superficie de captura entre la frita externa y un tubo interno, y un tubo colector. La frita exterior comprende una estructura de red grande para permitir el paso del líquido, y está preferiblemente en un extremo de la columna. El tubo interno mantiene la superficie de captura en su lugar, y preferiblemente tiene una forma ligeramente cónica. El tubo de recolección puede estar comercialmente disponible, es decir, tubo Falcon de 50 mL. La columna es preferiblemente adecuada para centrifugación, es decir, el tamaño es compatible con máquinas centrífugas y microcentrífugas estándar.
Cuando la superficie de captura es una membrana, el dispositivo para aislar la fracción de microvesículas de una muestra biológica contiene al menos una membrana. El dispositivo puede comprender una, dos, tres, cuatro, cinco o seis membranas. El dispositivo puede comprender tres membranas. Cuando el dispositivo comprende más de una membrana, las membranas están directamente adyacentes entre sí en un extremo de la columna. Cuando el dispositivo comprende más de una membrana, las membranas son todas idénticas entre sí, es decir, tienen la misma carga y/o tienen el mismo grupo funcional.
Debe observarse que la captura mediante el filtrado a través de un tamaño de poro más pequeño que las microvesículas no es el mecanismo principal de captura por los métodos proporcionados en el presente documento. Sin embargo, el tamaño del poro del filtro es muy importante, por ejemplo, porque el ARNm se atasca en un filtro de 20 nm y no se puede recuperar, mientras que los microARN pueden eluirse fácilmente, y por ejemplo porque el tamaño de poro del filtro es un parámetro importante en el área de captura de superficie disponible.
Los métodos proporcionados en el presente documento usan cualquiera de una variedad de superficies de captura. La superficie de captura puede ser una membrana, también denominada en este documento como filtro o filtro de membrana. La superficie de captura puede ser una membrana comercialmente disponible. La superficie de captura puede ser una membrana cargada comercialmente disponible. La superficie de captura es neutra. La superficie de captura se puede seleccionar de la membrana de intercambio iónico Mustang® de PALL Corporation; Membrana Vivapure® Q de Sartorius AG; Sartobind Q o Vivapure® Q Maxi H; Sartobind® D de Sartorius Ag, Sartobind (S) de Sartorius AG, Sartobind® Q de Sartorius AG, Sartobind® IDA de Sartorius AG, Sartobind® Aldehyde de Sartorius AG, Whatman® DE81 de Sigma, columna de purificación de virus de trampa rápida de EMD Millipore; Columnas de centrifugación de intercambio de cationes y aniones fuertes, Pierce Thermo Scientific*.
Cuando la superficie de captura está cargada, la superficie de captura puede ser un filtro cargado seleccionado del grupo que consiste en filtración al vacío Q PES con carga positiva de 0,65 pm (Millipore), filtración de columna de centrifugación Q RC con carga positiva de 3-5 pm (Sartorius), filtración en columna de centrifugación hecha a la medida Q PES cargada positivamente de 0,8 pm (Pall), filtración por jeringa Q PES cargada positivamente de 0,8 pm (Pall), filtración en columna de centrifugación hecha a la medida S PES cargada negativamente de 0,8 pm (Pall), filtración por jeringa S PES cargada negativamente de 0,8 pm (Pall) y filtración por jeringa de nylon cargada negativamente de 50 nm (Sterlitech). Preferiblemente, el filtro cargado no está alojado en un aparato de filtración por jeringa, ya que Qiazol/ ARN es más difícil de extraer del filtro.
Preferiblemente, el filtro cargado está alojado en un extremo de una columna.
Cuando la superficie de captura es una membrana, la membrana puede estar hecha de una variedad de materiales adecuados. En algunas realizaciones, la membrana es polietersulfona (PES) (por ejemplo, de Millipore o PALL Corp.). La membrana puede ser celulosa regenerada (RC) (por ejemplo, de Sartorius o Pierce).
La superficie de captura puede ser una membrana cargada positivamente. La superficie de captura puede ser una membrana Q, que es una membrana cargada positivamente y es un intercambiador de aniones con aminas cuaternarias. Por ejemplo, la membrana Q tiene como función amonio cuaternario, R-CH2-N+(CH3)3. La superficie de captura puede ser una membrana cargada negativamente. La superficie de captura puede ser una membrana S, que es una membrana cargada negativamente y es un intercambiador catiónico con grupos de ácido sulfónico. Por ejemplo, la membrana S tiene la función ácido sulfónico, R-CH2-SO3. La superficie de captura puede ser una membrana D, que es un intercambiador aniónico básico débil con grupos dietilamina, R-CH2-NH+(C2Hs)2. La superficie de captura puede ser una membrana de quelato metálico. Por ejemplo, la membrana es una membrana IDA, con la función ácido minodiacético -N(CH2COOH')2. La superficie de captura puede ser una membrana microporosa, con función de grupos aldehído, -CHO. La membrana puede ser un intercambiador aniónico básico débil, con celulosa dietilaminoetilo (DEAE). No todas las membranas cargadas son adecuadas para su uso en los métodos proporcionados en este documento, por ejemplo, el ARN aislado usando la columna de centrifugación de membrana Sartorius Vivapure S mostró inhibición de RT-qPCR y, por lo tanto, no es adecuado para el ensayo posterior relacionado con PCR.
Cuando la superficie de captura está cargada, las microvesículas pueden aislarse con un filtro cargado positivamente.
Cuando la superficie de captura está cargada, el pH durante la captura de microvesículas es un pH <7. El pH puede ser mayor que 4 y menor o igual que 8.
Cuando la superficie de captura es un filtro Q cargado positivamente, el sistema de tampón incluye un tampón de lavado que comprende Bis-Tris-Propano 250 mM, pH 6,5-7,0. Cuando la superficie de captura es un filtro Q cargado positivamente, el tampón de lisis es Qiazol. Cuando la superficie de captura es un filtro Q cargado positivamente, el tampón de lisis está presente en un volumen. Cuando la superficie de captura es un filtro Q cargado positivamente, el tampón de lisis está presente en más de un volumen.
Dependiendo del material de la membrana, los tamaños de poro de la membrana varían de 3 |jm a 20 nm.
La carga superficial de la superficie de captura puede ser positiva, negativa o neutra. La superficie de captura puede ser una perla o perlas cargadas positivamente.
Los métodos proporcionados en el presente documento incluyen un reactivo de lisis. El agente usado para la lisis en membrana puede ser un reactivo a base de fenol. El reactivo de lisis puede ser un reactivo a base de guanidinio. El reactivo de lisis puede ser un tampón con alto contenido de sal. El reactivo de lisis puede ser QIAzol.
Los métodos proporcionados en el presente documento incluyen una variedad de tampones que incluyen tampones de carga y lavado. Los tampones de carga y lavado pueden ser de alta o baja fuerza iónica. La concentración de sal, por ejemplo, la concentración de NaCl, puede ser de 0 a 2,4 M. Los tampones pueden incluir una variedad de componentes. Los tampones pueden incluir uno o más de los siguientes componentes: Tris, Bis-Tris, Bis-Tris-Propano, imidazol, citrato, ácido metil malónico, ácido acético, etanolamina, dietanolamina, trietanolamina (TEA) y fosfato de sodio. En los métodos proporcionados en el presente documento, el pH de los tampones de carga y lavado es importante. Los filtros tienden a obstruirse cuando las muestras de plasma se ajustan a pH S. 5.5 antes de cargarse (el plasma no se centrifugará a través de la columna en absoluto), y a pH más alto, la recuperación de ARN de microvesícula es menor debido a la inestabilidad de las microvesículas. A pH neutro, la recuperación de ARN de las microvesículas es óptima. El tampón utilizado está en concentración 1X, concentración 2x, concentración 3X o concentración 4X. Por ejemplo, el tampón de carga o unión está a una concentración 2X mientras que el tampón de lavado está a una concentración 1X.
Los métodos pueden incluir una o más etapas de lavado, por ejemplo, después de poner en contacto la muestra biológica con la superficie de captura. Se pueden agregar detergentes al tampón de lavado para facilitar la eliminación de la unión no específica (es decir, contaminantes, restos celulares, y complejos de proteínas circulantes o ácidos nucleicos), para obtener una fracción de microvesícula más pura. Los detergentes adecuados para su uso incluyen, entre otros, dodecil sulfato de sodio (SDS), Tween-20, Tween-80, Triton X-100, Nonidet P-40 (NP-40), Brij-35, Brij-58, octil glucósido, octil tioglucósido, CHAPS o CHAPSO.
La superficie de captura, por ejemplo, la membrana puede alojarse dentro de un dispositivo utilizado para centrifugación; por ejemplo, columnas de centrifugación, o para sistema de vacío, por ejemplo, portafiltros de vacío, o para filtración con presión, por ejemplo, filtros de jeringa. Preferiblemente, la superficie de captura se aloja en una columna de centrifugación o sistema de vacío.
El aislamiento de microvesículas de una muestra biológica antes de la extracción de ácidos nucleicos es ventajoso por las siguientes razones: 1) la extracción de ácidos nucleicos de microvesículas brinda la oportunidad de analizar selectivamente o ácidos nucleicos específicos de enfermedades o tumores obtenidos aislando microvesículas específicas de enfermedades o tumores aparte de otras microvesículas dentro de la muestra de fluido; 2) las microvesículas que contienen ácido nucleico producen rendimientos significativamente más altos de especies de ácido nucleico con mayor integridad en comparación con el rendimiento/integridad obtenido al extraer ácidos nucleicos directamente de la muestra de fluido sin aislar primero las microvesículas; 3) escalabilidad, por ejemplo, para detectar ácidos nucleicos expresados a niveles bajos, la sensibilidad puede aumentarse concentrando microvesículas de un volumen mayor de muestra usando los métodos descritos en este documento; 4) una calidad/integridad más pura o más alta de los ácidos nucleicos extraídos en el sentido de que las proteínas, los lípidos, los desechos celulares, las células y otros contaminantes potenciales y los inhibidores de PCR que se encuentran naturalmente en las muestras biológicas se excluyen antes de la etapa de extracción de ácido nucleico; y 5) se pueden utilizar más opciones en los métodos de extracción de ácido nucleico ya que las fracciones de microvesículas aisladas pueden ser de un volumen menor que el del volumen de muestra inicial, lo que hace posible extraer ácidos nucleicos de estas fracciones o gránulos utilizando filtros de columna de pequeño volumen.
Se han descrito varios métodos para aislar microvesículas de una muestra biológica en la técnica. Por ejemplo, un método de centrifugación diferencial se describe en un artículo de Raposo et al., (Raposo et al., 1996), un artículo de Skog et al., (Skog et al., 2008) y un artículo de Nilsson et al., (Nilsson et al., 2009). Los métodos de intercambio iónico y/o cromatografía de permeación en gel se describen en las patentes de los Estados Unidos Nos. 6.899.863 y 6.812.023. Los métodos de gradientes de densidad de sacarosa o electroforesis de orgánulos se describen en la patente de Estados Unidos No. 7.198.923. Taylor y Gercel Taylor (Taylor y Gercel-Taylor, 2008) describen un método de clasificación de células activadas magnéticamente (MACS). Un método de concentración de ultrafiltración por nanomembrana se describe en un artículo de Cheruvanky et al., (Cheruvanky et al., 2007). Un método de aislamiento de gradiente de Percoll se describe en una publicación de Miranda et al., (Miranda et al., 2010). Además, las microvesículas pueden identificarse y aislarse del fluido corporal de un sujeto mediante un dispositivo de microfluidos (Chen et al., 2010). En investigación y desarrollo, así como en aplicaciones comerciales de biomarcadores de ácido nucleico, es deseable extraer ácidos nucleicos de alta calidad de muestras biológicas de manera consistente, confiable y práctica.
Por lo tanto, un objetivo es proporcionar un método para el aislamiento rápido y fácil de partículas que contienen ácido nucleico de muestras biológicas tales como fluidos corporales y extracción de ácidos nucleicos de alta calidad de las partículas aisladas. El método descrito puede ser adecuado para la adaptación e incorporación a un dispositivo o instrumento compacto para su uso en un laboratorio o entorno clínico, o en el campo.
La muestra no puede procesarse previamente antes del aislamiento y extracción de ácidos nucleicos, por ejemplo, ADN y/o ADN y ARN, de la muestra biológica.
La muestra puede someterse a una etapa de procesamiento previo antes de que se realice el aislamiento, la purificación o el enriquecimiento de las microvesículas para eliminar partículas grandes no deseadas, células y/o restos celulares y otros contaminantes presentes en la muestra biológica. Las etapas de procesamiento previo se pueden lograr a través de una o más etapas de centrifugación (por ejemplo, centrifugación diferencial) o una o más etapas de filtración (por ejemplo, ultrafiltración), o una combinación de los mismos. Cuando se realizan más de una etapa de procesamiento previo de centrifugación, la muestra biológica se puede centrifugar primero a la velocidad más baja y luego a la velocidad más alta. Si se desea, se pueden llevar a cabo otras etapas adecuadas de procesamiento previo por centrifugación. Alternativamente o además de una o más etapas de procesamiento previo por centrifugación, la muestra biológica puede filtrarse. Por ejemplo, una muestra biológica se puede centrifugar primero a 20.000 g durante 1 hora para eliminar partículas grandes no deseadas; la muestra se puede filtrar, por ejemplo, a través de un filtro de 0,8 |jm.
La muestra puede filtrarse previamente para excluir partículas mayores de 0,8 jm . La muestra incluye un aditivo como EDTA, citrato de sodio y/o citrato-fosfato-dextrosa. Preferiblemente, la muestra no contiene heparina, ya que la heparina puede afectar negativamente a RT-qPCR y otros análisis de ácido nucleico. La muestra se puede mezclar con un tampón antes de la purificación y/o aislamiento y/o extracción de ácido nucleico. En algunas realizaciones, el tampón es tampón XBP.
Se pueden realizar una o más etapas de centrifugación antes o después de poner en contacto la muestra biológica con la superficie de captura para separar las microvesículas y concentrar las microvesículas aisladas de la fracción biológica. Por ejemplo, la muestra se centrifuga a 20.000 g durante 1 hora a 4 °C. Para eliminar partículas grandes no deseadas, células y/o restos celulares, las muestras pueden centrifugarse a una velocidad baja de aproximadamente 100-500 g, preferiblemente aproximadamente 250-300 g. Alternativamente o además, las muestras pueden centrifugarse a una velocidad mayor. Las velocidades de centrifugación adecuadas son de hasta aproximadamente 200.000 g; por ejemplo de aproximadamente 2.000 g a menos de aproximadamente 200.000 g. Se prefieren velocidades por encima de aproximadamente 15.000 g y menos de aproximadamente 200.000 g o más de aproximadamente 15.000 g y menos de aproximadamente 100.000 g o más de aproximadamente 15.000 g y menos de aproximadamente 50.000 g. Velocidades de aproximadamente 18.000 g a aproximadamente 40.000 g o aproximadamente 30.000 g; y se prefieren más de aproximadamente 18.000 g a aproximadamente 25.000 g. Particularmente preferido es una velocidad de centrifugación de aproximadamente 20.000 g. Generalmente, los tiempos adecuados para la centrifugación son de aproximadamente 5 minutos a aproximadamente 2 horas, por ejemplo, de aproximadamente 10 minutos a aproximadamente 1,5 horas, o más preferiblemente de aproximadamente 15 minutos a aproximadamente 1 hora. Se puede preferir un tiempo de aproximadamente 0,5 horas. A veces se prefiere someter la muestra biológica a centrifugación a aproximadamente 20.000 g durante aproximadamente 0,5 horas. Sin embargo, las velocidades y tiempos anteriores pueden usarse adecuadamente en cualquier combinación (por ejemplo, de aproximadamente 18.000 g a aproximadamente 25.000 g, o de aproximadamente 30.000 g a aproximadamente 40.000 g durante aproximadamente 10 minutos a aproximadamente 1,5 horas, o durante aproximadamente 15 minutos a aproximadamente 1 hora, o durante aproximadamente 0,5 horas, y así sucesivamente). La etapa o etapas de centrifugación se pueden llevar a cabo a temperaturas inferiores a la ambiente, por ejemplo a aproximadamente 0-10 °C, preferiblemente a aproximadamente 1-5 °C, por ejemplo, aproximadamente 3 °C o aproximadamente 4 °C.
Se pueden realizar una o más etapas de filtración antes o después de poner en contacto la muestra biológica con la superficie de captura. Se puede emplear un filtro que tenga un tamaño en el intervalo de aproximadamente 0,1 a aproximadamente 1,0 jm , preferiblemente de aproximadamente 0,8 jm o 0,22 jm . La filtración también puede realizarse con filtraciones sucesivas usando filtros con disminución de la porosidad.
Se pueden realizar una o más etapas de concentración, para reducir los volúmenes de muestra a tratar durante las etapas de cromatografía, antes o después de poner en contacto la muestra biológica con la superficie de captura. La concentración puede ser por centrifugación de la muestra a altas velocidades, por ejemplo, entre 10.000 y 100.000 g, para provocar la sedimentación de las microvesículas. Esto puede consistir en una serie de centrifugaciones diferenciales. Las microvesículas en el sedimento obtenido se pueden reconstituir con un volumen más pequeño y en un tampón adecuado para las etapas posteriores del proceso. La etapa de concentración también se puede realizar por ultrafiltración. De hecho, esta ultrafiltración concentra la muestra biológica y realiza una purificación adicional de la fracción de microvesículas. La filtración puede ser una ultrafiltración, preferiblemente una ultrafiltración tangencial. La ultrafiltración tangencial consiste en concentrar y fraccionar una solución entre dos compartimentos (filtrado y retenido), separados por membranas de umbrales de corte determinados. La separación se lleva a cabo aplicando un flujo en el compartimento del retenido y una presión transmembrana entre este compartimento y el compartimento de filtrado. Se pueden usar diferentes sistemas para realizar la ultrafiltración, tales como membranas espirales (Millipore, Amicon), membranas planas o fibras huecas (Amicon, Millipore, Sartorius, Pall, GF, Sepracor). El uso de membranas con un umbral de corte por debajo de 1000 kDa, preferiblemente entre 100 kDa y 1000 kDa, o incluso más preferiblemente entre 100 kDa y 600 kDa es ventajoso.
Una o más etapas de cromatografía de exclusión por tamaño o etapas de cromatografía de permeación en gel pueden realizarse antes o después de poner en contacto la muestra biológica con la superficie de captura. Para realizar la etapa de cromatografía de permeación en gel, se usa preferiblemente un soporte seleccionado de sílice, acrilamida, agarosa, dextrano, copolímero de etilenglicol-metacrilato o mezclas de los mismos, por ejemplo, mezclas de agarosadextrano. Por ejemplo, dichos soportes incluyen, entre otros: SUPERDEX® 200HR (Pharmacia), TSK G6000 (TosoHaas) o SEPHACRYL® S (Pharmacia).
Se pueden realizar una o más etapas de cromatografía de afinidad antes o después de poner en contacto la muestra biológica con la superficie de captura. Algunas microvesículas también pueden caracterizarse por ciertas moléculas de superficie. Debido a que las microvesículas se forman a partir de la gemación de la membrana plasmática celular, estas microvesículas a menudo comparten muchas de las mismas moléculas de superficie encontradas en las células de las que se originaron. Como se usa en el presente documento, "moléculas de superficie" se refiere colectivamente a antígenos, proteínas, lípidos, carbohidratos y marcadores que se encuentran en la superficie o en la membrana de la microvesícula. Estas moléculas de superficie pueden incluir, por ejemplo, receptores, antígenos asociados a tumores, modificaciones de proteínas de membrana (por ejemplo, estructuras glicosiladas). Por ejemplo, las microvesículas que brotan de las células tumorales a menudo muestran antígenos asociados a tumores en su superficie celular. Como tal, la cromatografía de afinidad o la cromatografía de exclusión de afinidad también se pueden utilizar en combinación con los métodos proporcionados en el presente documento para aislar, identificar y enriquecer poblaciones específicas de microvesículas de un tipo de célula donante específico (Al-Nedawi et al., 2008; Taylor y Gercel-Taylor, 2008). Por ejemplo, las microvesículas tumorales (malignas o no malignas) portan antígenos de superficie asociados a tumores y pueden detectarse, aislarse y/o enriquecerse a través de estos antígenos de superficie asociados a tumores específicos. En un ejemplo, el antígeno de superficie es la molécula de adhesión de células epiteliales (EpCAM), que es específica para las microvesículas de carcinomas de origen en el pulmón, colorrectal, mama, próstata, cabeza y cuello, y hepático, pero no de origen celular hematológico (Balzar et al., 1999; Went et al., 2004). Además, las microvesículas específicas de tumor también pueden caracterizarse por la falta de ciertos marcadores de superficie, tales como CD80 y CD86. En estos casos, las microvesículas con estos marcadores pueden excluirse para un análisis posterior de marcadores específicos de tumores, por ejemplo, mediante cromatografía de exclusión por afinidad. La cromatografía de afinidad se puede lograr, por ejemplo, utilizando diferentes soportes, resinas, perlas, anticuerpos, aptámeros, análogos de aptámeros, polímeros impresos molecularmente u otras moléculas conocidas en la técnica que se dirigen específicamente a las moléculas de superficie deseadas en las microvesículas.
Opcionalmente, se pueden agregar partículas de control a la muestra antes del aislamiento de microvesículas o extracción de ácido nucleico para servir como control interno para evaluar la eficiencia o calidad de la purificación de microvesículas y/o extracción de ácido nucleico. Los métodos descritos en este documento proporcionan el aislamiento eficiente y las partículas de control junto con la fracción de microvesículas. Estas partículas de control incluyen bacteriófagos Q-beta, partículas de virus o cualquier otra partícula que contenga ácidos nucleicos de control (por ejemplo, al menos un gen objetivo de control) que puede producirse de forma natural o manipularse mediante técnicas de ADN recombinante. La cantidad de partículas de control puede ser conocido antes de la adición a la muestra. El gen objetivo de control puede cuantificarse usando análisis de PCR en tiempo real. La cuantificación de un gen objetivo de control puede usarse para determinar la eficiencia o la calidad de los procesos de purificación de microvesículas o extracción de ácido nucleico.
Preferiblemente, la partícula de control es un bacteriófago Q-beta, denominado en el presente documento "partícula Q-beta". La partícula Q-beta utilizada en los métodos descritos en el presente documento puede ser una partícula viral de origen natural o puede ser un virus recombinante o modificado genéticamente, en el que al menos un componente de la partícula viral (por ejemplo, una porción del genoma o la proteína de la cubierta) se sintetiza mediante ADN recombinante o técnicas de biología molecular conocidas en la técnica. Q-beta es un miembro de la familia leviviridae, que se caracteriza por un genoma de ARN lineal de cadena sencilla que consta de 3 genes que codifican cuatro proteínas virales: una proteína de cubierta, una proteína de maduración, una proteína de lisis y una ARN replicasa. Debido a su tamaño similar a las microvesículas promedio, Q-beta se puede purificar fácilmente de una muestra biológica utilizando los mismos métodos de purificación utilizados para aislar microvesículas, como se describe en el presente documento. Además, la baja complejidad de la estructura del gen monocatenario viral Q-beta es ventajosa para su uso como control en ensayos de ácido nucleico basados en amplificación. La partícula Q-beta contiene un gen objetivo de control o una secuencia objetivo de control que se detectará o medirá para la cuantificación de la cantidad de partícula Q-beta en una muestra. Por ejemplo, el gen objetivo de control es el gen de la proteína de la cubierta Q-beta. Después de la adición de las partículas Q-beta a la muestra biológica, los ácidos nucleicos de la partícula Q-beta se extraen junto con los ácidos nucleicos de la muestra biológica utilizando los métodos de extracción descritos en este documento. La detección del gen objetivo de control Q-beta se puede determinar mediante análisis de RT-PCR, por ejemplo, simultáneamente con el o los biomarcadores de interés. Se puede utilizar una curva estándar de al menos 2, 3 o 4 concentraciones conocidas en una dilución de 10 veces de un gen objetivo de control para determinar el número de copias. El número de copias detectadas y la cantidad de partículas Q-beta agregadas se pueden comparar para determinar la calidad del proceso de aislamiento y/o extracción.
Las partículas Q-beta se pueden agregar a la muestra de orina antes de la extracción nucleica. Por ejemplo, las partículas Q-beta se agregan a la muestra de orina antes de la ultrafiltración y/o después de la etapa previa de filtración.
Se pueden agregar 50, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 1.000 o 5.000 copias de partículas Q-beta a una muestra de fluido corporal. Se pueden agregar 100 copias de partículas Q-beta a una muestra de fluido corporal. El número de copias de partículas Q-beta se puede calcular en función de la capacidad del bacteriófago Q-beta para infectar las células objetivo. Por lo tanto, el número de copias de partículas Q-beta se correlaciona con las unidades formadoras de colonias del bacteriófago Q-beta.
Extracción de ácido nucleico
La presente descripción está dirigida al uso de una superficie de captura para el aislamiento, purificación o enriquecimiento mejorado de microvesículas. Los métodos descritos en el presente documento proporcionan una fracción de microvesículas altamente enriquecida para la extracción de ácidos nucleicos de alta calidad de dichas microvesículas. Las extracciones de ácido nucleico obtenidas por los métodos descritos en el presente documento pueden ser útiles para diversas aplicaciones en las que se requieren o prefieren extracciones de ácido nucleico de alta calidad, como para su uso en el diagnóstico, pronóstico o control de enfermedades o condiciones médicas.
Estudios recientes revelan que los ácidos nucleicos dentro de las microvesículas desempeñan un papel como biomarcadores. Por ejemplo, el documento WO 2009/100029 describe, entre otras cosas, el uso de ácidos nucleicos extraídos de microvesículas en suero de pacientes con GBM para diagnóstico médico, pronóstico y evaluación de terapia. El documento WO 2009/100029 también describe el uso de ácidos nucleicos extraídos de microvesículas en orina humana para los mismos fines. Se considera que el uso de ácidos nucleicos extraídos de microvesículas evita potencialmente la necesidad de biopsias, destacando el enorme potencial diagnóstico de la biología de microvesículas (Skog et al., 2008).
La calidad o pureza de las microvesículas aisladas puede afectar directamente la calidad de los ácidos nucleicos de extraídos de microvesículas, lo que luego afecta directamente la eficiencia y la sensibilidad de los ensayos de biomarcadores para el diagnóstico, pronóstico y/o monitoreo de enfermedades. Dada la importancia de las pruebas de diagnóstico precisas y sensibles en el campo clínico, se necesitan métodos para aislar fracciones de microvesículas altamente enriquecidas de muestras biológicas. Para abordar esta necesidad, la presente descripción proporciona métodos para aislar microvesículas de una muestra biológica para la extracción de ácidos nucleicos de alta calidad de una muestra biológica. Como se muestra en el presente documento, las fracciones de microvesículas altamente enriquecidas se aíslan de las muestras biológicas mediante los métodos descritos en este documento, y en donde los ácidos nucleicos de alta calidad se extraen posteriormente de las fracciones de microvesículas altamente enriquecidas. Estos ácidos nucleicos extraídos de alta calidad son útiles para medir o evaluar la presencia o ausencia de biomarcadores para ayudar en el diagnóstico, pronóstico y/o monitoreo de enfermedades u otras condiciones médicas.
Como se usa en el presente documento, el término "alta calidad" en referencia a la extracción de ácido nucleico significa una extracción en la que se puede detectar ARNr 18S y 28S, preferiblemente en una relación de aproximadamente 1:1 a aproximadamente 1:2; y más preferiblemente, aproximadamente 1:2. Idealmente, las extracciones de ácido nucleico de alta calidad obtenidas por los métodos descritos en el presente documento también tendrán un número de integridad de ARN mayor o igual a 5 para una muestra biológica baja en proteínas (por ejemplo, orina), o mayor o igual a 3 para una muestra biológica alta en proteína (por ejemplo, suero) y un rendimiento de ácido nucleico mayor o igual a 50 pg/ mL de una muestra biológica baja en proteínas de 20 mL o una muestra biológica alta en proteínas de 1 mL.
Las extracciones de ARN de alta calidad son deseables porque la degradación del ARN puede afectar negativamente la evaluación posterior del ARN extraído, como en la expresión génica y el análisis de ARNm, así como en el análisis de ARN no codificante tal como ARN pequeño y microARN. Los nuevos métodos descritos en este documento permiten extraer ácidos nucleicos de alta calidad de microvesículas aisladas de una muestra biológica para que se pueda realizar un análisis preciso de los ácidos nucleicos dentro de las microvesículas.
Después del aislamiento de microvesículas de una muestra biológica, el ácido nucleico puede extraerse de la fracción de microvesícula aislada o enriquecida. Para lograr esto, las microvesículas se pueden lisar primero. La lisis de microvesículas y la extracción de ácidos nucleicos se puede lograr con varios métodos conocidos en la técnica. La extracción de ácido nucleico se puede lograr usando fenol:cloroformo de acuerdo con procedimientos y técnicas estándar conocidos en la técnica. Tales métodos también pueden utilizar una columna de unión a ácido nucleico para capturar los ácidos nucleicos contenidos dentro de las microvesículas. Una vez unidos, los ácidos nucleicos pueden eluirse usando un tampón o solución adecuada para interrumpir la interacción entre los ácidos nucleicos y la columna de unión, eluyendo con éxito los ácidos nucleicos.
Los métodos de extracción de ácido nucleico también pueden incluir la etapa de eliminar o mitigar los factores adversos que evitan la extracción de ácido nucleico de alta calidad de una muestra biológica. Dichos factores adversos son heterogéneos porque diferentes muestras biológicas pueden contener varias especies de factores adversos. En algunas muestras biológicas, factores como el ADN excesivo pueden afectar la calidad de las extracciones de ácido nucleico de dichas muestras. En otras muestras, factores como la RNasa endógena excesiva pueden afectar la calidad de las extracciones de ácido nucleico de dichas muestras. Se pueden usar muchos agentes y métodos para eliminar estos factores adversos. Estos métodos y agentes se denominan colectivamente en el presente documento como "operaciones de mejora de extracción". En algunos casos, la operación de mejora de extracción puede implicar la adición de agentes de mejora de extracción de ácido nucleico a la muestra biológica. Para eliminar los factores adversos como las RNasas endógenas, los agentes potenciadores de la extracción tal como se definen en el presente documento pueden incluir, entre otros, un inhibidor de RNasa tal como Superase-In (comercialmente disponible a través de Ambion Inc.) o RNaseINplus (comercialmente disponible a través de Promega Corp.), u otros agentes que funcionan de manera similar; una proteasa (que puede funcionar como un inhibidor de RNasa); DNasa; un agente reductor; un sustrato señuelo tal como un ARN sintético y/o ARN portador; un receptor soluble que puede unirse a RNasa; un ARN pequeño de interferencia (ARNpi); una molécula de unión a ARN, tal como un anticuerpo anti-ARN, una proteína básica o una proteína chaperona; una sustancia desnaturalizante de RNasa, tal como una solución de alta osmolaridad, un detergente o una combinación de los mismos.
Por ejemplo, la operación de mejora de extracción puede incluir la adición de un inhibidor de RNasa a la muestra biológica, y/o a la fracción de microvesícula aislada, antes de extraer el ácido nucleico; preferiblemente el inhibidor de RNasa tiene una concentración mayor de 0,027 AU (1X) para una muestra igual o mayor a 1 pL en volumen; alternativamente, mayor o igual a 0,135 AU (5X) para una muestra igual o mayor a 1 pL; alternativamente, mayor o igual a 0,27 AU (10X) para una muestra igual o mayor a 1 pL; alternativamente, mayor o igual a 0,675 AU (25X) para una muestra igual o mayor a 1 pL; y, alternativamente, mayor o igual a 1,35 AU (50X) para una muestra igual o mayor a 1 pL; en donde la concentración 1x se refiere a una condición enzimática en donde 0,027 AU o más del inhibidor de RNasa se usa para tratar microvesículas aisladas de 1 pL o más de fluido corporal, la concentración 5X se refiere a una condición enzimática en donde 0,135 AU o más del inhibidor de RNasa se usa para tratar microvesículas aisladas de 1 pL o más de fluido corporal, la concentración de proteasa 10X se refiere a una condición enzimática en la que se usa 0,27 AU o más del inhibidor de RNasa para tratar partículas aisladas de 1 pL o más de fluido corporal, la concentración de 25X se refiere a una condición enzimática en donde 0,675 AU o más del inhibidor de RNasa se usa para tratar microvesículas aisladas de 1 pL o más de fluido corporal, y la concentración de proteasa 50X se refiere a una condición enzimática en la que se usa 1,35 AU o más del inhibidor de RNasa para tratar partículas aisladas de 1 pL o más de fluido corporal. Preferiblemente, el inhibidor de la RNasa es una proteasa, en cuyo caso, 1 AU es la actividad de la proteasa que libera aminoácidos con folina y péptidos correspondientes a 1 pmol de tirosina por minuto.
Estos agentes potenciadores pueden ejercer sus funciones de varias maneras, por ejemplo, mediante la inhibición de la actividad de la ARNasa (por ejemplo, inhibidores de la ARNasa), mediante una degradación ubicua de proteínas (por ejemplo, proteasas), o mediante una proteína chaperona (por ejemplo, un proteína de unión a ARN) que se une y protege a los ARN. En todos los casos, dichos agentes de mejora de extracción eliminan o al menos mitigan algunos o todos los factores adversos en la muestra biológica o asociados con las partículas aisladas que de otro modo evitarían o interferirían con la extracción de alta calidad de ácidos nucleicos de las partículas aisladas.
La cuantificación de los ARNr 18S y 28S extraídos puede usarse para determinar la calidad de la extracción de ácido nucleico.
Detección de biomarcadores de ácido nucleico
El ácido nucleico extraído puede comprender ADN y/o ADN y ARN. Cuando el ácido nucleico extraído comprende ADN y ARN, el ARN se transcribe preferiblemente de manera inversa en ADN complementario (ADNc) antes de una amplificación adicional. Dicha transcripción inversa puede realizarse sola o en combinación con una etapa de amplificación. Un ejemplo de un método que combina las etapas de transcripción inversa y amplificación es la reacción en cadena de la polimerasa de transcripción inversa (RT-PCR), que puede modificarse adicionalmente para que sea cuantitativa, por ejemplo, RT-PCR cuantitativa como se describe en la patente de los Estados Unidos No. 5.639.606. Otro ejemplo del método comprende dos etapas separadas: una primera transcripción inversa para convertir el ARN en ADNc y una segunda etapa para cuantificar la cantidad de ADNc mediante PCR cuantitativa. Como se demuestra en los ejemplos que siguen, los ARN extraídos de partículas que contienen ácido nucleico usando los métodos descritos en el presente documento incluyen muchas especies de transcripciones que incluyen, pero no se limitan a, ARNr ribosómico 18S y 28S, microARN, ARN de transferencia, transcripciones que están asociadas con enfermedades o condiciones médicas y biomarcadores que son importantes para el diagnóstico, pronóstico y monitoreo de condiciones médicas.
Por ejemplo, el análisis de RT-PCR determina un valor de Ct (umbral de ciclo) para cada reacción. En RT-PCR, se detecta una reacción positiva mediante la acumulación de una señal de fluorescencia. El valor de Ct se define como el número de ciclos necesarios para que la señal fluorescente cruce el umbral (es decir, excede el nivel de fondo). Los niveles de Ct son inversamente proporcionales a la cantidad de ácido nucleico objetivo, o ácido nucleico de control, en la muestra (es decir, cuanto menor es el nivel de Ct, mayor es la cantidad de ácido nucleico de control en la muestra).
El número de copias del ácido nucleico de control puede medirse usando cualquiera de una variedad de técnicas reconocidas en el arte, que incluyen, pero no se limitan a, RT-PCR. El número de copias del ácido nucleico de control puede determinarse usando métodos conocidos en la técnica, tales como generando y utilizando una calibración o curva estándar.
Uno o más biomarcadores pueden ser una o una colección de aberraciones genéticas, que se usa en el presente documento para referirse a las cantidades de ácido nucleico así como a las variantes de ácido nucleico dentro de las partículas que contienen ácido nucleico. Específicamente, las aberraciones genéticas incluyen, sin limitación, la sobreexpresión de un gen (por ejemplo, un oncogén) o un panel de genes, la subexpresión de un gen (por ejemplo, un gen supresor de tumores como p53 o RB) o un panel de genes, producción alternativa de variantes de empalme de un gen o un panel de genes, variantes del número de copias del gen (CNV) (por ejemplo, minutos dobles de ADN) (Hahn, 1993), modificaciones de ácidos nucleicos (por ejemplo, metilación, acetilación y fosforilaciones), polimorfismos de un solo nucleótido (SNP), reordenamientos cromosómicos (por ejemplo, inversiones, supresiones y duplicaciones) y mutaciones (inserciones, supresiones, duplicaciones, sentido erróneo, sin sentido, sinónimo o cualquier otro cambio de nucleótidos) de un gen o un panel de genes, cuyas mutaciones en muchos casos, en última instancia, afectan la actividad y la función de los productos génicos, conducen a variantes de empalme transcripcional alternativas y/o cambios en el nivel de expresión génica, o combinaciones de cualquiera de los anteriores.
El análisis de los ácidos nucleicos presentes en las partículas aisladas es cuantitativo y/o cualitativo. Para el análisis cuantitativo, las cantidades (niveles de expresión), ya sean relativas o absolutas, de ácidos nucleicos específicos de interés dentro de las partículas aisladas se miden con métodos conocidos en la técnica (descritos a continuación). Para el análisis cualitativo, las especies de ácidos nucleicos específicos de interés dentro de las microvesículas aisladas, ya sean de tipo silvestre o variantes, se identifican con métodos conocidos en la técnica.
La presente descripción también incluye diversos usos de los nuevos métodos para aislar microvesículas de una muestra biológica para la extracción de ácido nucleico de alta calidad de un para (i) ayudar en el diagnóstico de un sujeto, (ii) monitorear el progreso o la recurrencia de una enfermedad u otra condición médica en un sujeto, o (iii) ayudar en la evaluación de la eficacia del tratamiento para un sujeto que experimenta o está sometido a tratamiento de una enfermedad u otra condición médica; en el que se determina la presencia o ausencia de uno o más biomarcadores en la extracción de ácido nucleico obtenida del método, y uno o más biomarcadores están asociados con el diagnóstico, el progreso o la recurrencia, o la eficacia del tratamiento, respectivamente, de una enfermedad u otra condición médica.
Kits para aislar microvesículas de una muestra biológica
La presente descripción se refiere además a kits para su uso en los métodos descritos en este documento. El kit comprende un aparato de superficie de captura suficiente para separar las microvesículas de una muestra biológica de partículas no deseadas, desechos y pequeñas moléculas que también están presentes en la muestra biológica. La presente descripción también incluye opcionalmente instrucciones para usar los reactivos anteriores en el aislamiento y el proceso de extracción de ácido nucleico posterior opcional.
Ejemplos
Aunque los ejemplos proporcionados en el presente documento usan una variedad de membranas y dispositivos usados para propósitos de centrifugación y/o filtración, debe entenderse que estos métodos pueden usarse con cualquier superficie de captura y/o dispositivo de alojamiento que permita la captura eficiente de microvesículas y liberación de los ácidos nucleicos, particularmente, a Rn , contenidos en ellos.
Ejemplo 1: aislamiento de ADN con EXO52, así como aislamiento conjunto de ARN y ADN
Este ejemplo demuestra la capacidad del método EXO52 para aislar todo el ADN de una muestra de plasma. Cabe señalar que en algunas de las figuras presentadas en este documento, se ha utilizado una terminología diferente para identificar los métodos precursores de los métodos de aislamiento mencionados en el presente documento como EXO52. Por ejemplo, algunas Figuras incluyen términos tales como el antiguo EXO52, EXO52.1 y sus variantes. Estas versiones anteriores se proporcionan únicamente como una comparación y para demostrar el aislamiento superior logrado utilizando los métodos EXO52 de la divulgación. El uso del término EXO52.2 es el método EXO52 en el que la extracción de ARN y ADN se realiza en un solo tubo.
La columna de EXO52 también se puede usar para aislar todo el ADN de una muestra de plasma. En la Figura 1 y la Figura 2 se representan dos métodos para utilizar la columna de EXO52 para el aislamiento de ADN además del a Rn . Específicamente, la diferencia entre los dos procesos es que la extracción de ARN y ADN se combina en un tubo en EXO52, para facilitar la usabilidad, agilizar el protocolo y aumentar la reproducibilidad. La Figura 3 muestra una ganancia de 1,5 Ct en ARN ADN con EXO50 (EXO52). EXO50 es un método para aislar ARN de microvesículas en una muestra biológica tal como, por ejemplo, plasma. Este método se describe en la publicación PCT No. WO2014/107571. La Figura 4 muestra que al aumentar la cantidad de cloroformo durante la separación de fases, agrega el ADN nuevamente a la fase acuosa, de modo que el ADN se aísla con el procedimiento EXO50 normal. La optimización adicional de los niveles de pH durante la separación de fases también agrega el ADN a la preparación, como se muestra en la Figura 5.
Por lo tanto, los métodos de la divulgación se pueden usar para aislar todo el ADN de las muestras de plasma. El ADN se recupera de la fase inferior, hidrófoba de la lisis con QIAzol después de la separación de fases. Los métodos de la divulgación (por ejemplo, dos tubos o un solo tubo como en EXO52) separan el ARN y el ADN a niveles similares para el mismo volumen de muestra, y el ARN y el ADN pueden separarse entre sí. Estos métodos de divulgación capturan el mismo o más ARNm y mucho más miARN que un kit de aislamiento comercialmente disponible, por ejemplo, Qiagen.
El EXO52 también se puede usar para la purificación conjunta de ARN y ADN. Como se usa en el presente documento, EXO52 se refiere al siguiente protocolo, a menos que se especifique lo contrario.
Preparación de la muestra: El procedimiento EXO52 se puede usar para aislar ARN y ADN de exosomas y otras microvesículas usando 0,2 - 4 mL de plasma o suero. Se recomienda usar solo plasma o suero prefiltrado, excluyendo partículas mayores de 0,8 pm. La lista de tubos de plasma compatibles incluye plasma con los aditivos EDTA, citrato de sodio y citrato-fosfato-dextrosa. El plasma que contiene heparina puede inhibir la RT-qPCR.
La muestra, sola o diluida con un tampón de unión, se carga en la columna de centrifugación de EXO52 y se centrifuga durante 1 minuto a 500 x g. Descartar el flujo y colocar la columna nuevamente en el mismo tubo de recolección. Luego se agrega tampón de lavado y la columna de EXO52 se centrifuga durante 5 minutos a 5000 x g para eliminar el volumen residual de la columna. Nota: Después de la centrifugación, la columna de centrifugación de EXO52 se retira del tubo de recolección para que la columna no entre en contacto con el flujo. La columna de centrifugación se transfiere luego a un tubo de recolección nuevo y se añaden 700 pL de Qiazol a la membrana. Luego, la columna de centrifugación se centrifuga durante 5 minutos a 5000 x g para recoger el homogeneizado que contiene los exosomas lisados. El homogeneizado se transfiere luego a un tubo PLG.
Luego, se añaden 350 pL de cloroformo al tubo que contiene el homogeneizado y se agita vigorosamente durante 15 s. El tubo que contiene el homogeneizado se mantiene a temperatura ambiente durante 2-3 minutos, seguido de centrifugación durante 5 minutos a 12.000 x g a 4 °C. Después de la centrifugación, la centrífuga se calienta a temperatura ambiente (15-25 °C) si se utilizará la misma centrífuga para las siguientes etapas de centrifugación.
La fase acuosa superior se transfiere a un nuevo tubo de recolección, evitando la transferencia de cualquier material de la interfase. Luego se agregan 2 volúmenes de etanol al 100% y se mezclan completamente pipeteando hacia arriba y hacia abajo varias veces y sin el uso de una centrífuga. Luego, se pipetean 700 pL de la muestra, incluido cualquier precipitado que se haya formado, hasta una columna de centrifugación RNeasy MinElute en un tubo de recolección de 2 mL (Cat. # 1026497), seguido de centrifugación a 2:8000 xg (2:10.000 rpm) durante 15 s a temperatura ambiente (15-25 °C). El flujo se descarta. Estas etapas se repiten con el resto de la muestra y se descarta el flujo.
El EXO52 es útil para aislar y detectar ADN de muestras biológicas. Se cree que el ARN de las vesículas se deriva de células vivas por ejemplo en el tejido enfermo. Se cree que el ADNc libre de células (ADNlc) se deriva de células moribundas, por ejemplo, células necróticas en el tejido enfermo. Por lo tanto, ADNlc es útil como un indicador de respuesta terapéutica, mientras que el ARN es un indicador de mutaciones de resistencia en aumento.
El EXO52 es útil para la detección de mutaciones raras en la sangre, ya que el EXO52 proporciona un método suficientemente sensible que puede aplicarse en ácidos nucleicos en cantidad suficiente. La cantidad real de moléculas de ADN y ARN en los biofluidos es muy limitada, y EXO52 proporciona un método de aislamiento que extrae todas las moléculas de la sangre que son relevantes para la detección de mutaciones en un volumen lo suficientemente pequeño como para un procesamiento y/o análisis posterior efectivo.
Las Figuras 13-223 (denominadas solamente en este ejemplo como "las Figuras") demuestran la especificidad y sensibilidad de los métodos EXO52.
Los estudios han demostrado que la columna de EXO50/52 une todo el ADN en plasma, pero el procedimiento para extraer el ADN de la fase fenólica no produce resultados satisfactorios, ya que el procedimiento de aislamiento es muy variable. Los métodos proporcionados en este documento permiten un aislamiento y/o extracción de ADN reproducible y eficiente de la membrana de la columna de EXO50/52.
Dos de las tres réplicas del aislamiento con EXO52 con tubo PLG muestran casi los mismos valores de CT que un KIT de ADNlc comercialmente disponible. Una de cada tres réplicas del aislamiento con EXO52 sin tubo PLG muestra casi los mismos valores de CT que el kit de ADNlc. El plasma empobrecido (flujo de EXO50 a través del plasma sin tampón de unión 2x) no contiene mucho ADN (diferencia de 9CT para 18S con respecto al aislamiento normal). Casi todo, el ADN unido a la columna de EXO50.
Como se muestra en las Figuras, agregar cloroformo al método EXO52 permitió el aislamiento conjunto de ARN y ADN, y agregar cloroformo no dañó la detección o el aislamiento de ARN.
Con respecto al aislamiento de ARN, se determinó que agregar más cloroformo no influía en el aislamiento de ARN si se usaban ensayos específicos de ARN. Los ensayos específicos de ADN darán como resultado CT más bajos al agregar más cloroformo porque el ADN está en fase acuosa.
Con respecto al aislamiento de ADN, las CT para los ensayos de detección de ADN aumentaron en el aislamiento en fase acuosa con la adición de más cloroformo y disminuyeron en el aislamiento de ADN en fase fenólica de EXO52.
El aislamiento con EXO50 de la fase fenólica dio como resultado valores CT más bajos (= rendimiento de ADN más alto). 90 |jL de cloroformo dieron como resultado el mejor rendimiento de ADN de la fase fenólica.
Además, sin el tubo PLG, la relación de cloroformo a la cual no se observó contaminación del ADN fue de aproximadamente 0,13x.
Como se muestra en las Figuras, 350 j L de cloroformo fueron suficientes para agregar todo el ADN de la columna de EXO52 a la fase acuosa durante la extracción con PC. Cantidades más altas de cloroformo pueden interferir con el aislamiento de ARN.
Como se muestra en las Figuras, el rendimiento de ADN aumentó en fase acuosa con la adición de más cloroformo, mientras que el rendimiento de ADN disminuyó en fase fenólica (aislamiento de ADN con EXO52). El aislamiento de ADN de la fase acuosa produce más ADN en comparación con el aislamiento de ADN con EXO52 de la fase fenólica. Poco ADN pareció permanecer en la fase fenólica o en la fase acuosa restante después de eliminar la fase superior, ya que es difícil eliminar la fase completa sin usar un tubo PLG. El rendimiento de ADN es similar en la reacción de RT ( l0 j L de eluato de EXO50 en la mezcla final de RT de 20 j L) y eluato de EXO50 diluido 1:2. El ADN no pareció reaccionar con la mezcla de transcripción inversa.
Se repitieron los estudios usando un ensayo de GAPDH solo de ARN para ver si el ensayo de GAPDH solo de ARN se vio afectado por el aumento de la adición de cloroformo. El ARN no se vio afectado con el aumento de la adición de cloroformo. Los estudios también se realizaron utilizando un ensayo GAPDH_ARN_ADN, que no mostró reemplazo de la señal de ARN por el ADN (diferencia de 2 CT).
El ensayo BRAF mostró un aumento de 2x en la señal en la fracción de ARN con EXO50 al tener ADN presente en la fase acuosa. El ensayo GAPDH no mostró un claro efecto aditivo del ADN en la fracción de ARN con EXO50 ya que las copias agregadas fueron mínimas en comparación con las copias de ARN. Con esta clara diferencia entre las copias de ARN y ADN, no se puede mostrar el reemplazo de la señal de ARN.
Se realizaron estudios para determinar el efecto, si lo hubiera, de los cambios de pH en la separación de fases. El ajuste del pH proporciona una herramienta alternativa para agregar ADN a la fase acuosa. Se encontró que un pH demasiado alto interfería con el aislamiento de ARN.
El pH alto parecía molestar a BA. Por ejemplo, el perfil de BA de la muestra de NaOH 10 N mostró el pico de ADN más alto pero muy bajo FU ([FU] = 2 en comparación con [FU] = 40). El pH alto parecía dificultar la reacción de RT. Un aumento del pH de la fase acuosa dio como resultado valores de CT más bajos en el aislamiento de ADN con EXO50, mientras que el aislamiento de ADN con EXO52 dio como resultado valores más altos, pero quedaba una mayor cantidad de ADN en la fase fenólica en comparación con la valoración con cloroformo.
La disminución del pH fue capaz de eliminar el ADN de la fase fenólica de EXO52 y enriquecerlo en la fase acuosa. El ADN no fue dañado en la Rt . El ARN resultó dañado al pH más alto. BA se vio afectado en las tres etapas de pH más alto.
Como se muestra en las Figuras, la adición de cloroformo fue el factor predominante en la determinación del contenido de ADN de la fase acuosa. Se observó un efecto positivo de pH alto solo a niveles bajos de cloroformo. La señal de ARN no se vio afectada por la adición de ADN a la fase acuosa.
Como se muestra en las Figuras, no hubo efecto aditivo de la solución de pH al número de copias de ADN, y tampoco fue necesario un cambio en la cantidad de cloroformo necesaria para llevar el ADN a la fase acuosa. Las muestras incluso dieron como resultado números de copia más bajos en comparación con las muestras procesadas sin solución de pH. Solo las muestras que se procesaron con 90 j L dieron como resultado números de copia más altos. La solución de pH y la mayor cantidad de cloroformo no afectaron el aislamiento de ARN (ARNm). Durante la valoración completa, las muestras que se procesaron con solución de pH dieron como resultado números de copia más bajos (excepto muestras de cloroformo de 90 j L) en comparación con las muestras procesadas sin solución de pH.
Como se muestra en las Figuras, una centrifugación con QIAzol a temperatura ambiente aumentó el porcentaje de material de ADN en la fase acuosa. Este no fue el caso cuando se utilizaron mayores cantidades de cloroformo en el procedimiento EXO52.
Una etapa de centrifugación con Qiazol causó la contaminación del ADN en fase acuosa, pero solo en muestras sin tubo PLG. Las muestras con tubo PLG con etapa de centrifugación a temperatura ambiente también mostraron un poco más de ADN, pero el número de
centrifugación no influyó en el aislamiento de ARNm y miARN.
Una centrifugación con Qiazol a temperatura ambiente no añadió ADN al aislamiento de ADN con EXO52 normal. No hubo diferencia en los valores de CT referidos a la temperatura de centrifugado. La temperatura para la etapa de centrifugación no influyó en el aislamiento de ARNm y miARN.
Como se muestra en las Figuras, la unión y elución de ADN de EXO52 a la columna de centrifugación RNeasy no dependía de la concentración de etanol en el intervalo de volumen 1,5x a volumen 2,6x.
Como se muestra en las Figuras, el rendimiento de EXO52 no aumentó cuando se usó una concentración de etanol más alta. Los valores de CT de los tres ensayos permanecieron constantes durante la valoración completa del etanol. La concentración de etanol en la etapa de acondicionamiento previo del aislamiento de ARN no influyó en la recuperación de ADNlc.
Como se muestra en las Figuras, una digestión con proteinasa K (ProtK) de una muestra de plasma condujo específicamente a la pérdida de señal del ARN, pero el tratamiento con ProtK no influyó en el rendimiento del ADN, ya que se obtuvo la misma CT para todas las muestras.
Como se muestra en las Figuras, la capacidad de carga de ADN de EXO52 no se alcanzó con 8 mL de plasma ya que el rendimiento de ADN seguía aumentando linealmente y no había ADN detectable en el flujo. Esto contrasta con la capacidad de carga lineal de las vesículas, que se alcanza a 4 mL. No se detectó ADNlc en el flujo (FT) pero se observó que el ARN se acumulaba a partir de 2 mL. La salida de la muestra es lineal para el ADN, pero no para el ARN. El ARN tiene un punto de saturación diferente al ADN. Se encontró que agregar un tubo de PLG al procedimiento aumentaba ligeramente el rendimiento. El método EXO52 agregó copias de ARN, en comparación con los kits de CNA comercialmente disponibles.
Los métodos pueden usar un tampón de extracción basado únicamente en tiocianato de guanidinio para extraer ARN y ADN de la columna de EXO52.
Como se muestra en las Figuras para el aislamiento de ARN, 1 de 2 réplicas de RLT DTT alto 56 °C dio como resultado valores de CT esperados. La variación entre las réplicas puede haber sido causada por la obstrucción de la membrana RNeasy después de agregar la mezcla de carga. El perfil de BA mostró una concentración de ARN muy baja en el punto de datos de la columna para RLT DTT alta 56 °C, pero solo un aislamiento de ARN dio como resultado valores CT esperados.
Como se muestra en las Figuras para el aislamiento de ADN, la columna de ADN All-Prep dio como resultado un número de copias muy alto para ensayos de detección de ADN. También en el punto de datos de la columna mostró valores de CT muy altos. La columna de centrifugación de ADN All-Prep pareció perder el ADN debido a un corte alto (15-30 kb). El tamaño de ADNlc está típicamente en el rango de 35 pb -10 kb.
Las Figuras también demuestran el aislamiento de microARN usando diversos procedimientos de aislamiento de ADN o ADN/ARN. El EXO52 aisló más ARNm y muchos más miARN que el kit de CNA comercialmente disponible, y EXO52 y el kit de CNA aislaron la misma cantidad de ADN. El método EXO52 pareció aislar todo el ADN del plasma.
Como se muestra en las Figuras, EXO52 supera constantemente al kit de ácidos nucleicos en circulación (CAN) comercialmente disponible. EXO52 tiene un mejor rendimiento que el kit CNA en tres grupos diferentes de plasma, lotes diferentes del reactivo CNA, diferentes operadores y diferentes fuentes de muestra.
Los métodos EXO52 se usaron para analizar el ADNlc en muestras de una cohorte de melanoma. Los resultados obtenidos usando los métodos EXO52 se compararon con los resultados obtenidos usando un kit de CNA comercialmente disponible. La variación entre ensayos (basada en diferentes puntos de tiempo de aislamiento de la misma muestra de plasma) del kit de CNA fue mayor que la observada usando los métodos EXO52. Como se muestra en las Figuras, el rendimiento de los métodos EXO52 es igual o mejor que los obtenidos con el kit comercialmente disponible.
Como se muestra en las Figuras, quedaba aproximadamente un 15% de ADN en fase orgánica después de la separación de fases con 350 pL de cloroformo. La extracción doble aumentó el rendimiento de ADN en aproximadamente un 15% de puntos. La separación de fases con 90 pL de cloroformo (ARN) seguido de una segunda extracción con 260 pL adicionales (suma: 350 pL de cloroformo) solo dio como resultado aproximadamente 50% de rendimiento de ADN en comparación con la extracción normal de ADN con EXO52. La recarga del material de EXO52 acondicionado en la misma columna no mejoró el rendimiento.
Ejemplo 2. Desarrollo de una plataforma de aislamiento en una sola etapa para el ARN exosómico y el ADN libre de células a partir de plasma canceroso
Los ácidos nucleicos circulantes en el torrente sanguíneo de pacientes con cáncer son de gran interés para la investigación médica debido a su potencial para proporcionar información sobre el estado de la enfermedad del paciente y las opciones de tratamiento sin requerir una biopsia de tejido. Cualquier prueba de diagnóstico que busque utilizar biofluidos para el análisis de mutaciones necesita una plataforma que pueda maximizar la captura de mutaciones derivadas de tumores en la circulación. El plasma sanguíneo contiene al menos dos fuentes de ácidos nucleicos libres de células: ADN circulante libre de células (ADNlc), generado a partir de células apoptóticas o necróticas, y ARN encerrado en vesículas extracelulares que incluyen exosomas (ARNexo), que son secretadas activamente por las células en el cuerpo. Dado que la cantidad total de ácidos nucleicos en los biofluidos es muy limitada y las mutaciones tumorales se reflejan tanto en el ARN como en el ADN, se ideó un método para aislar conjuntamente todo el ARNexo y el ADNlc de las muestras de plasma sanguíneo en un volumen lo suficientemente pequeño para un procesamiento eficaz posterior mediante RT-qPCR y nueva secuenciación dirigida por NGS.
Las Figuras 224-226 ilustran los estudios presentados en el presente documento que demuestran lo siguiente: (i) El plasma sanguíneo contiene ARN libre de células además del ADN libre de células; (ii) EXO52 es un procedimiento rápido, reproducible y conveniente para aislar conjuntamente todo el ARNexo y ADNlc de altos volúmenes de biofluidos; y (iii) el uso de ambos, ARNexo y ADNlc normalmente duplica las moléculas disponibles para la detección de mutantes raros por qPCR y NGS.
Las Figuras 227 y 228 son una serie de gráficos que representan la capacidad de los métodos EXO52 proporcionados en el presente documento para capturar los ácidos nucleicos circulantes totales. Los métodos EXO52 se compararon con un kit de aislamiento de ADN de ácido nucleico circulante comercialmente disponible. Como se muestra en las Figuras 227-228, EXO52 capturó todo el ADNlc, y EXO52 detectó significativamente más copias combinando ARNexo y ADNlc frente a ADNlc solo. La Figura 228 también demuestra que los pacientes fueron identificados como negativos para un biomarcador basándose únicamente en el análisis de ADNlc, pero con el análisis combinado de ADN y ARN, estos pacientes fueron identificados como positivos para el biomarcador. Los expertos habituales en la materia apreciarán que más copias de una mutación u otro biomarcador conducen a una mayor sensibilidad y precisión en la identificación de mutaciones y otros biomarcadores.

Claims (15)

REIVINDICACIONES
1. Un método para extraer ADN y ARN de una muestra biológica que comprende:
(a) proporcionar una muestra biológica;
(b) poner en contacto la muestra biológica con una superficie de captura en condiciones suficientes para retener ADN libre de células y microvesículas de la muestra biológica sobre o en la superficie de captura, en la que la superficie de captura comprende una membrana o una o más perlas que son intercambiadores de aniones con la función amonio cuaternario R-CH2-N+(CH3)3 , o una membrana o una o más perlas que están cargadas positivamente y con la función amonio cuaternario R-CH2-N+(CH3)3 ;
(c) poner en contacto la superficie de captura con un reactivo de lisis a base de fenol mientras el ADN libre de células y las microvesículas están sobre o en la superficie de captura, liberando así el ADN y el ARN de la muestra y produciendo un homogeneizado; y
(d) extraer el ADN, el ARN, o tanto el ADN como el ARN del homogeneizado.
2. El método de la reivindicación 1, en el que la membrana o una o más perlas están cargadas positivamente.
3. El método de la reivindicación 1, en el que la membrana o una o más perlas están cargadas positivamente y un intercambiador de aniones que contiene la función amonio cuaternario R-CH2-N+(CH3)3.
4. El método de la reivindicación 1, en el que la membrana tiene un tamaño de poro de al menos 3 pm.
5. El método de la reivindicación 1, en el que la superficie de captura comprende tres membranas, en el que dichas tres membranas están directamente adyacentes entre sí.
6. El método de la reivindicación 5, en el que las tres membranas son idénticas entre sí.
7. El método de la reivindicación 6, en el que cada membrana está cargada positivamente y/o es un intercambiador aniónico que contiene la función amonio cuaternario R-CH2-N+(CH3)3.
8. El método de la reivindicación 1, en el que la muestra biológica es plasma o suero, opcionalmente en el que la muestra biológica está entre 0,2 y 4 mL.
9. El método de la reivindicación 1, en el que la muestra biológica es orina, líquido cefalorraquídeo o sobrenadante de cultivo celular.
10. El método de la reivindicación 1, en el que la etapa (a) comprende además procesar la muestra biológica filtrando la muestra biológica, opcionalmente en el que la filtración se realiza usando un filtro de 0,8 pm.
11. El método de la reivindicación 1, en el que la etapa (b) comprende además una etapa de centrifugación después de poner en contacto la muestra biológica con la superficie de captura.
12. El método de la reivindicación 1 o la reivindicación 11, en el que la etapa (b) comprende además lavar la superficie de captura después de poner en contacto la muestra biológica con la superficie de captura.
13. El método de la reivindicación 1, en el que la etapa (c) comprende además una etapa de centrifugación después de poner en contacto la superficie de captura con el reactivo de lisis a base de fenol.
14. El método de la reivindicación 1, en el que la etapa (d) comprende además agregar cloroformo al homogeneizado, opcionalmente comprende además agregar un control al homogeneizado antes de agregar cloroformo al homogeneizado.
15. El método de la reivindicación 1, en el que el método comprende además la etapa (e) acondicionamiento con etanol de la extracción de la etapa (d); etapa (f) unión de la extracción acondicionada con etanol a una columna de sílice; y la etapa (g) elución de la extracción de la columna de sílice.
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