TWI790602B - 纖維素系離子交換膜及其製造方法、用於胞外體純化之器件以及胞外體之純化方法 - Google Patents

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Abstract

本發明的課題在於提供一種離子交換膜，將存在於血清等生物體試樣中之胞外體簡便且低成本地分離純化。本發明係一種纖維素系離子交換膜，係纖維素系聚合物的2位、3位及6位的任一位置的至少一部分羥基或乙醯基經具有正電荷之化合物取代。另外，本發明係一種胞外體之純化方法，包括：對前述纖維素系離子交換膜，使包含胞外體之試樣穿透膜，藉此吸附前述胞外體之步驟；使洗淨液接觸於前述膜而去除雜質之步驟；使溶析液接觸於前述膜而使前述胞外體脫附之步驟。

Description

纖維素系離子交換膜及其製造方法、用於胞外體純化之器件以及胞外體之純化方法
本發明係關於一種用以將胞外體(exosome)高純度地純化之離子交換膜。
已知胞外體係由動物、植物、菌類等的真核細胞所釋出之直徑約30nm至150nm之細胞外囊泡，於體液中內包蛋白質、信使核糖核酸(mRNA；messenger ribonucleic acid)、微小核糖核酸(miRNA；micro-ribonucleic acid)等進行傳播等，對細胞間的資訊傳遞表現重要的功能。近年來，啟示了胞外體涉及癌之轉移之亢進、癌之惡化，且開發出以由源自癌之胞外體表現之miRNA作為腫瘤標記來預測癌之進展、確認癌之轉移與預後之生物標記等著眼於胞外體之診斷用標記。
另外，期待藉由將胞外體自生物體分離純化，而作為源自內包細胞內的核酸、蛋白質等之生物之輸送體，應用於藥物遞送系統(DDS；Drug Delivery System)。因此，要求高純度地將胞外體分離純化之技術。
作為將胞外體分離純化之方法，可列舉：離心區分法、密度梯度離心法等超離心法、使用聚乙二醇等聚合物之沈澱法、粒徑篩析層析法、親和層析法等層析法。作為通常的方法，可列舉超離心分離法，有藉由密度梯度離心而獲得高純度的胞外體之情形。然而，超離心分離法有於離心過程中因胞外體之結構變化、破壞而導致品質降低、回收率低等問題。
作為上述之超離心法以外的分離純化法，已知有使用過濾器之過濾法。該方法係使用具有適於分離胞外體之膜孔徑之過濾膜，藉此能夠分離夾雜物與胞外體，因此能夠較超離心法更簡便地進行。然而，過濾器表面會因夾雜物而產生堵塞，因此不適於大量之分離純化，且難以回收由過濾器所捕捉之胞外體。
作為自過濾器以高純度回收胞外體之方法，專利文獻1中揭示有一種使用由多孔質體所構成之穿孔基板之分離回收方法。該發明能夠以高捕捉率回收胞外體，但於回收步驟中，需要超音波振動之賦予、電場施加或壓力施加。
另外，作為以高純度回收胞外體之方法，已知有使用包覆有抗體之磁性珠粒之方法、使用擔載有肽之磁性珠粒之方法(專利文獻2、3)。於使用磁性珠粒之情形時，磁性材料之原料成本增加，回收方法亦產生限制。
另外，專利文獻4中揭示有一種具有離子交換基之纖維素膜。該離子交換膜係作為以下述方式而成之膜揭示，亦即，利用鹼等使乙酸纖維素多孔質膜水解，繼而導入二乙基胺基乙基(DEAE基；diethylaminoethyl group)等陽離子性基。 [先前技術文獻] [專利文獻]
[專利文獻1]國際公開第2017/154951號。 [專利文獻2]日本特開2017-067706號公報。 [專利文獻3]國際公開第2019/039179號。 [專利文獻4]日本特開平7-081022號公報。
[發明所欲解決之課題]
本發明係以解決上述技術問題為目標，本發明的目的在於提供一種能夠將胞外體高純度且低成本地分離純化之離子交換膜。 [用以解決課題之手段]
本發明者進行了銳意研究，結果發現，藉由以下所示之手段而能夠解決上述課題，從而完成了本發明。
亦即，本發明係由以下之構成所組成。 1.一種纖維素系離子交換膜，係纖維素系聚合物的2位、3位及6位的任一位置的至少一部分羥基或乙醯基經具有正電荷之化合物取代。 2.如1所記載之纖維素系離子交換膜，其中前述具有正電荷之化合物為三級胺及／或四級銨。 3.如1或2所記載之纖維素系離子交換膜，其最小孔徑為50nm至600nm。 4.如1至3中任一項所記載之纖維素系離子交換膜，其離子交換容量為0.03meq/g至0.9meq/g。 5.如1至4中任一項所記載之纖維素系離子交換膜，其平均厚度為10μm至1000μm。 6.如1至5中任一項所記載之纖維素系離子交換膜，其於pH6.5至7.5之範圍內所測定之ζ電位為10mV至70mV。 7.如1至6中任一項所記載之纖維素系離子交換膜，其中細孔直徑為30nm以上之細孔的比表面積為8m2 /g以上。 8.如1至7中任一項所記載之纖維素系離子交換膜，其中前述纖維素系離子交換膜為細孔直徑自一表面向另一表面增大之非對稱結構。 9.一種用於胞外體純化之器件，包含如1至8中任一項所記載之纖維素系離子交換膜。 10.一種纖維素系離子交換膜之製造方法，係製造如1至7中任一項所記載之纖維素系離子交換膜，係於製造包含纖維素系聚合物之多孔質基材膜後，將2位、3位及6位的任一位置的至少一部分羥基或乙醯基取代為具有正電荷之化合物。 11.一種胞外體之純化方法，包括：使用如1至7中任一項所記載之纖維素系離子交換膜或如9所記載之器件，使包含胞外體之試樣穿透膜，藉此吸附前述胞外體之步驟；使洗淨液接觸於前述膜而去除雜質之步驟；使溶析液接觸於前述膜而使前述胞外體脫附之步驟。 [發明功效]
本發明的離子交換膜藉由具有於膜厚方向上孔徑自一表面向另一表面擴大或縮小之所謂非對稱結構，能夠控制生物體液中所含之尺寸大之細胞凋亡小體等夾雜物的膜穿透性，並且提高直徑30nm至150nm之胞外體的分離性。進而，藉由含有正電荷基，能夠靜電捕捉負電荷性之胞外體，能夠自培養上清液簡便且高純度地將胞外體分離純化。
本發明係一種纖維素系離子交換膜，係纖維素系聚合物的2位、3位及6位的任一位置的至少一部分羥基或乙醯基經具有正電荷之化合物取代。
本發明中，作為纖維素系聚合物，可列舉：乙酸纖維素、丙酸纖維素、丁酸纖維素、乙酸丙酸纖維素、乙酸丁酸纖維素、乙酸月桂酸纖維素、乙酸油酸纖維素、及乙酸硬脂酸纖維素等，但就容易導入具有正電荷之化合物之方面而言，較佳為使用乙酸纖維素。乙酸纖維素市售有乙酸化度、分子量不同之乙酸纖維素，更佳為使用乙酸化度為52至62左右之乙酸纖維素或三乙酸纖維素。
本發明中，作為具有正電荷之化合物，較佳為使用下述式(I)所表示之三級胺或下述式(II)所表示之四級銨化合物。式中，R1 至R3 表示相同或不同之氫原子、或者碳數1至10之直鏈或支鏈狀烷基，亞甲基之n表示1至5之整數。式中，X表示選自由氟、氯、溴、碘等鹵素原子、甲苯磺酸酯(tosylate)、三氟甲磺酸酯(triflate)、甲磺酸酯(mesylate)等磺酸酯等脫離基、烷氧基矽基、矽烷醇等矽基、環氧基、異氰酸酯基、羧酸基所組成之群組中的1種以上。具有正電荷之化合物可使用任一取代基X，但就容易獲取原料之方面而言，較佳為X具有氯、矽基、環氧基之化合物。
[化1]
Figure 02_image001
[化2]
Figure 02_image003
本發明中，纖維素系離子交換膜可為細孔直徑自一表面向另一表面大致固定之所謂均質膜，亦可為細孔直徑自一表面向另一表面連續或不連續地變化之所謂非對稱膜。另外，前述離子交換膜的最小孔徑較佳為50nm至600nm。非對稱膜中，最小孔徑層較佳為位於任一表面附近。若最小孔徑大，則有胞外體與膜面及／或細孔表面之接觸機率降低，被處理液中的胞外體的吸附率變低之情況。另外，有無法去除細胞屑或細胞凋亡囊泡之情況。另一方面，若最小孔徑小，則有進入至膜內部之胞外體的回收率降低，或回收需要時間之情況。因此，最小孔徑更佳為55nm至400nm，進而較佳為60nm至300nm。此外，最小孔徑係將於如後述般使用聚苯乙烯粒子分散液進行測定時，阻擋率成為80%以上之聚苯乙烯粒徑設為離子交換膜的最小孔徑。
另外，前述離子交換膜的表面(不具有最小孔徑層之側的表面)的平均孔徑較佳為100nm以上至5000nm以下。若表面的平均孔徑小，則有處理速度變慢之情況。另外，若表面的平均孔徑大，則有不吸附於膜而漏出之胞外體量變多而回收率降低之情況。另外，若表面的平均孔徑過小或過大，則有無法發揮深度過濾的效果之情況。此外，表面的平均孔徑可如後述般基於使用掃描式電子顯微鏡(SEM；Transmission Electron Microscopy)以倍率1000倍至20,000倍拍攝膜的表面(一表面及另一表面)所得之照片，藉由圖像處理軟體Image J來算出。
本發明中，被處理液可利用錯流進行處理，亦可利用端點(dead-end)進行處理。另外，於使用非對稱膜之情形時，可對大孔徑側導入被處理液，亦可對小孔徑側導入被處理液。例如，培養上清液等固形成分濃度低且胞外體濃度高之生物體試樣中，如圖1所示，將孔徑大之面設為一次側，將孔徑小之面設為二次側，藉此即便於將生物體試樣負載於膜而使胞外體荷電吸附於膜時，亦能夠防止因所吸附之胞外體而導致膜的細孔堵塞。另一方面，血清、血漿、尿或乳等固形成分濃度相對於胞外體濃度相對較高之生物體試樣中，將孔徑小之面設為一次側，將孔徑大之面設為二次側，藉此能夠藉由表層過濾去除夾雜物，能夠防止因細孔的完全閉塞而導致膜堵塞(參照圖1)。
本發明中，纖維素系離子交換膜的離子交換容量較佳為0.05meq/g至1.5meq/g。若離子交換容量小，則膜的ζ電位無法穩定地表現充分的值，如胞外體般擴散係數小之純化對象物質中，無法使樣品中的粒子充分地吸引至膜，吸附量變小，需要大容量的器件。另一方面，若離子交換容量大，則有膜的強度不足之情形、或膜的每單位體積的吸附量過度變大而產生膜堵塞之情形。此外，於使用三級胺化合物之情形時，離子交換容量較佳為膜每單位重量為0.03meq/g至0.9meq/g。另外，於使用四級銨化合物之情形時，離子交換容量較佳為膜每單位重量為0.03meq/g至0.4meq/g。
本發明中，纖維素系離子交換膜的形態可為平板膜，亦可為中空纖維膜，膜的厚度較佳為10μm至1000μm。若膜的厚度薄，則有膜的強度不足而產生製膜或器件製作中的操作上的問題之情況。另一方面，若膜的厚度厚，則有回收胞外體需要時間或回收率降低之情況。因此，膜的厚度更佳為10μm至500μm，進而較佳為10μm至300μm。另外，於中空纖維膜之情形時，內徑較佳為50μm至1000μm。若內徑小，則流過中空部之液體的剪切應力變大，因此有對胞外體造成損傷之情況。另一方面，若內徑大，則有各器件之膜面積變小之情況。因此，內徑更佳為100μm至700μm，進而較佳為100μm至500μm。
本發明中，纖維素系離子交換膜的ζ電位於pH6.5至7.5之條件下較佳為10mV至70mV之範圍，更佳為15mV至65mV之範圍，進而較佳為20mV至60mV。於ζ電位低於10mV之膜中，有對擴散係數低之胞外體之吸附力弱，無法獲得充分的吸附性之情況。於ζ電位高於70mV之膜中，有引起膜強度降低之情形，另外，於將如胞外體之粒子設為純化對象之情形時，若膜每單位體積的吸附量過度變大，則有引起膜堵塞之情形。前述纖維素系離子交換膜的ζ電位可使用平板ζ電位測定用池進行測定。
本發明中，關於纖維素系離子交換膜的比表面積，細孔直徑為30nm以上之細孔的比表面積的合計較佳為8m2 /g以上，更佳為15m2 /g以上，進而較佳為20m2 /g以上。若比表面積小，則有無法獲得胞外體的充分的吸附量之情況。比表面積通常藉由氣體吸附法或壓汞法而測定。氣體吸附法能夠檢測出約2nm以下之微孔及2nm至50nm之間隙孔的比表面積，相對於此，壓汞法能夠檢測出間隙孔及50nm以上之大孔。關於比表面積，為了確保胞外體的吸附量而以大為佳，但由於胞外體無法進入至細孔直徑未達30nm之孔內部，故而為了增大膜的每單位體積的胞外體的吸附量，必須使由細孔直徑為30nm以上之間隙孔及大孔所構成之比表面積充分大。此外，雖細孔的比表面積過大不會成為問題，但較佳為150m2 /g以下，更佳為120m2 /g以下。
另外，離子交換膜的孔隙率較佳為40%以上。若孔隙率過小，則胞外體所吸附之區域變少，反之，若孔隙率過大，則有無法保持膜的強度之情況。因此，孔隙率更佳為45%以上至90%以下，進而較佳為50%以上至85%以下，進而更佳為55%以上至85%以下。
於將本發明的離子交換膜用於胞外體之分離純化時，較佳為將ζ電位、比表面積、及孔隙率等調整為特定的範圍。胞外體係如前述般大小為30nm至150nm且表面具有負電荷之細胞外囊泡。例如，於使生物體試樣或細胞培養上清液中的胞外體高效率地吸附脫附之情形時，若細孔過小(微孔過多)，則胞外體無法進入至細孔內，因此即便增大膜面積(比表面積)，亦無法獲取吸附區域(吸附容量)。另外，若細孔過大(大孔過多)，則有膜表面與胞外體之距離過遠而電性吸引力變得不易發揮作用，或直徑超過150nm之細胞外囊泡進入至細孔內，而目標之胞外體的吸附效率降低之情況。另一方面，離子交換膜有以具有一定程度的微孔為佳之情形。於生物體試樣或細胞培養上清液中包含大量各種小分子量物質，這些之中亦存在大量具有電荷之物質。藉由使此種小分子量物質吸附於微孔內，能夠將間隙孔或大孔的吸附部位有效地利用於胞外體之吸附。細孔直徑未達30nm之細孔的比表面積較佳為30m2 /g以上至80m2 /g以下。
以下，對本發明的纖維素系離子交換膜之製造進行說明。
本發明中，離子交換膜之製造可使用導入有離子交換基之聚合物進行製膜，亦可於製造纖維素系多孔質基材膜後導入離子交換基。作為後者的示例，對以下之方法進行說明，亦即，於製造包含纖維素系聚合物之多孔質基材膜後，將2位、3位及6位的任一位置的至少一部分羥基或乙醯基取代為具有正電荷之化合物，藉此獲得纖維素系離子交換膜。
本發明中，包含纖維素系聚合物之多孔質基材膜可使用將纖維素系聚合物與溶劑及非溶劑混合而製作製膜溶液後，使之以中空狀噴出，並於空氣中進行乾燥之方法(乾式法)；導入至凝固浴中使之凝固之方法(濕式法)；使溫度急遽變化之方法(熱誘發型相分離法)；延伸法等。可使用任一種方法，但於噴出製膜溶液後於凝固浴中使之凝固之乾濕式法，就製膜管理的容易性及不需要複雜設備等而言較佳。另一方面，平板膜係將纖維素系聚合物溶解於溶劑，將溶液均勻地塗佈於玻璃等基材，浸漬於凝固液而使之凝固後，進行洗淨，視需要進行乾燥，藉此能夠製作多孔質基材膜。作為製膜溶液中的纖維素系聚合物的濃度，較佳為5wt%至40wt%之範圍，更佳為10wt%至35wt%之範圍。
作為用於製備製膜溶液之溶劑，只要為使纖維素系聚合物溶解之溶劑，則無限制，但較佳為商業上容易獲取且於製膜時具有適度的黏性之γ-丁內酯、N-甲基吡咯啶酮、二甲基乙醯胺等極性溶劑。前述溶劑可直接單獨使用，亦可混合使用。另外，亦可視需要添加水、甘油、乙二醇、三乙二醇、聚乙二醇(200、400)等非溶劑。製膜溶液中的溶劑與非溶劑的混合比(溶劑/非溶劑)較佳為90/10至10/90。
本發明中，凝固液較佳為使用由溶劑、非溶劑及水所構成之混合液。另外，凝固液中的溶劑／非溶劑比較佳為與製膜溶液中的溶劑／非溶劑比一致。藉由使製膜溶液與凝固液之溶劑／非溶劑比一致，於連續製膜時亦能夠抑制凝固液的組成變動。於平板膜之情形時，N-甲基吡咯啶酮與水之混合溶液的重量比較佳為30：70至50：50之範圍，更佳為40：60至50：50之範圍內。藉由將凝固浴設為此種組成，最初接觸於凝固浴之側的膜表面的孔徑相較於與基材之接觸面側的膜表面的孔徑變大，相對於厚度方向形成非對稱結構。若凝固浴中的N-甲基吡咯啶酮的濃度為25%以上至未達30%，則最初接觸於凝固浴之側的膜面的孔徑和與基材之接觸面側的膜表面的孔徑相等，存在膜的非對稱結構得到緩和之傾向。進而，若凝固浴中的N-甲基吡咯啶酮的濃度未達25%，則於最初接觸於凝固浴之側的膜面容易形成無明確孔之緻密層。凝固液的溫度較佳為5℃至60℃。
針對所獲得之多孔質基材膜，利用溫水進行洗淨而去除過量的溶劑等。洗淨後的多孔質基材膜可於水中保存，亦可於細孔內填充甘油水溶液等細孔保持劑後，進行乾燥。
針對前述所獲得之多孔質基材膜，其次進行導入離子交換基之處理。具體而言，進行脫乙醯化處理後，進行對羥基之荷電賦予處理。作為一例，作為將纖維素系多孔質基材膜的羥基取代為正電荷性基而製作陽離子性纖維素膜(離子交換膜)之方法，可將前述纖維素系多孔質基材膜於鹼存在下浸漬於非溶解性溶劑中，滴加具有正電荷之化合物之溶液，於加熱條件下使之反應，利用醇進行驟冷，藉此進行製作。
作為前述非溶解性溶劑，只要為不使纖維素系多孔質基材膜溶解且使具有正電荷之化合物溶解之溶劑，則並無特別限制。例如，水、四氫呋喃(THF；tetrahydrofuran)、二甲基亞碸(DMSO；dimethylsulfoxide)、二甲基甲醯胺(DMF；dimethylformamide)等為較佳例，可根據原料的溶解性單獨或混合使用。
作為用於脫乙醯化之鹼，可使用氫氧化鋰、氫氧化鉀、氫氧化鈉、氫氧化銫等氫氧化物、及碳酸鹽、有機胺等。當中，較佳為使用工業上廉價的氫氧化鈉。作為所使用之鹼的濃度，較佳為0.05質量%至5.0質量%之範圍。另外，相對於膜重量，較佳為1.0質量%至10.0質量%之範圍。若鹼的濃度低，則無法增加荷電基的導入量，無法增大每單位體積的胞外體吸附量。另一方面，若鹼的濃度高，則膜的膨潤度變大，因此於荷電基導入後的離子交換膜中無法保持基材膜的結構(細孔直徑)及物性(膜強度)。因此，鹼的濃度更佳為0.1質量%至2.5質量%，進而較佳為0.2質量%至2.0質量%。
作為上述反應溫度，較佳為50℃至80℃，更佳為50℃至70℃。若反應溫度低，則有因反應不足而引起正電荷基的取代率降低之情形。於反應溫度高之情形時，有膜發生熱變形之情形。
可藉由上述具有正電荷之化合物的添加量來控制對纖維素膜之荷電基賦予量。例如，於使用含環氧基之三級胺化合物之情形時，非溶解性溶劑中的上述三級胺化合物的濃度較佳為0.01mol/l至3.0mol/l之範圍，更佳為0.02mol/l至1.5mol/l之範圍。該情形時，離子交換容量以纖維素膜每單位重量計相當於0.05meq/g至0.9meq/g。於使用含環氧基之上述四級銨化合物之情形時，非溶解性溶劑中的上述四級胺化合物的濃度較佳為0.01mol/l至1.0mol/l之範圍，更佳為0.02mol/l至0.5mol/l之範圍。該情形時，離子交換容量以纖維素膜每單位重量計相當於0.05meq/g至0.4meq/g。若正電荷的荷電基賦予量過多，則聚合物每1分子的正電荷基的含量變高，因此有水溶性變高，於水中的膜強度變弱之情形。另外，若正電荷的荷電基賦予量過小，則有胞外體的捕捉效率變低之情形。
本發明中，離子交換膜較佳為設為收容於容器內之器件的形態，前述容器具備：導入口，用以導入被處理液；及排出口，用以排出經離子交換處理之被處理液。該器件具有由離子交換膜分隔之第1室及第2室，導入至第1室之被處理液穿透離子交換膜而移動至第2室。此時，被處理液中的胞外體吸附於離子交換膜的表面及細孔表面。
本發明中，作為使用離子交換膜將胞外體分離純化之方法，較佳為經過如下步驟：使包含胞外體之試樣(被處理液)穿透纖維素系離子交換膜來吸附前述胞外體之步驟、使洗淨液接觸於前述纖維素系離子交換膜而去除雜質之步驟、使溶析液接觸於前述纖維素系離子交換膜而使前述胞外體脫附之步驟。
作為包含胞外體之試樣(被處理液)，並無特別限定，可將培養上清液(細胞培養液)、血液(血清、血漿)、尿、腦脊髓液、淋巴液、腹水、乳等、以及均質化提取液等設為對象。
使胞外體吸附於纖維素系離子交換膜之條件並無特別限定，只要使包含胞外體之被處理液利用如前述之錯流過濾或端點過濾接觸於前述離子交換膜即可。本發明中，胞外體係利用藉由該胞外體的表面負電荷而荷電吸附於具有正電荷之離子交換膜(陰離子交換膜)之機制，但若過濾速度過快，則有對通過前述膜的內部之胞外體造成損傷之情況，因此較佳為設為0.3mL/min/cm2 至100mL/min/cm2 。
使胞外體吸附之前述離子交換膜亦吸附被處理液中所含之雜質(藉由荷電吸附或疏水性相互作用進行吸附之蛋白質等)，因此為了提高所回收之胞外體的純度，較佳為進行洗淨處理。作為洗淨處理所使用之洗淨液，較佳為使用緩衝液或包含低濃度之生理鹽水之緩衝液。緩衝液例如可列舉：檸檬酸緩衝液、磷酸緩衝液、三羥甲基胺基甲烷緩衝液、磷酸緩衝生理鹽水等。
針對進行洗淨而去除了雜質之離子交換膜，其次為了使吸附於離子交換膜之胞外體溶出而進行使之接觸於溶析液之處理。荷電吸附於離子交換膜之胞外體可藉由使鹽濃度或pH變化而容易地脫離。於使用鹽溶液作為溶析液之情形時，較佳為使用氯化鈉水溶液。於使用氯化鈉水溶液之情形時，只要為接近生物體的電解質濃度之濃度範圍即可，例如較佳為0.1mol/L至1.5mol/L之範圍。若鹽濃度低，則有無法使胞外體溶出之情況。另外，若鹽濃度高，則有利用洗淨未完全去除之雜質溶出而所回收之胞外體的純度降低之情況。胞外體的回收率較佳為70%以上。 [實施例]
以下示出實施例具體地說明本發明，但本發明並不限定於實施例。
[多孔質基材膜之製作] [製造例1] 將乙酸纖維素(Sigma-Aldrich公司製造，分子量5000，取代度2.45)11質量%、γ-丁內酯(Nacalai Tesque公司製造)53質量%、N-甲基吡咯啶酮(以下，有時簡稱為NMP)(Nacalai Tesque公司製造)36質量%均勻地溶解，製作製膜溶液。將製膜溶液脫氣2小時後，於室溫、相對濕度62%之條件下，使用將間隙設定為0.2mm之敷料器，將上述溶液於玻璃板上均勻地攤開。連同玻璃板一起靜靜地投入至凝固液(NMP/水(RO(reverse osmosis；反滲透)水)＝48/52)，使之凝固。凝固結束後，自凝固液提起膜，進行水洗而獲得多孔質基材膜1。
[製造例2] 作為凝固液之NMP/水(RO水)的混合比，使用55/45，除此以外，藉由製造例1記載之方法獲得多孔質基材膜2。
[製造例3] 作為凝固液之NMP/水(RO水)的混合比，使用60/40，除此以外，藉由製造例1記載之方法獲得多孔質基材膜3。
[離子交換膜之製作] [實施例1] 將上述製造例1中所獲得之多孔質基材膜1於室溫下於0.4質量%氫氧化鈉水溶液中浸漬4小時，實施脫乙醯處理。針對所獲得之膜，將相對於膜重量為5質量%之氫氧化鈉作為觸媒，以氫氧化鈉濃度成為0.3質量%之方式添加水，使膜浸漬於當中。將縮水甘油基三甲基氯化銨(GTMAC，東京化成公司)的添加量設為0.15mol/l，於65℃下反應4小時而使膜陽離子化，製作離子交換膜1。
[實施例2] 使用上述製造例2中所獲得之多孔質基材膜2，除此以外，藉由與實施例1相同的方法製作離子交換膜2。
[實施例3] 使用上述製造例3中所獲得之多孔質基材膜3，除此以外，藉由與實施例1相同的方法製作離子交換膜3。
[實施例4] 將縮水甘油基三甲基氯化銨的添加量設為0.23mol/l，除此以外，藉由與實施例1相同的方法製作離子交換膜4。
[實施例5] 使用N,N-二乙基-N-縮水甘油胺(DOA，Enamine公司)代替縮水甘油基三甲基氯化銨，除此以外，藉由與實施例1相同的方法製作離子交換膜5。
[實施例6] 使製造例1中所獲得之多孔質基材膜於6質量%氫氧化鈉水溶液(20℃)中膨潤後，加入至氫氧化鈉與N,N-二乙基-N-縮水甘油胺的重量比為4：7、氫氧化鈉與N,N-二乙基-N-縮水甘油胺的合計重量的水溶液濃度為4質量%之浴中，以浴溫度75℃使之反應20分鐘。反應結束後，利用脫離子水進行洗淨而使之乾燥，獲得離子交換膜6。
[粒子之阻擋率評價] 使用聚苯乙烯粒子之分散液評價多孔質基材膜及離子交換膜的阻擋率。使各種尺寸的聚苯乙烯粒子分散於0.01質量%、Tween20水溶液中而獲得溶液，使所得溶液以操作壓10kPa穿透膜，獲得穿透液。以250nm之吸光度測定原本的溶液及穿透液中的聚苯乙烯粒子濃度，藉由下述式算出阻擋率。 阻擋率(%)＝{1－(Ca－Cb)/Ca}×100 Ca：原本的溶液的聚苯乙烯粒子濃度。 Cb：穿透液的聚苯乙烯粒子濃度。 使用粒徑為79nm、132nm、208nm、262nm、313nm、420nm、460nm、616nm之聚苯乙烯進行阻擋率之測定，將阻擋率成為80%之聚苯乙烯粒徑設為最小孔徑。 製造例1至製造例3中所製作之各多孔質基材膜的阻擋率示於表1。
[表1]
  NMP/水 聚苯乙烯粒子阻擋率(%) 最小 孔徑 表面孔徑 膜厚 膜結構
79 nm 132 nm 208 nm 262 nm 313 nm 420 nm 460 nm 616 nm 小孔 徑側 大孔 徑側
nm nm nm μm
基材膜1 48/52 - 0 0 80 100 - - - 262 395 463 106 非對稱
基材膜2 55/45 - - - 20 85 90 100 100 300 602 817 98 ↑
基材膜3 60/40 - - - - 10 40 50 90 560 890 1215 102 ↑
[膜之結構觀察] 將上述所獲得之膜載置於SEM用試樣台而於室溫使之乾燥，進行鉑蒸鍍，利用掃描式電子顯微鏡(日立製造 SU-1500)進行觀察。
[膜的大孔徑側的平均孔徑之測定] 針對以10000倍觀察之膜的前述表面SEM圖像，按照以下的順序測定大孔徑側的平均孔徑。於圖像處理軟體ImageJ上打開圖像，自工具列使用直線工具在比例尺之範圍內劃線，選擇Analyze＞Set Scale，對「Known Distance」輸入比例尺的長度，對「Unit of length」輸入單位。以Image＞Adjust＞Auto Threshold，Method之模式設定為Default，選擇OK而進行二值化。以Analyze＞Set Measurements，確認勾選「Feret's diameter」，按下OK。以Analyze＞Analayze Particles，將「Size(pixel^2)」設為0-Imfinity，確認勾選「Display results」「Exclude on edges」「Include holes」之各框，選擇OK，以Results畫面獲得費雷特直徑(Feret Diameter)之測定資料。為了消除15像素以下之雜訊，以與Feret直徑相同的單位計算相當於15像素之長度，將15像素以下之值消除，而算出費雷特直徑的平均值。
[離子交換容量之測定] 離子交換容量測定係以下述方式測定。製備0.1質量%之溴酚藍(BPB；bromophenol blue)水溶液，使膜浸漬1小時而進行染色。將染色後的膜水洗後，浸漬於8質量%氯化鈉水溶液而使吸附於膜之BPB溶出。測定溶出有BPB之8%氯化鈉水溶液的590nm吸光度，算出吸附於陽離子化膜之莫耳數。
[ζ電位之測定] 膜的ζ電位係對Zetasizer Nano ZS(Malvern公司製造)安裝平板ζ電位測定用池(ZEN1020)，於pH6.5至7.5之離子交換水中測定氧化鋁粒子的遷移率而算出。
[比表面積及孔隙率之測定] 比表面積及孔隙率係使用細孔分佈測定裝置[AutoPore V9620(Micromeritics公司製造)]，於以下之條件下測定。 採取試樣0.06g至0.08g置於標準池(容積6mL)中，於初期壓2.2kPa(相當於細孔直徑約560μm)之條件下測定。水銀參數係將裝置預設之水銀接觸角設定為130.0度、水銀表面張力設定為485.0dynes/cm。細孔分佈係相對於細孔直徑繪製滲透至樣品內之水銀的Log微分體積的推移，獲得細孔分佈曲線。另外，由藉由DA(Dubinin-Astakhov)法所獲得之細孔體積求出孔隙率。 比表面積係測定相對於各模式徑D之細孔體積V，根據下述式求出相對於各模式徑D之比表面積S，根據0.03μm至500μm範圍的總和算出總比表面積。 S＝4V/D
[使用培養上清液之胞外體之回收] 將HEK-293細胞之培養液進行低速度離心，去除游離細胞而獲得上清液。將實施例及比較例中所獲得之膜(直徑25mm)固定於固持器，使培養上清液以穿透速度2mL/min之速度穿透。繼而，通入三羥甲基胺基甲烷磷酸緩衝液(5mL)，去除膜內部的雜質後，通入0.8M之氯化鈉水溶液(10mL)。通液後的氯化鈉水溶液中的胞外體的回收率係藉由下述方式而求出：利用奈米粒子解析系統(NanoSight，Malvern Panalytical)測定處理前後的10nm至900nm的粒子數。源自HEK-293細胞之上清液中以2×109 個/ml之濃度包含胞外體。
[比較例1] 使用製造例1的多孔質基材膜1，實施胞外體的回收測試。
[比較例2] 將源自HEK-293細胞之培養液進行低速度離心，去除游離細胞而獲得上清液。將上清液以150,000×g進行3小時超離心，使顆粒再懸浮於三羥甲基胺基甲烷緩衝液。
[比較例3] 將非溶解性溶劑設為水：DMSO＝1：1，將縮水甘油基三甲基氯化銨的添加量設為6mol/l，除此以外，藉由與實施例1相同的方法製作離子交換膜。
[比較例4] 使用Advantech公司(C300A047A)作為多孔質基材膜，除此以外，藉由與實施例1相同的方法製作離子交換膜。
[比較例5] 將縮水甘油基三甲基氯化銨的添加量設為0.01mol/l，除此以外，藉由與實施例1相同的方法製作離子交換膜。
使用實施例1至實施例6及比較例1、比較例3、比較例4、比較例5中所獲得之膜之各種試驗結果及比較例2中所獲得之結果匯總於表2。
[表2]
  反應時的鹼濃度 具有正電荷之化合物 離子交換容量 反應中的膜的膨潤 ζ電位 比表面積 (30nm以上) 比表面積 (未達30nm) 孔隙率 胞外體回收率
HEK培養上清液
質量% meq/g mV m2 /g m2 /g % %
實施例1 0.3 GTMAC 0.2 未達10% 41 52 66 72 44
實施例2 0.3 ↑ ↑ ↑ 43 38 53 77 38
實施例3 0.3 ↑ ↑ ↑ 44 28 39 83 36
實施例4 0.3 ↑ 0.3 ↑ 49 53 74 72 50
實施例5 0.3 DOA 0.1 ↑ 34 51 71 72 78
實施例6 4.0 ↑ 0.8 12% 57 49 69 72 65
比較例1 - - - - - - - - 3
比較例2 - - - - - - - - 10
比較例3 0.3 GTMAC 3.0 膠狀(膜結構崩解) 無法測定 無法測定 無法測定 無法測定 無法測定
比較例4 0.3 DOA 0.1 未達10% 34 3 9 79 25
比較例5 0.3 GTMAC 0.03 未達10% 2至9 52 66 72 9
由表2之結果可明顯看出，實施例的離子交換膜由於細孔結構(微孔至大孔)與非對稱性之平衡優異，且具有適當的離子交換容量，故而顯示高胞外體回收率。另外，如圖2所示，確認到製造例1的多孔質基材膜為於基檯面側與空氣面側孔徑不同，於膜剖面方向上細孔直徑變化之非對稱結構。另外，由圖3可明顯看出，本發明中，在導入荷電基之前後，膜結構無膨潤等大變化(圖3)。另一方面，比較例1的多孔質基材膜1或許由於胞外體對膜之吸附量少，故而成為回收率低之結果。比較例3的膜的離子交換容量過大而無法維持膜形狀。比較例4的膜或許由於間隙孔至大孔之比率(比表面積)過低，故而無法獲得充分的胞外體的回收率。比較例5的膜或許由於離子交換容量及ζ電位過低，故而無法獲得充分的胞外體的回收率。 [產業可利用性]
藉由本發明，能夠將生物體試樣中所含之胞外體簡便且低成本地純化分離。
1:離子交換膜 2:雜質(大) 3:胞外體 4:雜質(小)
[圖1]係表示使用本發明的離子交換膜之胞外體分離的概念之示意圖。 [圖2]係製造例1的多孔質基材膜的掃描式電子顯微鏡照片。 [圖3]係本發明的離子交換膜的掃描式電子顯微鏡的照片。

Claims (9)

  1. 一種纖維素系離子交換膜，係用以將胞外體分離純化，纖維素系聚合物的2位、3位及6位的任一位置的至少一部分羥基或乙醯基經具有正電荷之化合物取代；離子交換容量為0.1meq/g至0.9meq/g；於pH6.5至7.5之範圍內所測定之ζ電位為10mV至70mV。
  2. 如請求項1所記載之纖維素系離子交換膜，其中前述具有正電荷之化合物為下述式(I)所表示之三級胺及/或下述式(II)所表示之四級銨；
    Figure 110114617-A0305-02-0023-1
    Figure 110114617-A0305-02-0023-2
     式中，R1至R3表示相同或不同之氫原子、或者碳數1至10之直鏈或支鏈狀烷基；亞甲基之n表示1至5之整數；X表示選自由氟、氯、溴、碘等鹵素原子、甲苯磺酸酯、三氟甲磺酸酯、甲磺酸酯、烷氧基矽基、矽烷醇、環氧基、異氰酸酯基、羧酸基所組成之群組中的1種以上。
  3. 如請求項1或2所記載之纖維素系離子交換膜，其最小孔徑為50nm至600nm。
  4. 如請求項1或2所記載之纖維素系離子交換膜，其平均厚度為10μm至1000μm。
  5. 如請求項1或2所記載之纖維素系離子交換膜，其中細孔直徑為30nm以上之細孔的比表面積為8m2/g以上。
  6. 如請求項1或2所記載之纖維素系離子交換膜，其中前述纖維素系離子交換膜為細孔直徑自一表面向另一表面增大之非對稱結構。
  7. 一種用於胞外體純化之器件，包含如請求項1至6中任一項所記載之纖維素系離子交換膜。
  8. 一種纖維素系離子交換膜之製造方法，係製造如請求項1至6中任一項所記載之纖維素系離子交換膜，係於製造包含纖維素系聚合物之多孔質基材膜後，將2位、3位及6位的任一位置的至少一部分羥基或乙醯基取代為具有正電荷之化合物。
  9. 一種胞外體之純化方法，包括：使用如請求項1至6中任一項所記載之纖維素系離子交換膜或如請求項7所記載之用於胞外體純化之器件，使包含胞外體之試樣穿透前述纖維素系離子交換膜，藉此吸附前述胞外體之步驟；使洗淨液接觸於前述纖維素系離子交換膜而去除雜質之步驟；使溶析液接觸於前述纖維素系離子交換膜而使前述胞外體脫附之步驟。
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