KR20170141245A - 사이즈 기반 분리를 위한 아가로스 초여과 멤브레인 복합체 - Google Patents

사이즈 기반 분리를 위한 아가로스 초여과 멤브레인 복합체 Download PDF

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이엠디 밀리포어 코포레이션
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Abstract

본 발명에 기술된 실시예들은 아가로스 초여과 멤브레인 복합체 및 그를 제조하고 사용하기 위한 방법에 관한 것이다.

Description

사이즈 기반 분리를 위한 아가로스 초여과 멤브레인 복합체
본 출원은 2015년 8월 17일자 출원된 미국 가특허 출원 제62/205,859호 및 2015년 12월 16일자 출원된 미국 가특허 출원 제62/268,220호를 우선권 주장한 것으로, 이들은 본 명세서에 전체적으로 채용되어 있다.
본 발명에 기술된 실시예들은 다공성 지지 멤브레인상에 아가로스(agarose) 층을 포함하는 신규한 초여과 복합체 구조 및 이와 같은 초여과 복합체 구조를 제조하기 위한 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명에는, 예컨대, 생물약제 용액으로부터 바이러스를 제거하기 위해, 이러한 초여과 복합체 구조를 사용하기 위한 방법이 기술되어 있다.
초여과(ultrafiltration) 멤브레인들은 전형적으로 압력-구동 여과 공정에 사용된다. 제조된 치유 제품의 필요한 안전성을 제공하기 위해 바이러스 제거 멤브레인 필터들이 바이오테크 산업에 널리 사용되고 있다. 이들 필터는 치유 제품을 포함하는 공급 장치(feed)에 존재할 수 있는 높은 비율의 바이러스들을 유지하는 것으로 여겨지고, 제품은 멤브레인을 통해 유동한다.
초여과(UF) 멤브레인들은 일차적으로 단백질, DNA, 바이러스, 탄수화물, 및 자연 또는 합성 중합체들과 같은 가용성 고분자들을 농축 또는 다이아필터하기 위해 사용된다. 많은 적용 분야에 있어서, 초여과는 접선 유동 여과(TFF) 모드에서 수행되며, 공급 용액은 멤브레인 표면을 가로질러 통과되며 멤브레인의 기공 크기보다 작은 분자들은 통과(여과)하고 잔여물(시료;retentate)은 멤브레인의 상류측에 남는다. 유체가 멤브레인을 통과할 때, 효율적인 TFF 동작을 유지하기 위해 재순환하거나 또는 시료 유동에 부가할 필요가 있다. TFF 방법을 사용하는 하나의 이점은 유체가 멤브레인의 면을 가로질러 일정하게 스위프(sweep)하기 때문이며, 이는 멤브레인의 긴 수명으로 이어지는 멤브레인 표면 또는 그 부근에서 용질의 파울링(fouling) 및 분극(polarization)을 감소시키는 경향이 있다.
초여과 멤브레인들은 일반적으로, 종종 멤브레인 구조의 영구적 부분으로 되는 지지부상의 대부분에 형성된 노출된 비대칭 멤브레인들이다. 상기 지지부는 부직물(non-woven fabric), 또는 미리형성된 멤브레인일 수 있다. UF 멤브레인은 침지 주조법(immersion casting method)에 의해 제조되며 노출되고 비대칭이다. 초기의 상업적 적용 분야는 단백질 농축에 관련되었고 멤브레인들은 예컨대 이들이 멤브레인의 분획 분자량 정격(MWCO: molecular weight cutoff rating of the membrane)을 유지하도록 하는 단백질의 분자량에 의해 정격화되었다.
단백질을 갖는 시험에 기초한 초여과 멤브레인 정격은 계속 행해지는 반면, 통상적인 방법은, 다당류(Dextrans) 또는 폴리에틸렌 글리콜과 같은 좁은 분자량 분포를 갖는 비단백질 고분자(non-protein macromolecules)을 사용한다((예컨대, “A rejection profile test for ultrafiltration membranes and devices", Biotechnology 9(1991) 941-943) 참조)).
침지 주조(immersion casting)에 의한 초여과 멤브레인 제조 방법은 잘 알려져 있다. 간결한 언급이 “Microfiltration and ultrafiltration: Principles and Applications"; 마르셀 데커(1996); 엘. 제이. 제만 및 에이. 제이. 지드니, 에디터들에 주어진다. 하나의 예시적 제조 방법은 다음 단계들로 구성하도록 기술된다.
a) 특정 및 잘 제어된 중합체 용액의 제조;
b) 기판상에 얇은 필름의 형태로 중합체 용액을 주조;
c) 비용제에 중합체 용액의 결과적인 필름을 응고;
d) 초여과 멤브레인을 선택적으로 건조.
초여과 멤브레인에서 기공 크기를 제어하는 것은 일반적으로 간단하지 않다. 주조 용액의 고체 함량이 멤브레인 공극률에 영향을 미치는 것은 물론 기공 크기는 비용제가 유입하고 용제가 주조 용액에 남는 상대 비율에도 영향을 준다. 비용제가 용제의 잔류 전에 필름에 들어가면, 중합체는 높은 공극률 및 큰 기공 크기의 UF 멤브레인으로 되는 (기공 형성자로 기능하는) 대용적의 용제 주위에 침전된다. 비용제의 유입 보다 빠르게 용제가 필름에 남는 경우 실제로는 반대이며, 결과적인 UF 멤브레인은 낮은 공극률 및 작은 기공들을 갖는다. 비용제 조 또는 주조 용액에 대한 첨가제는 물론 이들 모두에 대한 온도 조정이 종종 주조 필름으로부터의 용제 제거와 미용제 엔트리의 상대 비율을 조절하기 위해 사용된다.
아가로스는 다공성 비드들을 제조하기 위해 널리 사용되고 있는 자연 다당류이다. 이들 비드는 크로마토그래피 분리에 있어서 수많은 적용을 발견한다. (크로마토그래피 응용에 대해) 아가로스 비드들의 형성을 기술하는 최근 기술은, 아가로스가 냉각에 의한 겔 형성 전에 유화되는 따뜻한, 비수용성 용제를 사용했다. 예컨대, 다음을 참조하기 바란다: 제르텐, 에스. Biochim, Biophys, Acta 1964, 79:393-398; 및 벵츠손 등, S. Biochim, Biophys, Acta 1964, 79:399. 미국 특허 제4,647,536호에 기술된 바와 같이, 아가로스 비드 형성을 위한 다른 방법은 냉각된 오일 내로 아가로스 에멀젼을 적하하는 것이다. 이와 같은 방법은 “Methods in “Enzymology”(Vol. 135 Part B, 401쪽, Academic Press, 1987)에도 기술되어 있다. 중합체는 약 92℃인 그의 용융 온도 이상 가열되어야 하고 물의 존재하에 용해된다. 상기 온도 이상에서, 중합체는 용융하며, 다음, 용융된 중합체는 물에 의해 용매화되어 용액을 형성한다. 중합체는 온도가 약 45℃인 중합체의 겔화 점 이상인 한 물에서 용융 상태로 있다. 겔화 점 이하에서, 중합체 상은 분리 및 히드로겔로 되어 용액이 겔화 직전의 어떤 형상을 취한다. 부가적으로, 아가로스가 그의 겔화 점에 접근할 때, 용액의 점도는 높아지고 리드로 겔이 형성을 시작함에 따라 더 높아진다.
전통적으로, 다당류 비드들에 대해, 이들은 크로마토그래피 매질에 사용되며, 가열된 용액은 그의 겔 포인트 이상으로 유지되고 미네랄 또는 식물성 오일과 같이, 혼합되지 않는 가열된 유체내로 교반된다. 다음, 2상(two-phased) 물질(혼합되지 않는 유체에서의 아가로스의 비드들)은 냉각되고 비드들이 회복된다. 비드들 그자체는 확산적 다공성이며 사이즈 배제(size exclusion) 크로마토그래피를 위한 제조로서 사용될 수 있다. 부가적으로, 이들은, 그들의 캡쳐 능력을 향상시키기 위해 친화성 케미스트리 또는 리간드, 정 또는 부전하, 소수성 등 또는 가교와 화학물질의 결합과 같은 각종 캡쳐 케미스트리의 가교, 첨가에 의해 더 진행될 수 있다.
아가로스는 다공성 비드들을 형성하기 위해 광범위하게 사용되고 있으며, 타겟 제품 및/또는 불순물들은 확산/구동 공정에서 기공들 내로 및 그로부터 벗어나 주행한다.
본 발명에 기술된 실시예는 아가로스를 포함하는 신규한 초여과 복합체 구조에 관한 것이다. 아가로스 비드들은 종래 기술에서 발견될 수 있으나, 이전에는, 타겟 제품 및/또는 불순물은 상기한 바와 같이 압력-구동 공정에서 기공들 내로 및 기공들을 통해 주행하도록, 아가로스는 여과 멤브레인으로서 채용될 수 있는 연속적인, 편평한 다공성 구조를 생성하도록 사용될 수 없었다.
본 발명에서 번갈아 사용되는 용어 “아가로스 초여과 복합체 구조(aragose ultrafiltration composite structure)” 및 “아가로스 초여과 멤브레인 복합체(aragose ultrafiltration membrane composite)”는 (기판으로도 지칭되는) 적어도 하나의 지지 다공성 멤브레인 및 멤브레인상에 퇴적된 다공성 아가로스의 층을 포함하는 다층 다공성 구조들을 의미한다.
본 발명에 기술된 초여과 멤브레인 복합체는 현재 입수가능한 초여과 멤브레인들보다 서너 점의 장점을 갖는다. 특히, 본 발명에 기술된 초여과 멤브레인 복합체는 제조 공정시 유해한 유기 용제의 사용을 회피한다. 이는 보다 간단하고, 보다 안전하고, 보다 저렴하고, 더욱 환경 친화적인 제조 공정을 수행하는데 일조한다. 또한, 형성 공정은 보다 적은 공정 단계들 및 아가로스 농축을 처리함으로써 초여과 멤브레인의 기공 크기를 용이하게 조절하기 위한 능력으로 인해 간단히 될 수 있다. 또한, 본 발명에 기술된 초여과 멤브레인 복합체는 높은 pH 조건 하에 낮은 단백질 결합, 안정성을 나타내며, 또한 다공성 구조를 형성하기 위한 추출가능 및/또는 해제가능한 조성물의 존재에 의존하지 않는다.
어떤 실시예에서, 본 발명에 기술된 초여과 멤브레인 복합체는 실질적으로 셀룰로스 화합물이다. 어떤 실시예에서, 아가로스 초여과 멤브레인 복합체의 제조 방법이 제공되며, 상기 방법은, a) 0.01μm 내지 1μm 범위의 평균 기공 크기 및 10μm 내지 500μm 범위의 평균 두께를 갖는 (기판으로도 지칭되는) 다공성 지지 멤브레인을 제공하는 단계로서, 상기 다공성 지지 멤브레인은, 폴리에스테르, 폴리올레핀, 폴리에틸렌(PE), 폴리프로필렌, 폴리아미드, 폴리에틸렌 테레프탈레이트(PET), 폴리에테르-에테르 케톤(PEEK), 폴리술폰, 폴리에테르술폰(PES), 방향족 중합체 및 폴리테트라플루오로에틸렌 및 폴리비닐리덴 불화물(PVDF)과 같은 플루오르화 중합체로 구성되는 그룹으로부터 선택된 중합체를 포함하는, 단계; b) 아가로스 용액을 제공하는 단계; c) 20 내지 90℃ 범위의 온도로 다공성 지지 멤브레인 상에 아가로스 용액의 층을 주조하여, 아가로스 코팅된 다공성 지지 멤브레인을 형성하는 단계; 및 d) 상기 아가로스 용액의 겔화 점(gelling point) 미만의 온도로 아가로스 코팅 다공성 지지 멤브레인을 수조 내에 침지하는 단계를 포함하며, 이에 의해 아가로스 초여과 멤브레인을 형성한다.
어떤 실시예에서, 상기 아가로스 초여과 멤브레인 복합체는 0.1μm 미만의 기공 크기를 갖는다. 어떤 실시예에서, 수조는 빙수(ice water)를 포함한다.
상기한 방법은 다공성 지지부를 갖는 아가로스 초여과 멤브레인 복합체의 제조를 위해 유용하며, 상기 멤브레인 복합체는 10 - 1000 kDa(R90)의 분획 분자량(molecular weight cut-off)(MWCO) 값을 갖는다.
어떤 실시예에서, 상기 아가로스 초여과 멤브레인 복합체는, 폴리비닐리덴 불화물(PVDF), 폴리에틸렌(PE), 및 폴리에테르술폰(PES)으로 구성되는 그룹으로부터 선택된 중합체로 형성되는 다공성 지지부를 포함한다. 특정 실시예에서, 다공성 지지부는 폴리비닐리덴 불화물(PVDF) 또는 초고 분자량 폴리에틸렌(UHMW-PE)를 포함한다. 본 발명에 기술된 방법에 의한 어떤 실시예에서, 1 - 12 중량% 범위의 아가로스의 농도를 갖는 아가로스 용액이 사용된다. 다른 실시예에서, 5 - 11 중량% 범위의 아가로스의 농도를 갖는 아가로스 용액이 사용된다. 특정 실시예에서, 상기 방법은 15 중량% 까지의 농도로 안정제로서 ZnCl2를 포함하는 아가로스 용액을 제공함으로써 행해진다.
본 발명에 기술된 어떤 실시예에서, 가교제가 아가로스 용액에 첨가되며, 이에 의해, 멤브레인의 상하 압력 사이의 차동 압력으로 지칭되는 포지티브 트랜스멤브레인 압력(TMP) 하에 아가로스 층을 안정화시킨다. 따라서, 어떤 실시예에서, 아가로스 용액은 0.01 중량% 내지 1 중량% 범위의 농도를 갖는 가교물질(cross-linker) 또는 가교제(cross-linking agent)를 포함하는 상기 방법에 사용된다. 예시적인 가교물질 또는 가교제는 디비닐술폰(DVS)이다. 본 발명에 기술된 어떤 실시예에서, 아가로스 용액은 20 내지 90℃ 범위 또는 45 내지 75℃ 범위의 온도로 가열된다. 특정 실시예에서, 아가로스 용액은 70℃의 온도로 가열된다.
어떤 실시예에서, 가열된 아가로스 용액은 본 발명에 기술된 바와 같이, 다공성 지지 멤브레인에 도포되며, 다공성 지지 멤브레인은 또한, 예컨대 20 내지 90℃ 범위 또는 45 내지 75℃ 범위의 온도로 가열된다. 특정 실시예에서, 상기 다공성 지지 멤브레인은 70℃의 온도로 가열된다. 아가로스 용액과 다공성 지지 멤브레인이 가열되는 온도는 동일한 온도일 수도 있고 또는 상이한 온도로 될 수도 있다.
다공성 지지 멤브레인 상에 아가로스 용액을 도포하는 것에 이어서, 이어서 아가로스 코팅된 다공성 지지 멤브레인이 아가로스 용액의 겔화 점(gelling point) 미만의 온도로 수조에 침지된다. 아가로스의 겔화 점은 본 발명에 기술된 것들 및 종래 기술에 알려진 것을 사용하여 미리 정해질 수 있다. 아가로스 용액의 겔화 점을 결정하기 위한 방법에 대해서는 통상의 기술자에 자명할 것이다. 어떤 실시예에서, 수조는 실온 미만의 온도로 냉각된다. 어떤 실시예에서, 온도는 5 - 60℃ 범위로 된다. 다른 실시예에서, 온도는 10 - 40℃의 범위이다.
어떤 실시예에서, 다공성 지지 멤브레인은 100μm 내지 200μm 범위의 평균 두께 및 0.2μm 미만의 평균 기공 크기를 갖는다. 어떤 실시예에서, 다공성 지지 멤브레인은 10μm 내지 500μm 범위의 두께를 갖는다.
본 발명에 기술된 방법들은 다공성 지지 멤브레인 상에 아가로스의 한 층을 포함하는 초여과 멤브레인 복합체를 제조하기에 유용하다. 어떤 실시예에서, 다공성 지지 멤브레인 층은 다공성 지지 멤브레인 내로 침투 또는 침입하여, 이에 의해 층간 박리(delamination)에 높은 저항성을 갖는 멤브레인 복합체로 된다. 1 내지 15μm의 침투 두께가 여과에 적합한 멤브레인으로 되고 층간 박리에 높은 저항성을 갖는 것으로 확인되었다.
본 발명에 기술된 아가로스 초여과 멤브레인 복합체는 일반적으로 1μm 내지 100μm 범위 또는 1μm 내지 20μm 범위의 두께를 갖는 아가로스 층을 포함한다. 특정 실시예에서, 상기 아가로스 층의 두께는 10μm 내지 20μm의 범위에 있다. 각종 실시예에서, 아가로스 층은 다공성 지지 멤브레인 상에 퇴적된다. 어떤 실시예에서, 상기 다공성 지지 멤브레인상의 아가로스 층의 퇴적은 하부 다공성 지지 멤브레인 내로의 아가로스 용액의 침투 또는 침입, 겔화 및 그 후 냉각에 의한 아가로스 용액의 고화를 포함한다.
어떤 실시예에서, 상기 다공성 지지 멤브레인은, 폴리에스테르, 폴리올레핀, 폴리에틸렌(PE), 폴리프로필렌, 폴리에틸렌 테레프탈레이트(PET), 폴리에테르-에테르 케톤(PEEK), 폴리에테르술폰(PES), 및 폴리테트라플루오로에틸렌 또는 폴리비닐리덴 불화물(PVDF)과 같은 플루오르화 중합체로 구성되는 그룹으로부터 선택된 중합체로 형성되는 직물 또는 부직물이다. 어떤 실시예에서, 상기 다공성 지지 멤브레인은, 폴리비닐리덴 불화물(PVDF), 폴리에틸렌(PE), 폴리에테르술폰(PES), 폴리에틸렌 테레프탈레이트(PET), 및 폴리카프로락탐과 폴리(헥사메틸렌 아디프아미드)를 포함하는 폴리아미드로 구성되는 그룹으로부터 선택된 중합체로 형성되는 직물 또는 부직 중합체 섬유로 구성된다.
본 발명에 제공된 실험 데이터에 의해 입증된 바와 같이, 본 발명에 기술된 초여과 멤브레인 복합체는 10μm 보다 큰 평균 두께를 갖는 다공성 지지 멤브레인을 포함한다. 어떤 실시예에서, 본 발명에 기술된 초여과 멤브레인 복합체는 20μm 내지 500μm 범위의 두께를 갖는 다공성 지지 멤브레인을 포함한다. 특정 실시예에서, 다공성 지지 멤브레인은 100μm의 평균 두께를 갖는다.
또한, 본 발명에는 아가로스 초여과 멤브레인 복합체를 사용하기 위한 공정이 기술된다. 어떤 실시예에서, 본 발명에 기술된 멤브레인 복합체들은 관심대상의 단백질을 함유하는 샘플로부터 바이러스 입자들을 제거하기에 유용하다. 어떤 실시예에서, 관심대상의 단백질은 재조합체 단백질이다. 특정 실시예에서, 관심대상의 단백질은 단일클론 항체이다.
본 발명에 기술된 멤브레인 복합체들은 정상 유동((normal flow) 여과 조건 또는 접선 유동(tangential flow) 여과 조건들 하에 사용될 수 있고 또한 단백질 용액의 정화 및/또는 농축과 같은 공정들에 채용될 수 있다. 어떤 실시예에서, 본 발명에 기술된 멤브레인 복합체들은 적절한 여과 장치에 내장된다.
각종 실시예에서, 본 발명에 기술된 아가로스 초여과 멤브레인 복합체들은 사이즈 기반 분리(size based separation)를 위해 사용된다. 어떤 실시예에서, 본 발명에 기술된 멤브레인 복합체들은, 예컨대, 사이즈 기반 분리 또는 사이즈 배제(size exclusion)에 의해 관심대상의 단백질을 함유하는 용액으로부터 바이러스 또는 바이러스상 입자들의 제거를 위해 사용될 수 있다.
도 1(도 1A 및 1B)은 본 발명에 기술된 아가로스 멤브레인 복합체들의 제조를 위해 이용되는 장치들의 설명을 포함하고, 도 1A는 70℃에서 핫 또는 가열된 플레이트(30) 상에 위치된 폴리비닐리덴 불화물(PVDF)로 형성되는 미세다공성 기판(20)(즉, 다공성 지지 멤브레인)을 갖는 장치(10)를 도시하며, 아가로스 주조 용액을 유리 판(50)상에 테이프(40)에 의해 지지되는 기판(20) 위로 붓는다.
도 1B는 70℃에서 핫 또는 가열된 플레이트(30) 상에 위치된 미세다공성 기판(PVDF)(20)(즉, 다공성 지지 멤브레인)을 포함하고 심(shim)(80)과 플라스틱 시트(70) 사이에 끼워진 장치(60)를 도시하며, 상기 심(80)은 아가로스 주조 용액을 산포하기 위해 사용되는 마이크로미터 조정가능 나이프(90)를 간극조정하기 위해 사용되나, 기판(20)과 플라스틱 시트(70) 사이에 아가로스 주조 용액을 붓기 전에 제거되고, 이어서 아가로스를 산포하기 위해 간극조정된 마이크로미터 조정가능 나이프(90)가 사용되며, 그에 따른 아가로스 멤브레인 복합체는 핫 플레이트로부터 신속히 분리되고 적어도 2분 동안 얼음과 접촉하며, 이어서 20℃로 유지되는 수조에 침지되고, 플라스틱 시트(70)는 조심스럽게 박리된다.
도 2는 실시예 5에 기술된 바와 같이 제조된 아가로스 초여과 멤브레인 복합체의 고배율 SEM 마이크로그래프(필드 에미션 스캐닝 전자 현미경)를 도시하며, SEM은 기공 구조를 유지하기 위해 초저온 조건하에 행해지고 분석된 샘플들은 150℃ 미만의 온도로 낮춰 냉각되며, 도 2A 및 2B는 각각 멤브레인 복합체의 상부 및 저부(즉, 미세다공성 기판과 아가로스 층의 계면)를 나타내는 단면도이고, 도 2C는 표면 이미지를 도시하며, 멤브레인은 저면보다 더 개방된 상면을 갖는 약간 비대칭인 것으로 나타낸다.
도 3은 본 발명에 기술된 대표적 아가로스 멤브레인 복합체의 분획 분자량 을 예시한 리젝션 커브를 도시하며, X축은 분획 분자량을 도시하고 Y축은 리젝션을 도시하며, 분석은 실시예 4에 기술된 바와 같이 행해진다.
도 4는 채용된 아가로스 주조 용액의 농도에 대한 아가로스 멤브레인 복합체의 투과량(flux)과 분획 분자량의 의존성을 도시한 그래프이고, R90 및 물 투과량(water flux) 데이터는 실시예 3 및 4에 기술된 바와 같이 결정되고, X축은 아가로스 농도를 나타내고 우측 Y축은 LMH/PSI에서의 투과량을 도시하고 좌측 Y축은 R90을 나타낸다.
도 5는, 채용된 아가로스 주조 용액의 이온 강도에 대한 본 발명에 기술된 아가로스 멤브레인 복합체의 분획 분자량의 의존성을 도시한 그래프이고, R90 수(number)들은 실시예 7에 기술된 바와 같이 결정되고, X축은 사용된 ZnCl2의 농도를 나타내고 우측 Y축 및 좌측 Y축은 각각 7중량% 및 10중량% 아가로스 용액들의 R90 값들을 나타내고, 주조 용액에서의 아가로스의 농도에 무관하게, 보다 높은 주조 용액의 이온 강도는 보다 개방된 초여과 멤브레인으로 귀결되며, 기대된 바와 같이, 임의의 주어진 이온 강도에서, 보다 개방된 초여과 멤브레인이 보다 낮은 아가로스 주조 용액 농도로 얻어진다.
도 6은 압력하에 압축으로부터 방지하도록 DVS와 아가로스 층의 가교를 도시한 그래프로, 0.1% DVS 용액과 아가로스 층을 가교함으로써 15 psi의 투과량에서의 20% 손실이 회피될 수 있는 것을 설명하며, X축은 PSI에서의 압력을 나타내고 Y축은 LMH/PSI에서의 정형화된 투과량을 나타낸다.
도 7은 (물에 있어서) 20% 글리세린 용액에 있는 습윤 아가로스 멤브레인 복합체의 건조가 멤브레인의 분획 분자량에 부정적인 영향을 주지 않는 것을 도시한 그래프로, 즉, 건조 공정은 아가로스 층의 기공 구조를 붕괴시키지 않는 것을 나타낸다.
도 8은, 미세다공성 PVDF 기판의 상부층 내로의 아가로스 층의 침투 깊이를 도시한 그래프로, 기본적인 분석 데이터는 SEM-EDS Instrument(INCA300, Oxford Instrument, 영국)를 사용하여 얻어지고 (SEM 인서트상에 별표로 나타낸) 미소 영역 조성 분석은, 미세다공성 기판의 표면으로부터 시작하여 기판 내로 40μm 연장되는 Z 방향으로 5μm 간격으로 행해지며, 불소 신호는 PVDF 미세다공성 기판으로 인한 것이고, 반면에 산소 신호는 아가로스로 인한 것이며, 또한, 대부분의 아가로스는 미세다공성 기판의 10μm 깊이까지 제1층에서 국소화되며, X축은 깊이(마이크로미터)를 나타내고 Y축은 비(O/F)를 나타낸다.
도 9는 겔화 점이 도달된 때 대표적인 아가로스 용액(7중량%)의 점도의 증가를 도시한 그래프로, 본 발명에 기술된 바와 같이 분석을 행하기 위해 회전 점도계가 사용되며, X축은 온도(섭씨)를 나타내고 Y축은 점도를 나타낸다.
도 10은 아가로스 아가로스 초여과 멤브레인 복합체와 Viresolve® Pro 멤브레인의 특징적 투과량 감쇄를 도시한 그래프로, 바이러스 스파이크 세포(virus-spiked cell) 배양 매질이 10 psi의 일정한 압력으로 각 장치를 통해 유동되고 멤브레인 투과량이 측정되고, 각종 시간 포인트들에서 침투 볼륨을 측정함으로써 스루풋이 모니터되며, X축은 스루풋을 나타내고 Y축은 J/Jo 값들을 나타낸다.
본 발명에 기술된 실시예들은 아가로스 초여과 멤브레인 복합체 및 그의 제조 및 사용 방법들에 관한 것이다. 특히, 본 발명에 기술된 초여과 멤브레인 복합체들은 (기판으로도 지칭되는) 다공성 지지 멤브레인 위로 아가로스 용액의 층을 주조(casting)함으로써 제조된다. 아가로스 용액은 다공성 지지 멤브레인 내로 침투하며, 그에 의해 층간 박리에 고도로 저항적인 아가로스 초여과 멤브레인 복합체로 된다.
본 명세서에 사용되는 용어 "초여과 멤브레인" 또는 "UM 멤브레인"은, 멤브레인 및 멤브레인 공정에 대한 Pure Appl. Chem.(1996), 68, 1479에 공개된, International Union of Pure and Applied Chemistry(IUPAC) 전문용어의 정의에 기초하며; 그에 따르면, 미세여과(microfiltration)는, 0.1 μm보다 큰 입자 및 용해된 거대분자들이 거절되는 압력-구동 멤브레인 기반 분리 공정으로 정의되고, 초여과(ultrafiltration)는 0.1 μm보다 작고 약 2nm보다 큰 입자 및 용해된 거대분자들이 거절되는 압력-구동 멤브레인 기반 분리 공정으로 정의된다.
따라서, 초여과 멤브레인들은 약 0.1 μm 미만의 용액에서의 크기를 갖는 용해성 거대분자들을 농축 또는 다이아필터링(diafiltering) 가능하고 또한, 통상적으로 4시간 이상 및 24시간까지, 연장된 기간 동안 접선 유동 모드에서 연속적으로 동작가능한 것으로 정의된다. 이에 반해, 미세다공성 멤브레인들은 0.1 μm보다 큰 입자들을 제거할 수 있고 데드-엔드(dead-end) 여과 응용 기술 분야에 사용된다. 미세다공성 멤브레인은 일반적으로 용해성 거대분자들이 멤브레인을 통과할 수 있도록 한다.
본 발명에 기술된 방법들은 용액과 열적 상(thermal phase) 반전 기술을 결합하고 주조 용액 또는 비용제 조에 있어서 유기 용제의 사용을 제거한다. 또한, 본 발명에 기술된 방법들은 기공 사이즈를 제어하기 위해 보다 간단한 대책을 허용한다. 이는, 적어도 부분적으로, 교차결합(가교)된 덱스트란 또는 폴리아크릴아미드 겔과 같은 다른 화합물의 겔에 대해 아가로스 겔의 기공 크기를 제어하는 것이 일반적으로 용이하다는 사실 때문이다. 예컨대, 미국 특허 제3,527,712A에 따르면, 아가로스 겔의 기공 크기는 겔의 아가로스 농도에 의존한다. 아가로스의 농도가 감소할 때, 겔의 유효 기공 크기가 증대하는 것이 당업계에 알려져 있다. 따라서, 아가로스의 특정 농도에 따라, 10 Da와 700 kDa 사이의 분자량을 갖는 분자들의 분류를 행하는 것이 가능하게 된다. 아가로스를 처리하기 위해, 아가로스 중합체는, 물의 존재하에 약 92℃인 그의 용융 온도 이상 가열되어야 한다. 중합체는 그 온도에서 용융하며 용융된 중합체는 다음, 물에 의해 용매화되어 용액을 형성한다. 중합체는 온도가 중합체의 겔화 점보다 높으면 물에 용해된 상태로 존재하며, 상기 겔 포인트는 사용된 아가로스의 형태 및 농도에 따라 20 내지 43℃의 범위에 있다. 겔 포인트에서 및 그 미만에서, 중합체 상은 분리하고 히드로겔로 된다. 본 발명에 기술된 멤브레인 복합체를 제조하기 위해 사용되는 아가로스의 형태는 약 35 내지 40℃의 범위 또는 37 내지 39℃의 범위에 있는 겔화 점을 나타낸다.
어떤 실시예에서, 본 발명에 기술된 아가로스 초여과 멤브레인은, a) 그 위에 필름을 갖거나 또는 필름이 없는 가열된 스테인리스 스틸 롤; 및 b) 회전 실린더:에 의해 형성된 두 개의 니프 롤(nip roll)들 사이에 다공성 지지 멤브레인 및 아가로스의 뜨거운 용액을 통과시킴으로써 형성된다.
다공성 지지 멤브레인 내로의 아가로스의 침투의 정도 및 아가로스 층의 두께는 니프 롤들 사이의 공간으로 입구에서의 용액 압력, 롤의 듀로미터(경도) 및 직경, 용액 점도 및 공정 속도에 의해 제어된다.
다른 실시예에서, 아가로스 용액은 통상적인 나이프-오버-롤 또는 슬롯 다이 코팅법에 의해 다공성 지지 멤브레인에 도포될 수 있다.
다음, 다공성 지지 멤브레인은 그의 겔화 온도 또는 그 미만으로 물과 같은 아가로스에 대한 비용제와 접촉된다. 어떤 실시예에서, 아가로스 층은 기능성 화학 등을 사용하여 가교, 화학 유도체화와 같은 부가적 단계들로 행해질 수 있다.
또 다른 실시예에서, 아가로스 초여과 멤브레인 복합체는, 다공성 지지 멤브레인과 비점착(non-stick) 비중합체 시트 사이에 아가로스 용액을 산포(spreading)함으로써 형성된다. 아가로스 용액의 산포는 임의의 적절한 수단에 의해 달성될 수 있다. 예시적 실시예로는, 러버 로울러(rubber roller) 또는 버드 나이프(bird knife), 닥터 블레이드(doctor blade) 등을 포함한다. 산포 단계는 아가로스 용액의 겔화 점 위의 온도로 핫 플레이트상에 행해질 수 있으며, 이에 의해 열적 상 반전을 사용하여 다공성 지지 멤브레인의 길이 및 폭을 따라 전체 표면에 걸쳐 초여과 층을 형성한다. 다음, 초여과 범위에 있는 아가로스의 얇은 층으로 피복된 다공성 지지 멤브레인을 남긴 채로, 아가로스 코팅된 다공성 지지 멤브레인은, 비점착 중합체 시트가 제거되는 동안 아가로스 층의 손상을 방지하기 위해 물과 접촉된다. 선택적으로, 형성된 아가로스 층은 이어서 기능적 화학 등을 사용하여 가교, 유도체화와 같은 부가적 단계들로 행해질 수 있다.
본 발명에서 기판으로도 지칭되는 다공성 지지 멤브레인은 본 발명에 기술된 아가로스 초여과 멤브레인 복합체를 제조하기 위해 이용될 수 있으며 이는 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 폴리에테르-에테르 케톤(PEEK)와 같은 중합체들로 형성될 수 있고, 이들은 DMSO, DMF 및 NMP와 같은 각종 용제가 있는 곳에 사용될 수 있다.
다공성 지지 멤브레인 또는 기판은, 유동, 기계적 강도, 가요성 및 유기 용제에 의한 팽윤(swelling) 또는 용해에 대한 저항을 위해 다공성을 갖도록 하는 것이 바람직하다. 다공성 지지 멤브레인은 직물 또는 부직물을 포함할 수 있으며, 이들은 폴리에스테르, 폴리아미드, 폴리카프로락탐, 폴리(헥사메틸렌 아디프아미드), 폴리올레핀, 폴리에틸렌(PE), 폴리프로필렌, 방향족 중합체, 폴리에틸렌 테레프탈레이트(PET), 폴리에테르-에테르 케톤(PEEK), 또는 폴리테트라플루오로에틸렌 또는 불화 폴리비닐리덴(PVDF)과 같은 플루오르화 중합체, 폴리술폰 또는 폴리에테르술폰(PES), 할로겐화 중합체 또는 폴리테트라플루오로에틸렌 및 폴리비닐리덴 불화물(PVDF)과 같은 플루오르화 중합체와 같은 중합체들로 형성된다.
어떤 실시예에서, 미세다공성인 다공성 지지 멤브레인이 사용된다. 이와 같은 미세다공성인 멤브레인들은 US 4,778,601 A에 기술된 바와 같은 초고 분자량 폴리에틸렌(UPE)으로 제조될 수 있다. 이들 미세다공성인 멤브레인들은 일반적으로 초고 분자량 폴리에틸렌으로 제조된다. 이 방법은 형성 염료를 통한 기공생성중합체(porogen) 및 UHMW-PE의 용액의 압출을 채용하며 이어서 중합체와 기공생성중합체의 열적 상 분리를 행한다. 이어서 미세다공성 구조들이 기공생성중합체의 제거에 의해 생성된다.
이와 같은 미세다공성 멤브레인들의 제조는 일반적으로 초고분자량 폴리에틸렌 및 기공생성중합체의 혼합물을 형성하는 단계들을 포함한다. 이 혼합물은 상승된 온도로 가열되어 용액을 형성한다. 용액은 적절한 전단(shear) 하에 형성 다이를 통해 압출되며, 이에 따라 멤브레인을 형성한다. 압출물은 냉각되어 멤브레인에 있어서 중합체 풍부 (polymer-rich), 기공생성중합체 빈약(porogen-poor) 상 및 중합체 빈약(polymer-poor)과 기공생성중합체 풍부(porogen-rich) 상으로 상 분리시킨 다음, 기공생성중합체를 제거함으로써 멤브레인에 미세다공성 구조를 생성한다. 이어서 상기에 따라 형성되는 미세다공성 멤브레인은 건조된다. 이 공정의 상세한 설명은 예컨대 미국 특허 제4,778,601호에서 발견될 수 있으며, 그의 전체적인 내용은 본 명세서에 참고로 채용된다. 어떤 실시예에서, 이들 미세다공성 멤브레인은, 본 발명에 기술된, 층으로 된 초여과 멤브레인들의 제조를 위한 기판 또는 지지 멤브레인으로서 적합하다.
상기와 같이 설명된 중합체들에 부가하여, 본 발명에 기술된 초여과 멤브레인 복합체의 제조를 위해 다른 직물 또는 부직 중합체로 형성되는 다공성 멤브레인을 사용할 수도 있다.
어떤 실시예에서, 본 발명에 기술된 다공성 아가로스 멤브레인 복합체의 제조를 위해 유용한 적절한 다공성 지지 멤브레인들은 10μm보다 큰 평균 층 두께를 갖는다. 다른 실시예에서, 이들 지지 멤브레인들은 20μm 내지 500μm 범위의 두께를 갖는다. 다른 실시예에서, 120μm까지의 두께를 갖는 다공성 지지 멤브레인들이 채용된다. 특정 실시예에서, 다공성 지지 멤브레인은 100μm의 평균 두께 및 약 0.2μm의 평균 기공 크기를 갖는다.
어떤 실시예에서, 본 발명에 기술된 아가로스 초여과 멤브레인 복합체는 예컨대, 도 1a 및 1b에 도시된 바와 같이 제조될 수 있다. 다공성 지지 멤브레인과 아가로스 사이에 양호한 접착을 달성하기 위해, 중합체 지지 멤브레인이 아가로스 용액과 접촉되기 전에 상승 온도로 가열된 경우가 바람직하다는 것이 발견되었다. 어떤 실시예에서, 다공성 지지 멤브레인은 약 20 내지 90℃의 범위의 온도, 또는 45 내지 75℃의 범위의 온도로 가열된다. 특정 실시예에서, 다공성 지지 멤브레인은 70℃로 가열된다. 또한, 아가로스 용액이 다공성 지지 멤브레인과 접촉되기 전에, 예컨대, 20 내지 90℃의 범위의 온도, 또는 45 내지 75℃의 범위의 온도로 상승된 온도로 가열된다. 아가로스 용액이 다공성 지지 멤브레인상에 주조 및 산포될 때, 하부 지지 멤브레인 내로의 아가로스 용액의 침투의 깊이를 조절하는 것이 바람직하다. 따라서, 아가로스로 처리된 다공성 지지 멤브레인은 가능한 한 빨리 냉각되고 고체 상태로 변환된다. 냉각 단계에 대해, 아가로스로 피복된 다공성 지지 멤브레인은 빙수와 접촉된 다음 수조에 접촉되며, 상기 수조는 겔화를 실시하기 위해 25℃ 미만의 온도로 유지된다. 아가로스 코팅된 멤브레인은 얼음 없이 물과 직접 접촉될 수도 있다. 어떤 실시예에서, 수조의 온도는 5 내지 60℃의 범위에 있다. 어떤 실시예에서, 물의 온도는 10 내지 40℃ 범위의 온도로 유지된다.
아가로스 층의 제조를 위해, 아가로스 용액은 1 - 12중량%의 범위 또는 5-11중량%의 범위의 농도를 갖는 아가로스를 포함하여 제조된다. 어떤 실시예에서, 예컨대, HD2, HR, ES 3:1 또는 LE와 같은 상업적으로 입수가능한 아가로스 형태가 사용된다. 아가로스의 상업적 소스의 일례는 스페인의 히스파나가르(Hispanagar), 에스. 에이. 이다. 아가로스 파우더는 실온에서 물과 혼합된 다음 아가로스 용액이 형성될 때까지 상승된 온도로 가열된다. 아가로스 용액이 아가로스의 용융점인 약 92℃의 온도에 달할 때, 그 용액은 원심력에 의해 교반되고 가스가 제거된다.
일반적으로, 가스제거는 3500 rpm의 원심력 및 20 내지 90℃ 범위의 온도 또는 45 내지 75℃ 범위의 온도로 냉각 후 행해진다. 특정 실시예에서, 상기 온도는 약 70℃이다. 아가로스 용액은 아가로스 필름을 주조하기 위해 사용될 때까지 이 온도로 유지된다.
도포된 아가로스 용액은 또한, 예컨대, 안정화제로서 염화 아연과 같은 첨가제를 더 포함할 수 있다. 상기 안정화제는 아가로스 파우더와 함께 혼합되고 적절한 비율로 수용액에 첨가될 수 있다. 이 방식에 있어서, 예컨대, 주조 용액은 15중량%까지의 농도로 염화 아연과 같은 안정화제를 포함하여 제조될 수 있다. 어떤 실시예에서, 아가로스 용액은 10중량%까지의 농도로 ZnCl2를 포함한다. 그러나, 5중량% ZnCl2 미만을 포함하는 용액들도 사용될 수 있다.
다공성 지지 멤브레인 내로의 아가로스 용액의 침투를 보장하기 위해, 다공성 지지 멤브레인은 아가로스 용액이 멤브레인 상에 주조되기 전에 약 20 내지 90℃의 온도로 가열된다. 어떤 실시예에서, 다공성 지지 멤브레인은 45 내지 75℃ 범위의 온도 또는 약 70℃의 온도로 가열된다.
아가로스 용액이 다공성 지지 멤브레인에 도포될 때, 극히 정확한 양의 아가로스 용액이 다공성 지지 멤브레인 내로 침투하는 것이 중요하다. 또한, 아가로스 용액에 의해 다공성 지지 멤브레인의 기공들이 막히는 것은 바람직하지 않다. 아가로스 용액이 다공성 지지 멤브레인 상에 주조될 때, 멤브레인의 표면 위로 균일하게 적절한 수단에 의해 통과된다. 적절한 수단은 예컨대, 버드 나이프, 또는 갭을 갖는 닥터 블레이드(Doctor blade)의 사용을 포함하지만 이에 한정되지 않는다. 이어서, 코팅된 멤브레인이 가열 소스로부터 즉시 떨어지고 아가로스 용액은 냉각 및 겔화 된다. 이를 달성하기 위해, 코팅된 멤브레인은 수조에 침지되고 15 내지 20℃ 범위 또는 18 내지 20℃의 범위의 온도로 유지된다. 특정 실시예에서, 온도는 약 20℃이다. 또한, 냉각은 얼음 조 및/또는 수조에서의 후속 침지에 의해 달성될 수 있다.
또한, 아가로스 층은 압력 저항을 증대시키기 위해 교차결합될 수 있다. 더욱이, 예컨대, 이온 교환 멤브레인으로서 사용하기 위해, 상기와 같은 멤브레인의 소망 적용에 따라, 아가로스 코팅 멤브레인의 표면 개질도 행해질 수 있다.
아가로스 층을 교차결합하기 위해, 제조된 아가로스 코팅 멤브레인은 가교제 또는 가교물질을 포함하는 용액과 적절한 방식으로 접촉될 수도 있다. 다른 실시예에서, 아가로스 층이 다공성 지지 멤브레인 상에 주조되기 전에 가교제가 아가로스 용액에 첨가될 수 있다. 어떤 실시예에서, 가교제는 0.01중량% 내지 1중량% 범위의 농도로 아가로스 용액에 포함된다. 가교제의 직접 첨가는 아가로스의 균일한 가교가 일어나도록 보장한다. 당해 기술 분야에 공지되고 본 발명에 기술된 각종 가교 방법이 사용될 수 있다.
상기한 바와 같이, 가교 반응은 용해된 가교제와 멤브레인 복합체의 아가로스 사이의 반응을 수반할 수도 있다. 적절한 반응 용액은 수용성, 또는 유기 용제, 또는 수성-유기 혼합물에 기초할 수 있다. 유기 용제의 비제한적 예를 들면, N-메틸 피롤리돈, 디메틸 아세트아미드, 디메틸 술폭시드, 디메틸 포름아미드 및 유사 용제들을 포함한다.
예시적 가교제로는, 예컨대, 2 또는 다기능성 에폭시드, 예컨대 에피클로로히드린, 부탄디올 디글리시딜 에테르(BUDGE), 에틸렌디올 디글리시딜 에테르(EDGE), 폴리에틸렌글리콜 디글리시딜 에테르 및 부탄 디에폭시드와 같은 것들을 포함한다. 다기능성 N-메틸 메톡시 화합물은 또한, 가교 시약으로 사용될 수도 있다. 예를 들면, Cymel 385 및 Powerlink 1174(이들 모두 뉴 저지, 웨스트 패터슨의 Cytec Industries로부터 입수가능)를 포함한다. 가교 반응은, 가교제가 약 5중량% 내지 약 60중량% 또는 약 10중량% 내지 약 40중량% 범위의 농도로 존재하는 용액으로 실시될 수 있다는 것이 발견되었다.
특정 실시예에서, 디비닐술폰 또는 DVS가 가교제로서 사용된다. DVS는 본 발명에 기술된 아가로스 층을 교차결합하기에 특히 적합한 것으로 입증되었다. DVS는 아가로스 층의 주조 전에 아가로스 용액에 첨가될 수 있으며 또한, 상기한 바와 같이 통상적으로 사용되는 가교제의 농도에 대해 매우 낮은 농도로 도포될 수 있다.
당해 분야의 통상의 기술자는, 예컨대, 사용된 기기의 적절한 농도, 온도, 압력 및 설정을 채용하기 위해 적절한 반응 조건을 용이하게 결정할 수 있다. 일반적으로, 반응은 보다 높은 온도에서 보다 빠른 속도로 발생하는 것이 기대된다: 그러나, 반응 온도는 본 발명에 기술된 복합체 물질이 가능한 한 유연하게 개질되도록 선택되어야 한다. 또한, 당해 분야의 통상의 기술자는 반응 스케일의 영향을 용이하게 결정할 수 있다. 예를 들면, 보다 큰 반응 용기는 반응 온도에 달하기 위해 또한 낮게 냉각시키기 위해 보다 긴 시간을 필요로 할 것이다. 또한, 반응 속도를 증가시키기 위해 보다 높은 압력이 사용될 수 있다. 반응 용기에 따라, 전문가는 멤브레인에 대한 반응물질의 접촉을 증대시키기 위해 연속 흐름 반응기 또는 다른 적절한 수단을 사용할 수 있으며, 이에 의해 반응을 제어한다. 보다 높은 농도는 일반적으로 반응 속도를 증가시킨다. 도포된 가교제 형태 및 선택된 용제는 필요한 반응 시간을 결정할 때 역할을 할 수 있다. 히드록실 이온 활동도는 다른 중요한 반응 조건이다.
일반적으로, 사용되는 반응 시간은 약 2 내지 약 100 시간의 범위에 있으나, 약 4 내지 약 24 시간의 반응 시간이 가장 일반적이다. 반응은 실온에서 행해질 수 있으며 약 60℃까지이다. 어떤 실시예에서, 반응은 약 25℃ 내지 약 50℃ 범위의 온도로 행해진다. 당해 분야의 통상의 기술자는, 예컨대, 롤 공정에 대해 연속 롤을 사용하여 물질 전달률을 증가시킴으로써, 또는 온도, 농도 또는 임의의 다른 파라미터들을 조정하여 반응 속도를 더 증가시킴으로써, 상기 시간을 변경 또는 감소시킬 수 있다.
다기능성 에폭시 화합물이 가교제로 사용될 때, 반응은 기본 조건으로 행해진다. 예를 들면, 나트륨 또는 칼륨 히드록시드를 포함한다. 전형적으로, 약 0.1 M 내지 약 1 M 히드록시드 용액이 사용된다. 당해 분야의 통상의 기술자는 아가로스의 알칼리성 열화에 대한 반응의 균형을 이루기 위한 방법을 용이하게 결정할 수 있다. 보다 높은 히드록시드 농도 및 보다 높은 반응 온도는 일반적으로 알칼리성 열화를 가속시키며, 반면에, 보다 낮은 히드록시드 농도 및 보다 낮은 반응 온도는 일반적으로 열화 비율은 물론 가교 반응 속도를 늦춘다.
Powderlink 1174, Cymel 385 및 유사한 가교제들(다기능성 N-메틸 메톡시 화합물)은 톨루엔 술폰산과 같은 산 촉매제로 아가로스에 대한 히드록실을 통해 아가로스와 교차결합한다. 다른 유사한 산 촉매제들은 유기 술폰산 및 비산화 무기산들이다. pH가 약 2 내지 4인 약 또는 적당한 산성 조건이 일반적으로 적합하다. 바람직한 촉매는 Cytec industries로부터 입수가능한 Cycyt 4040, 술폰산 촉매이다. 강산성 조건들이 멤브레인 열화를 야기하여 추천될 수 없다는 것은 당해 분야의 통상의 기술자에 매우 명백할 것이다.
아가로스 멤브레인과 가교 반응물질 간의 반응은 예컨대, 메틸에틸 케톤, 메틸펜탄디올, 아세톤 또는 다른 케톤과 같은 용제와 혼합된 물 또는 100% 물과 같은 수용액에서 행해질 수 있다. 그러나, 이 수용액의 리스트는 예시적인 것이다. 특정 실시예에서, 가교 단계는 알칼리 환경에서 행해진다.
본 발명에 기술된 초여과 아가로스 멤브레인 복합체는 당해 기술 분야에 공지되었거나 또는 본 발명에 기술된 임의의 적절한 기술들을 사용하여 변경될 수 있다. 어떤 실시예에서, 이온 교환 물질로서 적절한 멤브레인이 형성될 수 있다.
본 발명에 기술된 바와 같이, 용어 “이온 교환 물질”은 그에 대해 고정화되는 공유결합된 대전 치환기를 갖는 고분자량 매트릭스를 지칭한다. 전체적인 전하적 중성에 대해, 비공유결합 반대이온들은 이온의 상호작용들에 의해 대전된 치환기에 결합된다. “이온 교환 물질”은 유사하게 대전된 결합 파트너에 대한 비공유결합 반대이온 또는 주변 용액의 이온들을 교환하기 위한 능력을 갖는다. 그의 교환가능한 반대이온의 전하에 따라, “이온 교환 물질”은 “양이온 교환 물질” 또는 “음이온 교환 물질”로 지칭된다. 대전된 그룹(치환기)의 성질에 따라, “이온 교환 물질”은 예컨대, 양이온 교환 물질의 경우에, 술폰산 또는 술포프로필 또는 카르복실 수지로 지칭된다. 또한, 부가적으로, 대전된 그룹/치환기의 화학 성질에 따라, “이온 교환 물질”은 예컨대, 공유결합 대전 치환기의 세기에 기초하여, 강 또는 약 이온 교환 물질로 분류될 수 있다. 예를 들면, 어떤 실시예에서, 강 양이온 교환 물질은 대전된 치환기로서 술폰산 그룹(예컨대, 술포프로필 그룹)를 포함할 수 있다. 예시적인 약 양이온 교환 물질은 대전된 치환기로서 카르복실산 그룹(예컨대, 카르복시메틸 그룹)을 포함한다. 예시적인 강 음이온 교환 물질은 제4 암모늄 그룹을 포함하고, 반면에 예시적인 약 음이온 교환 물질은 대전된 치환기로서 디에틸아미노에틸 그룹을 포함한다.
더욱이, 본 발명에 기술된 방법에 따라 제조된 멤브레인 복합체의 표면은 1 단계 또는 2 단계 공정을 통해 도입된 부전하를 포함한다. 1단계 공정의 경우에, 전하 변경 반응물이 가교 용액에 첨가된다. 2단계 방법의 경우에, 가교 반응 전 또는 후에 전하 부가 반응이 행해진다.
음전하 멤브레인 복합체를 형성하기 위한 적절한 반응물질은 예컨대, 구조 X(CH2)mA의 화합물 또는 그의 알칼리 금속염을 포함하며, 상기 X는 할로겐, 바람직하게는 염화물 또는 브롬화물이고; A는 카르복실 또는 술폰산염이다. 다음의, 예컨대, 반응 시간, 반응물 농도, pH, 및 온도의 하나 이상은 멤브레인의 표면에 첨가된 부전하의 양을 조절하도록 제어될 수 있다.
본 발명에 기술된 어떤 실시예에서, 디비닐술폰은 미국 특허 제4,591,640호에 기술된 바와 같은 반응 조건하에 가교제로서 사용되며, 상기 특허는 본 명세서에 참고로 채용된다. 어떤 실시예에서, 가교 반응은 환원제의 존재하에 pH>11로 실온에서 행해지며, 미반응 비밀 그룹들이 몇몇 히드록실 그룹을 포함하는 중성의 친수성 비활성 물질에 의해 비활성화된다.
어떤 실시예에서, 양전하는 글리시딜 제4 암모늄 화합물 또는 제4 암모늄 알킬 할로겐화물을 사용하여 멤브레인에 부여된다. 어떤 실시예에서, 할로겐화물 분자는 Y(CH2)mB의 구조를 가지며, 상기 식에서 Y는 할로겐이고 B는 양전하 성분이다.
기술된 실시예들의 어떤 것의 경우에, 가교 반응은 멤브레인에 대해 대전된 그룹을 부가하기 전에 행해진다. 대전된 그룹을 부가하기 전에 가교 반응을 행함으로써, 유사 대전된(like-charged) 그룹들 간의 전하 척력이 회피될 수 있으며, 이에 따라 중합체 및 멤브레인의 스웰링(swelling)을 방지한다. 다른 실시예에서, 가교는 전하 부가와 동시에 행해진다. 이 예에서, 전하가 부가될 때 스웰링을 회피하는 비율로 가교 반응을 제어하는 것이 바람직하다.
본 출원의 지식과 결합된 당해 기술의 지식에 기초하여, 당업자는 바람직한 기공 크기, 전하 및 다른 물질 특성을 갖는 본 발명에 기술된 내용제 아가로스 초여과 멤브레인 복합체를 제조할 수 있음을 이해할 것이다.
상기 기술된 방법을 사용하여, 초여과 멤브레인 복합체들이 얻어지며, 이들은 아가로스의 층 및 다공성 지지 멤브레인을 포함하고, 이 때 아가로스는 다공성 지지 멤브레인의 두께의 적어도 일부로 침투하며, 이에 의해 층간 박리에 고도로 저항하는 아가로스 초여과 멤브레인 복합체로 귀결된다. 예컨대, 기술된 어떤 실시예에서, 아가로스는 다공성 지지 멤브레인 내로 침투하며, 그에 의해 1 내지 15μm의 침투 깊이에 달하게 된다.
어떤 실시예에서, 아가로스 층은 1 내지 100μm의 범위 또는 1 내지 40μm의 범위의 두께를 갖는다. 특정 실시예에서, 아가로스 층은 10 내지 20μm의 범위 또는 15 내지 20μm 범위의 두께를 갖는다. 아가로스 층의 두께는 다공성 지지 멤브레인 내로 침투함은 물론 다공성 지지 멤브레인의 상부에 있는 아가로스를 포함한다. 기술된 각종 실시예에서, 아가로스 층은 다공성 지지 멤브레인의 두께의 적어도 일부로 침투하며, 이어서 아가로스의 냉각에 의해 겔화 및 고화된다.
상기 아가로스 초여과 멤브레인 복합체는 몇 개의 사용들을 갖는다. 멤브레인 복합체는 분석적 응용분야는 물론 산업적 규모로 생물학적 제조 분야에 사용될 수 있다. 어떤 실시예에서, 멤브레인 복합체는 장치 내에 채용된다.
상기한 바와 같이, 기술된 아가로스 초여과 멤브레인 복합체는 임의 크기의 분자들의 여과에 매우 적합함은 물론 정상 유동 또는 접선 유동 포맷으로 바이러스 정화에 유용하다.
본 발명에 기술된 멤브레인 복합체는 재조합체 단백질 함유 용액으로부터 바이러스를 제거하기에 유용한 고해상도의 것이다. 바이러스를 제거하기 위한 상기와 같은 멤브레인 복합체의 사용은, 예컨대, 대용량(예컨대, 멤브레인 복합체의 단위 면적을 통해 처리되는 관심대상의 단백질의 양으로 측정된 바와 같이)이고 고효율(예컨대, 로그 감소 값, LRV에 의해 측정된 바와 같이)과 같은 몇몇 장점을 갖는다.
예컨대, 바이러스를 제거하기 위해 멤브레인을 통해 수용성 단백질 용액을 여과할 때, 멤브레인은 일반적으로 관심대상의 단백질이 멤브레인을 통과하도록 허용하면서 바이러스들을 유지하도록 충분히 작은 기공 크기를 갖는다. 일반적으로, 이와 같은 멤브레인은 높은 스루풋과 동시에 높은 바이러스 유지를 갖는 것이 바람직하다.
바이러스 유지는 로그 감소 값(Log Reduction Value; LRV)으로서 정의되며, 이는 여과된 액체에 있어서 그에 대한 공급에서 바이러스 농도(titer; 적정 농도)의 비의 알고리즘으로서 정의된다. 스루풋은 완전한 파울링(fouling)이 일어나기 전에 멤브레인의 소정 영역을 통과할 수 있는 단백질 용액의 용적으로서 정의된다. 본 발명에 사용된 바와 같이, 용어 “완전한 파울링”은 3.5 이상의 LRV의 바이러스 유지를 얻기 위해 멤브레인으로 여과를 실시할 때 멤브레인의 원래 플럭스의 10% 미만이 관찰되는 멤브레인의 농도를 지칭한다. 일반적으로 멤브레인을 통한 높은 플러스와 멤브레인 표면의 낮은 단백질 결합 모두 높은 스루풋으로 이어지는 것으로 관찰된다. 소정 멤브레인의 스루풋 값들은 단백질 용액의 형태 및 농도, 압력, 이온 강도 및 다른 시험 조건에 따라 크게 변한다. 전형적인 공정 조건하에, 만족스런 초여과 멤브레인은 약 1000 L/m2 이상의 스루풋을 갖는다.
바이러스 유지 멤브레인의 보다 대표적인 성능 게이지는 Vmax 방법에 따라 계산되는 멤브레인 영역이다. 이 방법에 관한 모다 자세한 사항은 데 1 775 016 B1에서 발견될 수 있으며, 그의 기재는 본 발명에 참고적으로 채용된다.
어떤 실시예에서, 바이러스의 제거는, 멤브레인 복합체를 통한 바이러스의 통과를 방지하면서, 멤브레인을 통한 재조합체 단백질의 통과를 허용하도록 하는 조건하에 본 발명에 기술된 아가로스 초여과 멤브레인 복합체를 함유하는 여과 장치를 통한 재조합체 단백질 함유 용액의 유동을 수반한다.
본 발명에 기술된 어떤 실시예에서, 바이러스의 제거를 위해 사용된 아가로스 초여과 멤브레인 복합체는 실질적으로 친수성, 즉, 물에 용이하게 습윤가능하다. 본 발명에 기술된 각종 실시예에서, 멤브레인에 있어서의 그의 아가로스 층은 멤브레인 친수성을 형성한다. 상기한 바와 같이, 아가로스 초여과 멤브레인 복합체는, 바이러스 제거를 위해 사용될 때, 관심대상의 단백질의 통과를 허용하면서, 멤브레인 복합체를 통한 바이러스의 통과를 방지하도록 하는 것이 바람직하다. 이는, 적어도 부분적으로, 멤브레인을 통한 관심대상의 단백질의 통과를 허용하면서, 도포된 아가로스 층의 기공들이 바이러스를 유지하도록 충분히 작을 때, 다공성 지지 멤브레인상에 아가로스 층을 갖는 것에 의해 달성된다.
어떤 실시예에서, 본 발명에 기술된 멤브레인 복합체는 장치에 내장된다. 어떤 실시예에서, 장치는 본 발명에 기술된 하나, 둘 또는 세 개의 아가로스 초여과 멤브레인 복합체로 형성되는 주름진 관을 포함한다, 어떤 실시예에서, 이와 같은 장치는 바이러스들의 제거를 위해 사용된다. 그러나, 이론에 얽매이도록 바라지 않고, 본 발명에 기술된 멤브레인 복합체를 구현하는 임의의 적절한 장치 포맷이 사용될 수 있는 것이 고려된다.
어떤 실시예에서, 본 발명에 기술된 멤브레인 복합체(홀로 또는 적절한 장치내로 채용되는 것)는 비교적 큰 바이러스(예컨대, 쥐류 백혈병 바이러스)에 대해 6보다 큰 LRV에서 또는 비교적 작은 바이러스(예컨대, 파보 바이러스)로부터 4보다 큰 LRV에서 효과적으로 바이러스를 제거하기 위해 사용될 수 있다.
어떤 실시예에서, 단백질 함유 용액으로부터 바이러스를 제거하기 위해 사용되는 장치는 본 발명에 기술된 멤브레인 복합체 여과 물질을 함유하기에 적합한 하우징을 포함하고, 또한 여과될 액체를 수용하기 위한 입구 및 여과된 액체를 제거하기 위한 출구를 더 포함하며, 상기 여과 물질은 하나, 둘 또는 세 개의 복합체의 보이드 프리 멤브레인을 포함하고, 상류층은 그의 단단한 면(tightest face)이 하류에 면하도록 배향된다.
일반적으로, 멤브레인이“타이트 사이드 다운 스트림”배향되고, 주름진 구성으로 배치된 다수의 비대칭 초여과 멤브레인들의 채용에 의해, 결과적인 필터 캡슐은 양호한 플럭스를 유지하면서 양호한 바이러스 유지 능력을 갖는다.
특정 실시예에서, 바이러스를 제거하기 위해 사용되는 여과 캡슐은 관형 하우징 및 상기 하우징 내에 실질적으로 동축상으로 둘러싸인 주름진 여과 튜브를 포함한다. 상기 여과 캡슐의 관형 하우징은 그를 통해 유체 프로세스 스트림을 포함하고 보내도록 구성될 수 있으며, 그에 따라, 유체 입구 및 여과액 출구가 제공된다. 주름진 여과 튜브의 상류에서 유체 프로세스 스트림은 유체 입구를 통해 여과 캡슐 내로 도입된다. 주름진 여과 튜브의 하류에서, 유체 프로세스 스트림은 여과 캡슐로부터 여과액 출구를 통해 방출된다.
이와 같은 장치들의 구성 및 동작에 대한 다른 상세한 내용들에 대해서는, EU 2 163 296 A1 및 미국 특허 5,736,044 A1에 의해 참조될 수 있으며, 이들의 기재는 본 발명에 참고로 채용된다. 특히, 필터 카트리지의 양태는, 본 발명에 기술된 잘명의 정신 및 범위부터 벗어남이 없이, 본 발명에 기술된 멤브레인 복합체를 채용하는 필터 캡슐의 구성에 채용될 수 있다.
단백질 용액으로부터 바이러스를 제거하기 위해, 관심대상의 하나 이상의 단백질(들) 및 하나 이상 형태의 바이러스들을 함유하는 용액은 하나 이상의 아가로스 초여과 멤브레인을 이용하는 여과 단계를 실시하며, 여과는 TFF 모드 또는 NFF 모드로 행해질 수 있다. 어느 모드에서도, 여과는, 멤브레인 복합체를 통한 하나 이상의 단백질(들)의 통과를 허용하면서, 일반적으로 20 내지 100 나노미터(nm) 직경을 갖는 바이러스를 유지하기 위한 조건 하에 행해진다. 더욱이, 용액의 여과가 완료될 때, 맴브레인은 임의의 유지된 단백질들을 제거하기 위해 물 또는 수용성 버퍼 용액으로 세척된다. 세척 단계의 사용은 실질적으로 바이러스가 제거된 단백질 용액의 높은 수율을 얻을 수 있도록 한다.
당해 기술의 지식과 결합된 본 발명은 하나 이상의 당업자가 본 발명에 기술된 방법들을 이해가능하게 실시할 수 있다.
더욱이, 당업자에게는 말할 필요도 없이, 주어진 실시예 및 나머지 설명에 있어서, 항시 조성물에 존재하는 성분 양은 전체적으로 조성물에 기초하여 오직 100중량% 또는 100몰%까지 부가되고, 지시된 백분률 범위부터 보다 높은 바이러스들이 야기되더라도 이를 초과할 수 없다. 달리 지시되지 않는 한, % 데이터는 중량에 의한 % 및 몰%이며, 비율의 예외로, 이들은, 임의 용적에서의 용제들이 혼합물에 사용되는 제조를 위해 예컨대 용리제와 같은 용적 데이터로 나타냈다.
실시예, 살세한 설명 및 청구범위에서의 온도는 항상 ℃이다.
실시예들은 예시적인 것으로 고려되어야 하는 다음의 실시예들에 의해 더 예시된다. 본 출원에 인용된 모든 참고사항, 특허 및 공개된 특허 출원의 내용들 및 도면들은 참고로 본 발명에 채용된다.
실시예
실시예 1: 아가로스 용액의 제조
이는 10중량%의 아가로스 용액, 10g의 아가로스 파우더(Hispanagar 로부터 얻어진 타입 HD2 및 Aquapor로부터 얻어진 타입 HR, ES, 3:1 및 LE)가 90g의 물에 첨가되고 30분 동안 실온에서 혼합된다. 다음, 아가로스 용액이 형성될 때까지 수화한 아가로스 혼합물이 마이크로웨이브에서 가열된다. 용액은 5분 동안 약 3500 rpm 및 70 ℃에서 원심력에 의해 탈기된다. 용액의 자유 유동 특성이 이 온도로 유지된다. 용액은 얇은 아가로스 필름 또는 층을 주조하도록 사용될 때까지 70℃로 하이브리드 오븐에서 유지된다. 다른 아가로스 용액 농도가 아가로스와 물의 적절한 상대 비를 사용하여 유사한 방식으로 제조된다.
실시예 2: 다른 첨가제를 갖는 아가로스 용액의 제조
아가로스 용액은 처음에 실시예 1에 기술된 바와 같이 제조되며, (Acro로부터 얻어진, 98%) 10g의 염화아연이 10중량% 아가로스 용액에 첨가되고 소금이 용해될 때까지 70℃로 하이브리드 오븐에서 혼합된다. 용액의 자유 유동 특성은 이들 조건하에서 유지된다. 다음, 용액은 얇은 아가로스 필름 또는 층을 주조하도록 사용될 때까지 70℃로 하이브리드 오븐에서 유지된다. 다른 염화아연 농도를 포함하는 다른 아가로스 용액 농도가, 아가로스, 연화아연 및 물의 적절한 상대 비를 사용하여 유사한 방식으로 제조된다.
실시예 3: 아가로스 초여과 멤브레인 복합체의 물 투과량 측정
물 투과량(water flux) 측정은 Amicon(이엠디 밀리포어 코포레이션, 빌레리카) 교반식 셀을 사용하여 실시된다. 습윤 멤브레인(50:50 IPA; 물 혼합물에서)이 셀에 위치된다. 셀에는 가입된 공기 공급부에 연결되고, 25 psig까지 가압된 탈이온수가 충전된다. 유출액이 표준 시험 시간에 걸쳐 수집되고 투과량이 공지의 멤브레인 영역을 사용하여 계산된다. 대안적으로, 자동 투과량 시험 기기가 멤브레인 복합체를 테스트하기 위해 사용될 수 있다.
실시예 4: 아가로스 여과 멤브레인 복합체의 분획 분자량 측정
모델 용질의 거절은 초여과 멤브레인의 성능을 평가하기 위한 가장 일반적인 방법이다. 이에 따라, 명목상 분자량 제한은 다양한 용질들로 측정될 수 있으며; 단백질이 빈번히 사용된다. UF 멤브레인의 NMWL은 일반적으로, 멤브레인이 통상적으로 90 내지 95%의 선택된 레벨 또는 리젝션으로 거절하는 가장 작은 단백질의 분자 질량이다. UF 멤브레인을 특징화하기 위해 사용될 수 있는 다른 용질들은 덱스트란들을 포함하며, 이들은 여러 가지의 분자량으로 입수가능하다. 약 1000 Da 분자량 내지 약 2,000,000 Da의 분자로부터의 전체 거절 스펙트럼이 단일 시험으로 측정될 수 있다.
분획 분자량 측정은, 무엇보다도, Separation Science and Technology, 16(30), p. 275-290(1981)에 있어서 엘. 제만 및 엠. 웨일즈에 의해 공개된 방법들에 기초한다. 특징적으로 될 멤브레인 복합체는 적절한 장치에서 1000 내지 2,000,000 Da 범위의 분자량으로 다분산계의 덱스트란을 함유하는 용액으로 문제가 된다. 테스트 동안의 투과율은 농도차 편극을 최소화하기 위해 낮은 투과량으로 제어된다. 공급 및 침투 스트림들이 샘플링되고 크기 배제 크로마토그래피(SEC)에 의해 분석되고 크로마토그래피 데이터는 덱스트란 분자 질량(molecular mass)의 함수로서 리젝션을 계산하기 위해 사용된다.
덱스트란 분자 질량을 갖는 리젝션(R)은 R=1-Cp/Cf이며, 상기 식에서 Cp 및 Cf는 각각 공급 및 투과에 있어서 주어진 분자 질량의 덱스트란 농도이다. 멤브레인이 덱스트란 공급의 90%를 유지하는 분자량은 덱스트란 리젝션 값(R90)의 9O%이다.
대표적인 아가로스 멤브레인 복합체에 대한 상기 분석으로부터의 일반적인 NMWL 데이터를 도 3에 나타냈다.
실시예 5: 65 kDa, 120 kDa 및 250 kDa NMWL 아가로스 초여과 멤브레인 복합체의 제조 방법
이 실시예는 65 kDa 명목 분획 분자량 아가로스 초여과 멤브레인 복합체를 제조하기 위한 공정을 예시한다.
0.2μm의 평균 기공 크기 및 100μm의 평균 두께를 갖는 폴리비닐리덴 불화물(PVDF) 미세다공성 멤브레인을 미세다공성 멤브레인 기판으로서 채용했다. 미세다공성 기판을 핫 플레이트에 부착하고 70℃의 온도로 유지했다.
실시예 1에서 제조된 10중량% 아가로스(타입 ES)를 함유하는 중합체 용액을 25μm 갭을 갖는 마이크로미터 조정가능 나이프를 사용하여 상기 가열된 미세다공성 PVDF 멤브레인상에 주조했다. 다음, 아가로스 피복된 멤브레인을 가열된 플레이트로부터 신속히 제거하고 20℃의 온도로 유지된 수조에 침지했다(도 1A에 도시).
Gatan, model Alto 2500에 의해 제조된 크라이오 스테이지를 상에 메브레인 이미징을 실시했다. Alto 2500은 고해상도 주사 전자 현미경(SEM)에 직접 부착되는 정교한 제조 챔버를 갖는다. 상기 챔버는 제어된 심도 파괴를 확보하는 냉각된 프랙쳐 나이프를 포함한다. 샘플들을 동결시키기 위해 분리 2 포트 신속 동결 스테이션을 사용했다. 제조된 멤브레인 복합체의 단면을 도 2A-2C에 도시했다. 아가로스 기판의 표면 위의 아가로스 코팅의 두께는 약 15μm이다.
멤브레인 복합체는 결함이 없고 표 1에 나타낸 투과량 및 유지 특성(실시예 3 및 4에 기술된 바와 같이 결정)을 갖는다.
120 kDa NMWL 아가로스 초여과 멤브레인 복합체를 다음과 같이 제조했다. 0.2μm의 평균 기공 크기 및 100μm의 평균 두께를 갖는 폴리비닐리덴 불화물(PVDF) 미세다공성 멤브레인을 미세다공성 멤브레인 기판으로서 채용했다. 미세다공성 기판을 핫 플레이트에 부착하고 70℃의 온도로 유지했다.
실시예 1에 기술된 바와 같이 제조된 10중량% 아가로스(타입 3:1)를 함유하는 중합체 용액을 25μm 갭을 갖는 버드 또는 마이크로미터 조정가능 나이프를 사용하여 상기 가열된 미세다공성 PVDF 멤브레인상에 주조했다. 다음, 아가로스 피복된 멤브레인을 핫 플레이트로부터 신속히 제거하고 20℃의 온도로 유지된 수조에 침지했다.
SEM에 의해 측정된 바와 같이, 미세다공성 기판의 표면 위의 아가로스 코팅의 두께는 약 18μm이다. 멤브레인 복합체는 결함들이 없고 표 1에 나타낸 투과량 및 유지 특성(실시예 3 및 4에 기술된 바와 같이 결정)을 갖는다. 마지막으로, 250 kDa NMWL 아가로스 초여과 멤브레인 복합체를 다음과 같이 제조했다.
0.2μm의 평균 기공 크기 및 100μm의 평균 두께를 갖는 폴리비닐리덴 불화물(PVDF) 미세다공성 멤브레인을 미세다공성 멤브레인 기판으로서 채용했다. 미세다공성 기판을 핫 플레이트에 부착하고 70℃의 온도로 유지했다.
실시예 1에 기술된 바와 같이 제조된 10중량% 아가로스(타입 HR)를 함유하는 중합체 용액을 25μm 갭을 갖는 버드 나이프를 사용하여 상기 가열된 미세다공성 PVDF 멤브레인상에 주조했다. 다음, 코팅된 멤브레인을 핫 플레이트로부터 신속히 제거하고 20℃의 온도로 유지된 수조에 침지했다.
SEM에 의해 측정된 바와 같이, 미세다공성 기판의 표면 위의 아가로스 코팅의 두께는 약 15μm이다. 멤브레인 복합체는 결함들이 없고 표 1에 나타낸 투과량 및 유지 특성(실시예 3 및 4에 기술된 바와 같이 결정)을 갖는다.
Figure pct00001
실시예 6: 주조 용액에서의 아가로스의 농도에 대한 아가로스 초여과 멤브레인 복합체의 분획 분자량 및 물 투과량의 의존성
아가로스 멤브레인 복합체를 제조하기 위해 사용되는 장치는 도 1에 나타냈다. 우선, 비다공성 플라스틱 시트(70)를 70℃로 유지된 핫 또는 가열된 플레이트(30) 아래에 접착한다. PVDF 미세다공성 멤브레인 기판(기공 크기 정격 0.2μm)을 플라스틱 시트(70)의 상부에 위치시키고 그를 플라스틱 시트(70)에 접착함으로써 제자라에 경화시켰다. 실시예 1에 기술된 바와 같이 제조된 5, 7 및 10중량% 아가로스(타입 ES)를 함유하는 중합체 용액을 약 35μm의 갭을 갖는 마이크로미터 조정가능 나이프를 사용하여 PVDF 멤브레인 기판(20)과 플라스틱 시트(70) 사이에 얇은 층으로서 산포했다. 다음, 아가로스 코팅된 멤브레인 시트쌍을 핫 또는 가열된 플레이트(30)로부터 제거하고 얼음 조에 위치시켜 아가로스 켈화를 실시하고 열적 상 반전에 의해 초여과 층을 형성했다. 다음, 멤브레인 시트쌍을 (20℃로 유지된 조에서) 물과 접촉시켜, 아가로스의 얇은 층으로 코팅된 미세다공성 기판을 남긴 채로 플라스틱 시트(70)가 제거되는 동안 아가로스 초여과 층을 손상시키지 않도록 했다.
도 4에 도시된 바와 같이, 멤브레인 분획 분자량 및 투과량은 주조 용액에서 아가로스 농도의 함수이다. 25 kDa(1.2 LMH/PSI), 47 kDa(3.7 LMH/psi), 및 1200 kDa(5.4 LMH/PSI)의 R90이 10, 7 및 5중량% 아가로스 용액에서 각각 얻어진다.
실시예 7: 주조 용액에서의 염화아연 농도에 대한 아가로스 초여과 멤브레인 복합체 분획 분자량의 의존성
대표적인 멤브레인 복합체를, 실시예 2에 기술된 바와 같이 제조된 아가로스 주조 용액(7 및 10중량% HR 타입 아가로스)의 사용하는 차이만으로 실시예 6에 기술된 바와 같이 제조했다. 도 5에 도시된 바와 같이, 주조 용액에서의 높은 염분 농도는 보다 개방된 UF 멤브레인으로 된다. 0, 5, 10, 12 및 14중량% ZnCl2를 포함하는 7중량% 아가로스 주조 용액 농도에서, 다음 각각의 R90을 얻었다: 각각, 35 kDa, 31 kDa, 44 kDa 및 300 kDa. 0, 5, 10, 15중량% ZnCl2를 포함하는 10중량% 아가로스 주조 용액 농도에서, 다음 각각의 R90을 얻었다: 각각, 15 kDa, 16 kDa, 26 kDa 및 1350 kDa.
실시예 8: 압력하에 아가로스 층 압축을 방지하기 위해 DVS와 아가로스 멤브레인 복합체의 가교
대표적인 아가로스 멤브레인 복합체를 실시예 5에 기술된 바와 같이 제조했다. 3개의 멤브레인 복합체 멤브레인 디스크들(각각의 직경 25mm)을, DI 물에 (Sigma-Aldrich로부터 얻어진) 메르캅토에탄올의 0.1, 0.5 및 1% 용액을 포함하는 20ml 탄산나트륨 용액(pH 11에서 0.5M)에 (모두 함께) 습윤시키고 6시간 동안 혼합했다. 다음, 멤브레인을 실시예 3에 기술된 바와 같이 시험했다.
도 6에 도시된 바와 같이, 복합체 멤브레인을 압력에 의해 압축성으로 될 때 15 psi로 물 투과량의 20% 손실을 야기한다. DVS와의 가교는 아가로스 겔 층의 기계적 특성을 향상시키고 압력에 의한 손상을 방지한다. 단지 0.1중량% DVS만 필요하다.
실시예 9: 아가로스 멤브레인 복합체의 건조
이 실시예는 (물에서) 20% 글리세린 용액에 있는 아가로스 멤브레인 복합체의 건조를 예시한다.
대표적인 아가로스 멤브레인 복합체를 상기 실시예에 기재된 바와 같이 제조했다. 멤브레인 복합체의 분획 분자량 및 투과량은 실시예 3 및 4에 기술된 바와 같이 결정된다. 멤브레인 복합체를 시험 교반 셀로부터 제거하고, 물에 세척하고, 습윤제로 기능하는, 수용액에 20볼륨% 글리세린으로 처리했다. 이어서, 멤브레인 복합체를 3일 동안 대기 조건하에 건조시켰다.
도 7에 도시된 비와 같이, 멤브레인 복합체의 분획 분자량은 건조 후에 변하지 않는다. 건조 전 및 후의 멤브레인 복합체의 투과량은 0.7 LMH/psi로 변하지 않는다.
실시예 10: 기판 내로의 아가로스의 침투 평가
이 실시예는 미세다공성 PVDF 기판내로의 아가로스 침투의 깊이의 평가를 예시한다.
미세다공성 기판 내로의 아가로스의 어떤 침투는 기판과 초여과 아가로스 층 사이에 충분히 강한 결합을 얻고 층간 박리에 대해 높은 저항성을 갖는 아가로스 멤브레인 복합체로 되기 위해 필요하다. 침투 깊이 분석은 Scanning Electron Microscope-Energy Dispersive Spectroscopy(SEM-EDS) Instrument(INCA300, 옥스포드 인스트루먼츠, 영국) 을 사용하여 실시된다. 미소 영역 복합 분석이 미세다공성 기판의 표면으로부터 시작하고 기판 내로 40μm 연장되는 Z방향으로 5μm 간격으로 실시된다.
대표적인 아가로스 멤브레인 복합체를 실시예 5에 기술된 바와 같이 제조했다. SEM-EDS로부터 얻어진 기본적 분석 데이터는 샘플에 나타난 산소와 불소 원자의 생대 농도를 결정하기 위해 사용된다. 불소 신호는 PVDF 미세다공성 기판으로 인한 것인 반면, 산소 신호는 아가로스로 인한 것이다. 도 8에 도시된 바와 같이, PVDF 기판 내로의 아가로스 침투의 깊이는 대략 10μm이다.
실시예 11: 아가로스의 다른 등급의 겔화 점의 결정
이 실시예는 회전 점도계를 사용하여 아가로스의 다른 등급의 겔화 점의 결정을 예시한다.
대표적인 7중량% 아가로스 용액을 실시예 1에 기술된 바와 같이 제조하고 70℃로 하이브리드 오븐에 저장했다. 브룩필드 점도 표준(Brookfield viscosity standard)(Lot#112305)을 기기 교정을 위한 검사용으로 사용했다: 기록 및 관찰, 489/502±6cp.(레그 가드는 경계 조건, 50 RPM 속도, LV2 스핀들을 설정하기 위해 사용된다).
16 ml의 아가로스 용액을, 브룩필드 점도계 Model DV-II+Pro (Brookfield Labs Inc.)에 장착된 물 자켓에 결합된 샘플 챔버에 붓는다. 샘플 챔버의 온도는 (물을 함유하는, VWR Scientific Products Model# 11301-1) 순환 온도 조를 사용하여 55℃로 설정되고, DV-II+Pro 점도계에 연결된 내장 RTD 센서를 사용하여 챔버 온도의 직접 판독이 제공된다. 아가로스 용액의 각 샘플은 데이터 포인트의 수집이 개시?? 전에 온도 제어 챔버에서 55℃로 10분 동안 평형시키도록 된다. 측정은, 2 rpm의 회전 속도 및 2%의 시작 토르크로 SC4-25 스핀들로 Wingather V3.0 소프트웨어(Brookfield Engineering Labs Inc.)를 사용하여 얻어진다.
아가로스 용액을 함유하는 챔버의 온도는 도 9에 도시된 바와 같이 점도의 1차 증가에 의해 입증된, 겔 포인트가 도달될 때까지 순환 온도 조에 얼음을 연속적으로 첨가함으로써 낮춰진다. 토르크가 95% 연장되면 데이터 수집이 중지되고 점도계는 오프된다.
겔화의 장치 온도는 7중량%로 상이한 아가로스 등급들의 대표 세트에 대해 표 2에 기록된다.
Figure pct00002
실시예 12: 세포 배양 매질을 함유하는 용액을 사용한 아가로스 초여과 멤브레인 복합체의 스루풋 및 바이러스 유지 특성
세포 배양 매질을 갖는 스루풋 및 바이러스 유지에 대해, 아가로스 초여과 멤브레인 복합체를 7중량% 아가로스(타입 3:1) 및 미세자공성 기판으로서 GEHP(0.2μ 소수성 PES)를 사용하여 실시예 1에 기술된 바와 같이 제조했다. 멤브레인 복합체는 485 kDa의 R90 및 4 LMH/psi의 투수성을 갖는다. 멤브레인 복합체 디스크(25mm)를 절단하고 4.5cm2의 필터 영역을 갖는 Swinnex®필터 홀더에 위치시켰다. 한 층의 폴리에스테르 부직물이 장치의 저부/출구 측에 사용된다. 25mm Viresolve®Pro 장치가 제어부로서 사용된다. 멤브레인 복합체는 100 kDa의 R90 및 14 LMH/psi의 투수성을 갖는다.
로드 셀이 구비된 정압 장치(constant pressure setup)에서 투수성, 배포 배양 매질 스루풋 및 바이러스 유지를 테스트했다. 중국 햄스터 난소(Chinese Hamster Ovary; CHO) 세포의 성장을 위해 이엠디 밀리포어 코포레이션 등록상표의 화학적으로 정의된 세포 배양 매질을 연구를 위해 사용했다.
모델 바이러스, 박테리아파지 PhiX-174를 농도 1.4*107PFU/ml로, pH 5, 전도성 13.5 mS/cm로 아세테이트 버퍼내에 투입한다. 장치를 10분 동안 버퍼로 세척하고 공급이 바이러스 스파이크 용기로 전환하고, 바이러스 스파이크 세포 배양 매질을 10 psi의 정압으로 각 장치를 통해 유동시켰다. 각종 시간 포인트들에서 침투 볼륨을 측정함으로써 스루풋을 모니터했다.
바이러스 분석을 위한 샘플들을 각 스루풋(15, 250 및 500 L/m2)에서 수집하고 LRV 결과들은 표 3에 나타냈다. 도 10은 아가로스 초여과 멤브레인 복합체 및 Viresolve®Pro 멤브레인의 투과량 감소를 나타낸다. 본 발명에 기술된 아가로스 초여과 멤브레인 복합체는 Viresolve®Pro 와 다른 플러깅 거동을 보이며, 투과량은 멤브에인 용량이 도달되기 전에 빠른 속도로 감소한다.
Figure pct00003
명세서는, 어디까지나 본 발명에 참고로 채용된 명세서에 인용된 참고 자료의 측면에서 이해되어야 한다. 명세서 내의 실시예들은 실시예들의 예시를 제공하며 범위를 제한하기 위한 것으로 이해되어서는 안된다. 당업자(실시자)는 많은 다른 실시예들이 본 발명에 의해 포함되는 것을 용이하게 인식할 것이다. 모든 공보 및 참고 자료들이 그들의 전체적으로 참고로 채용되었다. 참고적으로 채용된 자료들이 본 발명과 상충하거나 모순되는 범위에 대해, 본 명세서는 임의의 이러한 자료들을 대체할 것이다. 본 명세서의 임의의 참고자료의 인용은 이러한 참고자료가 종래 기술인 것을 의미하지 않는다.
달리 지시되지 않는 한, 청구범위를 포함하여, 명세서에 사용된 구성 요소들, 세포 배양, 처리 조건, 등의 양을 나타내는 모든 숫자는 용어 "약"에 의해 모든 예에서 변경되는 것으로 이해되어야 한다. 따라서, 달리 반대로 지시되지 않는 한, 수치 파라미터들은 대략적이며 본 발명에 기술된 실시예들에 의해 얻어지는 소망 특성 관점에 따라 변할 수 있다. 달리 지시되지 않는 한, 일련의 구송 요소들 앞에 오는 용어 "적어도"는 일련의 모든 구성 요소들을 지칭하는 것으로 이해되어야 한다. 통상의 기술자는 본 발명에 기술된 특정 실시예에 대해 등가물을 인식하거나 또는 단지 일상적인 실험을 사용하여 확인할 수도 있을 것이다. 이와 같은 등가물들은 다음의 청구 범위에 포함되는 것으로 이해된다.
본 발명에 기술된 실시예들의 많은 변경 및 변형예들이 본 발명의 정신 및 범위를 벗어남이 없이 이루어질 수 있을 것이며, 이는 당업자들에 명백할 것이다. 본 발명에 기술된 특정 실시예들은 단지 예시적으로 제공된 것으로 임의의 방법으로 제한되는 것을 의미하지 않는다. 상세한 설명 및 실시예들은 단지 예시적인 것으로 고려되며, 발명의 진정한 범위 및 정신은 다음의 청구범위에 의해 나타내지는 것이다.

Claims (20)

  1. 0.1μm 미만의 기공 크기를 갖는 아가로스 초여과 멤브레인 복합체로서,
    상기 복합체는 지지 멤브레인상에 아가로스 층을 갖는 다공성 지지 멤브레인을 포함하고, 상기 아가로스 층은 1 내지 100μm 범위의 두께를 포함하는, 아가로스 초여과 멤브레인 복합체.
  2. 제1항에 있어서, 상기 아가로스 층은 다공성 지지 멤브레인의 두께의 적어도 일부 내로 침투하는, 아가로스 초여과 멤브레인 복합체.
  3. 제1항에 있어서, 상기 복합체는 층간 박리(delamination)에 높은 저항성을 갖는, 아가로스 초여과 멤브레인 복합체.
  4. 제1항에 있어서, 상기 아가로스 층은 1 내지 20μm 범위의 두께를 포함하는, 아가로스 초여과 멤브레인 복합체.
  5. 제1항에 있어서, 상기 다공성 지지 멤브레인은 직물 또는 부직 중합체 물질을 포함하는, 아가로스 초여과 멤브레인 복합체.
  6. 제5항에 있어서, 상기 직물 또는 부직 중합체 물질은, 폴리에스테르, 폴리아미드, 폴리올레핀, 폴리에틸렌(PE), 폴리카프로락탐, 폴리(헥사메틸렌 아디프아미드), 폴리프로필렌, 방향족 중합체, 폴리에틸렌 테레프탈레이트(PET), 폴리에테르-에테르 케톤(PEEK), 폴리술폰, 폴리에테르술폰(PES), 할로겐화 중합체 및 플루오르화 중합체로 구성되는 그룹으로부터 선택되는, 아가로스 초여과 멤브레인 복합체.
  7. 제6항에 있어서, 상기 플루오르화 중합체는, 폴리테트라플루오로에틸렌 및 폴리비닐리덴 불화물(PVDF)로부터 선택되는, 아가로스 초여과 멤브레인 복합체.
  8. 제1항에 있어서, 상기 다공성 지지 멤브레인은 20μm 내지 500μm 범위의 평균 두께를 포함하는, 아가로스 초여과 멤브레인 복합체.
  9. 제2항에 있어서, 상기 아가로스가 침투하는 다공성 지지 멤브레인의 두께의 일부는 적어도 1-15μm인, 아가로스 초여과 멤브레인 복합체.
  10. 아가로스 초여과 멤브레인 복합체의 제조 방법으로서, 상기 방법은,
    i. 0.01μm 내지 10μm 범위의 평균 기공 크기 및 20μm 내지 150μm 범위의 평균 두께를 갖는 다공성 지지 멤브레인을 제공하는 단계,
    ii. 아가로스 용액을 제공하는 단계,
    iii. 다공성 지지 멤브레인 상에 아가로스 용액의 층을 주조하는 단계, 및
    iv. 상기 아가로스 용액의 겔화 점(gelling point) 미만의 온도로 수조 내에 아가로스 코팅된 다공성 지지 멤브레인을 침지하는 단계를 포함하고,
    이에 의해 0.1μm 미만의 평균 기공 크기를 갖는 아가로스 초여과 멤브레인 복합체로 되는, 아가로스 초여과 멤브레인 복합체의 제조 방법.
  11. 제10항에 있어서, 상기 다공성 지지 멤브레인은, 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 폴리카프로락탐, 폴리(헥사메틸렌 아디프아미드), 폴리에틸렌 테레프탈레이트, 폴리에테르-에테르 케톤, 폴리술폰, 폴리에테르술폰, 폴리테트라플루오로에틸렌, 및 폴리비닐리덴 불화폴리비닐리덴 불화물(PVDF)로 구성되는 그룹으부터 선택된 중합체를 포함하는, 아가로스 초여과 멤브레인 복합체의 제조 방법.
  12. 제10항에 있어서, 상기 다공성 지지 멤브레인은, 폴리비닐리덴 불화물 (PVDF), 초고 분자량 폴리에틸렌(UHMW-PE), 폴리카프로락탐, 폴리(헥사메틸렌 아디프아미드), 폴리술폰, 및 폴리에테르술폰으로 구성되는 그룹으로부터 선택된 중합체를 포함하는, 아가로스 초여과 멤브레인 복합체의 제조 방법.
  13. 제10항에 있어서, 단계 (ii)에서의 아가로스 용액은 1 - 12 중량% 또는 5 - 11 중량% 범위의 농도로 아가로스를 포함하는. 초여과 멤브레인 복합체의 제조 방법.
  14. 제10항에 있어서, 단계 (ii)에서의 아가로스 용액은, 15 중량% 이하의 농도로 ZnCl2를 더 포함하는. 초여과 멤브레인 복합체의 제조 방법.
  15. 제11항에 있어서, 단계 (ii)에서의 아가로스 용액은 0.01 중량% 내지 1 중량% 범위의 농도로 가교제를 포함하는. 초여과 멤브레인 복합체의 제조 방법.
  16. 제10항에 있어서, 단계 (ii)에서의 아가로스 용액은, 15 중량% 이하의 농도로 ZnCl2 및 가교제로서 디비닐술폰(DVS)을 포함하는. 초여과 멤브레인 복합체의 제조 방법.
  17. 제10항에 있어서, 단계 (ii)에서의 아가로스 용액은, 20 내지 90℃ 범위 또는 45 내지 75℃ 범위의 온도로 가열되는. 초여과 멤브레인 복합체의 제조 방법.
  18. 제10항에 있어서, 단계 (iii)에서의 다공성 지지 멤브레인은, 20 내지 90℃ 범위 또는 45 내지 75℃ 범위의 온도로 가열되는. 초여과 멤브레인 복합체의 제조 방법.
  19. 제10항에 있어서, 단계 (iv)에서, 아가로스 코팅된 다공성 지지 멤브레인은, 5 - 60℃ 범위 또는 10 - 40℃ 범위의 온도로 수조에 침지되는. 초여과 멤브레인 복합체의 제조 방법.
  20. 제10항에 있어서, 단계 (i)에서, 다공성 지지 멤브레인은, 100μm - 200μm 사이의 평균 두께 및 0.2μm의 평균 기공 크기를 갖도록 제공되는. 초여과 멤브레인 복합체의 제조 방법.
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