CN107847875B - 用于基于尺寸的分离的琼脂糖超滤复合膜 - Google Patents

用于基于尺寸的分离的琼脂糖超滤复合膜 Download PDF

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Abstract

本发明所述的实施方案涉及琼脂糖超滤复合膜及其制备和使用方法。

Description

用于基于尺寸的分离的琼脂糖超滤复合膜
相关专利
本申请要求于2015年8月17日提交的美国临时专利申请号62/205,859 和于2015年12月16日提交的美国临时专利申请号62/268,220的优先权的权益，每个申请的全部内容在此整体并入本发明。
技术领域
本发明公开的实施方案涉及包含位于多孔载体膜上的琼脂糖层的新型超滤复合结构，并且涉及用于生产这种超滤复合结构的方法。本发明还描述了这种超滤复合结构的使用方法，例如用于从生物药物溶液中除去病毒。
背景技术
超滤膜通常用于压力驱动的过滤工艺。去除病毒的膜过滤器越来越多地用于生物技术行业，以提供制造医疗产品所需的安全性。这些过滤器是用来截留很高比例的可能存在于包含医疗产品的进料中的病毒，同时产品流通过膜。
超滤(UF)膜主要用于浓缩或渗滤可溶性大分子如蛋白质、DNA、病毒、淀粉和天然或合成聚合物。在绝大多数应用中，超滤是在切向流过滤(TFF) 模式下进行的，其中进料溶液流过膜表面，小于膜孔径的分子通过(滤液)，其余的(截留物)则留在膜的上游侧。当流体通过膜时，需要再循环或添加截留物流体以保持有效的TFF操作。使用TFF方法的一个优点是，因为流体不断地扫过膜的表面，所以容易降低膜表面处和附近的结垢和溶质极化，从而延长膜的寿命。
超滤膜通常是不对称皮层膜，所述膜的大部分是在载体上，所述载体通常是膜结构的永久部分。载体可以是无纺布，或预制膜。超滤膜通过浸没流延方法制成并且是带皮层的和不对称的。最初的商业应用与蛋白质增稠有关，并且通过它们截留的蛋白质的分子量即膜的截留分子量(MWCO) 对膜进行评级。
尽管仍然在根据蛋白质测试的结果对超滤膜进行评级，但常规方法使用的是具有窄分子量分布的非蛋白质大分子，如多糖(葡聚糖)或聚乙二醇 (例如参考“A rejectionprofile test for ultrafiltration membranes and devices”, Biotechnology 9(1991)941-943)。
通过浸没流延制备超滤膜的方法是众所周知的。Marcel Dekker(1996) 所著，L.J.Zeman和A.J.Zydney编辑的“Microfiltration and Ultrafiltration: Principlesand Applications”中给出了简要的讨论。所描述的作为示例的制备方法由以下步骤组成：
a)制备具体的且控制良好的聚合物溶液；
b)将聚合物溶液以薄膜的形式流延到基底上；
c)将所得的聚合物溶液的膜在非溶剂中凝结；和
d)任选干燥超滤膜。
通常不直接控制超滤膜中的孔径。不仅铸膜液的固含量，而且非溶剂进入和溶剂离开铸膜液的相对速率都对膜孔隙率和孔径有影响。如果非溶剂在溶剂离开之前进入膜中，则聚合物在较大体积的溶剂(其充当成孔剂) 周围形成沉淀，导致形成高孔隙率和大孔径的超滤膜。反之如果溶剂离开薄膜的速率比非溶剂进入的速率快，则所得到的超滤膜具有较低的孔隙率和较小的孔。通常采用向铸膜液或非溶剂浴加入添加剂以及调节两者的温度来控制非溶剂进入流延膜和从流延膜去除溶剂的相对速率。
琼脂糖是广泛用于生产多孔珠的天然多糖。这些珠子在色谱分离中有广泛应用。最早描述制备(用于色谱应用的)琼脂糖珠子的技术使用的是温热的非水性溶剂，在通过冷却形成凝胶之前琼脂糖被乳化在所述非水性溶剂中。参见，例如，Hjerten,S.Biochim.Biophys.Acta 1964,79:393-398；和 Bengtsson et al.,S.Biochim.Biophys.Acta 1964,79:399。另一种制备琼脂糖珠的方法是如美国专利号4,647,536所公开的，将琼脂糖乳液滴入冷却的油中。这样的方法也在"Methods inEnzymology"Vol.135Part B,p.401, Academic Press,1987中进行了介绍。聚合物必须被加热到高于其熔融温度约92℃，并在水存在下溶解。在该温度下或高于该温度下，聚合物熔化，然后熔融聚合物被水溶剂化形成溶液。只要温度高于聚合物凝胶化点即约 43℃，聚合物保持可溶于水。在凝胶化点处及以下，聚合物相分离并变成水凝胶，其呈现凝胶化之前溶液所具有的任何形状。另外，随着琼脂糖接近其凝胶化点，溶液的粘度变得越来越高，因为水凝胶开始形成。
通常对于诸如在色谱介质中使用的多糖珠，加热的溶液保持在其凝胶化点以上，并被搅拌到不混溶的加热流体如矿物油或植物油中，以形成珠粒。然后冷却双相材料(不混溶流体中的琼脂糖珠)并回收珠粒。珠粒本身是扩散性多孔的，并可以用于尺寸排阻色谱。另外，它们可以通过交联，加入各种捕获化学结构，如亲和化学结构或配体、正电荷或负电荷、疏水性等，或交联与化学结构的组合来进一步处理，以增强其捕获能力。
琼脂糖已广泛用于制备多孔珠粒，其中目标产物和/或杂质在扩散驱动过程中进出其孔。
发明内容
本发明所述的实施方案涉及包含琼脂糖的新型超滤复合结构。尽管在现有技术中可以看到琼脂糖珠的相关报道，但之前还未有人如本发明所述，使用琼脂糖来制备可用作滤膜的连续的扁平多孔结构，使得目标产物和/或杂质在压力驱动过程下进入并穿过孔。
术语“琼脂糖超滤复合结构”和“琼脂糖超滤复合膜”在本发明中可互换使用。这里可互换使用的术语“复合材料”、“复合结构”和“复合膜”描述了多层多孔结构，其包含至少一个载体多孔膜(也称为基底)和沉积在所述膜上的多孔琼脂糖层。
此处所述的超滤复合膜与已有的超滤膜相比具有若干优点。具体而言，此处所述的超滤复合膜避免了在制造过程中使用有害的有机溶剂。这有助于使制造过程更简单、更安全、更经济、更环保。另外，在膜形成之后无需提取这些溶剂。由于工艺步骤较少，且通过调节琼脂糖浓度能够容易地控制超滤膜的孔径，因此制备过程得到简化。此外，此处所述的超滤复合膜表现出低蛋白结合，在高pH条件下稳定，并且也不依赖于可提取和/或可释放组合物的存在形成多孔结构。
在一些实施方案中，此处所述的超滤膜在性质上是纤维素。在一些实施方案中，提供了制备琼脂糖超滤复合膜的方法，所述方法包括以下步骤： a)提供平均孔径为0.01μm至1μm且平均厚度为10μm至500μm的多孔载体膜(也称为基底)，其中所述多孔载体膜包含选自以下组的聚合物：聚酯、聚烯烃、聚乙烯(PE)、聚丙烯、聚酰胺、聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)、聚醚醚酮(PEEK)、聚砜、聚醚砜(PES)、芳香族聚合物和氟化聚合物如聚四氟乙烯和聚偏二氟乙烯(PVDF)；b)提供琼脂糖溶液；c)在20～90℃的温度下，将琼脂糖溶液层流延到所述多孔载体膜上，从而形成琼脂糖涂覆的多孔载体膜；和d)将所述琼脂糖涂覆的多孔载体膜浸入温度低于琼脂糖溶液凝胶化点的水浴中；从而形成琼脂糖超滤膜。
在一些实施方案中，琼脂糖超滤复合膜的孔径小于0.1μm。在一些实施方案中，所述水浴包括冰水。
此处描述的方法可用于生产具有多孔载体的琼脂糖超滤复合膜，其中复合膜的截留分子量(MWCO)值为10-1000kDa(R90)。
在一些实施方案中，琼脂糖超滤复合膜包含由选自聚偏二氟乙烯 (PVDF)、聚乙烯(PE)和聚醚砜(PES)的聚合物制成的多孔载体。在一个具体的实施方案中，所述多孔载体包括聚偏二氟乙烯(PVDF)或超高分子量聚乙烯(UHMW-PE)。在基于本发明所述的方法的一些实施方案中，使用琼脂糖浓度为1-12重量％的琼脂糖溶液。在其它实施方案中，使用琼脂糖浓度为 5-11重量％的琼脂糖溶液。在一个具体的实施方案中，所述方法通过提供包含浓度高达15重量％的ZnCl2作为稳定剂的琼脂糖溶液来进行。
在本发明所述的一些实施方案中，向琼脂糖溶液中加入交联剂，从而在正跨膜压(TMP)下稳定琼脂糖层，所述跨膜压是指膜上方和下方的压力之间的压力差。因此，在一些实施方案中，在本发明所述的方法中使用包含浓度为0.01重量％-1重量％的交联剂的琼脂糖溶液。示例性交联剂是二乙烯基砜(DVS)。在本发明所述的一些实施方案中，将琼脂糖溶液加热至 20-90℃；或者45-75℃的温度。在一个具体的实施方案中，将琼脂糖溶液加热至70℃的温度。
在一些实施方案中，如本发明所述，将加热的琼脂糖溶液涂覆在多孔载体膜上，所述多孔载体膜也被加热至例如20-90℃；或者45-75℃的温度。在一个具体的实施方案中，多孔载体膜被加热到70℃的温度。琼脂糖溶液和载体膜的加热温度可以是相同或不同的。
在将琼脂糖溶液涂覆到多孔载体膜上之后，将琼脂糖涂覆的多孔载体膜浸入温度低于琼脂糖溶液的凝胶化点的水浴中。琼脂糖的凝胶化点可以使用本领域已知的方法和本发明所述的方法预先测定。本领域普通技术人员清楚如何测定琼脂糖溶液的凝胶化点。在一些实施方案中，将水浴冷却至低于室温的温度。在一些实施方案中，所述温度为5-60℃。在其它实施方案中，温度为10-40℃。
在一些实施方案中，多孔载体膜具有100μm-200μm的平均厚度和小于0.2μm的平均孔径。在一些实施方案中，多孔载体膜具有10μm-500μm 的厚度。
本发明所述的方法可用于制造在多孔载体膜上包含琼脂糖层的超滤复合膜。在一些实施方案中，琼脂糖层渗透到多孔载体膜中，由此得到高度抗分层的复合膜。已经发现，1-15μm的渗透深度得到适于过滤并且高度抗分层的膜。
此处所述的琼脂糖超滤复合膜通常包含厚度为1μm-100μm，或者1 μm-20μm的琼脂糖层。在一个具体实施方案中，琼脂糖层的厚度为10 μm-20μm。在各种实施方案中，琼脂糖层沉积在多孔载体膜上。在一些实施方案中，琼脂糖层在多孔载体膜上的沉积包括琼脂糖溶液渗透到下面的多孔载体膜中，凝胶化并随后通过冷却凝固琼脂糖溶液。
在一些实施方案中，多孔载体膜是由选自以下组的聚合物制成的纺织物或者非织物：聚酯、聚烯烃、聚乙烯(PE)、聚丙烯、聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)、聚醚醚酮(PEEK)、聚醚砜(PES)和氟化聚合物如聚四氟乙烯或聚偏二氟乙烯(PVDF)。在一些实施方案中，多孔载体膜是由选自以下组的聚合物制成的纺织聚合物纤维或非纺织聚合物纤维构成的：聚偏二氟乙烯 (PVDF)、聚乙烯(PE)、聚醚砜(PES)、聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)和聚酰胺，所述聚酰胺包括聚己内酰胺和聚(己二酰己二胺)。
如此处提供的实验数据所证明的，本发明所述的超滤复合膜包含平均厚度大于10μm的多孔载体膜。在一些实施方案中，本发明所述的超滤复合膜包含厚度为20μm-500μm的多孔载体膜。在一个具体实施方案中，多孔载体膜平均厚度为100μm。
此处还描述了使用本发明所述的琼脂糖超滤复合膜的工艺。在一些实施方案中，本发明所述的复合膜可用于从含有目标蛋白质的样品去除病毒颗粒。在一些实施方案中，目标蛋白质是重组蛋白质。在一个具体的实施方案中，目标蛋白质是单克隆抗体。
本发明所述的复合膜可以在法向流动过滤条件或切向流动过滤条件下使用，并且可以用于蛋白质溶液的纯化和/或浓缩的工艺中。在一些实施方案中，本发明所述的复合膜被包装在合适的过滤装置中。
在各种实施方案中，本发明所述的琼脂糖超滤复合膜用于基于尺寸的分离。在一些实施方案中，本发明所述的复合膜可用于从含有目标蛋白质的溶液中，例如通过基于尺寸的分离或尺寸排阻去除病毒或像病毒的颗粒。
附图说明
图1(图1A和1B)描绘了用于制备本发明所述的琼脂糖复合膜的装置。图1A描绘了具有由聚偏二氟乙烯(PVDF)制成的微孔基底(20)(即多孔载体膜)的装置(10)，其被置于70℃的热台或加热台(30)上。将琼脂糖铸膜液倒在用胶带(40)固定在玻璃板(50)上的基底(20)上。图1B描绘了包含了放置在 70℃的热台或加热台(30)上，并夹在垫片(80)和塑料板(70)之间的微孔基底 (PVDF)(即，多孔载体膜)(20)的装置(60)。所述垫片(80)用来撑开用于铺展琼脂糖铸膜液的千分尺可调节刀(90)，但在将琼脂糖铸膜溶液倒入基底(20)和塑料板(70)之间将所述垫片移除，然后使用张开的千分尺可调节刀(90)铺展琼脂糖。将所得的琼脂糖复合膜迅速与热台分离，与冰接触至少2分钟，然后浸渍于保持在20℃的水浴中，小心地剥离塑料板(70)。
图2展示了如实施例5所制备的琼脂糖超滤复合膜的高倍率SEM显微照片(场发射扫描电子显微镜)。SEM在低温条件下操作以保留孔结构，并将分析的样品冷却至低于-150℃的温度。图2A和2B是分别显示复合膜的顶部和底部的截面图(即微孔基底和琼脂糖层的界面)。图2C展示了表面图像。该膜看起来略微不对称，顶面比底面更开放。
图3显示了说明本发明所述的代表性琼脂糖复合膜的截留分子量的截留曲线。X轴表示截留分子量，而Y轴表示截留率(rejection)。如实施例 4所述进行分析。
图4说明了琼脂糖复合膜的截留分子量和流量与所使用的琼脂糖铸膜液浓度的关系。如实施例3和4所述测定R90和水流量数据。X轴表示琼脂糖浓度；右侧的Y轴表示流量，单位为LMH/PSI，左侧的Y轴表示R90。
图5说明了本发明所述的琼脂糖复合膜的截留分子量与所用的琼脂糖铸膜液的离子强度的关系。R90值如实施例7中所述测定。X轴表示所用 ZnCl2的浓度，右Y轴和左Y轴分别表示7重量％和10重量％琼脂糖溶液的R90值。不管铸膜液中琼脂糖的浓度如何，铸膜液离子强度越高则导致超滤膜更多孔。正如预期的一样，在任何给定的离子强度下，在较低的琼脂糖铸膜液浓度下，得到更多孔的超滤膜。
图6说明了琼脂糖层与DVS交联以防止其在压力下压缩。已经证明，通过用0.1％DVS溶液交联琼脂糖层可以避免在15psi的压力下流量20％的损失。X轴表示压力，单位为psi，Y轴表示归一化流量，单位为LMH/PSI。
图7说明了干燥在20％(在水中)甘油溶液中的湿琼脂糖复合膜对膜的截留分子量没有负面影响，即干燥过程不会破坏琼脂糖层的孔结构。
图8说明了琼脂糖层渗透到微孔PVDF基底上层的深度。使用 SEM-EDS仪器(INCA300，Oxford Instruments，England)获得元素分析数据，并且在Z方向上从微孔基底的表面开始，直至基底中40μm处，以5μm为间隔进行微区域组成分析(在SEM插图上由星号表示)。氟信号源于PVDF 微孔基底，而氧信号来自于琼脂糖。大部分琼脂糖位于微孔基底第一层至 10μm深度。X轴表示深度，以微米为单位，Y轴表示比例(O/F)。
图9说明了当达到凝胶化点时代表性琼脂糖溶液(7重量％)的粘度增加。使用旋转粘度计进行此处所述的分析。X轴表示温度，单位为摄氏度，Y 轴表示粘度。
图10说明了琼脂糖超滤复合膜和
Figure BDA0001559548230000071
Pro膜的特征流量衰减。将病毒刺激的细胞培养基在10psi的恒定压力下流过每个装置，并测量膜流量。通过测量不同时间点的渗透物体积来监测通过量(throughput)。X轴表示通过量，Y轴表示J/Jo值。
具体实施方式
本发明所述的实施方案涉及琼脂糖超滤复合膜及其制备和使用方法。具体而言，本发明所述的超滤复合膜是通过将琼脂糖溶液层流延到多孔载体膜(也称为基底)上而制备的。琼脂糖溶液渗透到多孔载体膜中，从而得到高度抗分层的琼脂糖超滤复合膜。
此处所用的术语“超滤膜”或“UF膜”基于国际纯粹与应用化学联合会(IUPAC)关于膜和膜工艺的术语的定义，发表于Pure Appl.Chem.,(1996), 68,1479；据此，微滤被定义为压力驱动的基于膜的分离工艺，其中大于0.1 μm的颗粒和溶解的大分子被截留，而超滤被定义为压力驱动的基于膜的分离工艺，其中小于0.1μm且大于约2nm的颗粒和溶解的大分子被截留。
因此，超滤膜被定义为能够浓缩或渗滤可溶性大分子，所述可溶性大分子在溶液中的尺寸小于约0.1μm，并且能够长时间，通常大于4小时并且不长于24小时以切向流动模式持续运行。相比之下，微孔膜能够去除大于0.1μm的颗粒并用于末端过滤应用。微孔膜通常可以让可溶性的大分子通过膜。
此处所述的方法结合了溶液和热相转化技术，并且避免了在铸膜液或非溶剂浴中使用有机溶剂。此处所述的方法还可以通过更直接的方法来控制孔径。这至少部分是由于琼脂糖凝胶的孔径相对于其它化合物的凝胶如交联葡聚糖或聚丙烯酰胺凝胶更容易控制。例如，根据美国专利号 3,527,712A，琼脂糖凝胶的孔径取决于凝胶中的琼脂糖浓度。本领域已知，随着琼脂糖浓度降低，凝胶的有效孔径增加。因此，根据琼脂糖的特定浓度，有可能对分子量在10Da和700kDa之间的分子进行分选。为了加工琼脂糖，琼脂糖聚合物必须在有水存在下加热到其约92℃的熔化温度之上。聚合物在该温度下熔化，然后熔融聚合物被水溶剂化形成溶液。根据所使用的琼脂糖的类型和浓度，只要温度在聚合物的凝胶化点即20-43℃之上，聚合物就在水中保持溶解。在凝胶化点或凝胶化点以下，聚合物相分离并变成水凝胶。用于制备本发明所述的复合膜的琼脂糖类型显示出的凝胶化点为约35-40℃，或37-39℃。
在一些实施方案中，本发明描述的琼脂糖超滤膜通过使多孔载体膜和琼脂糖热溶液经过两个压料辊之间而形成，所述两个压料辊是由(a)其上具有或不具有膜的加热的不锈钢辊；和(b)旋转圆筒形成的。
琼脂糖层的厚度和琼脂糖渗入到多孔载体膜的程度是通过进入压料辊之间的空间的入口处的溶液压力、辊的硬度计(硬度)和直径、溶液粘度和工艺速率来控制。
在另一个实施方案中，琼脂糖溶液可以通过常规辊式刮刀涂布或狭缝式模具涂布方法涂覆到多孔载体膜上。
然后使多孔载体膜在其凝胶化温度或低于其凝胶化温度下与琼脂糖的非溶剂如水接触。在一些实施方案中，可以对琼脂糖层进行另外的步骤，例如进行交联，使用功能化学物质进行化学衍生化等。
在其它实施方案中，琼脂糖超滤复合膜通过在多孔载体膜和不粘的非聚合物片材之间铺展琼脂糖溶液而形成。琼脂糖溶液的铺展可以通过任何合适的方式来实现。非限制性实例包括使用橡胶辊或鸟刀、刮片等。铺展步骤可以在温度高于琼脂糖凝胶化点的热台上进行，由此利用热相转化沿着多孔载体膜的宽度和长度在整个表面上形成超滤层。然后将琼脂糖涂覆的多孔载体膜与水接触以防止在去除不粘聚合物片材时损坏琼脂糖层，留下涂布有处于超滤范围的琼脂糖薄层的多孔载体膜。形成的琼脂糖层可任选随后进行另外的步骤，例如进行交联，使用功能化学物进行化学衍生化等。
可用于制备本发明所述的琼脂糖超滤复合膜的多孔载体膜，在本发明中也称为基底，可由聚合物例如聚乙烯、聚丙烯、聚醚醚酮(PEEK)制成，其可在多种溶剂，如DMSO、DMF和NMP存在的情况下使用。
对于多孔载体膜或基底而言，理想的是具有流动的孔隙率、机械强度、柔韧性和抗有机溶剂溶胀或溶解的能力。多孔载体膜可以包含由聚合物制成的非织物或纺织物，所述聚合物例如聚酯、聚酰胺、聚己内酰胺、聚(己二酰己二胺)、聚烯烃、聚乙烯(PE)、聚丙烯、芳香族聚合物、聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)、聚醚醚酮(PEEK)、或氟化聚合物如聚四氟乙烯或聚偏二氟乙烯(PVDF)、聚砜或聚醚砜(PES)、卤化聚合物或氟化聚合物如聚四氟乙烯或聚偏二氟乙烯(PVDF)。
在一些实施方案中，使用的多孔载体膜是微孔的。这种微孔膜可以如专利US 4,778,601A中公开的那样，由超高分子量聚乙烯(UPE)制成。这些微孔膜通常由超高分子量聚乙烯制成。该方法将超高分子量聚乙烯 UHME-PE和致孔剂(porogen)的溶液通过成型模具挤出，然后将聚合物和致孔剂进行热相分离。随后通过去除致孔剂来生成微孔结构。
这种微孔膜的制备通常包括形成超高分子量聚乙烯和致孔剂的混合物的步骤。将该混合物加热至高温以形成溶液。该溶液在中等剪切作用下通过成型模具挤出，从而形成膜。将挤出物冷却以发生相分离，在膜中形成聚合物多、致孔剂少的相和聚合物少、致孔剂多的相，然后通过去除成孔剂在膜中生成微孔结构。随后干燥所得的微孔膜。该工艺的详细描述可以在例如美国专利号4,778,601中找到，其全部内容通过援引并入本发明。在一些实施方案中，这些微孔膜适合作为用于制造此处所述的层状超滤膜的基底或载体膜。
除了上述聚合物之外，还可以使用由其它纺织或非纺织聚合物制成的多孔膜来制备本发明所述的超滤复合膜。
在一些实施方案中，适用于制备此处所述的多孔琼脂糖复合膜的多孔载体膜的平均层厚为大于10μm。在其它实施方案中，这些多孔载体膜的厚度为20μm-500μm。在其它实施方案中，采用厚度高达120μm的多孔载体膜。在一个具体的实施方案中，多孔载体膜具有100μm的平均厚度和约0.2 μm的平均孔径。
在一些实施方案中，本发明所述的琼脂糖超滤复合膜可以如图1A )和1B ) 中所示制备。为了实现多孔载体膜和琼脂糖之间的良好结合，已经发现如果聚合物载体膜在与琼脂糖溶液接触之前被加热到高温是有利的。在一些实施方案中，将多孔载体膜加热至约20-90℃的温度或加热至45-75℃的温度。在一个具体的实施方案中，多孔载体膜被加热至70℃。在琼脂糖溶液与多孔载体膜接触之前，也将琼脂糖溶液加热至升高的温度，例如加热至 20-90℃的温度或加热至45-75℃的温度。当琼脂糖溶液被流延并铺展到多孔载体膜的表面上时，希望控制琼脂糖溶液渗透到下面的载体膜的深度。因此，将用琼脂糖处理的多孔载体膜尽可能快地冷却并转变成固态。关于冷却步骤，涂覆有琼脂糖的多孔载体膜可以与冰水接触，然后与保持在低于25℃的温度的水浴接触以发生凝胶化。琼脂糖涂覆的膜也可以立即与没有冰的水接触。在一些实施方案中，水浴的温度为5-60℃。在一些实施方案中，水的温度保持在10-40℃。
为了制备琼脂糖层，通常制备包含浓度为1-12重量％或5-11重量％的琼脂糖的琼脂糖溶液。在一些实施方案中，使用市售琼脂糖型号，例如HD2、 HR、ES 3:1或LE。琼脂糖的商品来源的一个例子是Hispanagar，S.A.，Spain。琼脂糖粉末在室温下与水混合，然后加热至高温直至形成琼脂糖溶液。当琼脂糖溶液的温度达到琼脂糖熔点即约92℃时，搅拌溶液并通过离心脱气。
通常，在冷却至20-90℃或45-75℃的温度之后通过在3500rpm下离心来进行脱气。在一个具体的实施方案中，所述温度为约70℃。琼脂糖溶液保持在这个温度下，直到被用于流延琼脂糖膜。
涂覆的琼脂糖溶液还可以包含其它添加剂，例如作为稳定剂的氯化锌。所述稳定剂可以与琼脂糖粉末一起混合，并以适当的比例加入到水溶液中。以这种方式，可以制备包含浓度高达15重量％的稳定剂例如氯化锌的铸膜液。在一些实施方案中，琼脂糖溶液包含浓度为10重量％的ZnCl2。然而，甚至可以使用包含少于5重量％的ZnCl2的溶液。
为了确保琼脂糖溶液渗透到多孔载体膜中，在将琼脂糖溶液流延到膜上之前将多孔载体膜加热到约20-90℃的温度。在一些实施方案中，多孔载体膜被加热至45-75℃的温度或约70℃的温度。
当将琼脂糖溶液涂覆到多孔载体膜上时，重要的是确保刚好合适量的琼脂糖溶液渗透到多孔载体膜中。此外，不希望琼脂糖溶液堵塞多孔载体膜的孔隙。当琼脂糖溶液流延到多孔载体膜上时，通过合适的方法将其均匀地涂在膜表面。合适的方法，包括但不限于，例如使用鸟刀或具有间隙的刮片。随后，立即从加热源取下涂覆的膜，并将琼脂糖溶液冷却并凝胶化。为了实现这一点，将涂覆的膜浸入水浴中并保持在15-20℃或18-20℃温度下。在特定的实施方案中，温度为约20℃。冷却也可以通过使用冰浴和/或随后浸入水浴中来实现。
琼脂糖层也可以交联以提高耐压性。此外，也可以根据膜的所需应用，例如用作离子交换膜的应用，来对琼脂糖涂覆的膜进行表面改性。
为了交联琼脂糖层，可以将制备的琼脂糖涂覆的膜以适当的方式与含有交联剂的溶液接触。在另一个实施方案中，可以在将琼脂糖层流延到多孔膜载体上之前将交联剂添加到琼脂糖溶液中。在一些实施方案中，琼脂糖溶液中包含浓度为0.01-1重量％的交联剂。交联剂的直接加入确保了琼脂糖的均匀交联。可以使用本领域已知的和此处所述的各种交联方法。
如上所述，交联反应还可能伴随溶解的交联剂与复合膜的琼脂糖层之间的反应。合适的反应溶液可以是在水性溶剂或有机溶剂或水性-有机混合物中。有机溶剂的非限制性例子包括N-甲基吡咯烷酮、二甲基乙酰胺、二甲基亚砜、二甲基甲酰胺和类似的溶剂。
示例性的交联剂包括例如二官能或多官能环氧化物，例如表氯醇、丁二醇二缩水甘油醚(BUDGE)、乙二醇二缩水甘油醚(EDGE)、聚乙二醇二缩水甘油醚和丁烷二环氧化物。多官能N-甲基甲氧基化合物也可用作交联剂。实例包括Cymel 385和Powerlink 1174，都可从West Patterson,N.J的Cytec Industries获得。已经发现交联反应可以用交联剂浓度为约5-60重量％，或约10-40重量％的溶液进行。
在一个具体的实施方案中，使用二乙烯基砜或DVS作为交联剂。已经证明，DVS特别适用于交联此处公开的琼脂糖层。可以在流延琼脂糖层之前将DVS加入到琼脂糖溶液中，并且可以以比上面讨论的通常使用的交联剂浓度低得多的浓度使用DVS。
本领域普通技术人员可以容易地确定适用的反应条件，例如合适的浓度、温度、压力和所用设备的设置。一般而言，在更高的温度下预计反应速率更快；然而，应选择反应温度使得本发明所述的复合材料尽可能温和地改性。而且，本领域的普通技术人员也可以容易地确定反应规模的影响。例如，越大的反应容器将需要更多的时间达到反应温度和冷却。而且，可以使用较高的压力来提高反应速率。取决于反应容器，实践者可以使用连续流动反应器或其它合适的装置来改善反应物与膜的接触，从而控制反应。较高的浓度通常会增加反应速率。应用的交联剂类型以及所选择的溶剂也对确定所需的反应时间起作用。羟基离子活性是另一个重要的反应条件。
通常，使用的反应时间为约2小时-约100小时，但是最典型的反应时间是约4小时-约24小时。该反应可以在室温下进行，以及在不高于约60℃的温度下进行。在一些实施方案中，反应在25℃-约50℃的温度下进行。本领域普通技术人员将能够通过例如使用连续的辊到辊工艺(roll to roll process)来增加传质速率，或通过调节温度、浓度或任何其它参数进一步提高反应速率，从而调整或缩短反应时间。
当使用多官能环氧化合物作为交联剂时，反应在碱性条件下进行。实例包括氢氧化钠或氢氧化钾。通常使用约0.1M-约1M的氢氧化物溶液。本领域普通技术人员可以容易地确定如何平衡反应对抗琼脂糖的碱性变质。较高的氢氧化物浓度和较高的反应温度通常加速碱性变质，而较低的氢氧化物浓度和较低的温度通常减慢了变质速率以及交联反应速率。
Powderlink 1174、Cymel 385以及类似的交联剂(多官能N-甲基甲氧基化合物)用酸催化剂如甲苯磺酸通过琼脂糖上的羟基使琼脂糖交联。其它类似的酸催化剂为有机磺酸和非氧化性无机酸。通常pH值为约2-4的弱酸性或中等酸性条件是合适的。优选的催化剂是Cycyt 4040，购自Cytec Industries的磺酸催化剂。本领域的普通技术人员非常清楚，强酸性条件可能导致膜变质，因此不被推荐。
琼脂糖膜和交联反应物之间的反应可以在水溶液中进行，例如在100％的水中或与溶剂如甲基乙基酮、甲基戊二醇、丙酮或其它酮的水中进行。但是，以上列举的水溶液不具有限制性。在一个具体的实施方案中，交联步骤在碱性环境中进行。
本发明所述的超滤琼脂糖复合膜可以使用本领域已知的任何合适的技术或此处所述的那些技术来改性。在一些实施方案中，可以制备适合作为离子交换材料的膜。
此处所用的术语“离子交换材料”是指其上固定有共价键结合的带电取代基的高分子量基质。为了达到总体电荷中性，非共价结合的反离子通过离子相互作用与带电取代基结合。“离子交换材料”能够将其非共价结合的反离子交换为周围溶液的同种电荷的结合配体或离子。根据其可交换反离子的电荷，“离子交换材料”被称为“阳离子交换材料”或“阴离子交换材料”。根据带电基团(取代基)的性质，例如，在阳离子交换材料的情况下，“离子交换材料”又指磺酸或磺丙基或羧甲基树脂。此外，根据带电基团/取代基的化学性质，“离子交换材料”例如可基于共价结合的带电取代基的强度，分为强离子交换材料或弱离子交换材料。例如，在一些实施方案中，强阳离子交换材料可以包含磺酸基团(例如磺丙基)作为带电的取代基。示例性弱阳离子交换材料包含羧酸基团(例如羧甲基)作为带电取代基。示例性强阴离子交换材料包含季铵基团；而弱阴离子交换材料包含二乙基氨基乙基作为带电取代基。
此外，根据本发明所述的方法制备的复合膜的表面可包含通过一步或两步法引入的负电荷。在一步法的情况下，将电荷改性反应物加入到交联溶液中。在两步法的情况下，在交联反应之前或之后进行增加电荷反应。
用于形成带负电复合膜的合适反应物包括例如结构为X(CH2)mA的化合物或其碱金属盐，其中X是卤素，优选氯或溴；A是羧基或磺酸盐。可以控制一个或多个以下变量以控制添加到膜表面的负电荷的量：例如反应时间、反应物浓度、pH值和温度。
在本发明所述的一些实施方案中，二乙烯基砜在如美国专利号 4,591,640中所述的反应条件下用作交联剂，所述专利通过援引并入本发明。在一些实施方案中，交联反应在室温下，pH>11，在还原剂存在的条件下进行，并且未反应的乙烯基基团通过包含数个羟基的中性亲水性减活化物质钝化。
在一些实施方案中，使用缩水甘油基季铵化合物或季铵烷基卤化物赋予膜正电荷。在一些实施方案中，卤化物分子将具有Y(CH2)mB的结构，其中Y是卤素以及B是带正电的基团。
在本发明所述的一些实施方案中，交联反应在将带电基团加入到膜中之前进行。通过在加入带电基团之前进行交联反应，可以避免带同种电荷基团之间的电荷排斥，从而防止聚合物和膜的溶胀。在其它实施方案中，交联与电荷添加同时进行。在这种情况下，理想的是控制交联反应的速率，避免在加入电荷时发生溶胀。
应该理解的是，基于本领域的教导结合本申请的教导，本领域的普通技术人员将能够生产此处所述的耐溶剂琼脂糖超滤复合膜，其具有期望的孔径、电荷和其它材料特性。
使用本发明所述的方法获得超滤复合膜，其包含琼脂糖层和多孔载体膜，使得琼脂糖渗透到多孔载体膜的至少一部分厚度中，从而使得到的琼脂糖超滤复合膜高度抗分层。例如，在本发明所述的一些实施方案中，琼脂糖渗透到多孔载体膜中，由此达到1-15μm的渗透深度。
在一些实施方案中，琼脂糖层的厚度为1μm-100μm或1μm-40μm。在具体的实施方案中，琼脂糖层的厚度为10μm-20μm或15μm-20μm。应理解的是，琼脂糖层的厚度包括渗透到多孔载体膜中的琼脂糖以及位于多孔载体膜顶部的琼脂糖。在本发明所述的各种实施方案中，琼脂糖层渗透至多孔载体膜的至少一部分厚度中，随后通过冷却琼脂糖而凝胶化并固化。
本发明所述的琼脂糖超滤复合膜具有多种用途。该复合膜可用于分析应用以及工业规模生产生物制剂。在一些实施方案中，复合膜被添加到装置中。
如这里所述，本发明所述的琼脂糖超滤复合膜不仅非常适用于过滤一定尺寸的分子，而且可用于法向流动或切向流动形式的病毒提纯。
本发明所述的复合膜具有高分辨率，可用于从含重组蛋白的溶液中除去病毒。用这种复合膜去除病毒具有几个优点，例如高容量(例如，根据通过单位面积的复合膜所处理的目标蛋白质的量来测量)和高效率(例如，如通过对数减少值LRV来测量)。
例如，当通过膜过滤蛋白质水溶液以除去病毒时，膜通常具有足够小的孔径以截留病毒，同时允许目标蛋白质穿过膜。一般希望这种膜具有高的病毒截留并同时具有高通过量。
病毒截留率被定义为对数减少值(LRV)，其被定义为进料中病毒浓度 (滴定浓度)与滤液中病毒浓度(滴定浓度)的比值的对数。通过量被定义为在完全结垢发生之前可通过给定面积膜的蛋白质溶液的体积。此处使用的术语“完全结垢”是指膜的条件，其中当用膜进行过滤实现LRV为3.5或更高的病毒截留率时观察到小于膜原始流量的10％。通常观察到，通过膜的流量更高和膜表面的低蛋白结合都导致较高的通过量。给定膜的通过量值根据蛋白质溶液的类型和浓度、压力、离子强度和其它测试条件，有很大不同。在典型的工艺条件下，令人满意的超滤膜具有约1000L/m2或更高的通过量。
病毒截留膜的更具代表性的性能评价是根据Vmax方法计算的膜面积。关于该方法的更多细节可见EP 1 775 016B1，其教导通过援引并入本发明。
在一些实施方案中，病毒的去除涉及在合适的条件下使含重组蛋白质的溶液流过含有本发明所述的琼脂糖超滤复合膜的过滤装置，使重组蛋白质通过复合膜，同时阻止病毒通过复合膜。
在本发明所述的一些实施方案中，用于除去病毒的琼脂糖超滤复合膜在性质上基本上是亲水的，即易于用水润湿。在此处所述的各种实施方案中，使膜亲水的是膜中的琼脂糖层。如上所述，当用于去除病毒时，希望琼脂糖超滤复合膜阻止病毒通过复合膜，同时允许目标蛋白质通过。这至少部分通过在多孔载体膜上的琼脂糖层来实现，因为所涂覆的琼脂糖层的孔隙足够小以截留病毒，同时允许目标蛋白质通过膜。
在一些实施方案中，本发明所述的复合膜被包装在装置中。在一些实施方案中，所述装置是过滤胶囊，其包含由本发明所述的一个、两个或三个琼脂糖超滤复合膜形成的褶状管。在一些实施方案中，这样的装置用于去除病毒。然而，不希望受到理论的限制，任何包含本发明描述的复合膜的合适的装置形式都可以被使用。
在一些实施方案中，本发明所述的复合膜(单独或包含到合适的装置中) 可用于有效地除去病毒：对于相对较大的病毒(例如，鼠白血病病毒)，LRV 大于6；或对于相对较小的病毒(例如，parvo病毒)，LRV大于4。
在一些实施方案中，用于从含蛋白质溶液中除去病毒的装置包含适于容纳本发明所述复合膜过滤材料的壳体，并且还包含用于接收待过滤的流体的入口和用于排放滤液的出口，其中所述过滤材料包含一个、两个或三个无孔隙复合膜，其中上游层的朝向使得其最紧密的一侧面向下游。
一般而言，已经观察到，通过引入多个以褶状构造排列的不对称的超滤膜，膜采取“紧密侧下游”的取向，所得到的过滤器胶囊将在保持良好的流量的同时具有良好的病毒截留能力。
在一个具体的实施方案中，用于除去病毒的过滤胶囊包括管状外壳和基本同轴封装在所述外壳内的褶状过滤管。所述过滤胶囊的管状外壳可以被构造成容纳和引导液体工艺流通过其中，并且因此设置有液体入口和滤液出口。折叠过滤管上游的液体工艺流通过流体入口被引入到过滤胶囊中。在褶状过滤管的下游，液体工艺流通过滤液出口从过滤胶囊排出。
关于这种装置的构造和操作的更多细节，可以参考EP 2 163 296A1和 US 5,736,044 A1，其教导通过援引并入本发明。具体地，在不脱离此处所述的本发明的精神和范围的条件下，过滤筒的各个方面可以用于制造包含此处所述复合膜的过滤胶囊。
为了从蛋白质溶液中除去病毒，使用一个或多个琼脂糖超滤复合膜对含有一种或多种目标蛋白质以及一种或多种病毒的溶液进行过滤操作，所述过滤可以在TFF模式或NFF模式下进行。在任一种模式中，均是在允许一种或多种蛋白质通过复合膜的同时截留直径通常为20-100纳米(nm)的病毒的条件下进行过滤。另外，当溶液的过滤完成时，用水或水性缓冲溶液冲洗膜以除去任何残留的蛋白质。冲洗步骤的使用可以获得高收率的基本上不含病毒的蛋白质溶液。
本说明结合本领域的知识使得本领域技术人员能够全面地实践本发明所述的方法。
此外，对于本领域技术人员而言不言而喻的是，无论是在给出的实施例还是在说明书的其余部分中，组合物中存在的各组分的量基于组合物整体，总是相加得到100重量％或100mol％，即使由所给出的百分比范围相加会得到更高的值，也不能超过这个百分比。除非另有说明，％数据是重量％或摩尔％，例外是以体积数据显示的比例，例如洗脱液，其制备时混合物中使用特定体积比的溶剂。
在实施例、说明书以及权利要求中给出的温度总是以℃表示。
以下实施例进一步说明了实施方案，这些实施例不应被理解为限制性的。在本申请中引用的所有参考文献、专利和公开的专利申请的内容以及附图通过援引并入本发明。
实施例
实施例1：琼脂糖溶液的制备
这是制备10重量％的琼脂糖溶液的代表性实施例。向90g水中加入10g 琼脂糖粉末(从Hispanagar购得的HD2型，以及从Aquapor购得的HR、ES， 3:1和LE型)，并在室温下混合30分钟。然后将水合琼脂糖混合物在微波炉中加热直至形成琼脂糖溶液。通过在70℃和3500rpm下离心5分钟使溶液基本脱气。该溶液的自由流动特性在此温度下被保留。将该溶液保存在70℃的混合器中，直到它被用于流延琼脂糖薄膜或薄层。其它浓度的琼脂糖溶液以相似的方式使用适当的琼脂糖和水的相对比例制备。
实施例2：制备具有其它添加剂的琼脂糖溶液
这是制备含有10重量％氯化锌的10重量％琼脂糖溶液(型号HR)的代表性实施例。
首先如实施例1中所述制备琼脂糖溶液。将10g氯化锌(98％，从Acros 获得)加入到10重量％的琼脂糖溶液中，并在70℃下在混合器中混合直到盐溶解。在这些条件下，溶液的自由流动特性得以保留。然后将溶液保存在70℃的混合器中，直到它被用于流延琼脂糖薄膜。包含不同浓度氯化锌的其它浓度的琼脂糖溶液以相似的方式使用合适的琼脂糖、氯化锌和水的相对比例制备。
实施例3：琼脂糖超滤复合膜的水流量测试
水流量使用Amicon(EMD Millipore Corp.，Billerica)搅拌池进行测定。将润湿的膜(在50:50的异丙醇/水混合物中)置于池中。池中充满去离子水，连接到加压空气供应源，并加压到25psig。在标准测试时间内收集流出物，并使用已知膜面积计算流量。或者，可以使用自动流量测试仪器来测试复合膜。
实施例4：琼脂糖超滤复合膜的截留分子量测定
模型溶质的截留是评估超滤膜性能的最常用方法。因此，标称分子量限制(NMWL)可以用不同溶质来测定；通常使用的是蛋白质。超滤膜的 NMWL通常是膜在选定的截留水平，通常为90-95％下所截留的最小蛋白质的分子量。其它可用于表征超滤膜的溶质包括葡聚糖，其可获得的分子量范围很大。可以在单个测试中测量从分子量约1000Da的分子至分子量约 2,000,000Da的分子的整个截留谱图。
截留分子量的测定是基于L.Zeman和M.Walley在Separation Science andTechnology,16(3),p.275–290(1981)中所给的方法。将待表征的复合膜在合适的装置中用含有分子量为1000-2,000,000Da的多分散葡聚糖的溶液进行测试。试验过程中的渗透速率控制在低流量下，以使浓度极化最小化。对进料和渗透物流进行取样并通过尺寸排阻色谱(SEC)进行分析，使用色谱数据来计算截留值作为葡聚糖分子量的函数。
葡聚糖分子量的截留值(R)是R＝1-Cp/Cf，其中Cp和Cf分别是进料和渗透物中给定分子量的葡聚糖浓度。在膜截留90％的葡聚糖进料下的分子量是90％葡聚糖截留值(R90)。
图3中显示了利用代表性琼脂糖复合膜分析获得典型的NMWL数据。
实施例5：制备NMWL为65kDa、120kDa和250kDa的琼脂糖超滤复合膜的方法
该实施例说明了制备标称截留分子量为65kDa的琼脂糖超滤复合膜的工艺。
使用平均孔径为0.2μm和平均厚度为100μm的聚偏氟乙烯(PVDF)微孔膜作为微孔膜基底。将微孔基底放置到热台上并保持在70℃的温度。
使用具有25μm间隙的千分尺可调刀将如实施例1所述制备的含有10 重量％琼脂糖(型号ES)的聚合物溶液流延到加热的微孔PVDF膜上。然后将琼脂糖涂覆的膜迅速从加热台上取下，浸入到温度保持在20℃的水浴中 (如图1A所示)。
在由Gatan制造的Alto 2500型低温台上进行膜成像。Alto 2500具有直接连接到高分辨率扫描电子显微镜(SEM)的专用备样室。该备样室包括确保受控深度断裂的冷却断裂刀(cooled fracture knife)。使用单独的双锅速冻站来冷冻样品。图2A-2C显示了所制备的复合膜的横截面。微孔基底表面上的琼脂糖涂层的厚度约为15μm。
该复合膜没有缺陷并且具有表1中列出的流量和截留特性(如实施例3 和4中所述测定)。
如下制备NMWL为120kDa的琼脂糖超滤复合膜。使用平均孔径为0.2 μm和平均厚度为100μm的聚偏氟乙烯(PVDF)微孔膜作为微孔膜基底。将微孔基底放置到热台上并保持在70℃的温度。
使用具有25μm间隙的鸟刀或千分尺可调刀，将如实施例1所述制备的含有10重量％琼脂糖(型号3:1)的聚合物溶液流延到加热的微孔PVDF膜上。然后将琼脂糖涂覆的膜迅速从热台上取下并浸入到温度保持在20℃的水浴中。
通过SEM测定，微孔基底表面上的琼脂糖涂层的厚度为约18μm。复合膜没有缺陷并具有表1中列出的流量和截留特性(如实施例3和4中所述测定)。最后，如下制备NMWL为250kDa的琼脂糖超滤复合膜。
使用平均孔径为0.2微米和平均厚度为100微米的聚偏二氟乙烯(PVDF) 微孔膜作为微孔膜基底。将微孔基底放置到热台上并保持在70℃的温度。
使用具有25μm间隙的鸟刀将如实施例1所述制备的包含10重量％琼脂糖(型号HR)的聚合物溶液流延到加热的微孔PVDF膜上。然后将涂覆的膜从热台上快速取下并浸入温度保持在20℃的水浴中。
通过SEM测定，微孔基底表面上的琼脂糖涂层的厚度为约15μm。该复合膜没有缺陷并且具有表1中列出的流量和截留特性(如实施例3和4中所述测定)。
表1：不同琼脂糖超滤复合膜的流量和截留特征
Figure BDA0001559548230000201
实施例6：琼脂糖复合膜截留分子量和水流量与铸膜液中琼脂糖浓度的关系
图1中突出显示了用于制备琼脂糖复合膜的装置。首先将非多孔塑料板(70)粘贴到保持在70℃的热台或加热台(30)上。将PVDF微孔膜基底 (20)(孔径等级0.2μm)置于塑料板(70)的顶部，并通过将其粘贴到塑料板(70) 上原位固化。使用具有约35μm间隙的刀(90)将如实施例1中所述制备的含有5重量％，7重量％和10重量％琼脂糖(型号：ES)的聚合物溶液铺展在 PVDF膜基底(20)和塑料板(70)之间成为薄层。然后将琼脂糖涂覆的膜-板对从热台或加热台(30)中取下并置于冰浴上以进行琼脂糖凝胶化并通过热相转化形成超滤层。然后使膜-板对与水(在维持在20℃的水浴中)接触以防止在去掉塑料板(70)时损坏琼脂糖超滤层，留下涂布有琼脂糖超滤薄层的微孔基底。
如图4所示，膜的截留分子量和流量是铸膜液中琼脂糖浓度的函数。分别在10重量％、7重量％和5重量％的琼脂糖溶液浓度下得到25 kDa(1.2LMH/PSI)、47kDa(3.7LMH/Psi)和1200kDa(5.4LMH/PSI)的R90(流量)。
实施例7：琼脂糖复合膜截留分子量和铸膜液中氯化锌浓度的关系。
具有代表性的复合膜如实施例6中所述制备，唯一的区别在于使用如实施例2中所述制备的琼脂糖铸膜液(7重量％和10重量％的HR型琼脂糖)。如图5所示，铸膜液中较高的盐浓度得到更多孔的超滤膜。对于含有0、5、 10、12和14重量％的ZnCl2的7重量％琼脂糖铸膜液，分别得到如下的R90： 35kDa、31kDa、44kDa、70kDa和300kDa。对于含有0、5、10、15重量％的ZnCl2的10重量％琼脂糖铸膜液，分别得到如下的R90：15kDa、16 kDa、26kDa和1350kDa。
实施例8：琼脂糖复合膜与DVS交联以防止压力下琼脂糖层发生压缩。
如实施例5中所述制备具有代表性的琼脂糖复合膜。将三个复合膜膜盘(每个直径为25mm)(一次同时)浸泡在20ml的包含0.1％、0.5％和1％的巯基乙醇(购自Sigma-Aldrich)的碳酸钠去离子水溶液(0.5M，pH为11) 中，并混合6小时。然后如实施例3中所述测试膜。
如图6所示，由于制备的复合膜在压力下可压缩，导致在15psi下水流量损失20％。与DVS交联改善了琼脂糖凝胶层的机械性能，并防止其在压力下崩塌。仅需要0.1重量％的DVS溶液。
实施例9：琼脂糖复合膜的干燥
该实施例说明了在20％甘油(在水中)溶液中的琼脂糖复合膜的干燥。
如上述实施例中所述制备具有代表性的琼脂糖复合膜。如实施例3和4 所述测定复合膜的截留分子量和流量。将复合膜从测试搅拌池中取出，在水中洗涤，并用水溶液中20体积％的甘油处理，所述甘油用作保湿剂。随后，将复合膜在环境条件下干燥3天。
如图7所示，干燥后复合膜的截留分子量不变。干燥前后复合膜的流量保持不变，为0.7LMH/psi。
实施例10：评估琼脂糖在基底中的渗透。
该实施例说明了对琼脂糖渗透到微孔PVDF基底中深度的评估。
为了在基底和超滤琼脂糖层之间获得足够强的结合并使得琼脂糖复合膜高度抗分层，有必要使琼脂糖渗透到微孔基底中。使用扫描电子显微镜能量分散光谱仪(SEM-EDS)仪器(INCA300，Oxford Instruments，英格兰)分析渗透深度。在Z方向上从微孔基底的表面开始，直至基底中40μm处，以5μm为间隔进行微区组成分析。
如实施例5中所述制备具有代表性的琼脂糖复合膜。使用从SEM-EDS 获得的元素分析数据来确定样品中存在的氧原子和氟原子的相对浓度。氟信号源于PVDF微孔基底，而氧信号源于琼脂糖。如图8所示，琼脂糖渗透到PVDF基底的深度为约10μm。
实施例11：测定不同等级的琼脂糖的凝胶化点
该实施例说明了使用旋转粘度计测定不同等级琼脂糖的凝胶化点。
如实施例1所述制备具有代表性的7重量％琼脂糖溶液，并储存在70℃下的混合器中。使用Brookfield粘度标准(Lot#112305)检查仪器校准：报道结果/观察结果，489/502±6cp(使用护腿建立边界条件，转速为50rpm，LV2 主轴)。
将16ml琼脂糖溶液倒入适合安装在型号为DV-II+Pro的Brookfield粘度计(Brookfield Engineering Labs Inc.)上的水套中的样品室中。使用循环温度浴(含水，VWR Scientific Products型号#1130-1)将样品室的温度设定为 55℃，使用连接到DV-II-Pro粘度计的嵌入式RTD传感器直接读出样品室的温度。在收集数据点之前，将每个琼脂糖溶液的样品在温控室中55℃下平衡10分钟。使用Wingather V3.0软件(BrookfieldEngineering Labs Inc.)以及SC4-25转轴以2rpm的转速和2％的起动转矩获取测量结果。
如图9所示，通过向循环温度浴中连续加入冰来降低含有琼脂糖溶液的样品室的温度，直到达到凝胶化点，这可由粘度的一级增加证实。一旦转矩扩展95％，就停止数据收集，并且关闭粘度计。表2中记录了一组在7 重量％下不同等级的琼脂糖溶液凝胶化的起始温度。
表2：使用旋转粘度计测定的不同等级琼脂糖溶液(7重量％)凝胶化的起始温度
样品 起始温度[℃]
LE 39
HR 37
ES 39
3:1 38
实施例12：使用含有细胞培养基的溶液的琼脂糖超滤复合膜的通过量和病毒截留特性
对于使用细胞培养基的通过量和病毒截留研究，如实施例1所述，使用7重量％的琼脂糖(型号3:1)和GEHP(0.2μ疏水性PES)作为微孔基底制备琼脂糖超滤复合膜。复合膜具有485kDa的R90和4LMH/psi的水渗透率。切出复合膜圆盘(25mm)并放置在过滤面积为4.5cm2的
Figure BDA0001559548230000231
过滤器固定装置中。在装置的底部/出口侧使用一层聚酯无纺布。使用25mm
Figure BDA0001559548230000232
装置作为对照。复合膜具有100kDa的R90和14LMH/psi的水渗透率。
水渗透率、细胞培养基通过量和病毒截留率在装有测力传感器的恒压装置中测试。使用EMD Millipore Corp.专有的用于中国仓鼠卵巢(CHO)细胞生长的化学定义的细胞培养基进行研究。
将模型病毒噬菌体PhiX-174掺入pH为5，电导率为13.5mS/cm的乙酸盐缓冲液中至浓度为1.4×107PFU/ml。将装置用缓冲液冲洗10分钟，将进料切换至加有病毒的容器，并且在10psi的恒压下使加有病毒的细胞培养基流过每个装置。通过测量不同时间点的渗透物体积来监测通过量。
收集不同通过量(15、250和500L/m2)下的病毒测定样品，LRV结果显示在表3中。图10显示了琼脂糖超滤复合膜和
Figure BDA0001559548230000233
膜的流量衰减。本发明描述的琼脂糖超滤复合膜显示了与
Figure BDA0001559548230000234
膜不同的堵塞行为，其中在达到膜容量之前，流量以更快的速率衰减。
表3：利用模型病毒进料流测试的琼脂糖超滤复合膜和
Figure BDA0001559548230000241
膜的 LRV结果
Figure BDA0001559548230000242
根据说明书中引用的参考文献的教导(其通过援引并入本发明)可以最彻底的理解本说明书。说明书内的实施方案提供了对其的说明，而不应被解释为限制范围。本领域技术人员(从业人员)容易认识到，本公开涵盖许多其它实施方案。所有的出版物和参考资料全部通过援引并入本发明。就通过援引并入的材料与本说明书相矛盾或不一致的地方，本说明书将替代任何这样的材料。在此引用任何参考文献并不是承认这些参考文献是现有技术。
除非另外指明，说明书，包括权利要求书中使用的所有表示成分、细胞培养物和处理条件等的量的数字应理解为在所有情况下均由术语“约”来修饰。因此，除非另有相反的说明，数字参数是近似值，并且可以根据本发明所公开的实施方案试图获得的期望性质而变化。除非另外指明，在一系列元素之前的术语“至少”应理解为是指系列中的每个元素。本领域的技术人员将认识到，或仅仅使用常规实验手段就能确定，本发明描述的特定实施方案的许多等同物。这样的等同物旨在由所附权利要求涵盖。
在不脱离本发明的精神和范围的情况下，可以对这里公开的实施方案做出许多修改和变动，这对于本领域技术人员是显而易见的。这里描述的具体实施方案仅作为示例提供，并不意图以任何方式进行限制。说明书和实施例仅旨在被认为是示例性的，本公开的真实范围和精神由所附权利要求说明。

Claims (21)

1.一种琼脂糖超滤复合膜，其具有小于0.1 µm的孔径，其中，所述复合膜包含多孔载体膜，在所述多孔载体膜上具有琼脂糖层，其中所述琼脂糖层的厚度为1-100 µm，其中所述琼脂糖层渗透到所述多孔载体膜的至少一部分厚度中1-15 µm，以及所述琼脂糖层由具有氯化锌和浓度为0.01-1.0重量%的交联剂的溶液形成，其中所述交联剂为二乙烯基砜，所述琼脂糖超滤复合膜是通过包括将琼脂糖溶液流延到所述多孔载体膜上，然后立即将琼脂糖涂覆的多孔载体膜浸入温度低于琼脂糖溶液的凝胶化点的水浴中的方法而制备的。
2.根据权利要求1所述的琼脂糖超滤复合膜，其中，所述复合膜是高度抗分层的。
3. 根据权利要求1所述的琼脂糖超滤复合膜，其中，所述琼脂糖层的厚度为1-20 µm。
4.根据权利要求1所述的琼脂糖超滤复合膜，其中所述多孔载体膜包括纺织聚合物材料或非纺织聚合物材料。
5.根据权利要求4所述的琼脂糖超滤复合膜，其中所述纺织聚合物材料或非纺织聚合物材料选自聚酯、聚酰胺、聚烯烃、聚醚醚酮(PEEK)、聚砜、聚醚砜(PES)和卤化聚合物。
6.根据权利要求5所述的琼脂糖超滤复合膜，其中所述聚酯包括聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)；所述聚酰胺包括聚己内酰胺、聚己二酰己二胺；所述聚烯烃包括聚乙烯(PE)、聚丙烯；或者，所述卤化聚合物包括氟化聚合物。
7.根据权利要求6所述的琼脂糖超滤复合膜，其中所述氟化聚合物选自聚四氟乙烯和聚偏二氟乙烯(PVDF)。
8. 根据权利要求1所述的琼脂糖超滤复合膜，其中所述多孔载体膜的平均厚度为20 µm-500 µm。
9.一种制备琼脂糖超滤复合膜的方法，所述方法包括以下步骤：
i. 提供平均孔径为0.01 µm-10 µm且平均厚度为20 µm-500 µm的多孔载体膜，
ii. 提供琼脂糖溶液，所述溶液具有氯化锌和浓度为0.01-1.0重量%的交联剂，其中所述交联剂为二乙烯基砜，和
iii. 将琼脂糖溶液流延到所述多孔载体膜上，以及
iv. 立即将琼脂糖涂覆的多孔载体膜浸入温度低于所述琼脂糖溶液的凝胶化点的水浴中，
从而得到平均孔径小于0.1 µm的琼脂糖超滤复合膜。
10.根据权利要求9所述的方法，其中所述多孔载体膜包含选自以下组的聚合物：聚乙烯、聚丙烯、聚己内酰胺、聚己二酰己二胺、聚对苯二甲酸乙二醇酯、聚醚醚酮、聚砜、聚醚砜、聚四氟乙烯和聚偏二氟乙烯(PVDF)。
11.根据权利要求9所述的方法，其中所述多孔载体膜包含选自以下组的聚合物：聚偏二氟乙烯(PVDF)、超高分子量聚乙烯(UHMW-PE)、聚己内酰胺、聚己二酰己二胺、聚砜和聚醚砜。
12.根据权利要求9所述的方法，其中步骤(ii)中的所述琼脂糖溶液包含浓度为1-12重量%的琼脂糖。
13.根据权利要求9所述的方法，其中步骤(ii)中的所述琼脂糖溶液包含浓度为5-11重量%的琼脂糖。
14.根据权利要求9所述的方法，其中步骤(ii)中的所述琼脂糖溶液包含浓度等于或小于15重量%的ZnCl2。
15.根据权利要求9所述的方法，其中步骤(ii)中的琼脂糖溶液被加热至20-90°C的温度。
16.根据权利要求9所述的方法，其中步骤(ii)中的琼脂糖溶液被加热至45-75°C的温度。
17.根据权利要求9所述的方法，其中步骤(iii)中的所述多孔载体膜被加热至20-90°C的温度。
18.根据权利要求9所述的方法，其中步骤(iii)中的所述多孔载体膜被加热至45-75°C的温度。
19.根据权利要求9所述的方法，其中在步骤iv)中将所述琼脂糖涂覆的多孔载体膜浸入温度为5–60°C的水浴中。
20.根据权利要求9所述的方法，其中在步骤iv)中将所述琼脂糖涂覆的多孔载体膜浸入温度为10–40°C的水浴中。
21. 根据权利要求9所述的方法，其中在步骤i)中提供平均厚度为100-200 µm且平均孔径为0.2 µm的多孔载体膜。
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