CN115427486A - 离子交换膜 - Google Patents

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Abstract

[课题]本发明的课题是，提供将存在于血清等生物体试样中的外泌体简便且低成本地分离纯化的离子交换膜。[解决手段]本发明是纤维素系聚合物的2位、3位及6位中任意位置的羟基或乙酰基的至少一部分被具有正电荷的化合物取代的纤维素系离子交换膜。另外，本发明是一种外泌体的纯化方法，其包括：通过使包含外泌体的试样从所述纤维素系离子交换膜进行膜渗透来吸附所述外泌体的工序；使清洗液与所述膜接触来除去杂质的工序；使洗脱液与所述膜接触来脱附所述外泌体的工序。

Description

离子交换膜
技术领域
本发明涉及用于高纯度地纯化外泌体的离子交换膜。
背景技术
外泌体是由动物、植物、菌类等真核细胞放出的直径约30-150nm的细胞外囊泡，已知其显示出在体液中将蛋白质、mRNA、miRNA等内包并传播等、对于细胞间的信息传递而言重要的功能。近年来，已经启示外泌体参与了癌转移的亢进、癌恶化，并且已经开发了以由源自癌的外泌体表达的miRNA作为肿瘤标记物的、用于判明癌进展的预测、转移、预后的生物标记物等、着眼于外泌体的诊断用标记物。
另外，外泌体被期待通过从生物体分离纯化，从而作为将细胞内的核酸、蛋白质等内包的源自生物的输送体而应用于药物递送系统(DDS)。因此，要求将外泌体高纯度地分离纯化的技术。
作为将外泌体分离纯化的方法，可举出离心分离法、密度梯度离心法等超离心法、使用聚乙二醇等聚合物的沉淀法、尺寸排阻色谱、亲和色谱等色谱法。作为通常的方法，可举出超离心分离法，有时通过密度梯度离心来得到高纯度的外泌体。然而，超离心分离法存在由于离心过程中外泌体的结构变化、破坏导致的品质的降低、回收率低等问题。
作为除上述的超离心法以外的分离纯化法，已知使用过滤器的过滤法。该方法通过使用具有适于外泌体的分离的膜孔径的过滤膜，能够进行夹杂物与外泌体的分离，因此，能够比超离心法更简便地进行。然而，由于在过滤器表面因夹杂物而产生堵塞，因此不适合大量的分离纯化，并且难以回收被过滤器捕捉的外泌体。
作为从过滤器以高纯度回收外泌体的方法，专利文献1中公开了使用由多孔体形成的开孔基盘的分离回收方法。该发明能够以高捕捉率回收外泌体，但在回收工序中，需要赋予超声波振动、施加电场或施加压力。
另外，作为以高纯度回收外泌体的方法，已知有使用涂覆有抗体的磁性珠的方法、使用担载有肽的磁性珠的方法(专利文献2、3)。在使用磁性珠的情况下，还需要磁性材料的原料成本，回收方法也产生限制。
另外，专利文献4中公开具有离子交换基团的纤维素膜。该离子交换膜被公开为：利用碱等将乙酸纤维素多孔膜进行水解，接下来导入二乙基氨基乙基(DEAE基)等阳离子性基团而得的膜。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：国际公开第2017/154951号小册子
专利文献2：日本特开2017-067706号公报
专利文献3：国际公开第2019/039179号小册子
专利文献4：日本特开平7-081022号公报
发明内容
发明要解决的问题
本发明的目的是解决上述技术问题，其目的在于，提供能够将外泌体高纯度且低成本地分离纯化的离子交换膜。
用于解决问题的方案
本发明人进行了深入研究，结果发现，通过以下所示的方案能够解决上述问题，从而获得本发明。
即，本发明包含以下的构成。
1.一种纤维素系离子交换膜，其是纤维素系聚合物的2位、3位及6位中任意位置的羟基或乙酰基的至少一部分被具有正电荷的化合物取代而得到的。
2.根据1所述的纤维素系离子交换膜，其中，所述具有正电荷的化合物为叔胺和/或季铵。
3.根据1或2所述的纤维素系离子交换膜，其最小孔径为50nm～600nm。
4.根据1～3中任一项所述的纤维素系离子交换膜，其离子交换容量为0.03meq/g～0.9meq/g。
5.根据1～4中任一项所述的纤维素系离子交换膜，其平均厚度为10μm～1000μm。
6.根据1～5中任一项所述的纤维素系离子交换膜，其在pH6.5～7.5的范围内测定的Zeta电位为10mV～70mV。
7.根据1～6中任一项所述的纤维素系离子交换膜，该纤维素系离子交换膜的细孔径为30nm以上的细孔的比表面积为8m2/g以上。
8.根据1～7中任一项所述的纤维素系离子交换膜，其中，所述离子交换膜为细孔径从一个表面朝向另一个表面增大的非对称结构。
9.一种外泌体纯化用的器件，其包含1～8中任一项所述的纤维素系离子交换膜。
10.1～7中任一项所述的纤维素系离子交换膜的制造方法，在制造包含纤维素系聚合物的多孔基材膜后，将2位、3位及6位中任意位置的羟基或乙酰基的至少一部分取代为具有正电荷的化合物。
11.一种外泌体的纯化方法，其包括：使用1～7中任一项所述的纤维素系离子交换膜或9所述的器件，通过使包含外泌体的试样进行膜渗透来吸附所述外泌体的工序；使清洗液与所述膜接触来除去杂质的工序；使洗脱液与所述膜接触来脱附所述外泌体的工序。
发明效果
本发明的离子交换膜通过在膜厚方向上具有孔径从一个表面朝向另一个表面扩大或缩小的、所谓的非对称结构，从而能够在控制生物体液中所含的尺寸大的凋亡小体等夹杂物的膜透性的同时，提高直径30-150nm的外泌体的分离性。进一步地，通过含有正电荷基团，能够静电性地捕捉负电荷性的外泌体，能够从培养上清液中简便且高纯度地将外泌体进行分离纯化。
附图说明
图1是示出使用本发明的离子交换膜的外泌体分离的概念的示意图。
图2是制造例1的多孔基材膜的扫描型电子显微镜照片。
图3是本发明的离子交换膜的扫描型电子显微镜的照片。
具体实施方式
本发明是纤维素系聚合物的2位、3位及6位中任意位置的羟基或乙酰基的至少一部分被具有正电荷的化合物取代而得到的纤维素系离子交换膜。
本发明中，作为纤维素系聚合物，可举出乙酸纤维素、丙酸纤维素、丁酸纤维素、乙酸丙酸纤维素、乙酸丁酸纤维素、乙酸月桂酸纤维素、乙酸油酸纤维素、及乙酸硬脂酸纤维素等，从具有正电荷的化合物的导入的容易性的方面出发，优选使用乙酸纤维素。乙酸纤维素有乙酰化度、分子量不同的市售品，更优选使用乙酰化度为52～62左右的乙酸纤维素或三乙酸纤维素。
本发明中，作为具有正电荷的化合物，优选使用下述式(I)所示的叔胺或下述式(II)所示的季铵化合物。式中，R1～R3表示相同或不同的氢原子、或者碳原子数1～10的直链或支链状烷基，亚甲基的n表示1～5的整数。式中，X表示选自氟、氯、溴、碘等卤素原子、甲苯磺酸酯、三氟甲磺酸酯、甲磺酸酯等磺酸酯等离去基团、烷氧基甲硅烷基、硅烷醇等甲硅烷基、环氧基、异氰酸酯基、羧酸基中的1种以上。具有正电荷的化合物可以使用任意的取代基X，从原料获取的容易性的方面出发，优选为X具有氯、甲硅烷基、环氧基的化合物。
[化1]
Figure BDA0003902520650000041
[化2]
Figure BDA0003902520650000051
在本发明中，纤维素系离子交换膜可以是：细孔径从一个表面朝向另一个表面基本固定的、所谓的均质膜；也可以是细孔径从一个表面朝向另一个表面连续或不连续地变化的、所谓的非对称膜。另外，所述离子交换膜的最小孔径优选为50nm～600nm。非对称膜中，最小孔径层优选位于任意表面附近。最小孔径大时，会有外泌体与膜面和/或细孔表面的接触概率降低，被处理液中的外泌体的吸附率变低的情况。另外，有时无法除去细胞屑、凋亡囊泡。另一方面，最小孔径小时，会有进入至膜内部的外泌体的回收率降低、或者回收需要花费时间的情况。因此，最小孔径更优选为55nm～400nm，进一步优选为60nm～300nm。需要说明的是，对于最小孔径而言，将如后所述地使用聚苯乙烯粒子分散液进行测定时，阻止率成为80％以上的聚苯乙烯粒径作为离子交换膜的最小孔径。
另外，所述离子交换膜的表面(不具有最小孔径层的侧的表面)的平均孔径优选为100nm以上且5000nm以下。表面的平均孔径小时，会有处理速度变慢的情况。另外，表面的平均孔径大时，会有未被膜吸附而漏出的外泌体量变多从而回收率降低的情况。另外，表面的平均孔径过小或过大时均会有无法发挥深度过滤的效果的情况。需要说明的是，表面的平均孔径如后所述地，可以基于使用扫描型电子显微镜(SEM)以倍率1000～20000倍对膜的表面(一个表面及另一个表面)进行拍摄而得的照片，利用图像处理软件Image J来算出。
本发明中，被处理液可以以错流方式处理，也可以以死端方式处理。另外，使用非对称膜的情况下，可以在大孔径侧导入被处理液，也可以在小孔径侧导入。例如，对于培养上清液等、固体成分浓度低而外泌体浓度高的生物体试样，如图1所示，通过将孔径大的表面作为一次侧、将孔径小的表面作为二次侧，从而即使在将生物体试样装载于膜而使外泌体荷电吸附于膜时，也能够防止由于所吸附的外泌体使膜的细孔堵塞的情况。另一方面，对于血清、血浆、尿、乳汁等相对于外泌体浓度而言固体成分浓度比较高的生物体试样，通过将孔径小的表面作为一次侧、将孔径大的表面作为二次侧，从而能够通过表层过滤除去夹杂物，能够防止由于细孔的完全闭塞导致的膜的堵塞(参照图1)。
本发明中，纤维素系离子交换膜的离子交换容量优选为0.05meq/g～1.5meq/g。离子交换容量小时，膜的Zeta电位稳定而不能表现充分的值，对于外泌体之类的扩散常数小的纯化对象物质而言，无法将样品中的粒子充分地引至膜，吸附量变小，需要大容量的器件。另一方面，离子交换容量大时，存在有时膜的强度不充分的情况、膜的每单位体积的吸附量变得过大而发生膜堵塞的情况。需要说明的是，在使用叔胺化合物的情况下，离子交换容量优选为每单位膜重量0.03meq/g～0.9meq/g。另外，在使用季铵化合物的情况下，离子交换容量优选为每单位膜重量0.03meq/g～0.4meq/g。
本发明中，纤维素系离子交换膜的形态可以为平膜，也可以为中空纤维膜，膜的厚度优选为10μm～1000μm。膜的厚度薄时，膜的强度不足有时产生制膜、器件制作中的处置方面的问题。另一方面，膜的厚度厚时，外泌体的回收需要花费时间，或者有时回收率降低。因此，膜的厚度更优选为10μm～500μm，进一步优选为10μm～300μm。另外，在中空纤维膜的情况下，内径优选为50μm～1000μm。内径小时，在中空部流动的液体的剪断应力变大，因此有时对外泌体造成损伤。另一方面，内径大时，有时每个器件的膜面积变小。因此，内径更优选为100μm～700μm，进一步优选为100μm～500μm。
本发明中，纤维素系离子交换膜的Zeta电位在pH6.5～7.5的条件下优选为10mV～70mV的范围，更优选为15mV～65mV的范围，进一步优选为20mV～60mV。对于Zeta电位低于10mV的膜而言，对扩散常数低的外泌体的吸附力弱，有时得不到充分的吸附性。对于Zeta电位高于70mV的膜而言，有时引起膜强度的降低，另外，在以外泌体之类的粒子作为纯化对象的情况下，膜的每单位体积的吸附量过大时，会有引起膜堵塞的情况。所述纤维素系离子交换膜的Zeta电位可以使用平板Zeta电位测定用单元进行测定。
本发明中，对于纤维素系离子交换膜的比表面积而言，细孔径为30nm以上的细孔的比表面积的合计优选为8m2/g以上，更优选为15m2/g以上，进一步优选为20m2/g以上。比表面积小时，有时得不到外泌体的充分的吸附量。比表面积一般而言通过气体吸附法、水银压入法来测定。对于气体吸附法而言，能够检测大致2nm以下的微孔及2nm～50nm的介孔的比表面积，与此相对，就水银压入法而言，能够检测介孔及50nm以上的大孔。为了确保外泌体的吸附量，比表面积大为宜，外泌体不能进入细孔径不足30nm的孔内部，因此为了增大膜的每单位体积的外泌体的吸附量，由细孔径为30nm以上的介孔及大孔构成的比表面积需要充分大。需要说明的是，细孔的比表面积过大虽然不会成为问题，但优选为150m2/g以下，更优选为120m2/g以下。
另外，离子交换膜的气孔率优选为40％以上。气孔率过小时，外泌体吸附的区域变少，反之，气孔率过大时，有时无法保持膜的强度。因此，气孔率更优选为45％以上且90％以下，进一步优选为50％以上且85％以下，进一步更优选为55％以上且85％以下。
在将本发明的离子交换膜用于外泌体的分离纯化时，优选将Zeta电位、比表面积及气孔率等调整为特定的范围。如上所述，外泌体是大小为30nm～150nm、在表面具有负电荷的细胞外囊泡。例如，在使生物体试样、细胞培养上清液中的外泌体高效地吸附脱附的情况下，细孔过小时(微孔过多时)，外泌体不能进入至细孔内，因此即使增大膜面积(比表面积)，也无法获得吸附区域(吸附容量)。另外，细孔过大时(大孔过多时)，膜表面与外泌体的距离过远，电吸引力难以发挥作用，或者直径超过150nm的细胞外囊泡进入细孔内，目标外泌体的吸附效率降低。另一方面，有时离子交换膜具有某种程度的微孔为宜。生物体试样、细胞培养上清液中大量地包含各种小分子量物质，这些之中也有较多具有电荷的物质。通过使这样的小分子量物质吸附于微孔内，能够将介孔、大孔的吸附部位有效地用于外泌体的吸附。细孔径不足30nm的细孔的比表面积优选为30m2/g以上且80m2/g以下。
以下，对本发明的纤维素系离子交换膜的制造进行说明。
本发明中，对于离子交换膜的制造，可以使用导入了离子交换基团的聚合物来进行制膜，也可以在制造了纤维素系多孔基材膜后导入离子交换基团。作为后者的例子，对以下方法进行说明：在制造包含纤维素系聚合物的多孔基材膜后，将2位、3位及6位中任意位置的羟基或乙酰基的至少一部分取代为具有正电荷的化合物，由此，得到纤维素系离子交换膜的方法。
本发明中，包含纤维素系聚合物的多孔基材膜可以使用如下方法：将纤维素系聚合物与溶剂及非溶剂混合而制作出制膜溶液后，吐出成中空状，在空气中进行干燥的方法(干式法)；导入至凝固浴中使其凝固的方法(湿式法)；使温度急剧变化的方法(热诱导型相分离法)；拉伸法等。虽然可以使用任意方法，但是，在制膜溶液的吐出后在凝固浴中使之凝固的干湿式法从制膜管理的容易性、不需要复杂的设备等方面出发是优选的。另一方面，对于平膜而言，通过将纤维素系聚合物溶解于溶剂中，将溶液均匀地涂布于玻璃等基材，浸渍于凝固液中使其凝固后，进行清洗，根据需要进行干燥，由此能够制作多孔基材膜。作为制膜溶液中的纤维素系聚合物的浓度，优选为5wt％～40wt％的范围，更优选为10wt％～35wt％的范围。
作为用于制膜溶液的制备的溶剂，只要是纤维素系聚合物可溶解的溶剂就没有限制，商业上容易获取、制膜时具有适度的粘性的γ-丁内酯、N-甲基吡咯烷酮、二甲基乙酰胺等极性溶剂是优选的。所述溶剂可以直接单独使用，也可以混合使用。另外，根据需要，可以添加水、甘油、乙二醇、三乙二醇、聚乙二醇(200、400)等非溶剂。制膜溶液中的溶剂与非溶剂的混合比(溶剂/非溶剂)优选为90/10～10/90。
本发明中，凝固液优选使用包含溶剂、非溶剂及水的混合液。另外，凝固液中的溶剂/非溶剂比优选与制膜溶液中的溶剂/非溶剂比一致。通过使制膜溶液与凝固液的溶剂/非溶剂比一致，从而在连续制膜时也能够抑制凝固液的组成变动。在平膜的情况下，N-甲基吡咯烷酮与水的混合溶液的重量比优选为30∶70～50∶50的范围，更优选为40∶60～50∶50的范围内。通过将凝固浴设为这样的组成，与凝固浴最初接触侧的膜表面的孔径大于与基材的接触面侧的膜表面的孔径，相对于厚度方向形成非对称结构。凝固浴中的N-甲基吡咯烷酮的浓度为25％以上且不足30％时，与凝固浴最初接触侧的膜面的孔径等于与基材的接触面侧的膜表面的孔径，有膜的非对称结构被缓和的倾向。此外，凝固浴中的N-甲基吡咯烷酮的浓度不足25％时，在与凝固浴最初接触侧的膜面容易形成没有明确的孔的致密层。凝固液的温度优选为5～60℃。
得到的多孔基材膜用温水清洗来除去过剩的溶剂等。清洗后的多孔基材膜可以在水中保存，也可以在细孔内填充甘油水溶液等细孔保持剂后进行干燥。
所述得到的多孔基材膜接下来进行导入离子交换基团的处理。具体而言，进行脱乙酰化处理后，进行对于羟基的荷电(日文：荷電)赋予处理。作为一例，作为对纤维素系多孔基材膜的羟基取代正电荷性基团来制作阳离子性纤维素膜(离子交换膜)的方法，将所述纤维素系多孔基材膜在碱存在下浸渍于非溶解性溶剂中，滴加具有正电荷的化合物的溶液，在加热条件下使其反应，通过用醇进行淬灭能够进行制作。
作为所述非溶解性溶剂，只要是纤维素系多孔基材膜不溶解的溶剂、且是具有正电荷的化合物溶解的溶剂就没有特别限制。例如，水、四氢呋喃(THF)、二甲基亚砜(DMSO)、二甲基甲酰胺(DMF)等是合适的例子，可以根据原料的溶解性来单独或混合使用。
作为用于脱乙酰化的碱，可以使用氢氧化锂、氢氧化钾、氢氧化钠、氢氧化铯等氢氧化物、及碳酸盐、有机胺等。其中，优选使用工业上廉价的氢氧化钠。作为使用的碱的浓度，优选为0.05质量％～5.0质量％的范围。另外，优选相对于膜重量为1.0质量％～10.0质量％的范围。碱的浓度低时，无法增加荷电基团的导入量，无法增大每单位容积的外泌体吸附量。另一方面，碱的浓度高时，膜的溶胀度变大，因此在荷电基团导入后的离子交换膜中会变得无法保持基材膜的结构(细孔径)、物性(膜强度)。因此，碱的浓度更优选为0.1～2.5质量％，进一步优选为0.2～2.0质量％。
作为上述反应温度，优选为50～80℃，更优选为50～70℃。反应温度低时，由于反应不足，会有引起正电荷基团的取代率降低的情况。反应温度高的情况下，会有膜发生热变形的情况。
通过上述具有正电荷的化合物的添加量，能够控制对于纤维素膜的荷电基团赋予量。例如，使用含环氧基的叔胺化合物的情况下，非溶解性溶剂中的上述叔胺化合物的浓度优选为0.01mol/L～3.0mol/L的范围，更优选为0.02mol/L～1.5mol/L的范围。该情况下，离子交换容量相当于每纤维素膜重量0.05meq/g～0.9meq/g。使用含环氧基的上述季铵化合物的情况下，非溶解性溶剂中的上述季胺化合物的浓度优选为0.01mol/L～1.0mol/L的范围，更优选为0.02mol/L～0.5mol/L的范围。该情况下，离子交换容量相当于每纤维素膜重量0.05meq/g～0.4meq/g。正电荷的荷电基团赋予量过多时，聚合物每1分子的正电荷基团的含量变高，因此水溶性变高，会有水中的膜强度变弱的情况。另外，正电荷的荷电基团赋予量过小时，会有外泌体的捕捉效率变低的情况。
本发明中，离子交换膜优选设为收纳于具有用于导入被处理液的导入口、和将经离子交换处理的被处理液排出的排出口的容器内的器件的形态。该器件具有由离子交换膜分隔开的第1室和第2室，导入至第1室的被处理液透过离子交换膜而移动至第2室。此时，被处理液中的外泌体吸附于离子交换膜的表面及细孔表面。
本发明中，作为使用离子交换膜将外泌体分离纯化的方法，优选经历以下工序：使包含外泌体的试样(被处理液)透过纤维素系离子交换膜，使所述外泌体吸附的工序；使清洗液与所述纤维素系离子交换膜接触来除去杂质的工序；使洗脱液与所述纤维素系离子交换膜接触，使所述外泌体脱附的工序。
作为包含外泌体的试样(被处理液)，没有特别限定，能够以培养上清液(细胞培养液)、血液(血清、血浆)、尿、髓液、淋巴液、腹水、乳汁等、以及均质提取液等作为对象。
使外泌体吸附于纤维素系离子交换膜的条件没有特别限定，使包含外泌体的被处理液通过如前所述的错流过滤或死端过滤而与所述离子交换膜接触即可。本发明中，外泌体利用的是通过其表面负电荷而荷电吸附于具有正电荷的离子交换膜(阴离子交换膜)的机理，但过滤速度过快时，有时给从所述膜的内部通过的外泌体造成损伤，因此优选设为0.3mL/min/cm2～100mL/min/cm2。
在使外泌体吸附后的所述离子交换膜上，也吸附被处理液所包含的杂质(通过荷电吸附、疏水性相互作用吸附的蛋白质等)，因此，优选为了提高所回收的外泌体的纯度而进行清洗处理。作为用于清洗处理的清洗液，优选使用缓冲液或包含低浓度的生理盐水的缓冲液。缓冲液例如可举出柠檬酸缓冲液、磷酸缓冲液、tris缓冲液、磷酸缓冲生理盐水等。
进行清洗而除去了杂质的离子交换膜接下来为了将吸附于离子交换膜的外泌体溶出而进行与洗脱液接触的处理。荷电吸附于离子交换膜的外泌体能够通过使盐浓度、pH变化而容易地脱离。使用盐溶液作为洗脱液的情况下，优选使用氯化钠水溶液。使用氯化钠水溶液的情况下，只要为接近生物体的电解质浓度的浓度范围即可，例如优选为0.1mol/L～1.5mol/L的范围。盐浓度低时，有时无法使外泌体溶出。另外，盐浓度高时，有时通过清洗未完全除去的杂质溶出而使回收的外泌体的纯度降低。外泌体的回收率优选为70％以上。
实施例
以下示出实施例来具体地对本发明进行说明，但本发明不限于实施例。
[多孔基材膜的制作]
(制造例1)
将乙酸纤维素(Sigma Aldrich公司制、分子量5000、取代度2.45)11质量％、γ-丁内酯(Nacalai Tesque公司制)53质量％、N-甲基吡咯烷酮(以下，有时简记为NMP)(NacalaiTesque公司制)36质量％均匀地溶解，制作制膜溶液。将制膜溶液进行2小时脱气后，在室温、相对湿度62％的条件下，使用将隙间设定为0.2mm涂敷器将上述溶液均匀地铺展到玻璃板上。连同玻璃板轻轻地投入凝固液(NMP/水(RO水)＝48/52)中，使其凝固。凝固结束后，从凝固液中将膜提起，进行水洗得到多孔基材膜1。
(制造例2)
作为凝固液的NMP/水(RO水)的混合比，使用55/45，除此以外，通过制造例1记载的方法，得到多孔基材膜2。
(制造例3)
作为凝固液的NMP/水(RO水)的混合比，使用60/40，除此以外，通过制造例1记载的方法，得到多孔基材膜3。
[离子交换膜的制作]
(实施例1)
在室温下将上述制造例1中得到的多孔基材膜1浸渍于0.4质量％氢氧化钠水溶液中4小时，实施脱乙酰处理。对于得到的膜，将相对于膜重量为5质量％的氢氧化钠作为催化剂，以氢氧化钠浓度成为0.3质量％的方式添加水，使膜浸渍。将缩水甘油基三甲基氯化铵(GTMAC、东京化成公司)的投入量设为0.15mol/L，在65℃进行4小时反应使膜阳离子化，制作离子交换膜1。
(实施例2)
使用在上述制造例2中得到的多孔基材膜2，除此以外，通过与实施例1同样的方法制作离子交换膜2。
(实施例3)
使用在上述制造例3中得到的多孔基材膜3，除此以外，通过与实施例1同样的方法制作离子交换膜3。
(实施例4)
将缩水甘油基三甲基氯化铵的投入量设为0.23mol/L，除此以外，通过与实施例1同样的方法制作离子交换膜4。
(实施例5)
替代缩水甘油基三甲基氯化铵而使用N，N-二乙基-N-缩水甘油胺(DOA、Enamine公司)，除此以外，通过与实施例1同样的方法制作离子交换膜5。
(实施例6)
使在制造例1中得到的多孔基材膜在6质量％氢氧化钠水溶液(20℃)中溶胀后，加入至氢氧化钠与N，N-二乙基-N-缩水甘油胺的重量比为4：7、且氢氧化钠与N，N-二乙基-N-缩水甘油胺的合计重量的水溶液浓度为4质量％的浴中，在浴温度75℃进行20分钟反应。反应结束后，用去离子水进行清洗并使其干燥，得到离子交换膜6。
(粒子的阻止率评价)
使用聚苯乙烯粒子的分散液来评价多孔基材膜及离子交换膜的阻止率。使各种尺寸的聚苯乙烯粒子分散于0.01质量％、Tween20水溶液中而得的溶液在操作压10kPa下透过膜，得到透过液。以250nm的吸光度测定原溶液及透过液中的聚苯乙烯粒子浓度，通过下述式算出阻止率。
阻止率(％)＝{1-(Ca-Cb)/Ca}×100
Ca：原溶液的聚苯乙烯粒子浓度
Cb：透过液的聚苯乙烯粒子浓度
使用粒径为79、132、208、262、313、420、460、616nm的聚苯乙烯进行阻止率的测定，将阻止率成为80％的聚苯乙烯粒径作为最小孔径。
制造例1～3中制作的各多孔基材膜的阻止率示于表1。
[表1]
Figure BDA0003902520650000141
(膜的结构观察)
将上述得到的膜载置于SEM用试样台并在室温下干燥，进行铂蒸镀，利用扫描型电子显微镜(日立制SU-1500)进行观察。
(膜的大孔径侧的平均孔径的测定)
针对用10000倍观察的膜的所述表面SEM图像，按照以下的步骤测定大孔径侧的平均孔径。在图像处理软件Image J上打开图像，从工具栏使用直线工具在比例尺的范围内画线，选择Analyze>Set Scale，在“Known Distance”中输入比例尺的长度、在“Unit oflength”中输入单位。在Image>Adjust>Auto Threshold中，将Method的模式设定为Default，选择OK进行二值化。在Analyze>Set Measurements中，确认“Feret‘s diameter”已被勾选，按下OK。在Analyze>Analayze Particles中，将“Size(pixel^2)”设为0-Imfinity，确认“Display results”“Exclude on edges”“Include holes”的各框已被勾选，选择OK，在Results画面中得到弗雷特直径的测定数据。为了消除15像素以下的噪声，以与弗雷特直径相同的单位计算相当于15像素的长度，消除其以下的值，算出弗雷特直径的平均值。
(离子交换容量的测定)
离子交换容量测定如下述地进行测定。制备0.1质量％的溴酚蓝(BPB)水溶液，使膜浸渍1小时进行染色。将染色后的膜进行水洗后，浸渍于8质量％氯化钠水溶液中，使吸附于膜的BPB溶出。测定BPB溶出的8％氯化钠水溶液的590nm吸光度，算出吸附于阳离子化膜的摩尔数。
(Zeta电位的测定)
膜的Zeta电位是在Zetasizer Nano ZS(Malvern公司制)安装平板Zeta电位测定用单元(ZEN1020)，在pH6.5～7.5的离子交换水中测定氧化铝粒子的迁移率而算出。
(比表面积及气孔率的测定)
比表面积及气孔率是使用细孔分布测定器件[AutoPore V9620(Micromeritics公司制)]在以下的条件下进行测定。
取试样0.06～0.08g于标准池(容积6mL)，在初始压2.2kPa(相当于细孔直径约560μm)的条件下进行测定。水银参数设定为装置默认的水银接触角130.0度、水银表面张力485.0dynes/cm。对于细孔分布，将浸透至样品内的水银的Log微分体积的推移相对于细孔径作图，得到细孔分布曲线。另外，利用DA(Dubinin-Astakhov)法，由得到的细孔容积求出气孔率。
对于比表面积，测定相对于各众数径(日文：モ一ド径)D的细孔容积V，由下述式求出相对于各众数径D的比表面积S，由0.03μm～500μm范围的总和算出总比表面积。
S＝4V/D
(使用培养上清液的外泌体的回收)
将HEK-293细胞的培养液低速度离心，得到除去游离细胞而得的上清液。将在实施例及比较例中得到的膜(直径25mm)固定于支架，将培养上清液液以透过速度2mL/min的速度透过。接下来，通入三磷酸缓冲液(5mL)，将膜内部的杂质除去后，通入0.8M的氯化钠水溶液(10mL)。通液后的氯化钠水溶液中的外泌体的回收率通过利用纳米粒子分析系统(NanoSight、Malvern Panalytical)测定处理前后的10nm～900nm的粒子数来求出。源自HEK-293细胞的上清液中，以2×109个/ml的浓度包含外泌体。
(比较例1)
使用制造例1的多孔基材膜1，实施外泌体的回收测试。
(比较例2)
将源自HEK-293细胞的培养液低速度离心，得到除去游离细胞而得的上清液。将上清液以150000×g进行3小时超离心，将颗粒再悬浮于tris缓冲液。
(比较例3)
将非溶解性溶剂设为水∶DMSO＝1∶1，将缩水甘油基三甲基氯化铵的投入量设为6mol/L，除此以外，通过与实施例1同样的方法制作离子交换膜。
(比较例4)
作为多孔基材膜使用ADVANTEC公司(C300A047A)，除此以外，通过与实施例1同样的方法制作离子交换膜。
(比较例5)
将缩水甘油基三甲基氯化铵的投入量设为0.01mol/L，除此以外，通过与实施例1同样的方法制作离子交换膜。
将使用在实施例1-6及比较例1、3、4、5中得到的膜的各种试验结果及比较例2中得到的结果总结于表2。
[表2]
Figure BDA0003902520650000181
根据表2的结果显然可知，实施例的离子交换膜的细孔结构(微孔～大孔)与非对称性的平衡优异，且具有合适的离子交换容量，因此显示出高的外泌体回收率。另外，如图2所示，对于制造例1的多孔基材膜，确认到在基台面侧与空气面侧孔径不同、且在膜截面方向细孔径发生变化的非对称结构。另外，根据图3显然可知，本发明中在导入荷电基团的前后，膜结构没有溶胀等大的变化(图3)。另一方面，对于比较例1的多孔基材膜1而言，可能是由于外泌体对膜的吸附量少，故成为回收率低的结果。对于比较例3的膜而言，离子交换容量过大而无法保持膜形状。对于比较例4的膜而言，可能是由于介孔～大孔的比率(比表面积)过低，故无法获得充分的外泌体的回收率。对于比较例5的膜而言，可能是由于离子交换容量及Zeta电位过低，故无法获得充分的外泌体的回收率。
产业上的可利用性
根据本发明，能够将生物体试样中所含的外泌体简便且低成本地纯化分离。
附图标记说明
1···离子交换膜
2···杂质(大)
3···外泌体
4···杂质(小)。

Claims (11)

1.一种纤维素系离子交换膜，其是纤维素系聚合物的2位、3位及6位中任意位置的羟基或乙酰基的至少一部分被具有正电荷的化合物取代而得到的。
2.根据权利要求1所述的纤维素系离子交换膜，其中，所述具有正电荷的化合物为叔胺和/或季铵。
3.根据权利要求1或2所述的纤维素系离子交换膜，其最小孔径为50nm～600nm。
4.根据权利要求1～3中任一项所述的纤维素系离子交换膜，其离子交换容量为0.1meq/g～0.9meq/g。
5.根据权利要求1～4中任一项所述的纤维素系离子交换膜，其平均厚度为10μm～1000μm。
6.根据权利要求1～5中任一项所述的纤维素系离子交换膜，其在pH6.5～7.5的范围内测定的Zeta电位为10mV～70mV。
7.根据权利要求1～6中任一项所述的纤维素系离子交换膜，该纤维素系离子交换膜的细孔径为30nm以上的细孔的比表面积为8m2/g以上。
8.根据权利要求1～7中任一项所述的纤维素系离子交换膜，其中，所述离子交换膜为细孔径从一个表面朝向另一个表面增大的非对称结构。
9.一种外泌体纯化用的器件，其包含权利要求1～8中任一项所述的纤维素系离子交换膜。
10.权利要求1～7中任一项所述的纤维素系离子交换膜的制造方法，在制造包含纤维素系聚合物的多孔基材膜后，将2位、3位及6位中任意位置的羟基或乙酰基的至少一部分取代为具有正电荷的化合物。
11.一种外泌体的纯化方法，其包括：
使用权利要求1～7中任一项所述的纤维素系离子交换膜或权利要求9所述的器件，通过使包含外泌体的试样进行膜渗透来吸附所述外泌体的工序；使清洗液与所述膜接触来除去杂质的工序；使洗脱液与所述膜接触来脱附所述外泌体的工序。
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