ES2898254T3 - Métodos para aislar microvesículas y extraer ácidos nucleicos de muestras biológicas - Google Patents

Abstract

Un método para extraer ADN y ARN de una muestra biológica que comprende: (a) proporcionar una muestra biológica; (b) poner en contacto la muestra biológica con una superficie de captura bajo condiciones suficientes para retener el ADN libre y las microvesículas de la muestra biológica sobre o en la superficie de captura, en la que la superficie de captura comprende una membrana o una o más perlas que son intercambiadores aniónicos funcionalizados con amonio cuaternario R-CH2-N+(CH3)3, o una membrana o una o más perlas que están cargadas de forma positiva y funcionalizadas con amonio cuaternario R-CH2-N+(CH3)3; (c) poner en contacto la superficie de captura con un reactivo de lisis basado en tiocianato de guanidinio mientras el ADN libre y las microvesículas están sobre o en la superficie de captura, liberando así el ADN y el ARN de la muestra y produciendo un homogeneizado; y (d) extraer el ADN, el ARN o tanto el ADN como el ARN del homogeneizado.

Description

DESCRIPCIÓN

Métodos para aislar microvesículas y extraer ácidos nucleicos de muestras biológicas

CAMPO DE LA INVENCIÓN

La invención proporciona nuevos métodos y kits para aislar ácidos nucleicos de muestras biológicas, que incluyen ADN libre y/o a Dn libre y ácidos nucleicos que incluyen al menos ARN de microvesículas, y para extraer ácidos nucleicos de las microvesículas y/o de las muestras biológicas.

ANTECEDENTES

Las vesículas de membrana que se liberan de las células se denominan colectivamente como microvesículas. Las microvesículas de diversas fuentes celulares se han estudiado ampliamente con respecto al contenido de proteínas y lípidos. Recientemente, se ha encontrado que las microvesículas también contienen tanto ADN como ARN, incluyendo ADN genómico, cADN, ADN mitocondrial, microARN (miARN) y RNA mensajero (mARN).

Debido a la información genética y proteómica contenida en las microvesículas liberadas por las células, la investigación actual está dirigida a utilizar microvesículas para obtener un mayor conocimiento del estado de estas células, por ejemplo, el estado de enfermedad o la predisposición a una enfermedad. Además, la investigación actual también está dirigida a utilizar el ADN libre para obtener un mayor conocimiento del estado de las células.

Por consiguiente, hay una necesidad de métodos de aislamiento de ADN libre y para aislar microvesículas de muestras biológicas y métodos de extracción de ácidos nucleicos de alta calidad para el diagnóstico exacto de condiciones médicas y enfermedades.

COMPENDIO DE LA INVENCIÓN

La presente invención proporciona métodos para el aislamiento de ADN libre (“cfADN”, también conocido como ADN circulante) y/o para el aislamiento combinado de cfADN y ácidos nucleicos que incluyen al menos el ARN de las microvesículas de una muestra capturando el ADN, ADN y ARN, y/o microvesículas a una superficie, lisando posteriormente las microvesículas para liberar los ácidos nucleicos, particularmente ARN, contenidos en ellas, y eluyendo el ADN y/o ADN y ácidos nucleicos que incluyen al menos ARN de la superficie de captura. Los expertos en la técnica apreciarán que la fracción de microvesículas también incluye ADN. Por consiguiente, la lisis de la fracción de microvesículas libera tanto ARN como ADN. Además, el ADN aislado puede provenir de cualquiera de una variedad de fuentes que incluyen, pero no están limitados a nucleosomas y otras fuentes de ADN libre.

Los procedimientos anteriores usados para aislar y extraer ácidos nucleicos de una muestra, p.ej., cfADN y/o ADN y ácidos nucleicos que incluyen al menos ARN de la fracción de microvesículas de una muestra, dependen del uso de la ultracentrifugación, p.ej., hacer girar a más de 10.000 xg durante 1-3 h, seguido por la eliminación del sobrenadante, lavar los gránulos, lisar los gránulos y purificar los ácidos nucleicos, p.ej., ADN y/o ADN y ARN en una columna. Estos métodos anteriores demostraron diversas desventajas como que son lentos, tediosos, sujetos a variabilidad entre lotes y no adecuados para la escalabilidad. Los métodos y kits para el aislamiento y extracción proporcionados en la presente memoria superan estas desventajas y proporcionan una columna con base de giro para el aislamiento y la extracción que es rápida, robusta y fácilmente escalable a grandes volúmenes.

Los métodos y kits aíslan y extraen ácidos nucleicos, p.ej., ADN y/o ADN y ácidos nucleicos que incluyen al menos ARN de una muestra que usa el siguiente procedimiento general, que se denomina en la presente memoria como “EXO52”. Primero, los ácidos nucleicos en la muestra, p.ej., el ADN y/o el ADN y la fracción de microvesículas, se unen a una superficie de captura como un filtro de membrana, y la superficie de captura se lava. Después, se usa un reactivo para realizar la lisis en la membrana y la liberación de los ácidos nucleicos, p.ej., ADN y/o ADN y ARN. Después se realiza la extracción con cloroformo usando tubos PLG, seguido por acondicionado con etanol. Los ácidos nucleicos, p.ej., ADN y/o ADN y ARN, se unen luego a la columna de sílice, se lavan y se eluyen.

Las membranas usadas en los métodos y kits EXO52 tienen poros grandes y están cargadas de forma positiva. En algunas realizaciones, se usa más de una membrana en los métodos y kits EXO52, por ejemplo, se usan dos o más membranas. En algunas realizaciones, se usan tres membranas. El número de membranas usadas en los métodos y kits EXO52 correlaciona con el volumen total de muestra que puede analizarse de una vez. En algunas realizaciones, aproximadamente 1 ml de muestras se procesa para cada capa de membrana usada en los métodos y kits EXO52.

En algunas realizaciones, la membrana es una membrana cargada de forma positiva. En algunas realizaciones, la superficie de captura es un intercambiador de aniones. En algunas realizaciones, la superficie de captura es un intercambiador de aniones con aminas cuaternarias. En algunas realizaciones, la superficie de captura es una membrana Q, que es una membrana cargada de forma positiva y es un intercambiador de aniones con aminas cuaternarias. Por ejemplo, la membrana Q está funcionalizada con amonio cuaternario, R-CH2-N+(CH3)3. En algunas realizaciones, la membrana tiene un tamaño de poro que es al menos 3 pm.

La purificación de la muestra, que incluye la fracción de microvesículas, se realiza usando técnicas de intercambio iónico. En algunas realizaciones, la técnica de intercambio iónico es una técnica seleccionada de las mostradas en los ejemplos de trabajo proporcionados en la presente memoria.

En algunas realizaciones, el agente usado para la lisis en la membrana es un reactivo basado en fenol. En algunas realizaciones, el reactivo de lisis es un reactivo basado en guanidinio. En algunas realizaciones, el reactivo de lisis es un tampón basado en alto contenido de sal. En algunas realizaciones, el reactivo de lisis es QIAzol. En algunas realizaciones, el reactivo de lisis es un reactivo de lisis basado en fenol, p.ej., QIAzol, y se usa en un volumen de aproximadamente 700 ul.

En un aspecto, el método para extraer ácidos nucleicos de una muestra biológica comprende (a) proporcionar una muestra biológica; (b) poner en contacto la muestra biológica con una superficie de captura en condiciones suficientes para retener la fracción de microvesículas sobre o en la superficie de captura; (c) lisar la fracción de microvesículas mientras las microvesículas están sobre o en la superficie de captura; y (d) extraer los ácidos nucleicos de la fracción de microvesículas. De forma alternativa, el método para extraer ácidos nucleicos de la muestra biológica comprende además eluir la fracción de microvesículas de la superficie de captura después de la etapa (b), recoger la fracción de microvesículas eluida, y extraer los ácidos nucleicos de la fracción de microvesículas eluidas. Opcionalmente, la fracción de microvesículas eluida puede concentrarse mediante un concentrador de giro para obtener una fracción de microvesículas concentrada, y los ácidos nucleicos se extraen posteriormente de la fracción de microvesículas concentrada.

En otro aspecto, el método para extraer ácidos nucleicos de una muestra biológica comprende (a) proporcionar una muestra biológica; (b) poner en contacto la muestra biológica con una superficie de captura en condiciones suficientes para retener la fracción de microvesículas sobre o en la superficie de captura; y (c) eluir la fracción de microvesículas mientras las microvesículas están sobre o en la superficie de captura. La fracción de microvesículas eluida puede procesarse entonces para el análisis adicional. Opcionalmente, la fracción de microvesículas eluida puede concentrarse mediante un concentrador de giro para obtener una fracción de microvesículas concentrada. En algunas realizaciones, los ácidos nucleicos se extraen posteriormente de la fracción de microvesículas concentrada.

En algunas realizaciones, la superficie de captura es una membrana. En un aspecto, la membrana comprende celulosa regenerada. Por ejemplo, la membrana tiene un tamaño de poro de al menos 1 pm, como por ejemplo, en el intervalo entre 2-5 pm. En algunas realizaciones, la membrana tiene un tamaño de poro en el intervalo de entre 3-5 pm. En algunas realizaciones, la membrana comprende polietersulfona (PES).

En algunas realizaciones, la membrana está cargada. En algunas realizaciones, la membrana está cargada de forma positiva. En algunas realizaciones, la membrana está cargada de forma negativa.

En algunos aspectos, la membrana está funcionalizada. Por ejemplo, la membrana está funcionalizada con amonio cuaternario R-Ch 2-N+(CH3)3.

En una realización, la superficie de captura comprende más de una membrana. En algunas realizaciones, la superficie de captura comprende al menos dos membranas, en la que cada membrana está próxima de forma adyacente a la(s) otra(s) membrana(s). En algunas realizaciones, la superficie de captura comprende al menos tres membranas, en la que cada una de las tres membranas es directamente adyacente con las otras. En algunas realizaciones, la superficie de captura comprende al menos cuatro membranas, en la que cada una de las cuatro membranas es directamente adyacente con las otras.

En algunas realizaciones, la superficie de captura es una perla. Por ejemplo, la perla es magnética. De forma alternativa, la perla no es magnética. En aún otra realización, la perla está funcionalizada con un ligando de afinidad.

En algunas realizaciones, la superficie de captura es una suspensión de polímero(s). En algunas realizaciones, la suspensión de polímero(s) tiene la forma de una perla.

En algunas realizaciones, la muestra biológica es plasma. En algunas realizaciones, la muestra biológica es suero. En algunas realizaciones, la muestra biológica es orina. En algunas realizaciones, la muestra biológica es líquido cerebroespinal. En algunas realizaciones, la muestra biológica es sobrenadante de cultivo celular.

En algunos aspectos, el método descrito en la presente memoria comprende además poner en contacto la muestra biológica con un tampón de carga. El tampón de carga está en el intervalo de pH 4-8. En un aspecto, el tampón de carga tiene un pH neutro.

Los métodos descritos en la presente memoria proporcionan la extracción de ácidos nucleicos de microvesículas. Preferiblemente, los ácidos nucleicos extraídos son ADN y/o ADN y ARN. El ARN extraído puede comprender ARN mensajero, ARN ribosómico, ARN de transferencia, o pequeños ARNs como microARNs, o cualquier combinación de los mismos.

Se usan diversas técnicas de secuenciación de ácido nucleico para detectar y analizar ácidos nucleicos como ADN libre y/o ARN extraído de la fracción de microvesículas de muestras biológicas. El análisis de ácidos nucleicos como ADN libre y/o ácidos nucleicos extraídos de microvesículas con propósitos diagnósticos tienen amplias implicaciones debido a la naturaleza no invasiva en que las microvesículas pueden recogerse fácilmente. El uso del análisis de microvesículas en lugar de biopsias de tejido invasivas impactará de forma positiva en el bienestar del paciente, mejorará la capacidad de realizar la monitorización longitudinal de la enfermedad, y mejorará la capacidad para obtener perfiles de expresión incluso cuando las células tisulares no son fácilmente accesibles (p.ej., en pacientes con cáncer de ovario o cerebro).

En algunas realizaciones, la presente invención está dirigida a composiciones y métodos para proporcionar un control en proceso para las técnicas de secuenciación de ácido nucleico, que incluye, por ejemplo, ensayos de secuenciación de siguiente generación (NGS), para detectar variantes de secuencia de baja frecuencia. Estos controles proporcionan un número de ventajas técnicas.

La muestra biológica es un fluido corporal. Los fluidos corporales pueden ser fluidos aislados de cualquier parte del cuerpo del sujeto, preferiblemente una posición periférica, que incluyen pero no están limitados a, por ejemplo, sangre, plasma, suero, orina, esputo, líquido espinal, líquido cerebroespinal, líquido pleural, aspirados del pezón, líquido linfático, líquido de los tractos respiratorio, intestinal y genitourinario, líquido lacrimal, saliva, leche mamaria, líquido del sistema linfático, semen, líquido cerebroespinal, líquido del sistema intra-orgánico, líquido ascítico, líquido de quiste tumoral, líquido amniótico y combinaciones de los mismos. Por ejemplo, el líquido corporal es orina, sangre, suero o líquido cerebroespinal.

En cualquiera de los métodos anteriores, los ácidos nucleicos son ADN y/o ADN y ARN. Ejemplos de ARN incluyen ARN mensajeros, ARN de transferencia, ARN ribosómicos, pequeños ARN (ARN que no codifican proteínas, ARN no mensajeros), microARN, piARN, exARN, snARN y snoARN.

En cualquiera de los métodos anteriores, los ácidos nucleicos se aíslan de o se derivan de otra forma de una muestra, que incluye ARN aislado de la fracción de microvesículas de una muestra.

En cualquiera de los métodos anteriores, los ácidos nucleicos son ácidos nucleicos libres, también denominados en la presente memoria como ácidos nucleicos circulantes. En algunas realizaciones, los ácidos nucleicos libres son ADN o ARN.

Diversos aspectos y realizaciones de la invención se describirán ahora en detalle. Se apreciará que la modificación de los detalles puede hacerse sin separarse del alcance de la invención. Además, a menos que se requiera por contexto, los términos singulares incluirán plurales y los términos plurales incluirán el singular.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS

La Figura 1 es un esquema que demuestra una realización del protocolo de aislamiento de ARN y ADN para aislar una fracción de microvesículas, liberar los ácidos nucleicos de la microvesícula, y extraer ARN y ADN usando dos protocolos separados.

La Figura 2 es un esquema que demuestra otra realización del protocolo de aislamiento de ARN y ADN para aislar una fracción de microvesículas, liberar los ácidos nucleicos de las microvesículas, y extraer ARN y ADN usando un único protocolo.

La Figura 3 es un gráfico que muestra el efecto de la concentración de cloroformo en la separación de fases para aislar ARN y ADN de microvesículas en una única extracción, como se demuestra por la detección de ARN y ADN BRAF de tipo salvaje.

La Figura 4 es un gráfico que muestra el efecto de la concentración de cloroformo en la separación de fases para aislar ARN y ADN de microvesículas en una única extracción, como se demuestra por la detección de ARN y ADN GAPDH.

La Figura 5 es un gráfico que muestra que el ajuste del pH en la fase de separación influye en la extracción y detección de ADN.

La Figura 6 es un gráfico que muestra el efecto de la valoración del volumen de la muestra de líquido cerebroespinal (CSF) en la extracción y detección de ARN de microvesículas.

La Figura 7 es un gráfico que muestra la comparación de detección de dianas de ARN de microvesículas a partir de métodos de ultracentrifugación y aislamiento EXO60.

La Figura 8 es un gráfico que muestra la comparación de la detección de dianas de ARN de microvesículas a partir de métodos de ultracentrifugación y aislamiento EXO60 para diferentes muestras de CSF del paciente. Las muestras del paciente se designan por la ID del paciente. Se utilizaron volúmenes de muestra variables. (*) indica la muestra después de la muerte.

La Figura 9 es un gráfico que muestra el efecto del volumen de la muestra de CSF (0,25 ml, 0,5 ml, 1,0 ml y 2,0 ml) en diferentes métodos de aislamiento y extracción de ARN de microvesículas. UC (ultracentrifugación), uCSC (método de filtración de orina) y EXO60.

La Figura 10 es una serie de gráficos de bioanalizador que representan los perfiles de ARN de la extracción de 2 muestras diferentes de orina usando el protocolo EXO70 comparado con el método de células madre circulantes de orina (uCSC).

La Figura 11 es un gráfico que muestra la correlación entre la detección de ARN después del aislamiento y extracción mediante EXO70 en comparación con el método de CSC de orina.

La Figura 12 es dos gráficos que muestran la detección de diferentes dianas de ARN después del aislamiento y la extracción mediante el método EXO70 o uCSC. El ARN se extrajo y se analizó a partir de la fracción de microvesículas aislada (EXO70 o uCSC) y la fracción de flujo continuo o de sobrenadante después del aislamiento (flujo EXO70 o flujo ucSc ). (A) dianas de mARN; (B) dianas miARN.

Las Figuras 13-223 son una serie de gráficos e ilustraciones que representan la sensibilidad y especificidad de los métodos de aislamiento y extracción de ADN y ARN EXO52, junto con comparaciones con kits de aislamiento de ácido nucleico circulante disponibles comercialmente, denominados en la presente memoria como kits de CNA disponibles comercialmente.

La Figura 13 es una representación esquemática de estudios diseñados para evaluar la extracción de ADN con o sin tubos PLG.

Las Figuras 14, 15, 16 y 17 son una serie de gráficos que representan la extracción de ADN con y sin tubos PLG usando un método inicial de aislamiento de ADN/ARN (EXO52.1) y kits disponibles comercialmente.

Las Figuras 18 y 19 son una serie de gráficos que representan la extracción de ADN usando los métodos de la descripción frente a un kit de extracción de ácidos nucleicos circulantes disponible comercialmente.

La Figura 20 es un gráfico que representa el efecto de la valoración con cloroformo en el aislamiento de ARN y ADN de la fase fenólica.

La Figura 21 es una representación esquemática de estudios diseñados para evaluar el efecto de la valoración con cloroformo en el aislamiento de ARN y el aislamiento de ADN de la fase fenólica en tubos PLG.

Las Figuras 22, 23, 24, 25 y 26 son una serie de gráficos que representan los efectos de la valoración con cloroformo en el aislamiento de ARN (Figura 22), el aislamiento de ARN y ADN (Figuras 23, 24), y el aislamiento de ADN (Figuras 25, 26).

La Figura 27 es un gráfico que representa el aislamiento de ADN usando el protocolo RNeasy (sin tubo PLG) y la valoración con cloroformo.

La Figura 28 es una representación esquemática de estudios diseñados para evaluar el aislamiento de ADN sin tubos PLG y con una valoración con cloroformo.

Las Figuras 29, 30 y 31 son una serie de gráficos que representan el aislamiento de ADN usando el protocolo RNeasy (sin tubo PLG) y la valoración con cloroformo.

La Figura 32 es un gráfico que representa que la adición de cloroformo ajustado co-aísla ADN y ARN.

La Figura 33 es una representación esquemática de estudios diseñados para evaluar el aislamiento de ADN sin tubos PLG y con una valoración con cloroformo.

Las Figuras 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43 y 44 son una serie de gráficos que representan el aislamiento de ADN usando el protocolo RNeasy (sin tubo PLG) y la valoración con cloroformo.

La Figura 45 es un gráfico que representa el efecto de los cambios de pH en la separación de fases en el aislamiento de ADN.

La Figura 46 es una representación esquemática de estudios diseñados para evaluar el aislamiento de ADN de la fase acuosa con una valoración de pH.

La Figura 47 es una representación esquemática del método de preparación de la disolución de acondicionamiento de pH.

La Figura 48 es un gráfico que representa las curvas de amplificación Nala para ARN y ADN aislados.

Las Figuras 49, 50, 51, 52, 53 y 54 son una serie de gráficos que representan el efecto de la valoración con pH en el aislamiento de ADN de la fase acuosa.

La Figura 55 es un gráfico que representa que la adición de cloroformo es el factor predominante en la determinación del contenido de ADN de la fase acuosa.

La Figura 56 es un gráfico que representa que la señal de ARN no está afectada por la adición del aislamiento de ADN.

La Figura 57 es una representación esquemática de estudios diseñados para evaluar el aislamiento de ADN de la fase acuosa con una valoración con cloroformo y con o sin añadir disolución de pH.

La Figura 58 es una representación esquemática del método de preparación de la disolución de acondicionamiento de pH.

Las Figuras 59, 60, 61,62, 63, 64, 65, 66, 67 y 68 son una serie de gráficos que representan el efecto de la valoración con cloroformo con y sin añadir disolución de pH en el aislamiento de ADN de la fase acuosa.

La Figura 69 es un gráfico que representa el efecto de una etapa de giro con Qiazol a 4°C o a temperatura ambiente en el aislamiento de ARN usando un kit disponible comercialmente.

La Figura 70 es un gráfico que representa el efecto de una etapa de giro con Qiazol a 4°C o a temperatura ambiente en los métodos de la descripción.

La Figura 71 y 72 son una representación esquemática y un resumen de estudios diseñados para evaluar el aislamiento de ARN usando un kit disponible comercialmente con la etapa de giro con Qiazol a 4°C o a temperatura ambiente.

Las Figuras 73, 74 y 75 son una serie de gráficos que representan el efecto de una etapa de giro con Qiazol a 4°C o a temperatura ambiente en un kit disponible comercialmente.

Las Figuras 76 y 77 son una representación esquemática y un resumen de estudios diseñados para evaluar el aislamiento de ARN usando el método EXO52 con la etapa de giro con Qiazol a 4°C o a temperatura ambiente. Las Figuras 78 y 79 son una serie de gráficos que representan el efecto de una etapa de giro con Qiazol a 4°C o a temperatura ambiente en los métodos de la descripción.

La Figura 81 es una representación esquemática de estudios diseñados para evaluar el efecto de volúmenes variables de etanol entre 1,5x a 2,6x.

Las Figuras 81 y 82 son una serie de gráficos que representan el efecto de volúmenes variables de etanol entre 1,5x a 2,6x en el aislamiento de ADN y ARN.

La Figura 83 es un gráfico que representa los resultados de la digestión con ProtK a temperatura ambiente antes de la etapa de unión.

La Figura 84 es una representación esquemática de estudios diseñados para evaluar la digestión con ProtK a temperatura ambiente antes de la etapa de unión.

Las Figuras 85 y 86 son una serie de gráficos que representan los resultados de digestión con ProtK a temperatura ambiente antes de la etapa de unión.

La Figura 87 es un gráfico que representa que la capacidad de carga es más de 8 mL de plasma.

La Figura 88 es un gráfico que representa que el flujo continuo no tiene un punto de avance hasta 8 mL de plasma. La Figura 89 es un gráfico que representa la diferente capacidad de unión para exosomas y nucleosomas.

La Figura 90 es una representación esquemática de estudios diseñados para evaluar la capacidad de carga.

La Figura 91 es un gráfico que representa la diferente capacidad de unión para exosomas y nucleosomas.

Las Figuras 92 y 93 son una serie de gráficos que representan que la capacidad de carga es más de 8 mL de plasma. La Figura 94 es un gráfico que representa que el flujo continuo no tiene un punto de avance hasta 8 mL de plasma. Las Figuras 95, 96 y 97 son una serie de gráficos que representan el efecto de variar el volumen de carga de plasma en el aislamiento de ADN y ARN.

La Figura 98 es un gráfico que representa que el flujo continuo no tiene un punto de avance hasta 8 mL de plasma. Las Figuras 99 y 100 son una serie de gráficos que representan el efecto de variar el volumen de carga de plasma en el aislamiento de ADN y ARN.

Las Figuras 101, 102, 103, 104, 105 y 106 son una serie de gráficos que representan la diferente capacidad de unión para exosomas y nucleosomas.

Las Figuras 107 y 108 son una serie de gráficos que representan el aislamiento de ADN libre (cfADN) usando diferentes técnicas de aislamiento que incluyen los métodos de la descripción y kits disponibles comercialmente. La Figura 109 es una representación esquemática de estudios diseñados para comparar el aislamiento de cfADN usando métodos de la descripción con kits disponibles comercialmente.

Las Figuras 110 y 111 son una representación esquemática y un resumen de estudios diseñados para comparar el aislamiento de cfADN usando técnicas diferentes de aislamiento que incluyen métodos de la descripción y kits disponibles comercialmente.

Las Figuras 112, 113, 114, 115,116, 117, 118, 119, 120, 121, 122 y 123 son una serie de gráficos que representan el aislamiento de cfADN usando diferentes técnicas de aislamiento que incluyen los métodos de la descripción y kits disponibles comercialmente.

Las Figuras 124, 125, 126, 127 y 128 son una serie de gráficos y tablas que representan una comparación del número de copia de cfADN usando diferentes técnicas de aislamiento que incluyen métodos de la descripción y kits disponibles comercialmente.

Las Figuras 129, 130 y 131 son una representación esquemática y resúmenes de estudios diseñados para evaluar el uso del kit AllPrep Micro para el análisis corriente abajo de ADN y ARN aislados.

Las Figuras 132, 133, 134, 135 y 136 son una serie de gráficos que representan el uso del kit AllPrep Micro para el análisis corriente abajo de ADN y ARN aislados.

Las Figuras 137 y 138 son una serie de gráficos que representan el aislamiento de ADN libre (cfADN) usando diferentes técnicas de aislamiento que incluyen los métodos de la descripción y kits disponibles comercialmente. La Figura 139 es una representación esquemática de estudios diseñados para comparar cfADN aislado usando métodos de la descripción y kits disponibles comercialmente.

Las Figuras 140, 141, 142, 143, 144, 145 y 146 son una serie de gráficos que representan el aislamiento de ADN libre (cfADN) usando diferentes técnicas de aislamiento que incluyen los métodos de la descripción y kits disponibles comercialmente.

Las Figuras 147, 148 y 149 son representaciones esquemáticas de estudios diseñados para comparar cfADN aislado usando métodos de la descripción y kits disponibles comercialmente.

Las Figuras 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169 y 170 son una serie de gráficos que representan el aislamiento de ADN libre (cfADN) usando diferentes técnicas de aislamiento que incluyen los métodos de la descripción y kits disponibles comercialmente.

La Figura 171 es una serie de gráficos que representan que los métodos de la descripción superan de forma consistente a los kits de cNA disponibles comercialmente.

Las Figuras 172, 173 y 174 son representaciones esquemáticas de estudios diseñados para comparar el cfADN aislado usando métodos de la descripción y kits disponibles comercialmente.

Las Figuras 175, 176, 177, 178, 179, 180, 181, 182, 183, 184, 185, 186, 187, 188, 189, 190, 191, 192, 193, 194, 195 y 196 son una serie de gráficos que representan el aislamiento de ADN libre (cfADN) usando diferentes técnicas de aislamiento que incluyen los métodos de la descripción y kits disponibles comercialmente.

La Figura 197 es un gráfico que representa el efecto de múltiples etapas de elución con Qiazol separadas en el aislamiento de ADN y ARN.

La Figura 198 es una representación esquemática de estudios diseñados para evaluar el aislamiento de ADN y ARN usando múltiples etapas de elución con Qiazol.

Las Figuras 199, 200, 201 y 202 son una serie de gráficos que representan el efecto de múltiples etapas de elución con Qiazol separadas en el aislamiento de ADN y ARN.

La Figura 203 es una representación esquemática de estudios diseñados para evaluar el aislamiento de ADN y ARN usando múltiples etapas de elución con Qiazol.

Las Figuras 204, 205 y 206 son una serie de gráficos que representan el efecto de múltiples etapas de elución con Qiazol separadas en el aislamiento de ADN y ARN.

La Figura 207 es un gráfico que representa el efecto de etapas de carga de RNeasy dobles con precipitación con etanol en el aislamiento de ADN y ARN.

Las Figuras 208 y 209 son una representación esquemática y un resumen de estudios diseñados para evaluar el aislamiento de ADN y ARN usando etapas de carga de RNeasy dobles con precipitación con etanol.

Las Figuras 210 y 211 son una serie de gráficos que representan el efecto de etapas de carga de RNeasy dobles con precipitación con etanol en el aislamiento de ADN y ARN.

La Figura 212 es un gráfico que representa el efecto de diferentes columnas corriente abajo en el aislamiento de ADN y ARN.

La Figura 213 es una representación esquemática de estudios diseñados para evaluar el aislamiento de ADN y ARN usando diferentes columnas corriente abajo.

Las Figuras 214, 215, 216 y 217 son una serie de gráficos que representan el efecto de diferentes columnas corriente abajo en el aislamiento de ADN y ARN.

La Figura 219 es una representación esquemática de estudios diseñados para evaluar el aislamiento de ADN y ARN usando múltiples etapas de elución de RNeasy.

Las Figuras 220, 221, 222 y 223 son una serie de gráficos que representan el efecto de múltiples etapas de elución de RNeasy en el aislamiento de ADN y ARN.

La Figura 224 es una serie de gráficos que representan la distribución de tamaños de ácidos nucleicos en plasma. El aislamiento completo del ácido nucleico de 1 mL de plasma se sometió a digestión con RNasa A (“cfADN”), digestión con DNasa I (“exoARN”), o tratamiento simulado (“EXO52”). Después de la limpieza de la reacción, la distribución de tamaños de ácidos nucleicos en el aislamiento se midió por un ensayo en Bioanalyzer Pico 6000.

La Figura 225 es un gráfico que representa el aislamiento secuencial de ácidos nucleicos a partir de 2 ml de plasma sanguíneo. El plasma sanguíneo de un donante sano normal se pasó a través de una columna EX052 y el material que quedó en el flujo continuo se aisló usando un kit exoRNeasy disponible comercialmente (ARN) o un kit de ácido nucleico circulante disponible comercialmente (ADN). El rendimiento total se compara con EX052 (ARN+ADN) usando (RT)-qPCR frente a los genes BRAF, KRAS y 18S como una función de delta CT. Las barras de error representan tres aislamientos replicados.

La Figura 226 es una serie de gráficos que representan que tanto exoARN como ciADN contribuyen sustancialmente a los ácidos nucleicos totales cosechados del plasma sanguíneo. 1 mL de plasma de donantes sanos se aisló usando el kit exoRNeasy disponible comercialmente (ARN) o un aislamiento EXO52 con una etapa de transcripción inversa (ARN+ADN) o sin ella (ADN). La cuantificación absoluta por RT-qPCR se presenta como un diagrama de caja e indica el número de copias medio por mL de plasma con donantes individuales representados como se determina.

Las Figuras 227 y 228 son una serie de gráficos que representan la capacidad de los métodos EXO52 proporcionados en la presente memoria para capturar los ácidos nucleicos circulantes totales. Los métodos EXO52 se compararon con un kit de aislamiento de ADN de ácido nucleico circulante disponible comercialmente.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN

La presente invención proporciona métodos de aislamiento de ADN libre (cfADN) y/o cfADN y ácidos nucleicos que incluyen al menos ARN de microvesículas capturando el ADN y las microvesículas en una superficie, lisando posteriormente las microvesículas para liberar los ácidos nucleicos, particularmente ARN, contenidos en ellas, y eluyendo el ADN y/o ADN y ácidos nucleicos que incluyen al menos ARN de la superficie de captura. Las microvesículas se liberan por las células eucarióticas, o brotan de la membrana plasmática, al exterior de la célula. Estas vesículas de membrana son heterogéneas en tamaño con diámetros que oscilan de aproximadamente 10 nm a aproximadamente 5000 nm. Todas las vesículas de membrana liberadas por las células <0,8 pm de diámetro se denominan en la presente memoria de forma colectiva como “microvesículas”. Estas microvesículas incluyen microvesículas, partículas tipo microvesículas, prostasomas, dexosomas, texosomas, ectosomas, oncosomas, cuerpos apoptóticos, partículas tipo retrovirus, y partículas de retrovirus endógenos humanos (HERV). Pequeñas microvesículas (aproximadamente de 10 a 1000 nm, y más a menudo de 30 a 200 nm de diámetro) que se liberan por exocitosis de cuerpos multivesiculares intracelulares se denominan en la técnica como “microvesículas”.

Los métodos actuales de aislamiento de ADN y/o ADN y ácidos nucleicos incluyendo al menos ARN de microvesículas incluyen ultracentrifugación, ultrafiltración, p.ej., usando filtros de 100 kD, técnicas de precipitación de polímero, y/o filtración basada en el tamaño. Sin embargo, existe una necesidad de métodos alternativos que sean eficaces y efectivos para aislar microvesículas y, opcionalmente, extraer los ácidos nucleicos contenidos en ellas, preferiblemente ARN de microvesículas, para usar en una variedad de aplicaciones, incluyendo propósitos de diagnóstico.

Los métodos y/o kits de aislamiento y extracción proporcionados en la presente memoria denominados como los métodos y/o kits de aislamiento de ADN y/o ADN y ARN EXO52 usan un proceso de purificación basado en la columna centrífuga que usa una membrana de afinidad que se une al ADN libre y/o a las microvesículas. Los métodos y kits de la descripción permiten la capacidad de realizar grandes números de muestras clínicas en paralelo, usando volúmenes de 0,2 hasta 4 mL en una única columna. El ADN libre aislado usando el procedimiento EXO52 es altamente puro. El ARN aislado es altamente puro, protegido por una membrana de vesícula hasta la lisis, y las vesículas intactas pueden eluirse de la membrana EXO52. El procedimiento EXO52 es capaz de agotar sustancialmente todo el ADN libre de la entrada de plasma, y es igual o mejor en el rendimiento de ADN cuando se compara con los kits de aislamiento de ADN circulante disponibles comercialmente. El procedimiento EXO52 es capaz de agotar sustancialmente todo el mARN de la entrada de plasma, y es igual o mejor en el rendimiento de mARN/miARN cuando se compara con la ultracentrifugación o la lisis directa. En contraste con los kits disponibles comercialmente y/o métodos de aislamiento anteriores, los métodos y/o kits EXO52 enriquecen la fracción unida a las microvesículas de miARN, y se pueden escalar fácilmente a grande cantidades de material de entrada. Esta capacidad de escalar permite la investigación en transcritos interesantes poco abundantes. En comparación con otros productos disponibles comercialmente en el mercado, los métodos y kits de la descripción proporcionan capacidades únicas que se demuestran por los ejemplos proporcionados en la presente memoria.

Los métodos y kits EXO52 aíslan y extraen ácidos nucleicos, p.ej., ADN y/o ADN y ácidos nucleicos que incluyen al menos ARN de una muestra biológica que incluye al menos ARN de una muestra biológica usando el siguiente procedimiento general. Primero, la muestra, que incluye el cfADN y la fracción de microvesículas, se une a un filtro de membrana, y el filtro se lava. Después, se usa un reactivo con base fenólica para realizar la lisis en la membrana y liberar los ácidos nucleicos, p.ej., ADN y/o ADN y ARN. Después se realiza la extracción con cloroformo usando tubos PLG, seguido por acondicionamiento con etanol. Los ácidos nucleicos, p.ej., ADN y/o ADN y ARN, se unen a una columna de silice, se lavan y se eluyen. Los ácidos nucleicos extraídos, por ejemplo ADN y/o ADN y ARN, pueden luego analizarse más, por ejemplo, usando cualquiera de una variedad de ensayos corriente abajo.

En algunas realizaciones, el método incluye las siguientes etapas. El filtro está contenido en una columna centrífuga. Antes de la adición del reactivo de lisis, la muestra se une a un filtro de membrana en una columna centrífuga, y la columna centrífuga se hace girar después durante 1 min a aproximadamente 500 x g. El flujo continuo luego se desecha, se añade un tampón a la columna centrífuga, y la columna centrífuga se hace girar de nuevo durante 5 min a aproximadamente 5000 x g para eliminar el volumen residual de la columna. El flujo continuo se desecha después de este segundo giro. La columna centrífuga se pone después en contacto con el reactivo de lisis con base fenólica y se hace girar durante 5 min a aproximadamente 5000 x g para recoger el homogeneizado que contiene las microvesículas lisadas y el cfADN capturado. En algunas realizaciones, el tampón de lisis es un tampón de lisis con base fenólica. Por ejemplo, el tampón de lisis es reactivo de lisis QIAzol® (Qiagen). El homogeneizado se somete después al aislamiento y extracción del ácido nucleico. En algunas realizaciones, un control para la eficacia del aislamiento de ARN, como, por ejemplo, Q-beta o cualquier otro control descrito en la presente memoria, se añade al homogeneizado antes del aislamiento y extracción del ácido nucleico.

En algunas realizaciones, el ácido nucleico se aísla según las siguientes etapas. Después de la adición del reactivo de lisis, se añade entonces cloroformo al homogeneizado, y la disolución se mezcla vigorosamente durante un breve periodo de tiempo. En algunas realizaciones, se añaden 350 pl de cloroformo al homogeneizado. La disolución se centrifuga después durante 5 min a 12.000 x g a 4°C. La fase acuosa superior se transfiere entonces a un nuevo tubo de recogida, y se añaden 2 volúmenes de etanol al 100% a la fase acuosa superior, y la disolución se mezcla. La disolución puede entonces procesarse usando cualquiera de una variedad de métodos reconocidos en la técnica para aislar y/o extraer ácidos nucleicos.

Los ácidos nucleicos aislados, p.ej., ADN y/o ADN y ARN, pueden someterse entonces a un análisis adicional usando cualquiera de una variedad de ensayos corriente abajo. En algunas realizaciones, la detección combinada de ADN y ARN se usa para aumentar la sensibilidad de mutaciones factibles. Hay múltiples fuentes potenciales de mutaciones detectables en los ácidos nucleicos circulantes. Por ejemplo, las células tumorales vivas son una fuente potencial de ARN y ADN aislados de la fracción de microvesículas de una muestra, y las células tumorales moribundas son fuentes potenciales para fuentes de ADN libre como, por ejemplo, ADN de vesículas apoptóticas y ADN libre de células tumorales necróticas. Como los ácidos nucleicos mutados son relativamente infrecuentes en circulación, la maximización de la sensibilidad de detección se vuelve muy importante. El aislamiento combinado de ADN y ARN da información clínica completa para evaluar la progresión de la enfermedad y la respuesta del paciente a la terapia. Sin embargo, en contraste con los métodos y kits proporcionados en la presente memoria, los kits disponibles comercialmente para detectar los ácidos nucleicos circulantes solo son capaces de aislar el cfADN del plasma, es decir, de células moribundas. Como se muestra en las figuras 227-228, EXO52 capturó todo el cfADN, y EXO52 detectó significativamente más copias combinando exoARN y cfADN frente a cfADN solo. Los expertos en la técnica apreciarán que más copias de una mutación u otro biomarcador lleva a la sensibilidad y exactitud mejoradas en la identificación de mutaciones y otros biomarcadores.

Como se usa en la presente memoria, el término “ácidos nucleicos” se refiere a ADN y ARN. Los ácidos nucleicos pueden ser monocatenarios o bicatenarios. En algunos ejemplos, el ácido nucleico es ADN. En algunos ejemplos, el ácido nucleico es ARN. El ARN incluye, pero no está limitado a, ARN mensajero, ARN de transferencia, ARN ribosómico, ARNs no codificantes, micro-ARNs y elementos HERV.

Como se usa en la presente memoria, el término “muestra biológica” se refiere a una muestra que contiene materiales biológicos como ADN, ARN y proteína.

En algunas realizaciones, la muestra biológica puede comprender de forma adecuada un fluido corporal de un sujeto. Los fluidos corporales pueden ser fluidos aislados de cualquier parte del cuerpo del sujeto, como, por ejemplo, una posición periférica, que incluye aunque no está limitado a, por ejemplo, sangre, plasma, suero, orina, esputo, líquido espinal, líquido cerebroespinal, líquido pleural, aspirados del pezón, líquido linfático, líquido de los tractos respiratorio, intestinal y genitourinario, líquido lacrimal, saliva, leche mamaria, líquido del sistema linfático, semen, líquido del sistema intra-orgánico, líquido ascítico, líquido de quistes tumorales, líquido amniótico y sobrenadante de cultivo celular, y combinaciones de los mismos. Las muestras biológicas pueden incluir también muestras fecales o cecales, o sobrenadantes aislados de los mismos.

En algunas realizaciones, la muestra biológica puede comprender de forma adecuada sobrenadante de cultivo celular.

En algunas realizaciones, la muestra biológica puede comprender de forma adecuada una muestra de tejido de un sujeto. La muestra de tejido puede aislarse de cualquier parte del cuerpo del sujeto.

Un volumen de muestra adecuado de un fluido corporal está, por ejemplo, en el intervalo de aproximadamente 0,1 ml a aproximadamente 30 ml de fluido. El volumen de fluido puede depender de algunos factores, p.ej., el tipo de fluido usado. Por ejemplo, el volumen de las muestras de suero puede ser de aproximadamente 0,1 ml a aproximadamente 4 ml, preferiblemente de aproximadamente 0,2 ml a 4 ml. El volumen de muestras de plasma puede ser de aproximadamente 0,1 ml a aproximadamente 4 ml, preferiblemente 0,5 ml a 4 ml. El volumen de muestras de orina puede ser de aproximadamente 10 ml a aproximadamente 30 ml, preferiblemente aproximadamente 20 ml.

Aunque los ejemplos proporcionados en la presente memoria usaron muestras de plasma, el experto apreciará que estos métodos son aplicables a una variedad de muestras biológicas.

Los métodos y kits de la descripción son adecuados para usar con muestras derivadas de un sujeto humano. Los métodos y kits de la descripción son adecuados para usar con muestras derivadas de un sujeto humano. Además, los métodos y kits de la descripción también son adecuados para usar con muestras derivadas de un sujeto humano. Los métodos y kits de la descripción son adecuados para usar con muestras derivadas de un sujeto no humano, tal como, por ejemplo, un roedor, un primate no humano, un animal de compañía (p.ej., gato, perro, caballo) y/o un animal de granja (p.ej., pollo).

El término “sujeto” pretende incluir todos los animales que muestran o que se espera que tengan partículas que contienen ácido nucleico. En realizaciones particulares, el sujeto es un mamífero, un primate humano o no humano, un perro, un gato, un caballo, una vaca, otros animales de granja, o un roedor (p.ej., ratones, ratas, cobaya, etc.). Un sujeto humano puede ser un ser humano normal sin anormalidades observables, p.ej., una enfermedad. Un sujeto humano puede ser un ser humano con anormalidades observables, p.ej., una enfermedad. Las anormalidades observables pueden observarse por el propio ser humano o por un profesional médico. El término “sujeto”, “paciente”, e “individuo” se usan de forma intercambiable en la presente memoria.

Aunque los ejemplos de trabajo proporcionados en la presente memoria usan una membrana como la superficie de captura, debería entenderse que el formato de la superficie de captura, p.ej., perlas o un filtro (también denominado en la presente memoria como una membrana), no afecta a la capacidad de los métodos proporcionados en la presente memoria para capturar de forma eficaz microvesículas de una muestra biológica.

Aunque los ejemplos proporcionados en la presente memoria usan cloroformo durante la etapa de extracción, los expertos en la técnica apreciarán que cualquier compuesto químico que realice la misma función que el cloroformo durante la extracción de ácido nucleico puede usarse en los métodos proporcionados en la presente memoria. Por medio de ejemplo no limitante, los compuestos químicos para el uso en la etapa de extracción incluyen diclorometano, tolueno, hexano, MTBE y acetato de etilo (EtOAc).

Una amplia gama de superficies son capaces de capturar microvesículas según los métodos proporcionados en la presente memoria, pero no todas las superficies capturarán microvesiculas (algunas superficies no capturan nada).

La presente descripción también describe un dispositivo para aislar y concentrar microvesículas de muestras biológicas o clínicas usando partes plásticas desechables y equipo centrífugo. Por ejemplo, el dispositivo comprende una columna que comprende una superficie de captura (es decir, un filtro de membrana), un soporte que asegure la superficie de captura entre la frita externa y un tubo interno, y un tubo de recogida. La frita externa comprende una gran estructura de red que permite el paso de líquido, y está preferiblemente en un extremo de la columna. El tubo interno mantiene la superficie de captura en su sitio, y tiene preferiblemente una forma ligeramente cónica. El tubo de recogida puede estar disponible comercialmente, es decir, tubo Falcon de 50 ml. La columna es preferiblemente adecuada para el giro, es decir, el tamaño es compatible con máquinas centrífugas y micro-centrífugas estándar.

En las realizaciones donde la superficie de captura es una membrana, el dispositivo para aislar la fracción de microvesículas de una muestra biológica contiene al menos una membrana. En algunas realizaciones, el dispositivo comprende una, dos, tres, cuatro, cinco o seis membranas. En algunas realizaciones, el dispositivo comprende tres membranas. En las realizaciones donde el dispositivo comprende más de una membrana, las membranas están todas directamente adyacentes entre ellas en un extremo de la columna. En las realizaciones donde el dispositivo comprende más de una membrana, las membranas son todas idénticas entre ellas, es decir, son de la misma carga y/o tienen el mismo grupo funcional.

Debería anotarse que la captura filtrando a través de un tamaño de poro menor que las microvesículas no es el mecanismo principal de captura por los métodos proporcionados en la presente memoria. Sin embargo, el tamaño de poro del filtro es sin embargo muy importante, p.ej. porque el mARN se queda atascado en un filtro de 20 nm y no puede recuperarse, mientras que los microARNs pueden eluirse fácilmente, y p.ej., porque el tamaño de poro del filtro es un parámetro importante en el área de captura superficial disponible.

Los métodos proporcionados en la presente memoria usan cualquiera de una variedad de superficies de captura. En algunas realizaciones, la superficie de captura es una membrana, también denominada en la presente memoria como un filtro o un filtro de membrana. En algunas realizaciones, la superficie de captura es una membrana disponible comercialmente. En algunas realizaciones, la superficie de captura es una membrana cargada disponible comercialmente. En algunas realizaciones, la superficie de captura es neutra. En algunas realizaciones, la superficie de captura se selecciona de Membrana de intercambio de iones Mustang® de PALL Corporation; membrana Vivapure® Q de Sartorius AG; Sartobind Q, o Vivapure® Q Maxi H; Sartobind® D de Sartorius Ag, Sartobind (S) de Sartorius AG, Sartobind® Q de Sartorius AG, Sartobind® IDA de Sartorius AG, Sartobind® Aldehyde de Sartorius AG, Whatman® DE81 de Sigma, columna de purificación de virus de trampa rápida de EMD Millipore; Columnas centrífugas de intercambio de cationes y aniones fuertes Thermo Scientific* Pierce.

En realizaciones donde la superficie de captura está cargada, la superficie de captura puede ser un filtro cargado seleccionado del grupo que consiste en filtración al vacío Q PES cargado de forma positiva de 0,65 um (Millipore), filtración en columna centrífuga Q RC cargada positivamente de 3-5 um (Sartorius), filtración en columna centrífuga casera Q PES cargada de forma positiva de 0,8 um (Pall), filtración por jeringa Q PES cargada de forma positiva de 0,8 um (Pall), filtración en columna centrífuga casera S PES cargada de forma negativa de 0,8 um (Pall), filtración por jeringa S PES cargado de forma negativa de 0,8 um (Pall), y filtración por jeringa de nailon cargada de forma negativa de 50 nm (Sterlitech). Preferiblemente, el filtro cargado no está alojado en un aparato de filtración en jeringa, ya que Qiazol/ARN es más difícil de sacar del filtro en estas realizaciones. Preferiblemente, el filtro cargado está alojado en un extremo de una columna.

En las realizaciones donde la superficie de captura es una membrana, la membrana puede estar hecha de una variedad de materiales adecuados. En algunas realizaciones, la membrana es polietersulfona (PES) (p.ej., de Millipore o PALL Corp.). En algunas realizaciones, la membrana es celulosa regenerada (RC) (p.ej., de Sartorius o Pierce).

En algunas realizaciones, la superficie de captura es una membrana cargada de forma positiva. En algunas realizaciones, la superficie de captura es una membrana Q, que es una membrana cargada de forma positiva y es un intercambiador aniónico con aminas cuaternarias. Por ejemplo, la membrana Q está funcionalizada con amonio cuaternario, R-CH2-N+(CH3)3. En algunas realizaciones, la superficie de captura es una membrana cargada de forma negativa. En algunas realizaciones, la superficie de captura es una membrana S, que es una membrana cargada de forma negativa y es un intercambiador catiónico con grupos de ácido sulfónico. Por ejemplo, la membrana S está funcionalizada con ácido sulfónico, R-CH²-SO³". En algunas realizaciones, la superficie de captura es una membrana D, que es un intercambiador aniónico básico débil con grupos dietilamina, R-CH²-NH+(C²Hs)². En algunas realizaciones, la superficie de captura es una membrana de quelato metálico. Por ejemplo, la membrana es una membrana IDA, funcionalizada con ácido iminodiacético -N(CH²COOH-)². En algunas realizaciones, la superficie de captura es una membrana microporosa, funcionalizada con grupos aldehído, -CHO. En otras realizaciones, la membrana es un intercambiador aniónico básico débil, con dietilaminoetil (DEAE) celulosa. No todas las membranas cargadas son adecuadas para el uso en los métodos proporcionados en la presente memoria, p.ej., el ARN aislado usando la columna centrífuga de membrana Vivapure S de Sartorius mostró inhibición de RT-qPCR y, por consiguiente, es inadecuada para un ensayo corriente abajo relacionado con PCR.

En realizaciones donde la superficie de captura está cargada, las microvesículas pueden aislarse con un filtro cargado de forma positiva.

En las realizaciones donde la superficie de captura está cargada, el pH durante la captura de microvesículas es un pH <7. En algunas realizaciones, el pH es mayor que 4 y menor que o igual a 8.

En las realizaciones donde la superficie de captura es un filtro Q cargado de forma positiva, el sistema tampón incluye un tampón de lavado que comprende Bis Tris propano 250 mM, pH 6,5-7,0. En realizaciones donde la superficie de captura es un filtro Q cargado de forma positiva, el tampón de lisis es Qiazol. En las realizaciones donde la superficie de captura es un filtro Q cargado de forma positiva, el tampón de lisis está presente en un volumen. En las realizaciones donde la superficie de captura es un filtro Q cargado de forma positiva, el tampón de lisis está presente a más de un volumen.

Dependiendo del material de membrana, los tamaños de poro de la membrana oscilan de 3 pm a 20 nm.

La carga superficial de la superficie de captura puede ser positiva, negativa o neutra. En algunas realizaciones, la superficie de captura es una perla o perlas cargadas de forma positiva.

Los métodos proporcionados en la presente memoria incluyen un reactivo de lisis. En algunas realizaciones, el agente usado para la lisis en membrana es un reactivo con base fenólica. En algunas realizaciones, el reactivo de lisis es un reactivo con base de guanidinio. En algunas realizaciones, el reactivo de lisis es un tampón con base de alto contenido en sal. En algunas realizaciones, el reactivo de lisis es QIAzol.

Los métodos proporcionados en la presente memoria incluyen una variedad de tampones que incluyen tampones de carga y lavado. Los tampones de carga y lavado pueden ser de alta o baja fuerza iónica. La concentración de sal, p.ej., la concentración de NaCl, puede ser de 0 a 2,4 M. Los tampones pueden incluir una variedad de componentes. En algunas realizaciones, los tampones incluyen uno o más de los siguientes componentes: Tris, Bis-Tris, Bis-Tris-Propano, imidazol, citrato, ácido metilmalónico, ácido acético, etanolamina, dietanolamina, trietanolamina (TEA) y fosfato sódico. En los métodos proporcionados en la presente memoria, el pH de los tampones de carga y lavado es importante. Los filtros tienden a obstruirse cuando las muestras de plasma se ponen a pH < 5,5 antes de la carga (el plasma no girará en absoluto en la columna), y a pH más alto la recuperación de ARN de las microvesículas es menor debido a la inestabilidad de las microvesículas. A pH neutro, la recuperación de ARN de las microvesículas es óptima. En algunas realizaciones, el tampón usado está a concentración 1X, concentración 2X, concentración 3X o concentración 4X. Por ejemplo, el tampón de carga o unión está a concentración 2X mientras que el tampón de lavado está a concentración 1X.

En algunas realizaciones, los métodos incluyen una o más etapas de lavado, por ejemplo, después de poner en contacto la muestra biológica con la superficie de captura. En algunas realizaciones, se añaden detergentes al tampón de lavado para facilitar la eliminación del enlace no específico (es decir, contaminantes, restos celulares, y complejos de proteína circulante o ácidos nucleicos), para obtener una fracción de microvesículas más pura. Los detergentes adecuados para el uso incluyen, pero no están limitados a, dodecilsulfato sódico (SDS), Tween-20, Tween-80, Triton X-100, Nonidet P-40 (NP-40), Brij-35, Brij-58, glucósido de octilo, tioglucósido de octilo, CHAPS o CHAPSO.

En algunas realizaciones, la superficie de captura, p.ej., membrana, se aloja en un dispositivo usado para la centrifugación; p.ej. columnas centrífugas, o para un sistema de vacío p.ej., soportes de filtro de vacío, o para filtración con presión, p.ej., filtros de jeringa. En una realización preferida, la superficie de captura está alojada en una columna centrífuga o sistema de vacío.

El aislamiento de microvesículas de una muestra biológica antes de la extracción de ácidos nucleicos es ventajoso por las siguientes razones: 1) la extracción de ácidos nucleicos desde microvesículas proporciona la oportunidad de analizar selectivamente los ácidos nucleicos específicos de la enfermedad o el tumor obtenidos aislando las microvesículas específicas de la enfermedad o el tumor de otras microvesículas en la muestra de fluido; 2) las microvesículas que contienen ácido nucleico producen rendimientos significativamente mayores de especies de ácido nucleico con mayor integridad en comparación con el rendimiento/integridad obtenido extrayendo ácidos nucleicos directamente de la muestra de fluido sin aislar primero las microvesículas; 3) escalabilidad, p.ej., para detectar ácidos nucleicos expresados a bajos niveles, la sensibilidad puede aumentarse concentrando microvesículas de un mayor volumen de muestra usando los métodos descritos en la presente memoria; 4) más pureza o mayor calidad/integridad de los ácidos nucleicos extraídos en que proteínas, lípidos, restos celulares, células y otros contaminantes potenciales e inhibidores de PCR que se encuentran de forma natural en las muestras biológicas se excluyen antes de la etapa de extracción del ácido nucleico; y 5) se pueden utilizar más opciones en los métodos de extracción de ácido nucleico ya que las fracciones de microvesículas aisladas pueden ser de un menor volumen que las del volumen de muestra de partida, haciendo posible extraer los ácidos nucleicos de estas fracciones o gránulos usando filtros de columna de pequeño volumen.

Se han descrito varios métodos de aislamiento de microvesículas de una muestra biológica en la técnica. Por ejemplo, un método de centrifugación diferencial se describe en un artículo de Raposo et al. (Raposo et al., 1996), un artículo de Skog et al. (Skog et al., 2008) y un artículo de Nilsson et al. (Nilsson et al., 2009). Los métodos de cromatografía de intercambio iónico y/o permeación en gel se describen en las Patentes de EE.UU. núms. 6.899.863 y 6.812.023. Los métodos de gradientes de densidad de sacarosa o electroforesis de orgánulos se describen en la Patente de EE.UU. núm. 7.198.923. Un método de clasificación celular activada magnéticamente (MACS) se describe en un artículo de Taylor y Gercel Taylor (Taylor y Gercel-Taylor, 2008). Un método de concentración por ultrafiltración en nanomembrana se describe en un artículo de Cheruvanky et al. (Cheruvanky et al., 2007). Un método de aislamiento en gradiente de Percoll se describe en una publicación de Miranda et al. (Miranda et al., 2010). Además, las microvesículas pueden identificarse y aislarse del fluido corporal de un sujeto mediante un dispositivo microfluídico (Chen et al., 2010). En la investigación y el desarrollo, además de aplicaciones comerciales de biomarcadores de ácido nucleico, es deseable extraer ácidos nucleicos de alta calidad de muestras biológicas de una manera constante, fiable y práctica.

Un objeto de la presente invención es por tanto proporcionar un método para el rápido y fácil aislamiento de partículas que contienen ácido nucleico de muestras biológicas como fluidos corporales y la extracción de ácidos nucleicos de alta calidad de las partículas aisladas. El método de la invención puede ser adecuado para la adaptación y la incorporación en un dispositivo compacto o instrumento para el uso en un laboratorio o entorno clínico, o en el campo.

En algunas realizaciones, la muestra no está pre-procesada antes del aislamiento y la extracción de ácidos nucleicos, p.ej., ADN y/o ADN y ARN, de la muestra biológica.

En algunas realizaciones, la muestra se somete a una etapa de pre-procesado antes de realizarse el aislamiento, purificación o enriquecimiento de las microvesículas para eliminar partículas grandes indeseadas, células y/o restos celulares y otros contaminantes presentes en la muestra biológica. Las etapas de pre-procesado pueden conseguirse a través de una o más etapas de centrifugación (p.ej., centrifugación diferencial) o una o más etapas de filtración (p.ej., ultrafiltración), o una combinación de las mismas. Donde se realiza más de una etapa de pre-procesado de centrifugación, la muestra biológica puede centrifugarse primero a la menor velocidad y después a la mayor velocidad. Si se desea, pueden realizarse más etapas de pre-procesado de centrifugación adecuadas. De forma alternativa o además de la una o más etapas de pre-procesado de centrifugación, la muestra biológica puede filtrarse. Por ejemplo, una muestra biológica puede centrifugarse primero a 20.000 g durante 1 hora para eliminar partículas grandes indeseadas; la muestra puede filtrarse entonces, por ejemplo, a través de un filtro de 0,8 pm.

En algunas realizaciones, la muestra se pre-filtra para excluir partículas mayores de 0,8 pm. En algunas realizaciones, la muestra incluye un aditivo como EDTA, citrato sódico y/o citrato-fosfato-dextrosa. Preferiblemente, la muestra no contiene heparina, ya que la heparina puede impactar negativamente en RT-qPCR y otros análisis de ácidos nucleicos. En algunas realizaciones, la muestra se mezcla con un tampón antes de la purificación y/o aislamiento de ácidos nucleicos y/o extracción. En algunas realizaciones, el tampón es tampón XBP.

En algunas realizaciones, una o más etapas de centrifugación se realizan antes o después de poner en contacto la muestra biológica con la superficie de captura para separar microvesículas y concentrar las microvesículas aisladas de la fracción biológica. Por ejemplo, la muestra se centrifuga a 20.000 g durante 1 hora a 4°C. Para eliminar partículas grandes indeseadas, células y/o restos celulares, las muestras pueden centrifugarse a una baja velocidad de aproximadamente 100-500g, preferiblemente aproximadamente 250-300g. De forma alternativa o además, las muestras pueden centrifugarse a una mayor velocidad. Las velocidades de centrifugación adecuadas son de hasta aproximadamente 200.000g; por ejemplo de aproximadamente 2.000g a menos de aproximadamente 200.000g. Se prefieren velocidades de más de aproximadamente 15.000g y menos de aproximadamente 200.000g o de más de aproximadamente 15.000g y menos de aproximadamente 100.000g o de más de aproximadamente 15.000g y menos de aproximadamente 50.000g. Se prefieren más velocidades de aproximadamente 18.000g a aproximadamente 40.000g o aproximadamente 30.000g; y de aproximadamente 18.000g a aproximadamente 25.000g. Se prefiere particularmente una velocidad de centrifugación de aproximadamente 20.000g. Generalmente, son tiempos adecuados para la centrifugación de aproximadamente 5 minutos a aproximadamente 2 horas, por ejemplo, de aproximadamente 10 minutos a aproximadamente 1,5 horas, o más preferiblemente de aproximadamente 15 minutos a aproximadamente 1 hora. Un tiempo de aproximadamente 0,5 horas puede preferirse. Se prefiere a veces someter a la muestra biológica a la centrifugación a aproximadamente 20.000g durante aproximadamente 0,5 horas. Sin embargo, las velocidades y tiempos anteriores pueden usarse de forma adecuada en cualquier combinación (p.ej., de aproximadamente 18.000g a aproximadamente 25.000g, o de aproximadamente 30.000g a aproximadamente 40.000g durante aproximadamente 10 minutos a aproximadamente 1,5 horas, o durante aproximadamente 15 minutos a aproximadamente 1 hora, o durante aproximadamente 0,5 horas, etcétera). La etapa o etapas de centrifugación pueden llevarse a cabo a temperaturas por debajo de ambiente, por ejemplo a aproximadamente 0-10°C, preferiblemente aproximadamente 1-5°C, p.ej., aproximadamente 3°C o aproximadamente 4°C.

En algunas realizaciones, una o más etapas de filtración se realizan antes o después de poner el contacto la muestra biológica con la superficie de captura. Puede emplearse un filtro que tiene un tamaño en el intervalo de aproximadamente 0,1 a aproximadamente 1,0 pm, preferiblemente aproximadamente 0,8 pm o 0,22 pm. La filtración puede llevarse también a cabo con sucesivas filtraciones usando filtros con porosidad decreciente.

En algunas realizaciones, se realizan una o más etapas de concentración, para reducir los volúmenes de muestra a tratar durante las etapas de cromatografía, antes o después de poner en contacto la muestra biológica con la superficie de captura. La concentración puede ser a través de centrifugación de la muestra a altas velocidades, p.ej., entre 10.000 y 100.000 g, para provocar la sedimentación de las microvesículas. Esto puede consistir en una serie de centrifugaciones diferenciales. Las microvesículas en el granulado obtenido pueden reconstituirse con un menor volumen y en un tampón adecuado para las posteriores etapas del proceso. La etapa de concentración puede también llevarse a cabo por ultrafiltración. De hecho, esta ultrafiltración tanto concentra la muestra biológica como realiza una purificación adicional de la fracción de microvesículas. En otra realización, la filtración es una ultrafiltración, preferiblemente una ultrafiltración tangencial. La ultrafiltración tangencial consiste en concentrar y fraccionar una disolución entre dos compartimientos (filtrado y retenido), separados por membranas de determinados umbrales de corte. La separación se realiza aplicando un flujo en el compartimiento del retenido y una presión transmembrana entre este compartimiento y el compartimiento de filtrado. Se pueden usar diferentes sistemas para llevar a cabo la ultrafiltración, tal como membranas espirales Millipore, Amicon), membranas planas o fibras huecas (Amicon, Millipore, Sartorius, Pall, GF, Sepracor). Dentro del alcance de la invención, el uso de membranas con un umbral de corte por debajo de 1000 kDa, preferiblemente entre 100 kDa y 1000 kDa, o incluso más preferiblemente entre 100 kDa y 600 kDa, es ventajoso.

En algunas realizaciones, una o más etapas de cromatografía de exclusión por tamaño o etapas de cromatografía de permeación en gel se realizan antes o después de poner en contacto la muestra biológica con la superficie de captura.

Para realizar la etapa de cromatografía de permeación en gel, se usa preferiblemente un soporte seleccionado de sílice, acrilamida, agarosa, dextrano, copolímero de etilenglicol-metacrilato o mezclas de los mismos, p.ej., mezclas de agarosa-dextrano. Por ejemplo, dichos soportes incluyen, pero no están limitados a: SU-PERDeX® 200HR (Pharmacia), TSK G6000 (Toso-Haas) o SEPhAc RYL® S (Pharmacia).

En algunas realizaciones, una o más etapas de cromatografía de afinidad se realizan antes o después de poner en contacto la muestra biológica con la superficie de captura. Algunas microvesículas pueden también caracterizarse por ciertas moléculas superficiales. Debido a que las microvesículas se forman brotando de la membrana plasmática celular, estas microvesículas a menudo comparten muchas de las mismas moléculas superficiales encontradas en las células de las que se originaron. Como se usa en la presente memoria, “moléculas superficiales” se refiere de forma colectiva a antígenos, proteínas, lípidos, carbohidratos y marcadores encontrados en la superficie o en o sobre la membrana de la microvesícula. Estas moléculas superficiales pueden incluir, por ejemplo, receptores, antígenos asociados al tumor, modificaciones de proteínas de membrana (p.ej., estructuras glicosidadas). Por ejemplo, las microvesículas que brotan de células tumorales a menudo presentan antígenos asociados al tumor o su superficie celular. Como tal, la cromatografía de afinidad o la cromatografía de exclusión por afinidad pueden utilizarse también en combinación con los métodos proporcionados en la presente memoria para aislar, identificar y o enriquecer poblaciones específicas de microvesículas de un tipo de célula donante específica (Al-Nedawi et al., 2008; Taylor y Gercel-Taylor, 2008). Por ejemplo, las microvesículas tumorales (malignas o no malignas) portan los antígenos superficiales asociados con el tumor y pueden detectarse, aislarse y/o enriquecerse por medio de estos antígenos superficiales asociados con el tumor. En un ejemplo, el antígeno superficial es una molécula de adhesión celular epitelial (EpCAM), que es específica para microvesículas de carcinomas de origen pulmonar, colorrectal, de mama, próstata, cabeza y cuello y hepático, pero no de origen celular hematológico (Balzar et al., 1999; Went et al., 2004). Adicionalmente, las microvesículas específicas del tumor pueden caracterizarse además por la falta de ciertos marcadores superficiales, tal como CD80 y CD86. En estos casos, las microvesículas con estos marcadores pueden excluirse para el análisis adicional de marcadores específicos del tumor, p.ej., por cromatografía de exclusión por afinidad. La cromatografía de afinidad puede conseguirse, por ejemplo, usando diferentes soportes, resinas, perlas, anticuerpos, aptámeros, análogos de aptámero, polímeros marcados de forma molecular, u otras moléculas conocidas en la técnica que se dirigen específicamente a moléculas superficiales deseadas en las microvesículas.

Opcionalmente, pueden añadirse partículas de control a la muestra antes de que el aislamiento de las microvesículas o la extracción del ácido nucleico sirvan como un control interno para evaluar la eficacia o calidad de la purificación de microvesículas y/o extracción de ácido nucleico. Los métodos descritos en la presente memoria proporcionan el aislamiento eficaz y las partículas de control junto con la fracción de microvesículas. Estas partículas de control incluyen bacteriófagos Q-beta, partículas víricas o cualquier otra partícula que contenga ácidos nucleicos de control (p.ej., al menos un gen diana de control) que puede darse de forma natural o diseñarse mediante técnicas de ADN recombinante. En algunas realizaciones, la cantidad de partículas de control se conoce antes de la adición a la muestra. El gen diana de control puede cuantificarse usando análisis PCR a tiempo real. La cuantificación de un gen diana de control puede usarse para determinar la eficacia o calidad de los procesos de purificación de microvesículas o extracción de ácidos nucleicos.

Preferiblemente, la partícula de control es un bacteriófago Q-beta, denominado en la presente memoria como “partícula Q-beta”. La partícula Q-beta usada en los métodos descritos en la presente memoria puede ser una partícula vírica que se da de forma natural o puede ser un virus recombinantes o diseñado, en el que al menos un componente de la partícula vírica (p.ej., una parte del genoma o proteína de recubrimiento) se sintetiza mediante técnicas de ADN recombinante o biología molecular conocidas en la técnica. Q-beta es un miembro de la familia leviviridae, caracterizada por un genoma de ARN monocatenario, lineal, que consiste en 3 genes que codifican cuatro proteínas virales: una proteína de recubrimiento, una proteína de maduración, una proteína de lisis, y ARN replicasa. Debido a su tamaño similar a microvesículas promedio, Q-beta puede purificarse fácilmente de una muestra biológica usando los mismos métodos de purificación usados para aislar microvesículas, como se describe en la presente memoria. Además, la baja complejidad de la estructura génica monocatenaria viral Q-beta es ventajosa para su uso como un control en los ensayos de ácido nucleico basados en la amplificación. La partícula Q-beta contiene un gen diana de control o secuencia diana de control que se detecta o mide para la cuantificación de la cantidad de partícula Q-beta en una muestra. Por ejemplo, el gen diana de control es el gen de proteína de recubrimiento Q-beta. Después de la adición de las partículas Q-beta a la muestra biológica, los ácidos nucleicos de la partícula Q-beta se extraen junto con los ácidos nucleicos de la muestra biológica usando los métodos de extracción descritos en la presente memoria. La detección del gen diana de control Q-beta puede determinarse mediante análisis RT-PCR, por ejemplo, de forma simultánea con el (los) biomarcador(es) de interés. Una curva estándar de al menos 2, 3 o 4 concentraciones conocidas en una dilución de diez veces de un gen diana de control puede usarse para determinar el número de copias. El número de copias detectado y la cantidad de partícula Q-beta añadida pueden compararse para determinar la calidad del proceso de aislamiento y/o extracción.

En una realización preferida, las partículas Q-beta se añaden a la muestra de orina antes de la extracción nucleica. Por ejemplo, las partículas Q-beta se añaden a la muestra de orina antes de la ultrafiltración y/o después de la etapa de pre-filtración.

En algunas realizaciones, 50, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 1.000 o 5.000 copias de partículas Q-beta se añaden a una muestra de fluido corporal. En una realización preferida, 100 copias de partículas Q-beta se añaden a una muestra de fluido corporal. El número de copias de partículas Q-beta puede calcularse en base a la capacidad del bacteriófago Q-beta para infectar a células diana. Por consiguiente, el número de copias de partículas Q-beta está correlacionado con las unidades formadoras de colonias del bacteriófago Q-beta.

Extracción de ácido nucleico

La presente invención está dirigida al uso de una superficie de captura para el aislamiento, purificación o enriquecimiento mejorados de las microvesículas. Los métodos descritos en la presente memoria proporcionan una fracción de microvesículas altamente enriquecida para la extracción de ácidos nucleicos de alta calidad de dichas microvesículas. Las extracciones de ácidos nucleicos obtenidas por los métodos descritos en la presente memoria pueden ser útiles para diversas aplicaciones en que las extracciones de ácidos nucleicos de alta calidad se necesitan o prefieren, como para el uso en el diagnóstico, pronóstico o monitorización de enfermedades o condiciones médicas.

Recientes estudios revelan que los ácidos nucleicos dentro de las microvesículas tienen un papel como biomarcadores. Por ejemplo, el documento WO 2009/100029 describe, entre otras cosas, el uso de ácidos nucleicos extraídos de microvesículas en suero de paciente de GBM para la evaluación médica del diagnóstico, pronóstico y terapia. El documento WO 2009/100029 también describe el uso de ácidos nucleicos extraídos de microvesículas en la orina humana con los mismos propósitos. El uso de ácidos nucleicos extraídos de microvesículas se considera que sortea potencialmente la necesidad de biopsias, resaltando el enorme potencial diagnóstico de la biología de microvesículas (Skog et al., 2008).

La calidad o pureza de las microvesículas aisladas puede afectar directamente a la calidad de los ácidos nucleicos de microvesículas extraídos, que luego afecta directamente a la eficacia y sensibilidad de los ensayos de biomarcadores para el diagnóstico, pronóstico y/o monitorización de la enfermedad. Dada la importancia de pruebas diagnósticas precisas y sensibles en el campo clínico, se necesitan métodos para aislar fracciones de microvesículas altamente enriquecidas procedentes de muestras biológicas. Para abordar esta necesidad, la presente invención proporciona métodos para aislar microvesículas de la muestra biológica para la extracción de ácidos nucleicos de alta calidad de una muestra biológica. Como se muestra en la presente memoria, las fracciones de microvesículas altamente enriquecidas se aíslan de muestras biológicas mediante métodos descritos en la presente memoria, y en los que los ácidos nucleicos de alta calidad se extraen posteriormente de las fracciones de microvesículas altamente enriquecidas. Estos ácidos nucleicos extraídos de alta calidad son útiles para medir o evaluar la presencia o ausencia de biomarcadores para ayudar en el diagnóstico, pronóstico y/o monitorización de enfermedades u otras condiciones médicas.

Como se usa en la presente memoria, el término “alta calidad” en referencia a la extracción de ácido s nucleicos significa una extracción en que uno es capaz de detectar rARN 18S y 28S, preferiblemente en una relación de aproximadamente 1:1 a aproximadamente 1:2; y más preferiblemente, aproximadamente 1:2. Idealmente, las extracciones de ácidos nucleicos de alta calidad obtenidas por los métodos descritos en la presente memoria también tendrán un número de integridad de ARN de más de o igual a 5 para una muestra biológica baja en proteínas (p.ej., orina), o mayor que o igual a 3 para una muestra biológica alta en proteínas (p.ej., suero), y un rendimiento de ácido nucleico de más de o igual a 50 pg/ml de una muestra biológica baja en proteínas de 20 ml o una muestra biológica alta en proteínas de 1 ml.

Las extracciones de ARN de alta calidad son deseables porque la degradación de ARN puede afectar de forma adversa a la evaluación corriente abajo del ARN extraído, como en la expresión génica y el análisis de mARN, además de en el análisis de ARN no codificante tal como ARN pequeño y microARN. Los nuevos métodos descritos en la presente memoria permiten extraer ácidos nucleicos de alta calidad de microvesículas aisladas de una muestra biológica de manera que pueda realizarse un análisis preciso de ácidos nucleicos en las microvesículas.

Después del aislamiento de las microvesículas a partir de una muestra biológica, el ácido nucleico puede extraerse de la fracción de microvesículas aislada o enriquecida. Para conseguir esto, en algunas realizaciones, las microvesículas pueden lisarse primero. La lisis de microvesículas y la extracción de ácidos nucleicos pueden conseguirse con diversos métodos conocidos en la técnica. En algunas realizaciones, la extracción de ácidos nucleicos puede conseguirse usando fervol:cloroformo según procedimientos estándar y técnicas conocidas en la técnica. Dichos métodos pueden utilizar también una columna de unión a ácido nucleico para capturar los ácidos nucleicos contenidos en las microvesículas. Una vez unidos, los ácidos nucleicos pueden entonces eluirse usando un tampón o disolución adecuada para interrumpir la interacción entre los ácidos nucleicos y la columna de unión, eluyendo así con éxito los ácidos nucleicos.

En algunas realizaciones, los métodos de extracción de ácido nucleico también incluyen la etapa de eliminar o mitigar los factores adversos que evitan la extracción de ácidos nucleicos de alta calidad de una muestra biológica. Dichos factores adversos son heterogéneos en que diferentes muestras biológicas pueden contener diversas especies de factores adversos. En algunas muestras biológicas, factores como un excesivo ADN puede afectar a la calidad de las extracciones de ácido nucleico de dichas muestras. En otras muestras, factores como excesiva RNasa endógena puede afectar a la calidad de las extracciones de ácidos nucleicos de dichas muestras. Muchos agentes y métodos pueden usarse para eliminar estos factores adversos. Estos métodos y agentes se denominan de forma colectiva en la presente memoria como unas “operaciones de mejora de la extracción”. En algunos ejemplos, la operación de mejora de extracción puede implicar la adición de agentes de mejora de la extracción de ácido nucleico a la muestra biológica. Para eliminar factores adversos tales como RNasas endógenas, dichos agentes de mejora de la extracción como se definen en la presente memoria pueden incluir, pero no están limitados a, un inhibidor de RNasa tal como Superase-In (disponible comercialmente de Ambion Inc.) o RNaseINplus (disponible comercialmente de Promega Corp.), u otros agentes que funcionan de un modo similar; una proteasa (que puede funcionar como un inhibidor de RNasa); DNasa; un agente reductor; un sustrato señuelo como un ARN sintético y/o ARN de transporte; un receptor soluble que puede unirse a RNasa; un pequeño ARN de interferencia (siARN); una molécula de unión a ARN, como un anticuerpo anti-ARN, una proteína básica o una proteína chaperona; una sustancia desnaturalizante de RNasa, como una disolución de alta osmolaridad, un detergente o una combinación de los mismos.

Por ejemplo, la operación de mejora de la extracción puede incluir la adición de un inhibidor de RNasa a la muestra biológica, y/o a la fracción de microvesículas aislada, antes de extraer el ácido nucleico; preferiblemente el inhibidor de RNasa tiene una concentración de más que 0,027 AU (I X) para una muestra igual a o mayor que 1 pl de volumen; ^{alternativamente, más que o igual a 0,135} Au (5X) para una muestra igual o mayor que 1 pl; alternativamente, más que o igual a 0,27 AU (10X) para una muestra igual a o mayor que 1 pl; alternativamente, más que o igual a 0,675 AU (25X) para una muestra igual a o mayor que 1 pl; y alternativamente, más que o igual a 1,35 AU (50X) para una muestra igual a o mayor que 1 pl; en el que la concentración I X se refiere a una condición enzimática en la que 0,027 AU o más inhibidor de RNasa se usa para tratar microvesículas aisladas de 1 pl o más de fluido corporal, la concentración 5X se refiere a una condición enzimática en la que 0,135 AU o más inhibidor de RNasa se usa para tratar microvesículas aisladas de 1 pl o más de fluido corporal, la concentración de proteasa 10X se refiere a una condición enzimática en la que 0,27 Au o más inhibidor de RNasa se usa para tratar partículas aisladas de 1 pl o más fluido corporal, la concentración 25X se refiere a una condición enzimática en la que 0,675 AU o más inhibidor de RNasa se usa para tratar microvesículas aisladas de 1 pl o más de fluido corporal, y la concentración de proteasa 50X se refiere a una condición enzimática en la que 1,35 AU o más inhibidor de RNasa se usa para tratar partículas aisladas de 1 pl o más de fluido corporal. Preferiblemente, el inhibidor de RNasa es una proteasa, en cuyo caso, 1 AU es la actividad proteasa que libera aminoácidos positivos de folin y péptidos correspondientes a 1 pmol de tirosina por minuto.

Estos agentes de mejora pueden ejercer sus funciones de varias formas, p.ej., a través de la inhibición de la actividad de RNasa (p.ej., inhibidores de RNasa), a través de la degradación ubicua de proteínas (p.ej., proteasas), o a través ^{de una proteína chaperona (p.ej., una proteína de unión a ARN) que se une y protege a los} ArN. En todos los ejemplos, dichos agentes de mejora de extracción eliminan o al menos mitigan algo o todos los factores adversos en la muestra biológica o asociados con las partículas aisladas que de otra manera evitarían o interferirían con la extracción de alta calidad de ácidos nucleicos de las partículas aisladas.

En algunas realizaciones, la cuantificación de rARNs 18S y 28S extraídos puede usarse para determinar la calidad de la extracción del ácido nucleico.

Detección de biomarcadores de ácidos nucleicos

En algunas realizaciones, el ácido nucleico extraído comprende ADN y/o ADN y ARN. En las realizaciones donde el ácido nucleico extraído comprende ADN y ARN, el ARN preferiblemente se transcribe de forma inversa en ADN complementario (cADN) antes de la amplificación adicional. Dicha transcripción inversa puede realizarse sola o en combinación con una etapa de amplificación. Un ejemplo de un método que combina etapas de transcripción inversa y amplificación es la reacción de cadena polimerasa con transcripción inversa (RT-PCR), que puede modificarse adicionalmente para ser cuantitativa, p.ej., RT-PCR cuantitativa como se describe en la Patente de EE.UU. núm.

5.639.606. Otro ejemplo del método comprende dos etapas separadas: una primera de transcripción inversa para convertir el ARN en cADN y una segunda etapa de cuantificación de la cantidad de cADN usando PCR cuantitativo. Como se demuestra en los ejemplos que siguen, los ARNs extraídos de las partículas que contienen ácido nucleico que usan los métodos descritos en la presente memoria incluyen muchas especies de transcritos que incluyen, pero no están limitados a, rARN 18S y 28S ribosómico, microARNs, ARNs de transferencia, transcritos que están asociados con enfermedades o condiciones médicas, y biomarcadores que son importantes para el diagnóstico, pronóstico y monitorización de condiciones médicas.

Por ejemplo, el análisis de RT-PCR determina un valor Ct (umbral de ciclo) para cada reacción. En la RT-PCR, se detecta una reacción positiva por acumulación de una señal de fluorescencia. El valor Ct se define como el número de ciclos necesarios para que la señal fluorescente cruce el umbral (es decir, excede el nivel de fondo). Los niveles Ct son inversamente proporcionales a la cantidad de ácido nucleico diana, o ácido nucleico de control, en la muestra (es decir, cuanto menor sea el nivel Ct, mayor será la cantidad de ácido nucleico de control en la muestra).

En otra realización, el número de copias del ácido nucleico de control puede medirse usando cualquiera de una variedad de técnicas reconocidas en la técnica, que incluye, pero no está limitada a, RT-PCR. El número de copias del ácido nucleico de control puede determinarse usando métodos conocidos en la técnica, como generando y utilizando una curva de calibración, o estándar.

En algunas realizaciones, uno o más biomarcadores pueden ser una o una colección de aberraciones genéticas, que se usan en la presente memoria para referirse a las cantidades de ácido nucleico además de variantes de ácido nucleico en las partículas que contienen ácido nucleico. Específicamente, las aberraciones genéticas incluyen, sin limitación, la sobre-expresión de un gen (p.ej., un oncogén) o un panel de genes, sub-expresión de un gen (p.ej., un gen supresor tumoral como p53 o RB) o un panel de genes, la producción alternativa de variantes de corte y empalme de un gen o un panel de genes, variantes del número de copias del gen (CNV) (p.ej., diminutos dobles de a Dn ) (Hahn, 1993), modificaciones de ácidos nucleicos (p.ej., metilación, acetilación y fosforilaciones), polimorfismos de nucleótidos sencillos (SNP), transposiciones cromosómicas (p.ej., inversiones, supresiones y duplicaciones), y mutaciones (inserciones, supresiones, duplicaciones, cambios de sentido, sin sentido, sinónimos o cualquier otro cambio de nucleótidos) de un gen o un panel de genes, cuyas mutaciones, en muchos casos, el último caso afectan a la actividad y la función de los productos génicos, llevan a variantes de corta y pega transcripcionales alternativos y/o cambios del nivel de expresión génica, o combinaciones de cualquiera de lo anterior.

El análisis de ácidos nucleicos presente en las partículas aisladas es cuantitativo y/o cualitativo. Para el análisis cuantitativo, las cantidades (niveles de expresión), relativas o absolutas, de ácidos nucleicos específicos de interés en las partículas aisladas se miden con métodos conocidos en la técnica (descritos a continuación). Para el análisis cualitativo, las especies de ácidos nucleicos específicos de interés en las microvesículas aisladas, de tipo salvaje o variantes, se identifican con métodos conocidos en la técnica.

La presente invención también incluye usos diversos de los nuevos métodos de aislamiento de microvesículas a partir de una muestra biológica para la extracción de ácidos nucleicos de alta calidad de un para (i) ayudar en el diagnóstico de un sujeto, (ii) monitorizar el progreso o repetición de una enfermedad u otra condición médica en un sujeto, o (iii) ayudar en la evaluación de la eficacia de tratamiento para un sujeto que se somete o contempla el tratamiento de una enfermedad u otra condición médica; en el que se determina la presencia o ausencia de uno o más biomarcadores en la extracción de ácido nucleico obtenida a partir del método, y el uno o más biomarcadores se asocian con el diagnóstico, progreso o repetición, o la eficacia de tratamiento, respectivamente, de una enfermedad u otra condición médica.

Kit para aislar microvesículas a partir de una muestra biológica

Un aspecto de la presente invención se dirige adicionalmente a kits para usar en los métodos descritos en la presente memoria. El kit comprende un aparato de superficie de captura suficiente para separar las microvesículas de una muestra biológica de partículas indeseadas, restos, y pequeñas moléculas que también están presentes en la muestra biológica. La presente invención incluye además opcionalmente instrucciones para usar los reactivos anteriores en el proceso de aislamiento y posterior extracción opcional de ácidos nucleicos.

EJEMPLOS

Aunque los ejemplos proporcionados en la presente memoria usan una variedad de membranas y dispositivos usados con propósitos de centrifugación y/o filtración, se va a entender que estos métodos pueden usarse con cualquier superficie de captura y/o dispositivo de alojamiento que permita la captura eficaz de microvesículas y la liberación de los ácidos nucleicos, particularmente, ARN, contenidos en ellas.

Ejemplo 1: Aislamiento EXO52 de ADN, además de co-aislamiento de ARN y ADN

Este ejemplo demuestra la capacidad del método EXO52 para aislar todo el ADN de una muestra de plasma. Debería notarse que en algunas de las figuras presentadas en la presente memoria, se ha usado diversa terminología para identificar métodos precursores a los métodos de aislamiento denominados en la presente memoria como EXO52. Por ejemplo, algunas figuras incluyen términos como EXO52 antiguo, EXO52.1, y variaciones de los mismos. Estas versiones tempranas se proporcionan solamente como una comparación y para demostrar el aislamiento superior conseguido usando los métodos EXO52 de la descripción. El uso del término EXO52.2 es el método EXO52 donde la extracción de ARN y ADN se realiza en un único tubo.

La columna EXO52 puede usarse también para aislar todo el ADN de una muestra de plasma. Se representan dos métodos para utilizar la columna EXO52 para el aislamiento de ADN además de ARN en la FIG. 1 y la FIG. 2. Específicamente, la diferencia entre los dos procesos es que la extracción de ARN y ADN se combina en un tubo en EXO52, para la facilidad de usabilidad, optimización del protocolo, y reproducibilidad aumentada. La FIG. 3 muestra una ganancia de 1,5 Cts en EXO50 ARN ADN (EXO52). EXO50 es un método para aislar ARN de las microvesículas en una muestra biológica como, por ejemplo, plasma. Este método se describe en la Publicación PCT núm. WO2014/107571. La FIG. 4 muestra que el aumento de la cantidad de cloroformo durante la separación de fases devuelve el ADN a la fase acuosa, de manera que el ADN se co-aísla con el procedimiento EXO50 normal. La optimización adicional de los niveles de pH durante la fase de separación también añade el ADN a la preparación, como se muestra en la FIG. 5.

Por consiguiente, el método de la descripción puede usarse para aislar todo el ADN de las muestras de plasma. El ADN se recupera de la fase inferior, hidrófoba, de la lisis con QIAzol después de la separación de fases. Los métodos de la descripción (p.ej. dos tubos o un único tubo como en EXO52), separan ARN y ADN a niveles similares para el mismo volumen de muestra, y el ARN y el ADN pueden separarse el uno del otro. Estos métodos de la descripción capturan el mismo o más mARN y mucho más miARN que un kit de aislamiento disponible comercialmente, p.ej., Qiagen.

EXO52 puede usarse también para la co-purificación de ARN y ADN. Como se usa en la presente memoria, EXO52 se refiere al siguiente protocolo, a menos que se especifique lo contrario.

Preparación de la muestra: El procedimiento EXO52 puede usarse para aislar ARN y ADN a partir de exosomas y otras microvesículas usando 0,2 - 4 mL de plasma o suero. Se recomienda usar solo plasma o suero pre-filtrado, excluyendo partículas mayores de 0,8 pm. La lista de tubos de plasma compatibles incluyen plasma con los aditivos EDTA, citrato sódico, y citrato-fosfato-dextrosa. El plasma que contiene heparina puede inhibir la RT-qPCR.

La muestra, sola o diluida con un tampón de unión, se carga luego en la columna centrífuga EXO52 y se hizo girar durante 1 min a 500 x g. Desechar el flujo continuo y poner de nuevo la columna en el mismo tubo de recogida. El tampón de lavado se añade después y la columna EXO52 se hace girar durante 5 min a 5000 x g para eliminar el volumen residual de la columna. Nota: Después de la centrifugación, la columna centrífuga EXO52 se quita del tubo de recogida de manera que la columna no entre en contacto con el flujo continuo. La columna centrífuga se transfiere después a un tubo de recogida nuevo, y se añaden 700 pL de Qiazol a la membrana. Después, la columna centrífuga se hace girar durante 5 min a 5000 x g para recoger el homogeneizado que contiene los exosomas lisados. El homogeneizado se transfiere entonces a un tubo PLG.

Después, se añaden 350 pl de cloroformo al tubo que contiene el homogeneizado y se agita vigorosamente durante 15 s. El tubo que contiene el homogeneizado se mantiene después a temperatura ambiente durante 2-3 min, seguido por centrifugación durante 5 min a 12.000 x g a 4°C. Después de la centrifugación, la centrífuga se calienta a temperatura ambiente (15-25°C) si la misma centrífuga se va a usar para las siguientes etapas de centrifugación.

La fase acuosa superior se transfiere a un nuevo tubo de recogida, evitando la transferencia de cualquier material de la interfase. Se añaden entonces 2 volúmenes de etanol al 100% y se mezclan cuidadosamente pipeteando arriba y abajo varias veces y sin el uso de una centrífuga. 700 pl de la muestra, incluyendo cualquier precipitado que pueda haberse formado, se pipetean entonces a una columna centrífuga RNeasy MinElute en un tubo de recogida de 2 ml (núm. cat. 1026497), seguido de centrifugación a >8000 x g (>10.000 rpm) durante 15 s a temperatura ambiente (15 -25°C). El flujo continuo se desecha. Estas etapas se repiten con el resto de la muestra, y el flujo continuo se desecha.

EXO52 es útil para aislar y detectar ADN de las muestras biológicas. Se cree que el ARN de vesícula se deriva de células vivas en p.ej. el tejido enfermo. Se cree que el ADN libre (cfADN) se deriva de células moribundas p.ej. células necróticas en el tejido enfermo. Por consiguiente, el cfADN es útil como un indicador de la respuesta terapéutica, mientras que el ARN es un indicador de mutaciones de resistencia en aumento.

EXO52 es útil para la detección de mutaciones raras en la sangre, ya que EXO52 proporciona un método suficientemente sensible que puede aplicarse a ácidos nucleicos de cantidad suficiente. La cantidad de moléculas de ADN y ARN real en los biofluidos es muy limitada, y EXO52 proporciona un método de aislamiento que extrae todas las moléculas de la sangre que son relevantes para la detección de mutaciones en un volumen suficientemente pequeño para el procesado y/o análisis eficaz corriente abajo.

Las figuras 13-223 (denominadas solo en este ejemplo como “las figuras”) demuestran la especificidad y sensibilidad de los métodos EXO52.

Los estudios han mostrado que la columna EXO50/52 se une a todo el ADN en el plasma, pero el procedimiento para obtener el ADN de la fase fenólica no produce resultados satisfactorios, ya que el procedimiento de aislamiento es muy variable. Los métodos proporcionados en la presente memoria permiten el aislamiento y/o extracción reproducible y eficaz del ADN de la membrana de la columna EXO50/52.

Dos de cada tres replicados del aislamiento Exo52 con tubo PLG muestran casi los mismos valores CT que el kit de cfADN disponible comercialmente. Uno de cada tres replicados del aislamiento EXO52 sin tubo PLG muestra casi los mismos valores CT que el kit de cfADN. El plasma agotado (flujo continuo Exo50 de plasma sin 2x de tampón de unión) no contiene mucho ADN (diferencia 18s ~ 9CT al aislamiento normal). Casi todo el ADN se unió a la columna Exo50.

Como se muestra en las figuras, añadir cloroformo al método EXO52 permitió el co-aislamiento tanto de ARN como de ADN, y la adición de cloroformo no dañó a la detección o aislamiento de ARN.

Con respecto al aislamiento de ARN, se determinó que añadir más cloroformo no influyó en el aislamiento de ARN si se usaban ensayos específicos de ARN. Los ensayos específicos de ADN darán por resultado menores CT cuando se añade más cloroformo porque el ADN está en fase acuosa.

Con respecto al aislamiento de ADN, los CT para ensayos de detección de ADN aumentaron en el aislamiento de la fase acuosa con la adición de más cloroformo y disminuyeron en el aislamiento de ADN en fase fenólica EXO52.

El aislamiento EXO50 de la fase fenólica dio por resultado los valores de CT más bajos (= el mayor rendimiento de ADN). 90 pl de cloroformo dieron por resultado el mejor rendimiento de ADN procedente de la fase fenólica.

Además sin el tubo PLG, la relación de cloroformo a la que no se observó contaminación de ADN fue aproximadamente 0,13x.

Como se muestra en las figuras, 350 pL de cloroformo fue suficiente para añadir todo el ADN de la columna EXO52 a la fase acuosa durante la extracción PC. Cantidades mayores de cloroformo pueden interferir con el aislamiento del ARN.

Como se muestra en las figuras, el rendimiento de ADN aumentó en la fase acuosa añadiendo más cloroformo, mientras que el rendimiento de ADN disminuyó en la fase fenólica (aislamiento de ADN EXO52). El aislamiento de ADN de la fase acuosa dio más ADN en comparación con el aislamiento de ADN EXO52 de la fase fenólica. Poco ADN pareció quedarse en la fase fenólica o en la fase acuosa sobrante después de eliminar la fase superior, ya que es difícil eliminar toda la fase sin usar un tubo PLG. El rendimiento del ADN es similar en la reacción RT ( l0 pl de eluido EXO50 en la mezcla RT de 20 pl final) y 1:2 en el eluido EXO50 diluido. El ADN no pareció reaccionar con la mezcla de transcripción inversa.

Los estudios se repitieron usando un ensayo GAPDH solo de ARN para ver si el ensayo de GAPDH solo de ARN se afectó por el aumento de adición de cloroformo. El ARN no se afectó con el aumento de adición de cloroformo. También se hicieron estudios usando un ensayo de GAPDH_ARN_ADN, que no mostró sustitución de la señal de ARN por el ADN (diferencia de ~2CT).

El ensayo BRAF mostró un aumento de 2x en la señal en la fracción de ARN EXO50 que tenía ADN presente en la fase acuosa. El ensayo GAPDH no mostró un efecto aditivo claro de ADN en la fracción de ARN EXO50 ya que las copias añadidas fueron ínfimas en comparación con las copias de ARN. Con esta clara diferencia entre las copias de a Rn y ADN, no puede mostrarse sustitución de la señal de ARN.

Se realizaron estudios para determinar el efecto, si lo hay, de los cambios de pH en la separación de fase. El ajuste de pH proporciona una herramienta alternativa para añadir ADN a la fase acuosa. Se encontró que un pH demasiado alto interfirió con el aislamiento de ARN.

El pH alto pareció dar problemas a BA. Por ejemplo, el perfil BA de la muestra ION NaOH mostró el mayor pico de ADN pero muy bajo FU ([FU] = 2 en comparación con [FU] = 40). El alto pH pareció dar problemas a la reacción RT. Un aumento en el pH de la fase acuosa dio por resultado menores valores de CT en el aislamiento de ADN Exo50 mientras que el aislamiento de ADN EXO52 dio por resultado mayores valores, pero fue mayor la cantidad de ADN que quedó en la fase fenólica en comparación con la valoración con cloroformo.

La disminución de pH fue capaz de eliminar el ADN de la fase fenólica EXO52 y enriquecerlo en la fase acuosa. El ADN no se dañó en el RT. El ARN se dañó al mayor pH. BA se afectó en las tres etapas de mayor pH.

Como se muestra en las figuras, la adición de cloroformo fue el factor predominante en la determinación del contenido de ADN de la fase acuosa. Un efecto positivo del pH alto se vio solo a bajos niveles de cloroformo. La señal de ARN no se afectó por la adición de ADN a la fase acuosa.

Como se muestra en las figuras, no hubo efecto aditivo de la disolución de pH al número de copias de ADN, y además no fue necesario el cambio en la cantidad de cloroformo necesario para llevar el ADN a la fase acuosa. Las muestras incluso dieron por resultado menores números de copias en comparación con las muestras procesadas sin disolución de pH. Solo las muestras que fueron procesadas con 90 pl dieron por resultado mayores números de copias. La disolución de pH y la mayor cantidad de cloroformo no afectó al aislamiento de a Rn (mARN). Durante toda la valoración, las muestras que se procesaron con disolución de pH dieron por resultado un poco menos de números de copias (excepto en las muestras de 90 pl de cloroformo) en comparación con las muestras procesadas sin la disolución de pH.

Como se muestra en las figuras, un giro con QIAzol a temperatura ambiente aumentó el porcentaje de material de ADN en la fase acuosa. Este no fue el caso cuando se usaron cantidades mayores de cloroformo en el procedimiento EXO52.

Una etapa de centrifugación con Qiazol provocó la contaminación del ADN en la fase acuosa, pero solo en muestras sin tubo PLG. Las muestras en tubo PLG con la etapa de centrifugación a temperatura ambiente también mostraron un poco más de ADN, pero el número de copias estuvo por debajo de LOQ=32 copias. La temperatura para la etapa de centrifugación no influyó en el aislamiento de mARN y miARN.

Un giro con Qiazol a temperatura ambiente no añadió ADN al aislamiento de ADN EXO52 normal. No hubo diferencia en los valores CT que hacían referencia a la temperatura de giro. La temperatura de la etapa de centrifugación no influyó en el aislamiento de mARN y miARN.

Como se muestra en las figuras, la unión y elución de ADN a partir de EXO52 a la columna centrífuga RNeasy no dependió de la concentración de etanol en el intervalo de volumen de 1,5x al volumen de 2,6x.

Como se muestra en las figuras, el rendimiento de EXO52 no se aumentó cuando se usó mayor concentración de etanol. Los valores CT de los tres ensayos permanecieron constantes durante toda la valoración con etanol. La concentración de etanol en la etapa de pre-acondicionado del aislamiento de ARN no influyó en la recuperación de cfADN.

Como se muestra en las figuras, la digestión con una proteinasa K (ProtK) de una muestra de plasma llevó específicamente a la pérdida de la señal de ARN, pero el tratamiento con ProtK no influyó en el rendimiento de ADN, ya que se obtuvo el mismo CT para todas las muestras.

Como se muestra en las figuras, la capacidad de carga de ADN de EXO52 no se alcanzó a 8 ml de plasma ya que el rendimiento de ADN estaba aumentando aún de forma lineal y no hubo ADN detectable en el flujo continuo. Esto contraste con la capacidad de carga lineal de las vesículas, que se alcanza a los 4 mL. No se detectó cfADN en el flujo lineal (FT) pero se vio que el ARN se acumuló a partir de 2 mL. El resultado de la muestra es lineal para el ADN, pero no para el ARN. El ARN tiene un punto de saturación diferente que el ADN. Se encontró que añadir un tubo PLG al procedimiento aumenta el rendimiento ligeramente. El método EXO52 añadió copias de ARN, cuando se compara con kits de CNA disponibles comercialmente.

En algunas realizaciones, los métodos usan un tampón de extracción basado solo en tiocianato de guanidinio para extraer ARN y ADN de la columna EXO52.

Como se muestra en las figuras para el aislamiento de ARN, 1 de cada 2 replicados de RLT alto DTT a 56°C dio por resultado los valores CT esperados. La variación entre replicados puede haber sido provocada por la obstrucción de la membrana RNeasy después de añadir la mezcla de carga. El perfil BA mostró una concentración muy baja de ARN para la izquierda en el punto de datos de la columna para RLT alto DTT a 56°C pero solo un aislamiento de ARN dio por resultado los valores de CT esperados.

Como se muestra en las figuras para el aislamiento de ADN, la columna de ADN All-Prep dio por resultado un número de copias muy alto para los ensayos de detección de ADN. También la izquierda del punto de datos de la columna mostró valores CT muy altos. El ADN pareció perderse por la columna centrífuga de ADN AllPrep provocado por un corte alto (15-30 kb). El tamaño de cfADN está típicamente en el intervalo de 35 bp - 10kb.

Las figuras también demuestran el aislamiento de microARN usando varios procedimientos de aislamiento de ADN o ADN/ARN. El EXO52 aisló más mARN y muchos más miARN que el kit CnA disponible comercialmente, y EXO52 y el kit de CNA aislaron la misma cantidad de ADN. El método EXO52 pareció aislar todo el ADN del plasma.

Como se muestra en las figuras, EXO52 consiguió de forma consistente mejores resultados que el kit de ácidos nucleicos circulantes (CNA) disponible comercialmente. EXO52 tiene mejor rendimiento que el kit de CNA en tres acumulaciones de plasma diferentes, lotes de reactivo de CNA diferentes, diferentes operadores y diferentes fuentes de muestras.

Los métodos EXO52 se usaron para analizar cfADN en muestras de una cohorte de melanoma. Los resultados obtenidos usando los métodos EXO52 se compararon con los resultados obtenidos usando un kit de CNA disponible comercialmente. La variación dentro del ensayo (en base a diferentes puntos temporales de aislamiento de la misma muestra de plasma) del kit de CNA fue mayor que la observada usando los métodos EXO52. Como se muestra en las figuras, el rendimiento de los métodos EXO52 es igual o mejor que los obtenidos usando el kit disponible comercialmente.

Como se muestra en las figuras, se dejó aproximadamente el 15% de ADN en la fase orgánica después de la separación de fases con 350 pl de cloroformo. La doble extracción aumentó el rendimiento de ADN en aproximadamente el 15% de puntos. La separación de fase con 90 pl de cloroformo (ARN) seguida por la segunda extracción con 260 pl adicionales (suma: 350 pl de cloroformo) solo dio por resultado aproximadamente 50% de rendimiento de ADN en comparación con la extracción de ADN EXO52. La recarga del material EXO52 acondicionado en la misma columna no mejoró el rendimiento.

Ejemplo 2. Desarrollo de una plataforma de aislamiento de una etapa para ARN exosómico y ADN libre de plasma cancerígeno

Los ácidos nucleicos circulantes en la corriente sanguínea de pacientes con cáncer son de gran interés para la investigación médica debido a su potencial para dar información del estado de la enfermedad del paciente y las opciones de tratamiento sin necesitar una biopsia tisular. Cualquier prueba diagnóstica que busca utilizar biofluidos para el análisis de mutaciones necesita una plataforma que pueda maximizar la captura de mutaciones derivadas del tumor en circulación. El plasma sanguíneo contiene al menos dos fuentes libres de ácidos nucleicos: ADN libre circulante (cfADN), generado a partir de células apoptóticas o necróticas, y ARN encerrado en vesículas extracelulares que incluyen exosomas (exoARN), que se secretan de forma activa por las células en el cuerpo. Como la cantidad total de ácidos nucleicos en biofluidos está muy limitada y las mutaciones tumorales se reflejan tanto en el ARN como el ADN, se ideó un método para co-aislar todo el exoARN y el cfADN fuera de las muestras de plasma sanguíneo en un volumen suficientemente pequeño para el procesado eficaz corriente abajo por RT-qPCR y re-secuenciación dirigida por NGS.

Las figuras 224-226 ilustran los estudios presentados en la presente memoria que demuestran lo siguiente: (i) el plasma sanguíneo contiene ARN libre además de ADN libre; (ii) EXO52 es un procedimiento rápido, reproducible y conveniente para co-aislar todo el exoARN y cfADN de altos volúmenes de biofluidos; y (iii) usar ambos, exoARN y cfADN típicamente dobla las moléculas disponibles para la detección de mutantes raros por qPCR y NGS.

Claims (15)

REIVINDICACIONES

1. Un método para extraer ADN y ARN de una muestra biológica que comprende:

(a) proporcionar una muestra biológica;

(b) poner en contacto la muestra biológica con una superficie de captura bajo condiciones suficientes para retener el ADN libre y las microvesículas de la muestra biológica sobre o en la superficie de captura, en la que la superficie de captura comprende una membrana o una o más perlas que son intercambiadores aniónicos funcionalizados con amonio cuaternario R-CH2-N+(CH3)3, o una membrana o una o más perlas que están cargadas de forma positiva y funcionalizadas con amonio cuaternario R-CH2-N+(CH3)3;

(c) poner en contacto la superficie de captura con un reactivo de lisis basado en tiocianato de guanidinio mientras el ADN libre y las microvesículas están sobre o en la superficie de captura, liberando así el ADN y el ARN de la muestra y produciendo un homogeneizado; y

(d) extraer el ADN, el ARN o tanto el ADN como el ARN del homogeneizado.

2. El método según la reivindicación 1, en el que la membrana o una o más perlas está cargada de forma positiva.

3. El método según la reivindicación 1, en el que la membrana o una o más perlas están cargadas de forma positiva y los intercambiadores aniónicos funcionalizados con amonio cuaternario R-CH2-N+(CH3)3.

4. El método según la reivindicación 1, en el que la membrana tiene un tamaño de poro de al menos 3 pm.

5. El método según la reivindicación 1, en el que la superficie de captura comprende tres membranas, en la que dichas tres membranas son directamente adyacentes entre ellas.

6. El método según la reivindicación 5, en el que las tres membranas son idénticas entre ellas.

7. El método según la reivindicación 6, en el que cada membrana está cargada de forma positiva y/o es un intercambiador aniónico funcionalizado con amonio cuaternario R-CH2-N+(CH3)3.

8. El método según la reivindicación 1, en el que la muestra biológica es plasma o suero, opcionalmente en el que la muestra biológica está entre 0,2 a 4 mL.

9. El método según la reivindicación 1, en el que la muestra biológica es orina, líquido cerebroespinal o sobrenadante de cultivo celular.

10. El método según la reivindicación 1, en el que la etapa (a) comprende además el procesado de la muestra biológica filtrando la muestra biológica, opcionalmente en la que la filtración se realiza usando un filtro de 0,8 pm.

11. El método según la reivindicación 1, en el que la etapa (b) comprende además una etapa de centrifugación después de poner en contacto la muestra biológica con la superficie de captura.

12. El método según la reivindicación 1 o la reivindicación 11, en el que la etapa (b) comprende además lavar la superficie de captura después de poner en contacto la muestra biológica con la superficie de captura.

13. El método según la reivindicación 1, en el que la etapa (c) comprende además una etapa de centrifugación después de poner en contacto la superficie de captura con el reactivo de lisis con base de tiocianato de guanidinio.

14. El método según la reivindicación 1, en el que la etapa (d) comprende además añadir cloroformo al homogeneizado, opcionalmente comprende además añadir un control al homogeneizado antes de añadir cloroformo al homogeneizado.

15. El método según la reivindicación 1, en el que el método comprende además la etapa (e) acondicionamiento con etanol de la extracción de la etapa (d); etapa (f) unión de la extracción acondicionada con etanol a una columna de sílice; y la etapa (g) elución de la extracción de la columna de sílice.