ES2908932T3 - Perfilado de ácidos nucleicos de microvesícula y usos del mismo como características distintivas en diagnóstico de rechazo de trasplante renal - Google Patents

Abstract

Un método para caracterizar a sujetos con trasplante renal para el diagnóstico, pronóstico, control o selección de tratamiento para rechazo de trasplante renal en un sujeto que lo necesita, comprendiendo el método comparar el nivel de expresión de un panel de biomarcadores que comprende CXCL9, IFNGR1, CXCL10, PXMP2, TNFRSF19, IL32, AGTR1, EPHX2, PDE4A, IRAK2, IL22RA1, IL1RAP, CXCL13, CXCL6, PTGES, STAT1, TSLP, BMP7, IL15RA, CCL8, PYCARD, C3 y ZMYND15 en ácidos nucleicos extraídos de una fracción de microvesícula aislada de una muestra biológica del sujeto con un nivel de control de expresión del panel de biomarcadores para determinar y/o para predecir el rechazo de trasplante renal en el sujeto, en el que el nivel de control de expresión del panel de biomarcadores es de un paciente que ha experimentado rechazo de trasplante renal o en el que el nivel de control de expresión del panel de biomarcadores es de un paciente que no ha experimentado ningún síntoma de rechazo de trasplante renal.

Description

DESCRIPCIÓN

Perfilado de ácidos nucleicos de microvesícula y usos del mismo como características distintivas en diagnóstico de rechazo de trasplante renal

Campo de la invención

La divulgación se refiere en general al uso de características distintivas de ARN de microvesícula para diagnosticar, predecir y/o controlar la eficacia de tratamiento en pacientes, por ejemplo, pacientes que son candidatos para trasplante renal y/o que han recibido un trasplante renal.

Antecedentes

El creciente conocimiento de los cambios genéticos y epigenéticos que se producen en las células proporciona una oportunidad de detectar, caracterizar y controlar enfermedades y trastornos analizando secuencias y perfiles de ácido nucleico específicos de enfermedad. Estos cambios pueden observarse detectando cualquiera de una diversidad de biomarcadores relacionados con enfermedad. Se usan diversos ensayos de diagnóstico molecular para detectar estos biomarcadores y producir información valiosa para pacientes, doctores, médicos e investigadores.

La capacidad de realizar estos ensayos usando una muestra corporal fluida tiene implicaciones de gran alcance en términos de bien estar de los pacientes, la capacidad de realizar control longitudinal de la enfermedad y la capacidad de obtener perfiles de expresión incluso cuando las células del tejido nos son fácilmente accesibles.

Por consiguiente, existe una necesidad de nuevos métodos no invasivos de detección de biomarcadores, por ejemplo, biomarcadores en microvesículas, para ayudar en el diagnóstico, pronóstico, control o selección de tratamiento para una enfermedad u otra afección médica.

Sumario de la invención

La divulgación proporciona métodos para el uso de características distintivas de ARN de microvesícula para controlar la eficacia del tratamiento y/o para predecir el rechazo renal en un sujeto. Los métodos pueden usarse para controlar la eficacia del tratamiento longitudinalmente.

Los métodos y composiciones proporcionados en este documento son útiles para medir ácidos nucleicos obtenidos de microvesículas, por ejemplo, ARN de microvesícula, también denominado en este documento ARN de exosoma o ARN exosómico, como diagnóstico para rechazo de trasplante tal como, por ejemplo, rechazo de trasplante renal.

Antes de los presentes métodos, las características distintivas de ácido nucleico se obtenían de células de una muestra de orina. Como se muestra en los estudios presentados en este documento, las células de una muestra de orina y los ácidos nucleicos de la fracción de microvesícula de la muestra de orina se analizaron en paralelo. De forma interesante, las células de la orina no podían discriminar de forma fiable y satisfactoria entre pacientes que experimentaba rechazo de trasplante renal y los que no experimentaban ningún síntoma de rechazo u otras indicaciones. En contraste, las características distintivas de ácido nucleico derivadas de las microvesículas discriminaban de forma fiable y satisfactoria entre estos dos grupos.

Tradicionalmente, el descubrimiento y desarrollo de biomarcadores ha requerido el uso de material obtenido de biopsias de tejido. Sin embargo, los recientes desarrollos en el campo de los exosomas han permitido que la investigación de biomarcadores en fluidos biológicos evolucione. Los exosomas son microvesículas muy estables, de aproximadamente 30-200 nm de diámetro, que se desprenden de las células en todos los fluidos biológicos, incluyendo la sangre, la orina y el líquido cefalorraquídeo, portando una fuente rica de proteína y ARN intactos. Los exosomas y otras vesículas pueden liberarse por la ruta corporal multivesicular o a través de gemación directa en la membrana plasmática. El ARN puede aislarse de forma eficaz y abordarse usando tecnologías tales como RT-qPCR y NGS (véase, por ejemplo, Brock, G. et al. (2015) Liquid biopsy for cancer screening, patient stratification and monitoring. Translational Cancer Research, 4(3), 280-290; y Enderle, D. et al. (2015) Characterization of RNA from Exosomes and Other Extracellular Vesicles Isolated by a Novel Spin Column-Based Method. PLoS ONE, 10(8): e0136133. doi:10.1371/journal.pone.0136133).

Los métodos y kits descritos en este documento aíslan la fracción de microvesícula capturando las microvesículas en una superficie y posteriormente lisando las microvesículas para liberar los ácidos nucleicos, particularmente ARN, contenidos en las mismas. Los métodos y kits proporcionados en este documento aíslan la fracción de microvesícula usando cualquier técnica adecuada. Las microvesículas pueden aislarse usando los métodos y superficies de captura descritos en la publicación PCT n.° WO 2014/107571 y en la publicación PCT n.° WO 2016/007755. Las microvesículas pueden aislarse de una muestra de orina usando los métodos y superficies de captura descritos en la publicación PCT n.° WO 2015/021158. El American Transplant Congress Meeting 2015, número de resumen 182; sesión del lunes 04.05.2015, describe un método para el diagnóstico de complicaciones posteriores a trasplante renal mediante análisis de ARNm exosómico de orina. El documento WO 2011/156763, describe el análisis de ARNm específico de riñón en exosomas de orina para diagnóstico y tratamiento precoz. PLoS ONE (2014) 9(10) e109074 y Kidney International (2010) 78 191-199, describen que puede usarse ultracentrifugación y ultrafiltración para aislar microvesículas.

La presente divulgación proporciona métodos de detección de uno o más biomarcadores en una muestra biológica para ayudar en el diagnóstico, pronóstico, control o selección de tratamiento para rechazo de trasplante tal como, por ejemplo, rechazo de trasplante renal. Los métodos y kits proporcionados en este documento son útiles en la detección de uno o más biomarcadores a partir de la fracción de microvesícula de una muestra biológica, por ejemplo, una muestra de orina.

La muestra biológica usada en los métodos proporcionados en este documento está en un líquido corporal. Los líquidos corporales pueden ser líquidos aislados de cualquier parte del organismo del sujeto, preferiblemente una localización periférica incluyendo, aunque sin limitación, por ejemplo, orina, sangre, plasma, suero, esputo, líquido medular, líquido cefalorraquídeo, líquido pleural, aspirados de los pezones, líquido linfático, líquido del aparato respiratorio, intestinal y genitourinario, líquido lagrimal, saliva, leche materna, líquido del sistema linfático, semen, líquido cefalorraquídeo, líquido del sistema intraorgánico, líquido ascítico, líquido de quiste tumoral, líquido amniótico y combinaciones de los mismos. Por ejemplo, el líquido corporal es orina, sangre, plasma, suero o líquido cefalorraquídeo. El líquido corporal puede ser orina.

En cualquiera de los métodos anteriores, los ácidos nucleicos son ADN o ARN. Ejemplos de ARN incluyen ARN mensajeros, ARN transferentes, ARN ribosómicos, ARN pequeños (ARN que no codifican proteínas, ARN que no son mensajeros), microARN, ARNpi, ARNex, ARNnp y ARNnop. El Ar N puede ser miARN.

Los ácidos nucleicos se aíslan de o derivan de otro modo de una fracción de microvesícula. Los ácidos nucleicos pueden ser ARN o ADN o ARN y ADN aislados de derivados de otro modo de una fracción de microvesícula. Los ácidos nucleicos pueden ser ARN aislado de o derivado de otro modo de una fracción de microvesícula.

Los ácidos nucleicos son ácidos nucleicos libres de células, también denominados en este documento ácidos nucleicos circulantes. Los ácidos nucleicos libres de células pueden ser ADN o ARN. El ácido nucleico libre de células puede ser ADN libre de células.

La superficie de captura puede estar cargada positivamente. La superficie de captura puede estar cargada negativamente. La superficie de captura puede ser neutra.

La superficie de captura puede ser una membrana. La superficie de captura puede ser una microesfera. Por ejemplo, la microesfera es magnética. Como alternativa, la microesfera no es magnética. La microesfera puede estar funcionalizada con un ligando de afinidad.

Pueden añadirse partículas de control a la muestra antes del aislamiento de las microvesículas y/o la extracción de los ácidos nucleicos para que sirvan como control interno para evaluar la eficacia o calidad de la purificación de las microvesículas y/o la extracción de los ácidos nucleicos. Los métodos descritos en este documento proporcionan el aislamiento eficaz y las partículas de control junto con la fracción de microvesícula. Estas partículas de control incluyen el bacteriófago Q-beta, partículas víricas o cualquier otra partícula que contenga ácidos nucleicos de control (por ejemplo, al menos un gen diana de control) que puedan producirse de forma natural o manipularse por técnicas de ADN recombinante. La cantidad de partículas de control puede ser conocida antes de la adición a la muestra. El gen diana de control puede cuantificarse usando análisis de PCR instantánea. La cuantificación de un gen diana de control puede usarse para determinar la eficacia o calidad de los procesos de purificación de las microvesículas o extracción de los ácidos nucleicos.

Los métodos y kits descritos en este documento pueden incluir uno o más controles dentro del proceso. El control dentro del proceso puede ser la detección y análisis de un gen de referencia que indique la calidad del plasma (es decir, un indicador de la calidad de la muestra de plasma). El uno o más genes de referencia pueden ser un transcrito inherente del plasma. El uno o más genes de referencia pueden analizarse por qPCR adicional.

Los ácidos nucleicos extraídos pueden someterse a análisis adicional. Se usan diversas técnicas de secuenciación de ácido nucleico para detectar y analizar ácidos nucleicos tales como ADN y/o ARN libres de células extraídos de la fracción de microvesícula de muestras biológicas. El análisis de ácidos nucleicos tales como ADN libre de células y/o ácidos nucleicos extraídos de microvesículas con propósitos de diagnóstico tiene implicaciones de gran alcance debido a la naturaleza no invasiva en que las microvesículas pueden recogerse fácilmente.

En un primer aspecto de la invención, se proporciona un método para caracterizar a sujetos con trasplante renal para el diagnóstico, pronóstico, control o selección de tratamiento para rechazo de trasplante renal en un sujeto que lo necesita, comprendiendo el método comparar el nivel de expresión de un panel de biomarcadores que comprende CXCL9, IFNGR1, CXCL10, PXMP2, TNFRSF19, IL32, AGTR1, EPHX2, PDE4A, IRAK2, IL22RA1, IL1RAP, CXCL13, CXCL6, PTGES, STAT1, Ts LP, b Mp7, IL15RA, CCL8, PYCARD, C3 y ZMYND15 en ácidos nucleicos extraídos de una fracción de microvesícula aislada de una muestra biológica del sujeto con un nivel de control de expresión del panel de biomarcadores para determinar y/o para predecir el rechazo de trasplante renal en el sujeto, en el que el nivel de control de expresión del panel de biomarcadores es de un paciente que ha experimentado rechazo de trasplante renal o en el que el nivel de control de expresión del panel de biomarcadores es de un paciente que no ha experimentado ningún síntoma de rechazo de trasplante renal.

En un segundo aspecto de la invención, se proporciona un método para caracterizar a sujetos con trasplante renal para el diagnóstico, pronóstico, control o selección de tratamiento para rechazo de trasplante renal en un sujeto que lo necesita, comprendiendo el método comparar el nivel de expresión de un panel de biomarcadores que comprende IL32, IL15RA, CXCL9, PXMP2, CXCL10, C1 R, TNFRSF19, CXCL14, C3, PYCARD, IL1 F5, LEP, C7, FABP4, CXCL6, CD55, KRT1, BMP7, INHBA, IL1F8, PTGES, EREG e IL12A en ácidos nucleicos extraídos de una fracción de microvesícula aislada de una muestra biológica del sujeto con un nivel de control de expresión del panel de biomarcadores para determinar y/o para predecir el rechazo de trasplante renal en el sujeto, en el que el nivel de control de expresión del panel de biomarcadores es de un paciente que ha experimentado rechazo de trasplante renal o en el que el nivel de control de expresión del panel de biomarcadores es de un paciente que no ha experimentado ningún síntoma de rechazo de trasplante renal.

Realizaciones preferidas de la invención en cualquiera de sus diversos aspectos son como se describe a continuación o como se define en las subreivindicaciones.

Breve descripción de las figuras

La figura 1 es un gráfico que representan los datos sin procesar de todos los ensayos, con 607 ensayos para cada muestra. Los números en la parte superior de la figura (es decir, 425, 304, 352, .... 406, 445, 6) son el número de ensayos de los 607 con lectura. E16 y E21 fallaron, y el resto varió de un 34 % a un 86 %. La anchura en cada diagrama de tipo violín refleja el número de datos puntuales, donde la abreviatura Cn.2n.2 usada en el eje de abscisas representa las muestras de sedimento celular, y la abreviatura En.2n.2 usada en el eje de ordenadas representa las muestras de microvesícula.

La figura 2 es un gráfico que representa los datos sin procesar para 21 ensayos de control endógeno. Los 21 controles se muestran en la leyenda de la figura.

Las figuras 3A, 3B, 3C, 3D, 3E, 3F y 3G son una serie de gráficos que representan la normalización de los resultados de ensayo usando los siguientes criterios: (i) excluir ensayos con Crt mínimo > 29; (ii) ensayos de control endógeno; y (iii) 15 < Crt medio < 22. La normalización dio como resultado siente ensayos de control usando selección conservativa: UBC (fig. 3A), RPLP0 (fig. 3B), ACTB (fig. 3C), PPIA (fig. 3D), GAPDH (fig.

3E), PGK1 (fig. 3F) y B2M (fig. 3G). Cada curva en las figuras 3A-3G representa una muestra, y la línea negra representa el control sin molde (NTC).

Las figuras 4A y 4B son una serie de gráficos que representan los resultados de normalización para los valores Crt sin procesar (fig. 4A) y el deltaCt (ACt) de los valores normalizados de control (fig. 4B). En estos estudios, la normalización se calculó restando el valor Crt medio para los 7 ensayos de control de las figuras 3A-3G de los valores Crt sin procesar. Cada curva en las figuras 4A y 4B representa una muestra, y el NTC, E16 y E21 se excluyeron de los resultados.

Las figuras 5 y 6 son una serie de gráficos que representan la agrupación global para las muestras que se ensayaron. La figura 5 representa todas las muestras, mientras que la figura 6 representa la muestra de solamente microvesículas.

Las figuras 7A y 7B son una serie de gráficos que comparan los resultados de 549 ensayos diana (fig. 7A) y 549 ensayos diana con atribución de valor perdido (fig. 7B). La atribución se calculó usando un modelo PCA probabilístico, donde los ensayos eran indeterminados en > 80 % de las muestras.

Las figuras 8, 9 y 10 son una serie de diagramas que representan el análisis de ARNm de todas las muestras en sujetos con rechazo frente a sin rechazo. Los diagramas se generaron usando un método basado en el ensayo de la t de contraste de dos grupos, donde los ARNm significativos tenían un valor de p < 0,05. Cada fila en cada diagrama está centrada en la mediana, representando los tonos más calientes valores de mayor abundancia, y representando los tonos más fríos valores de menor abundancia. En la barra de colores en la parte superior de cada diagrama, el color verde más oscuro representa muestras sin rechazo, y el color naranja más claro representa muestras con rechazo. La figura 8 es el diagrama de todas las muestras ensayadas, la figura 9 es el diagrama para solamente las muestras de sedimento celular, y la figura 10 es el diagrama para solamente las muestras de microvesículas. Los dos valores atípicos mostrados en la figura 10 se han explicado: en E10, el sujeto tenía nefritis intersticial alérgico (AIN), que puede dar lugar a un diagnóstico ambiguo; y en E19, la muestra era de una baja calidad.

La figura 11 es una representación esquemática del flujo de trabajo del aislamiento de exoARN de orina y perfilado de la expresión usado en los estudios presentados en el ejemplo 2.

Las figuras 12A, 12B y 12C son una serie de un gráfico, una ilustración y una tabla que representan la característica distintiva génica identificada en la cohorte de formación que diferencia entre rechazo y ausencia de rechazo renal. En el diagrama de recuadros de la figura 12A, la altura de cada barra es la probabilidad de rechazo estimada a partir de la expresión génica (barras rojas - muestras con rechazo, barras azules -muestras sin rechazo). En el mapa térmico de la figura 12B, los niveles de expresión de los marcadores (los tonos azules indican mayores valores Crt con respecto al valor de normalización del cuantil y, por tanto, menos niveles de expresión relativa).

Las figuras 13A, 13B y 13C son una serie de un gráfico, una ilustración y una tabla que representan el rendimiento de característica distintiva de 23 genes en la cohorte de ensayo. En el diagrama de recuadros de la figura 13A, la altura de cada barra es la probabilidad de rechazo estimada (barras rojas - muestras con rechazo, barras azules - muestras sin rechazo). En el mapa térmico de la figura 13B, los niveles de expresión de los marcadores (los tonos azules indican mayores valores Crt con respecto al valor de normalización del cuantil y, por tanto, menos niveles de expresión relativa).

La figura 14 es un gráfico que representa el análisis de curva ROC de la característica distintiva de 23 genes en la cohorte de ensayo.

Descripción detallada de la invención

La divulgación proporciona métodos para el uso de características distintivas de ARN de microvesícula para controlar la eficacia del tratamiento y/o para predecir la eficacia del tratamiento. Los métodos pueden usarse para controlar la eficacia del tratamiento longitudinalmente.

Los métodos y composiciones proporcionados en este documento son útiles para medir ácidos nucleicos obtenidos de microvesículas, por ejemplo, ARN de microvesícula, también denominado en este documento ARN de exosoma o ARN exosómico, como diagnóstico para rechazo de trasplante tal como, por ejemplo, rechazo de trasplante renal.

Como se usa en este documento, la expresión "ácidos nucleicos" se refiere a ADN y ARN. Los ácidos nucleicos pueden ser monocatenarios o bicatenarios. En algunos casos, el ácido nucleico es ADN. En algunos casos, el ácido nucleico es ARN. El ARN incluye, aunque sin limitación, ARN mensajero, ARN transferente, ARN ribosómico, ARN no codificantes, microARN y elementos HERV.

Como se usa en este documento, la expresión "muestra biológica" se refiere a una muestra que contiene materiales biológicos tales como ADN, ARN y proteína.

La muestra biológica puede comprender adecuadamente un líquido corporal de un sujeto. Los líquidos corporales pueden ser líquidos aislados de cualquier parte del organismo del sujeto tal como, por ejemplo, una localización periférica incluyendo, aunque sin limitación, por ejemplo, sangre, plasma, suero, orina, esputo, líquido medular, líquido cefalorraquídeo, líquido pleural, aspirados de los pezones, líquido linfático, líquido del aparato respiratorio, intestinal y genitourinario, líquido lagrimal, saliva, leche materna, líquido del sistema linfático, semen, líquido del sistema intraorgánico, líquido ascítico, líquido de quiste tumoral, líquido amniótico y sobrenadante de cultivo celular, y combinaciones de los mismos. Las muestras biológicas también pueden incluir muestras fecales o cecales, o sobrenadantes aislados de las mismas.

La muestra biológica puede comprender adecuadamente sobrenadante de cultivo celular.

La muestra biológica puede comprender adecuadamente una muestra de tejido de un sujeto. La muestra de tejido puede aislarse de cualquier parte del organismo del sujeto.

Un volumen de muestra adecuado de un líquido corporal está, por ejemplo, en el intervalo de aproximadamente 0,1 ml a aproximadamente 30 ml de líquido. El volumen de líquido puede depender de unos pocos factores, por ejemplo, el tipo de líquido usado. Por ejemplo, el volumen de muestras de suero puede ser de aproximadamente 0,1 ml a aproximadamente 4 ml, preferiblemente de aproximadamente 0,2 ml a 4 ml. El volumen de muestras de plasma puede ser de aproximadamente 0,1 ml a aproximadamente 4 ml, preferiblemente de 0,5 ml a 4 ml. El volumen de muestras de orina puede ser de aproximadamente 10 ml a aproximadamente 30 ml, preferiblemente de aproximadamente 20 ml.

Aunque los ejemplos proporcionados en este documento usaron muestras de plasma, los expertos en la materia apreciarán que estos métodos son aplicables a una diversidad de muestras biológicas. Otras muestras biológicas adecuadas incluyen orina, líquido cefalorraquídeo, sangre, incluyendo componentes de la sangre, por ejemplo, plasma y suero, esputo, líquido pleural, aspirados de los pezones, líquido linfático, líquido del aparato respiratorio, intestinal y genitourinario, líquido lagrimal, saliva, leche materna, líquido del sistema linfático, semen, líquido del sistema intraorgánico, líquido ascítico, líquido de quiste tumoral, líquido amniótico, sobrenadante de cultivo celular y combinaciones de los mismos.

Los métodos y kits de la divulgación son adecuados para su uso con muestras derivadas de un sujeto humano. Los métodos y kits de la divulgación son adecuados para su uso con muestras derivadas de un sujeto humano. Además, los métodos y kits de la divulgación también son adecuados para su uso con muestras derivadas de un sujeto humano. Los métodos y kits de la divulgación son adecuados para su uso con muestras derivadas de un sujeto no humano tal como, por ejemplo, un roedor, un primate no humano, un animal de compañía (por ejemplo, gato, perro, caballo) y/o un animal de granja (por ejemplo, pollo).

El término "sujeto" pretende incluir todos los animales que han demostrado tener o se espera que tengan partículas que contienen ácido nucleico. El sujeto puede ser un mamífero, un ser humano o primate no humano, un perro, un gato, un cabello, una vaca, otros animales de granja o un roedor (por ejemplo, ratones, ratas, cobayas, etc.). Un sujeto humano puede ser un ser humano normal sin anomalías observables, por ejemplo, una enfermedad. Un sujeto humano puede ser un ser humano con anomalías observables, por ejemplo, una enfermedad. Las anomalías observables pueden observarse por el propio ser humano o por un profesional médico. El término "sujeto", "paciente" e "individuo" se usan indistintamente en este documento.

Aunque los ejemplos de trabajo proporcionados en este documento usan una membrana como superficie de captura, debe entenderse que el formato de la superficie de captura, por ejemplo, microesferas o un filtro (también denominado en este documento membrana), no afecta a la capacidad de los métodos proporcionados en este documento para capturar de forma eficaz las microvesículas de una muestra biológica.

Una amplia gama de superficies puede capturar microvesículas de acuerdo con los métodos proporcionados en este documento, pero no todas las superficies capturarán microvesículas (algunas superficies no capturan nada).

La presente divulgación también describe un dispositivo para aislar y concentrar microvesículas de muestras biológicas o clínicas usando partes de plástico y equipo de centrifugación desechables. Por ejemplo, el dispositivo comprende una columna que comprende una superficie de captura (es decir, un filtro de membrana), un soporte que fija la superficie de captura entre la frita exterior y un tubo interno, y un tubo de recogida. La frita exterior comprende una estructura de red grande para permitir que pase líquido, y está preferiblemente en un extremo de la columna. El tubo interno aloja la superficie de captura en su sitio, y preferiblemente es ligeramente de forma cónica. El tubo de recogida puede estar disponible en el mercado, es decir, tubo Falcon de 50 ml. La columna es preferiblemente adecuada para centrifugación, es decir, el tamaño es compatible con máquinas de centrífuga y microcentrífuga convencionales.

Cuando la superficie de captura es una membrana, el dispositivo para aislar la fracción de microvesícula de una muestra biológica puede contener al menos una membrana. El dispositivo puede comprender una, dos, tres, cuatro, cinco o seis membranas. El dispositivo puede comprender tres membranas. Cuando el dispositivo comprende más de una membrana, las membranas pueden estar todas directamente adyacentes entre sí en un extremo de la columna. Cuando el dispositivo comprende más de una membrana, las membranas pueden ser todas idénticas entre sí, es decir, son de la misma carga y/o tienen el mismo grupo funcional.

Debe apreciarse que la captura por filtración a través de un tamaño de poro más pequeño que las microvesículas no es el mecanismo principal de captura por los métodos proporcionados en este documento. Sin embargo, el tamaño de poro del filtro es, no obstante, muy importante, por ejemplo, porque el ARNm queda bloqueado en un filtro de 20 nm y no puede recuperarse, mientras que los microARN pueden retirarse por elución fácilmente y, por ejemplo, porque el tamaño de poro del filtro es un parámetro importante en el área de captura superficial disponible.

Los métodos proporcionados en este documento usan cualquiera de una diversidad de superficies de captura. La superficie de captura puede ser una membrana, también denominada en este documento filtro o filtro de membrana. La superficie de captura puede ser una membrana disponible en el mercado. La superficie de captura puede ser una membrana disponible en el mercado cargada. La superficie de captura puede ser neutra. La superficie de captura puede seleccionarse de Mustang® Ion Exchange Membrane de PALL Corporation; Vivapure® Q membrane de Sartorius AG; Sartobind® Q o Vivapure® Q Maxi H; Sartobind® D de Sartorius AG, Sartobind (S) de Sartorius AG, Sartobind® Q de Sartorius AG, Sartobind® IDA de Sartorius AG, Sartobind® Aldehyde de Sartorius AG, Whatman® DE81 de Sigma, columna Fast Trap Virus Purification de EMD Millipore; columnas de centrifugación de intercambio catiónico y aniónico fuerte Thermo Scientific* Pierce.

Cuando la superficie de captura está cargada, la superficie de captura puede ser un filtro cargado seleccionado del grupo que consiste en filtración al vacío de Q PES cargada positivamente de 0,65 um (Millipore), filtración en columna de centrifugación de Q RC cargada positivamente de 3-5 um (Sartorius), filtración en columna de centrifugación casera de Q PES cargada positivamente de 0,8 um (Pall), filtración en jeringa de Q PES cargada positivamente de 0,8 um (Pall), filtración en columna de centrifugación casera de S PES cargada negativamente de 0,8 um (Pall), filtración en jeringa de S PES cagada negativamente de 0,8 um (Pall) y filtración en jeringa de nylon cargado negativamente de 50 nm (Sterlitech). Preferiblemente, el filtro cargado no se aloja en un aparato de filtración en jeringa, ya que Qiazol/ARN es más difícil de extraer del filtro en estas realizaciones. Preferiblemente, el filtro cargado se aloja en un extremo de una columna.

Cuando la superficie de captura es una membrana, la membrana puede fabricarse de una diversidad de materiales adecuados. La membrana puede ser de polietersulfona (PES) (por ejemplo, de Millipore o PALL Corp.). La membrana puede ser celulosa regenerada (RC) (por ejemplo, de Sartorius o Pierce).

La superficie de captura puede ser una membrana cargada positivamente. La superficie de captura puede ser una membrana Q, que es una membrana cargada positivamente y es un intercambiador aniónico con aminas cuaternarias. Por ejemplo, la membrana Q se funcionaliza con amonio cuaternario, R-CH2-N+(CH3)3. La superficie de captura puede ser una membrana cargada negativamente. La superficie de captura puede ser una membrana S, que es una membrana cargada negativamente y es un intercambiador catiónico con grupos ácido sulfónico. Por ejemplo, la membrana S se funcionaliza con ácido sulfónico, R-CH²-SO³-. La superficie de captura puede ser una membrana D, que es un intercambiador aniónico básico débil con grupos dietilamina, R-CH²-NH+(C²Hs)². La superficie de captura puede ser una membrana de quelato metálico. Por ejemplo, la membrana es una membrana IDA, funcionalizada con ácido aminodiacético -N(CH²COOH-)². La superficie de captura puede ser una membrana microporosa, funcionalizada con grupos aldehído, -CHO. La membrana puede ser un intercambiador aniónico básico débil, con grupos dietilaminoetilo (DEAE). No todas las membranas cargadas son adecuadas para su uso en los métodos proporcionados en este documento, por ejemplo, el ARN aislado usando columna de centrifugación de membrana Sartorius Vivapure S mostraba inhibición por RT-qPCR y, por tanto, era inadecuada para ensayos posterior relacionado con PCR.

Cuando la superficie de captura está cargada, pueden aislarse microvesículas con un filtro cargado positivamente.

Cuando la superficie de captura está cargada, el pH durante la captura de microvesículas puede ser un pH <7. El pH puede ser mayor de 4 y menor de o igual a 8.

Dependiendo del material de membrana, los tamaños de poro de la membrana varían de 3 pm a 20 nm.

La carga superficial de la superficie de captura puede ser positiva, negativa o neutra. La superficie de captura puede ser una microesfera o microesferas cargadas positivamente.

Los métodos proporcionados en este documento incluyen un reactivo de lisis. El agente usado para lisis en la membrana puede ser un reactivo basado en fenol. El reactivo de lisis puede ser un reactivo basado en guanidinio. El reactivo de lisis puede ser un tamaño basado en alta salinidad. El reactivo de lisis puede ser QIAzol.

Los métodos pueden incluir una o más etapas de lavado, por ejemplo, después de poner en contacto la muestra biológica con la superficie de captura. Pueden añadirse detergentes al tampón de lavado para facilitar la eliminación de unión no específica (es decir, contaminantes, desechos celulares y complejos proteínicos circulantes o ácidos nucleicos), para obtener una fracción de microvesícula más pura. Los detergentes adecuados para su uso incluyen, aunque sin limitación, dodecil sulfato de sodio (SDS), Tween-20, Tween-80, Triton X-100, Nonidet P-40 (NP-40), Brij-35, Brij-58, octil glucósido, octil tioglucósido, c Ha PS o CHAPSO.

La superficie de captura, por ejemplo, membrana, puede alojarse dentro de un dispositivo usado para centrifugación; por ejemplo, columnas de centrifugación o para sistema de vacío, por ejemplo, soportes de filtro de vacío, o para filtración con presión, por ejemplo, filtros de jeringa. La superficie de captura puede alojarse en una columna de centrifugación o sistema de vacío.

El aislamiento de microvesículas de una muestra biológica antes de la extracción de ácidos nucleicos es ventajoso por las siguientes razones: 1) extraer los ácidos nucleicos de microvesículas proporciona la oportunidad de analizar selectivamente ácidos nucleicos específicos de enfermedad o tumor obtenidos aislando microvesículas específicas de enfermedad o tumor de otras microvesículas dentro de la muestra líquida; 2) las microvesículas que contienen ácido nucleico producen rendimientos significativamente mayores de especies de ácido nucleico con mayor integridad en comparación con el rendimiento/integridad obtenida extrayendo ácidos nucleicos directamente de la muestra líquida sin aislar en primer lugar las microvesículas; 3) capacidad de cambio de escala, por ejemplo, para detectar ácidos nucleicos expresados a bajos niveles, la sensibilidad puede aumentarse concentrando las microvesículas de un volumen más grande de muestra usando los métodos descritos en este documento; 4) calidad/integridad más pura o mayor de ácidos nucleicos extraídos en esas proteínas, lípidos, desechos celulares, células y otros posibles contaminantes e inhibidores de PCR que se encuentran de forma natural dentro de muestras biológicas se excluyen antes de la etapa de extracción de ácido nucleico; y 5) pueden utilizarse más elecciones en los métodos de extracción de ácido nucleico ya que las fracciones de microvesícula aisladas pueden ser de un volumen más pequeño que el del volumen de la muestra de partida, haciendo posible extraer los ácidos nucleicos de estas fracciones o sedimentos usando filtros de columna de pequeño volumen.

Se han descrito en la técnica varios métodos de aislamiento de microvesículas de una muestra biológica. Por ejemplo, se describe un método de centrifugación diferencial en un artículo de Raposo et al. (Raposo et al., 1996), un artículo de Skog et a/.(Skog et al., 2008) y un artículo de Nilsson et al. (Nilsson et al., 2009). Se describen método de cromatografía de intercambio iónico y/o filtración en gel en las patentes de Estados Unidos n.° 6.899.863 y 6.812.023. Se describen métodos de gradientes de densidad de sacarosa o electroforesis de orgánulos en la patente de Estados Unidos n.° 7.198.923. Se describe un método de clasificación celular activada magnética (MACS) en un artículo de Taylor y Gercel Taylor (Taylor y Gercel-Taylor, 2008). Se describe un método de concentración por ultrafiltración en nanomembrana en un artículo de Cheruvanky et al. (Cheruvanky et al., 2007). Se describe un método de aislamiento en gradiente de Percoll en una publicación de Miranda et al. (Miranda et al., 2010). Además, pueden identificarse y aislarse microvesículas de líquido corporal de un sujeto mediante un dispositivo de microfluidos (Chen et al., 2010). En investigación y desarrollo, así como aplicaciones comerciales de biomarcadores de ácido nucleico, es deseable extraer ácidos nucleicos de alta calidad de muestras biológicas de una manera coherente, fiable y práctica.

La muestra puede no preprocesarse antes del aislamiento y extracción de ácidos nucleicos, por ejemplo, ADN y/o ADN y ARN, de la muestra biológica.

La muestra puede someterse a una etapa de preprocesamiento antes de realizar aislamiento, purificación o enriquecimiento de las microvesículas para retirar partículas indeseadas grandes, células y/o desechos celulares y otros contaminantes presentes en la muestra biológica. Las etapas de preprocesamiento pueden conseguirse a través de una o más etapas de centrifugación (por ejemplo, centrifugación diferencial) o una o más etapas de filtración (por ejemplo, ultrafiltración) o una combinación de las mismas. Cuando se realiza más de una etapa de preprocesamiento de centrifugación, la muestra biológica puede centrifugarse en primer lugar a la velocidad más baja y después a la velocidad más alta. Si se desea, pueden realizarse etapas adicionales de preprocesamiento de centrifugación adecuadas. Como alternativa o además de la una o más etapas de preprocesamiento de centrifugación, puede filtrarse la muestra biológica. Por ejemplo, una muestra biológica puede centrifugarse en primer lugar a 20000 g durante 1 hora para retirar partículas indeseadas grandes; la muestra entonces puede filtrarse, por ejemplo, a través de un filtro de 0,8 |um.

La muestra puede prefiltrarse para excluir partículas más grandes de 0,8 |um. La muestra puede incluir un aditivo tal como EDTA, citrato de sodio y/o citrato-fosfato-dextrosa.

Puede realizarse una o más etapas de centrifugación antes o después de poner en contacto la muestra biológica con la superficie de captura para separar las microvesículas y concentrar las microvesículas aisladas de la fracción biológica. Por ejemplo, la muestra se centrifuga a 20000 g durante 1 hora a 4 °C. Para retirar partículas indeseadas grandes, células y/o desechos celulares, las muestras pueden centrifugarse a una velocidad baja de aproximadamente 100-500 g, preferiblemente aproximadamente 250-300 g. Como alternativa o adicionalmente, las muestras pueden centrifugarse a una velocidad mayor. Las velocidades de centrifugación adecuadas son de hasta aproximadamente 200000 g; por ejemplo, de aproximadamente 2000 g a menos de aproximadamente 200000 g. Se prefieren velocidades de por encima de aproximadamente 15000 g y menos de aproximadamente 200000 g o por encima de aproximadamente 15000 g y menos de aproximadamente 100000 g o por encima de aproximadamente 15000 g y menos de aproximadamente 50000 g. Son más preferidas velocidades de aproximadamente 18000 g a aproximadamente 40000 g o aproximadamente 30000 g; y de aproximadamente 18000 g a aproximadamente 25000 g. Es particularmente preferida una velocidad de centrifugación de aproximadamente 20000 g. En general, tiempos adecuados para centrifugación son de aproximadamente 5 minutos a aproximadamente 2 horas, por ejemplo, de aproximadamente 10 minutos a aproximadamente 1,5 horas, o más preferiblemente de aproximadamente 15 minutos a aproximadamente 1 hora. Puede preferirse un tiempo de aproximadamente 0,5 horas. A veces se prefiere someter la muestra biológica a centrifugación a aproximadamente 20000 g durante aproximadamente 0,5 horas. Sin embargo, las velocidades y tiempos anteriores pueden usarse adecuadamente en cualquier combinación (por ejemplo, de aproximadamente 18000 g a aproximadamente 25000 g, o de aproximadamente 30000 g a aproximadamente 40000 g durante aproximadamente 10 minutos a aproximadamente 1,5 horas, o durante aproximadamente 15 minutos a aproximadamente 1 hora, o durante aproximadamente 0,5 horas, y así sucesivamente). La etapa o etapas de centrifugación pueden realizarse a temperaturas por debajo de ambiente, por ejemplo, a aproximadamente 0-10 °C, preferiblemente aproximadamente 1-5 °C, por ejemplo, aproximadamente 3 °C o aproximadamente 4 °C.

Puede realizarse una o más etapas de filtración antes o después de poner en contacto la muestra biológica con la superficie de captura. Puede emplearse un filtro que tiene un tamaño en el intervalo de aproximadamente 0,1 a aproximadamente 1,0 |um, preferiblemente de aproximadamente 0,8 |um o 0,22 |um. La filtración también puede realizarse con filtraciones sucesivas usando filtros con porosidad decreciente.

Puede realizarse una o más etapas de concentración, para reducir los volúmenes de muestra a tratar durante las fases de cromatografía, antes o después de poner en contacto la muestra biológica con la superficie de captura. La concentración puede ser a través de centrifugación de la muestra a altas velocidades, por ejemplo, entre 10000 y 100000 g, para provocar la sedimentación de las microvesículas. Esto puede consistir en una serie de centrifugaciones diferenciales. Las microvesículas en el sedimento obtenido pueden reconstituirse con un volumen más pequeño y en un tampón adecuado para las posteriores etapas del proceso. La etapa de concentración también puede realizarse por ultrafiltración. De hecho, esta ultrafiltración tanto concentra la muestra biológica como realiza una purificación adicional de la fracción de microvesícula. En otra realización, la filtración es una ultrafiltración, preferiblemente una ultrafiltración tangencial. La ultrafiltración tangencial consiste en concentrar y fraccionar una solución entre dos compartimentos (filtrado y retenido), separados por membranas de umbrales de corte determinados. La separación se realiza aplicando un flujo en el compartimento de retenido y una presión transmembranaria entre este compartimento y el compartimento de filtrado. Pueden usarse diferentes sistemas para realizar la ultrafiltración, tal como membranas espirales (Millipore, Amicon), membranas planas o fibras huecas (Amicon, Millipore, Sartorius, Pall, GF, Sepracor). Dentro del alcance de la divulgación, es ventajoso el uso de membranas con un umbral de corte por debajo de 1000 kDa, preferiblemente entre 100 kDa y 1000 kDa, o incluso más preferiblemente entre 100 kDa y 600 kDa.

Puede realizarse una o más etapas de cromatografía por exclusión de tamaño o etapas de cromatografía por filtración en gel antes o después de poner en contacto la muestra biológica con la superficie de captura. Para realizar la etapa de cromatografía por filtración en gel, se usa preferiblemente un soporte seleccionado de sílice, acrilamida, agarosa, dextrano, copolímero de etilenglicol-metacrilato o mezclas de los mismos, por ejemplo, mezclas de agarosa-dextrano. Por ejemplo, dichos soportes incluyen, aunque sin limitación: SUPERDEX® 200HR (Pharmacia), TSK G6000 (TosoHaas) o SEPHACRYL® S (Pharmacia).

Puede realizarse una o más etapas de cromatografía de afinidad antes o después de poner en contacto la muestra biológica con la superficie de captura. Algunas microvesículas también pueden caracterizarse mediante determinadas moléculas superficiales. Como las microvesículas se forman por gemación de la membrana plasmática celular, estas microvesículas a menudo comparten muchas de las mismas moléculas superficiales encontradas en las células de las que se originan. Como se usa en este documento, "moléculas superficiales" se refiere colectivamente a antígenos, proteínas, lípidos, carbohidratos y marcadores encontrados sobre la superficie o en o sobre la membrana de la microvesícula. Estas moléculas superficiales pueden incluir, por ejemplo, receptores, antígenos asociados a tumor, modificaciones de proteínas de membrana (por ejemplo, estructuras glucosiladas). Por ejemplo, las microvesículas que se desprenden de las células tumorales a menudo presentan antígenos asociados a tumor sobre su superficie celular. Por tanto, también puede utilizarse cromatografía de afinidad o cromatografía por exclusión de afinidad en combinación con los métodos proporcionados en este documento para aislar, identificar y/o enriquecer poblaciones específicas de microvesículas de un tipo específico de célula donadora (Al-Nedawi etal., 2008; Taylor y Gercel-Taylor, 2008). Por ejemplo, las microvesículas tumorales (malignas o no malignas) portan antígenos superficiales asociados a tumor y pueden detectarse, aislarse y/o enriquecerse mediante estos antígenos superficiales específicos asociados a tumor. En un ejemplo, el antígeno superficial es la molécula de adhesión de células epiteliales (EpCAM), que es específico de microvesículas de carcinomas de pulmón, colorrectal, de mama, de próstata, de cabeza y cuello, y de origen hepático, pero no de origen de células hemáticas (Balzar et al., 1999; Went et al., 2004). Además, las microvesículas asociadas a tumor también pueden caracterizarse por la ausencia de determinados marcadores superficiales, tales como CD80 y CD86. En estos casos, las microvesículas con estos marcadores pueden excluirse para análisis adicional de marcadores específicos de tumor, por ejemplo, por cromatografía por exclusión de afinidad. La cromatografía de afinidad puede conseguirse, por ejemplo, usando diferentes soportes, resinas, microesferas, anticuerpos, aptámeros, análogos de aptámero, polímeros con impresión molecular u otras moléculas conocidas en la técnica que se dirigen específicamente a moléculas superficiales deseadas en microvesículas.

Opcionalmente, pueden añadirse partículas de control a la muestra antes del aislamiento de las microvesículas o la extracción de los ácidos nucleicos para que sirvan como control interno para evaluar la eficacia o calidad de la purificación de las microvesículas y/o la extracción de los ácidos nucleicos. Los métodos descritos en este documento proporcionan el aislamiento eficaz y las partículas de control junto con la fracción de microvesícula. Estas partículas de control incluyen el bacteriófago Q-beta, partículas víricas o cualquier otra partícula que contenga ácidos nucleicos de control (por ejemplo, al menos un gen diana de control) que puedan producirse de forma natural o manipularse por técnicas de ADN recombinante. La cantidad de partículas de control puede ser conocida antes de la adición a la muestra. El gen diana de control puede cuantificarse usando análisis de PCR instantánea. La cuantificación de un gen diana de control puede usarse para determinar la eficacia o calidad de los procesos de purificación de las microvesículas o extracción de los ácidos nucleicos.

Preferiblemente, la partícula de control es un bacteriófago Q-beta, denominado en este documento "partícula Q-beta". La partícula Q-beta usada en los métodos descritos en este documento puede ser una partícula vírica de origen natural o puede ser un virus recombinante o manipulado, en que al menos un componente de la partícula vírica (por ejemplo, una parte del genoma o proteína de cubierta) se sintetiza por técnicas de ADN recombinante o biología molecular conocidas en la técnica. Q-beta es un miembro de la familia Leviviridae, caracterizada por un genoma de ARN monocatenario lineal que consiste en 3 genes que codifican cuatro proteínas víricas: una proteína de cubierta, una proteína de maduración, una proteína de lisis y la ARN replicasa. Debido a su tamaño similar a las microvesículas promedio, Q-beta puede purificarse fácilmente de una muestra biológica usando los mismos métodos de purificación usados para aislar microvesículas, como se describe en este documento. Además, la baja complejidad de la estructura génica monocatenaria vírica de Q-beta es ventajosa para su uso como control en ensayos de ácido nucleico basados en amplificación. La partícula Q-beta contiene un gen diana de control o secuencia diana de control a detectar o medir para la cuantificación de la cantidad de partícula Q-beta en una muestra. Por ejemplo, el gen diana de control es el gen de la proteína de cubierta de Q-beta. Después de la adición de las partículas Q-beta a la muestra biológica, los ácidos nucleicos de la partícula Q-beta se extraen junto con los ácidos nucleicos de la muestra biológica usando los métodos de extracción descritos en este documento. La detección del gen diana de control de Q-beta puede determinarse por análisis de RT-PCR, por ejemplo, simultáneamente con el uno o más biomarcadores de interés. Puede usarse una curva patrón de al menos 2, 3 o 4 concentraciones conocidas en dilución de factor 10 de un gen diana de control para determinar el número de copias. El número de copias detectado y la cantidad de partícula Q-beta añadida puede compararse para determinar la calidad del proceso de aislamiento y/o extracción.

Las partículas Q-beta pueden añadirse a la muestra de orina antes de la extracción de ácido nucleico. Por ejemplo, las partículas Q-beta se añaden a la muestra de orina antes de la ultrafiltración y/o después de la etapa de prefiltración.

Pueden añadirse 50, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 1000 o 5000 copias de partículas Q-beta a una muestra de líquido corporal. Preferiblemente, se añaden 100 copias de partículas Q-beta a una muestra de líquido corporal. El número de copias de partículas Q-beta puede calcularse basándose en la capacidad del bacteriófago Q-beta de infectar células diana. Por tanto, el número de copias de partículas Q-beta se correlaciona con las unidades formadoras de colonias del bacteriófago Q-beta.

Detección de biomarcadores de ácido nucleico

El ácido nucleico extraído puede comprender ADN y/o ADN y ARN. Cuando el ácido nucleico extraído comprende ADN y ARN, el ARN preferiblemente se retrotranscribe en ADN complementario (ADNc) antes de amplificación adicional. Dicha retrotranscripción puede realizarse en solitario o en combinación con una etapa de amplificación. Un ejemplo de un método que combina etapas de retrotranscripción y amplificación es reacción en cadena de la polimerasa con retrotranscripción (RT-PCR), que puede modificarse adicionalmente para que sea cuantitativa, por ejemplo, RT-PCR cuantitativa como se describe en la patente de Estados Unidos n.° 5.639.606. Otro ejemplo del método comprende dos etapas separadas: una primera retrotranscripción para convertir ARN en ADNc y una segunda etapa de cuantificación de la cantidad de ADNc usando PCR cuantitativa. Como se demuestra en los ejemplos que siguen, los ARN extraídos de partículas que contienen ácido nucleico usando los métodos divulgados en este documento incluyen muchas especies de transcritos que incluyen, aunque sin limitación, ARNr ribosómico 18S y 28S, microARN, ARN transferentes, transcritos que están asociados con enfermedades o afecciones médicas, y biomarcadores que son importantes para diagnóstico, pronóstico y control de afecciones médicas.

Por ejemplo, el análisis de RT-PCR determina un valor Ct (umbral de ciclo) para cada reacción. En RT-PCR, se detecta una reacción positiva por acumulación de una señal de fluorescencia. El valor Ct se define como el número de ciclos requerido para que la señal fluorescente cruce el umbral (es decir, excede el nivel de fondo). Los niveles de Ct son inversamente proporcionales a la cantidad de ácido nucleico diana, o ácido nucleico de control, en la muestra (es decir, cuando menor sea el nivel de Ct, mayor será la cantidad de ácido nucleico de control en la muestra).

El número de copias del ácido nucleico de control puede medirse usando cualquiera de una diversidad de técnicas reconocidas en la técnica incluyendo, aunque sin limitación, RT-PCR. El número de copias del ácido nucleico de control puede determinarse usando métodos conocidos en la técnica, tal como generando y utilizando una calibración o curva patrón.

Uno o más biomarcadores pueden ser una aberración genética o una colección de aberraciones genéticas, que se usan en este documento para hacer referencia a las cantidades de ácido nucleico, así como variantes de ácido nucleico dentro de las partículas que contienen ácido nucleico. Específicamente, las aberraciones genéticas incluyen, sin limitación, la sobreexpresión de un gen (por ejemplo, un oncogén) o un panel de genes, subexpresión de un gen (por ejemplo, un gen supresor tumoral tal como p53 o RB) o un panel de genes, producción alternativa de variantes de empalme de un gen o un panel de genes, variantes de número de copias (CNV) (por ejemplo, miniADN dobles) (Hahn, 1993), modificaciones de ácido nucleico (por ejemplo, metilación, acetilación y fosforilaciones), polimorfismos mononucleotídicos (SNP), reordenamientos cromosómicos (por ejemplo, inversiones, eliminaciones y duplicaciones), y mutaciones (inserciones, eliminaciones, duplicaciones, de aminoácido, terminadoras, sinónimas o cualquier otro cambio nucleotídico) de un gen o un panel de genes, que son mutaciones, en muchos casos, que finalmente afectan a la actividad y función de los productos génicos, dan lugar a variantes de empalme transcripcional alternativas y/o cambios del nivel de expresión génica, o combinaciones de cualquiera de los anteriores.

El análisis de ácidos nucleicos presentes en las partículas aisladas es cuantitativa y/o cualitativa. Para análisis cuantitativo, las cantidades (niveles de expresión), ya sean relativas o absolutas, de ácidos nucleicos específicos de interés dentro de las partículas aisladas se miden con métodos conocidos en la técnica (descritos a continuación). Para análisis cualitativo, las especies de ácidos nucleicos específicos de interés dentro de las microvesículas aisladas, sean de tipo silvestre o variantes, se identifican con métodos conocidos en la técnica.

La presente divulgación también incluye diversos usos de los nuevos métodos de aislamiento de microvesículas de una muestra biológica para extracción de ácidos nucleicos de alta calidad de las mismas para (i) ayudar en el diagnóstico de un sujeto, (ii) controlar el progreso o recidiva de una enfermedad u otra afección médica en un sujeto, o (iii) ayudar en la evaluación de la eficacia del tratamiento para un sujeto que experimenta o contempla el tratamiento para una enfermedad u otra afección médica; en los que se determina la presencia o ausencia de uno o más biomarcadores en la extracción de ácido nucleico obtenida del método, y el uno o más biomarcadores se asocian con el diagnóstico, progreso o recidiva, o eficacia del tratamiento, respectivamente, de una enfermedad u otra afección médica.

La presente divulgación es refiere además a kits para su uso en los métodos divulgados en este documento. El kit comprende un aparato con superficie de captura suficiente para separar microvesículas de una muestra biológica de partículas indeseadas, desechos y moléculas pequeñas que también están presentes en la muestra biológica. La presente divulgación también incluye opcionalmente instrucciones para usar los reactivos anteriores en el proceso de aislamiento y posterior extracción de ácido nucleico opcional.

Ejemplos

Aunque los ejemplos proporcionados en este documento usan una diversidad de membranas y dispositivos usados con propósitos de centrifugación y/o filtración, debe entenderse que estos métodos pueden usarse con cualquier superficie de captura y/o dispositivo de alojamiento que permita la captura eficaz de microvesículas y liberación de los ácidos nucleicos, particularmente, ARN, contenidos en las mismas.

Ejemplo 1: Estudio piloto de característica distintiva de microvesículas de la orina para el diagnóstico de rechazo de trasplante renal humano.

Los estudios presentados en este documento se realizaron de forma preliminar en 28 pacientes, y como se detalla en este documento, las características distintivas de ARN de microvesícula, también denominadas en este documento característica distintiva de ARN de microvesícula de la orina, la característica distintiva de ARN exosómico y/o la característica distintiva de ARN exosómico de la orina, agruparon perfectamente los pacientes con rechazo. En los estudios presentados en este documento, la característica distintiva de ARN de microvesícula es una característica distintiva de ARNm de microvesícula.

En los estudios presentados en este documento, se usaron 28 muestras de 24 pacientes. Se usaron cuatro pacientes con dos muestras cada uno para dos visitas. Cada muestra se procesó para extraer ARN de la fracción celular o la fracción de microvesícula. La demográfica de las muestras fue como sigue: ocho muestras femeninas y 20 muestras masculinas. Catorce pacientes tenían rechazo de trasplante, y catorce pacientes no tenían síntomas u otra indicación de rechazo de trasplante. Además, también se usaron tres muestras de control internas: una muestra masculina y femenina combinada ("CTRL_1"), una muestra masculina combinada ("CTRL_M") y una muestra femenina combinada ("CTRL_F").

A continuación, se proporciona una breve descripción de cada sujeto en la tabla 1:

Tabla 1. Información de la muestra

Se ensayó el panel de inflamación humana OpenArray® (OA). En total, se realizaron 586 ensayos diana, con 21 ensayos de control endógeno.

En resumen, el diseño del estudio fue como sigue: Se centrifugaron 20 ml de muestra de orina 2000 x g durante 20 minutos. El sobrenadante entonces se procesó para extraer el ARN de las microvesículas usando el concentrador de muestras clínicas de orina (uCSC), como se describe, por ejemplo, en las publicaciones de solicitud PCT n.° WO 2014/107571, WO 2015/021158, WO 2016/007755 y WO 2016/054252, cuyos contenidos de cada una se incorporan por la presente por referencia en su totalidad. El sedimento entonces se procesó para extraer el ARN celular usando el kit Promega ReliaPrep de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El ARN se eluyó en 16 pl de H²O sin nucleasa. Se usaron 14 pl en RT usando el kit de síntesis de ADNc VILO de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Se usaron 10 pl en preamplificación con 12 ciclos de preamplificación. Las reacciones de preamplificación se diluyeron 1:10 en tampón TE 1x y se mezclaron 1:1 con mezcla fundamental de PCR instantánea de OA antes de cargarla en placa OpenArray®.

El perfilado de ARN se realizó como sigue: El panel de inflamación humana OpenArray® se procesó a través de ensayos de qPCR TaqMan®, que incluía 586 ensayos diana de genes que se han estudiado como dianas para una serie de enfermedades inflamatorias. Los siguientes 21 ensayos de control endógeno también se procesaron: G6PD, POLR2A, IPO8, CASC3, YWHAZ, CDKN1A, UBE2D2, HMBS, UBC, HPRT1, 18S, RPLP0, ACTB, PPIA, GAPDH, PGK1, B2M, GUSB, HPRT1, TBP y TFRC.

Los datos sin procesar de 607 ensayos para cada muestra se muestran en la figura 1, y los datos sin procesar de los 21 ensayos de control endógeno se muestran en la figura 2. Los números en la parte superior de cada una de la figura 1 y figura 2 representan el número total de ensayos que tenían una lectura medible. La anchura de cada diagrama de tipo violín refleja el número de datos puntuales. Las muestras C1-C28 representan las muestras de sedimento celular, CTRL representa los tres controles y las muestras E1-E28 representan las muestras de microvesícula. NTC representa el control sin molde.

Las figuras 3A-3G son una serie de curvas para los resultados de ensayo normalizados. La normalización se realizó usando los siguientes criterios: (i) excluir ensayos con Crt mínimo > 29; (ii) ensayos de control endógeno; y (iii) 15 < Crt medio < 22. La normalización dio como resultado siente ensayos de control usando selección conservativa: UBC (fig. 3A), RPLP0 (fig. 3B), ACTB (fig. 3C), PPIA (fig. 3D), GAPDH (fig. 3E), PGK1 (fig. 3F) y B2M (fig. 3G).

Las figuras 4A y 4B presentan los resultados de normalización para los valores Crt sin procesar (fig. 4A) y el deltaCt (ACt) de los valores normalizados de control (fig. 4B). La normalización se calculó restando el valor Crt medio para los 7 ensayos de control de las figuras 3A-3G de los valores Crt sin procesar.

Las figuras 5 y 6 son una serie de gráficos que representan la agrupación global para las muestras que se ensayaron. La figura 5 representa todas las muestras, mientras que la figura 6 representa la muestra de solamente microvesículas. Estos gráficos representan la buena separación de las muestras de sedimento celular (muestras C) y las muestras de microvesícula (muestras E), incluyendo muestras específicas masculinas. Debe apreciarse que había más muestras masculinas ensayadas.

Las figuras 7A y 7B son una serie de gráficos que comparan los resultados de 549 ensayos diana (fig. 7A) y 549 ensayos diana con atribución de valor perdido (fig. 7B). La atribución se calculó usando un modelo PCA probabilístico, donde los ensayos eran indeterminados en > 80 % de las muestras.

Las figuras 8, 9 y 10 son una serie de diagramas que representan el análisis de ARNm de todas las muestras en sujetos con rechazo frente a sin rechazo. Los diagramas se generaron usando un método basado en el ensayo de la t de contraste de dos grupos, donde los ARNm significativos tenían un valor de p < 0,05. Cada fila en cada diagrama está centrada en la mediana, representando los tonos más calientes valores de mayor abundancia, y representando los tonos más fríos valores de menor abundancia. En la barra de colores en la parte superior de cada diagrama, el color verde más oscuro representa muestras sin rechazo, y el color naranja más claro representa muestras con rechazo. La figura 8 es el diagrama de todas las muestras ensayadas, la figura 9 es el diagrama para solamente las muestras de sedimento celular, y la figura 10 es el diagrama para solamente las muestras de microvesículas. Los dos valores atípicos mostrados en la figura 10 se han explicado: en E10, el sujeto tenía nefritis intersticial alérgico (AIN), que puede dar lugar a un diagnóstico ambiguo; y en E19, la muestra era de una baja calidad.

Por tanto, una característica distintiva génica derivada de microvesículas en una muestra de orina funcionó mejor en diferenciar pacientes que experimentaban rechazo de trasplante renal de aquellos pacientes que no mostraban síntomas u otra indicación de rechazo de trasplante.

Ejemplo 2: Descubrimiento y validación de característica distintiva de ARNm de exosomas de la orina para el diagnóstico de rechazo de trasplante renal humano

Pacientes con nefropatía en fase final habitualmente se someten a trasplante, sin embargo, tanto como un 10-15 % de estos pacientes desarrollan rechazo renal agudo. Los métodos para controlar el rechazo clínico incluyen aumento en la creatinina sérica y secreción de proteína urinaria. Estos métodos no son muy precisos y pueden no reflejar el rechazo subclínico. Actualmente, los pacientes a menudo se controlan mediante biopsias repetidas que pueden provocar complicaciones y costes aumentados. Un método preciso y no invasivo permitiría un diagnóstico más temprano y minimizaría la cantidad de inmunosupresión necesaria para tratar a estos pacientes. Las vesículas extracelulares tales como los exosomas (también denominados en este documento microvesículas o la fracción de microvesícula) son una nueva plataforma prometedora para biomarcadores y pueden usarse para controlar el ARN y la expresión de proteínas. Los exosomas desprendidos del riñón rechazado en la orina probablemente se originan en los podocitos glomerulares, las células tubulares renales y los inmunocitos activados durante el rechazo.

En los estudios presentados en este documento, se recogieron muestras de orina de pacientes que experimentan biopsia de riñón trasplantado para indicaciones clínicas. Se recogió un total de 66 muestras de orina entre dos cohortes (38 rechazos, 28 sin rechazo). Se aisló el ARN tanto de sedimentos celulares urinarios y exosomas de hasta 20 ml de orina para el perfilado de la expresión. Se cribaron dos cohortes de pacientes, la primera para generar un panel de marcadores candidatos (formación) y una segunda para verificar el funcionamiento del panel más pequeño (ensayo). El ARN de los exosomas, también denominado en este documento exoARN, se retrotranscribió y preamplificó antes del análisis de la característica distintiva de ARN usando el panel de inflamación humana OpenArray®. OpenArray® es una matriz de qPCR TaqMan. El panel de inflamación humana consiste en 586 ensayos diana y 21 ensayos de control endógeno. Se muestra una visión global del flujo de trabajo del aislamiento y perfilado de la expresión de exoARN de la orina en la figura 11. Se muestra una visión global de los criterios de rechazo para las muestras de orina de pacientes renales en una cohorte de formación a continuación en la tabla 2.

T l 2. M r rin i n r l n r n l h r f rm i n

Se detectó la expresión de 207 (34 %) a 518 (85 %) genes. Se excluyeron dos muestras del análisis debido al bajo rendimiento de ARN. El análisis de la expresión de ARNm en sedimentos y exosomas urinarios, de las muestras de la cohorte de formación, identificó genes que se regulaban de forma diferencial. Las muestras exosómicas identificaron 23 genes expresados de forma significativamente diferencial (figuras 12A-12C). Los 23 genes se muestran en la figura 12C. Los genes identificados del ARN exosómico funcionaron significativamente mejor en diferenciar correctamente entre rechazo y ausencia de rechazo en comparación con ARN de sedimento celular.

En una segunda cohorte de ensayo (denominada en este documento cohorte de ensayo), las muestras extraídas se procesaron de nuevo en el panel de inflamación humana OpenArray®. Se excluyó una muestra debido al bajo rendimiento de ARN.

Se muestra una visión global de los criterios de rechazo para las muestras de orina de pacientes renales en una cohorte de formación a continuación en la tabla 3.

T l . M r rin i n r l n r n l h r n

Se evaluó el funcionamiento de la característica distintiva de 23 genes (figuras 13A-13C). Los 23 genes se muestran en la figura 13C. El análisis de ROC de la característica distintiva demostró una ABC de 0,853 (figura 14).

Por tanto, los estudios presentados en este documento han identificado una característica distintiva de 23 genes en exosomas de la orina que es útil en caracterizar pacientes con rechazo renal. El análisis de ARN celular de orina no pudo generar dicha característica distintiva.

Claims (7)

REIVINDICACIONES

1. Un método para caracterizar a sujetos con trasplante renal para el diagnóstico, pronóstico, control o selección de tratamiento para rechazo de trasplante renal en un sujeto que lo necesita, comprendiendo el método comparar el nivel de expresión de un panel de biomarcadores que comprende CXCL9, IFNGR1, CXCL10, PXMP2, TNFRSF19, IL32, AGTR1, EPHX2, PDE4A, IRAK2, IL22RA1, IL1 RAP, CXCL13, CXCL6, PTGES, STAT1, TSLP, BMP7, IL15RA, CCL8, PYCARD, C3 y ZMYND15 en ácidos nucleicos extraídos de una fracción de microvesícula aislada de una muestra biológica del sujeto con un nivel de control de expresión del panel de biomarcadores para determinar y/o para predecir el rechazo de trasplante renal en el sujeto, en el que el nivel de control de expresión del panel de biomarcadores es de un paciente que ha experimentado rechazo de trasplante renal o en el que el nivel de control de expresión del panel de biomarcadores es de un paciente que no ha experimentado ningún síntoma de rechazo de trasplante renal.

2. Un método para caracterizar a sujetos con trasplante renal para el diagnóstico, pronóstico, control o selección de tratamiento para rechazo de trasplante renal en un sujeto que lo necesita, comprendiendo el método comparar el nivel de expresión de un panel de biomarcadores que comprende IL32, IL15RA, CXCL9, PXMP2, CXCL10, C1R, TNFRSF19, CXCL14, C3, PYCARD, IL1F5, LEP, C7, FABP4, CXCL6, CD55, KRT1, BMP7, INHBA, IL1F8, PTGES, EREG e IL12A en ácidos nucleicos extraídos de una fracción de microvesícula aislada de una muestra biológica del sujeto con un nivel de control de expresión del panel de biomarcadores para determinar y/o para predecir el rechazo de trasplante renal en el sujeto, en el que el nivel de control de expresión del panel de biomarcadores es de un paciente que ha experimentado rechazo de trasplante renal o en el que el nivel de control de expresión del panel de biomarcadores es de un paciente que no ha experimentado ningún síntoma de rechazo de trasplante renal.

3. El método de la reivindicación 1 o reivindicación 2, en el que una diferencia en el nivel de expresión del panel de biomarcadores y el nivel de control de expresión para el panel de biomarcadores indica que el sujeto probablemente experimenta rechazo de trasplante renal.

4. El método de la reivindicación 1 o reivindicación 2, en el que una diferencia en el nivel de expresión del panel de biomarcadores y el nivel de control de expresión para el panel de biomarcadores indica que el sujeto probablemente no experimenta rechazo de trasplante renal.

5. El método de la reivindicación 1 o reivindicación 2, en el que la muestra biológica es orina.

6. El método de la reivindicación 1 o reivindicación 2, en el que el ácido nucleico extraído es ARN.

7. El método de la reivindicación 1 o reivindicación 2, en el que los ácidos nucleicos se extraen usando un método que comprende (i) procesar la fracción de microvesícula para excluir proteínas, lípidos, desechos de células muertas y otros contaminantes; (ii) purificar microvesículas usando ultracentrifugación o una concentración de ultrafiltración de nanomembrana; y (iii) lavar las microvesículas.