CN111386122A - 用于检测组织状况的方法和系统 - Google Patents

Abstract

本文提供了用于检测组织状况的方法和系统。在一些方面，对疾病或状况的一种或多种标志物和一种或多种组织特异性无细胞多核苷酸的水平进行定量，将水平与参考进行比较，并且基于该比较来确定组织是否已被疾病或状况损害。还提供了用于进行本文描述的方法的系统。

Description

用于检测组织状况的方法和系统

交叉引用

本申请根据35USC 119要求于2017年9月20日提交的美国临时专利申请62/560,936的权益，该临时专利申请通过引用并入本文，如同在此充分阐述。

背景技术

多种标志物可用于检测各种状况。然而，这些状况中有许多是可以影响不同组织的状况。在循环中(如在血液样品中)检测这些状况的标志物并不总是有助于确定哪些组织受到影响。例如，炎症的通用标志物可以指示身体某处的炎症应答，但可能不知道哪个组织正在遭受该应答，如肝脏、肾脏、肺或关节。组织特异性检测如活检通常是侵入性的，具有感染的风险，并且通常不能涵盖整个器官或组织。诸如MRI和CT扫描等成像技术可用来评估组织健康，但通常只能检测明显的特征和变化。因此，这些成像技术的灵敏度通常不足以发现状况的早期发作或状况的相对近期的发展。

发明内容

在一些方面，本文公开了方法，其包括：从受试者获得血液样品；从所述血液样品中去除细胞以获得细胞耗竭的样品；从所述血液样品中去除细胞外微粒以获得微粒耗竭的样品；对所述微粒耗竭的样品中与基因相对应的无细胞RNA的量进行定量。在一些情况下，去除所述细胞外微粒包括使所述细胞耗竭的样品同与所述细胞外微粒表面上的蛋白质相互作用的结合部分接触。在一些情况下，所述结合部分是抗体或抗原结合抗体片段。在一些情况下，所述抗体或抗原结合抗体片段与已知被血细胞表达的细胞表面标志物相互作用。在一些情况下，所述抗体包括抗CD45抗体。在一些情况下，所述抗体包括抗CD66b抗体。在一些情况下，方法包括使所述细胞耗竭的样品同与第一细胞上的第一蛋白质相互作用的第一抗体和与第二细胞上的第二蛋白质相互作用的第二抗体接触。在一些情况下，所述第一蛋白质在所述第二细胞上不表达，并且所述第二蛋白质在所述第一细胞上不表达。在一些情况下，所述细胞外微粒是外来体。在一些情况下，所述外来体来自血细胞。在一些情况下，所述血细胞是血小板，并且其中去除所述细胞外微粒包括使所述细胞耗竭的样品与抗GypA抗体或其GypA抗原结合片段接触。在一些情况下，所述血细胞是红细胞，并且其中去除所述细胞外微粒包括使所述细胞耗竭的样品与抗CD235a抗体或其CD235a抗原结合片段接触。在一些情况下，所述血细胞是粒细胞，并且其中去除所述细胞外微粒包括使所述细胞耗竭的样品与抗CD66b抗体或其CD66b抗原结合片段接触。在一些情况下，所述血细胞是淋巴细胞，并且其中去除所述细胞外微粒包括使所述细胞耗竭的样品与结合CD45、CD19或CD3的抗体或其抗原结合片段接触。在一些情况下，所述细胞耗竭的样品在60摄氏度下孵育1h。在一些情况下，方法包括在离液盐、去污剂、蛋白酶K、2-巯基乙醇或其组合的存在下孵育所述细胞耗竭的样品。在一些情况下，方法包括将所述样品与Tris一起孵育。在一些情况下，方法包括破坏脂质结构和蛋白质结构。在一些情况下，方法包括使所述细胞耗竭的样品与硅胶柱接触。在一些情况下，方法包括使所述细胞耗竭的样品与离液盐和100％异丙醇一起孵育，以增强RNA与所述硅胶柱的结合。

援引并入

本说明书中所提及的所有出版物、专利和专利申请均通过引用并入本文，其程度犹如具体地且单独地指出每个单独的出版物、专利或专利申请均通过引用而并入。

附图说明

本发明的新颖特征在所附权利要求书中具体阐述。通过参考以下对利用本发明原理的说明性实施方案加以阐述的详细描述以及附图，将会对本发明的特征和优点获得更好的理解，在这些附图中：

图1显示新鲜过滤的样品具有最少量的血细胞污染，并且对于无细胞RNA研究而言是最佳的。

图2显示在过滤血液样品后，非血细胞转录物(肝RNA)的信号高两倍。

图3显示使用本文公开的方法，无细胞RNA产率增加。

图4A显示了不同疾病严重程度(NAFLD＝非酒精性脂肪性肝病，NASH＝非脂肪变性肝炎)的多形核(PMN)白细胞转录物。

图4B显示了由PMN说明的转录组的程度。

图5显示了由肝组织RNA的滴定计算的qPCR引物效率。

图6显示了采用根据本文所述方法处理的样品，非血细胞转录物的qPCR定量的优异再现性。

图7显示再现性随输入而提高。

图8显示了使用65名患者的NAFLD群组，测序与qPCR组之间的相关性。每个点代表通过每名患者的测序(log2 TPM)和qPCR(负Ct)检测而绘制的96个基因的qPCR组中的一个基因。对于每个样品，所提取的RNA的一半用于qPCR，另一半用于测序。

图9显示了在具有更多总RNA的样品中，qPCR与测序之间改善的相关性。

图10A显示了初始分类器，使用来自96个基因的组的qPCR数据的NASH相比于对照。图10B显示了初始分类器，使用来自96个基因的组的qPCR数据的NAFLD相比于NASH。

图11A-D显示CD45结合部分可以捕获多种类型的血细胞及其细胞外微粒。

图12A-B显示了测序分析灵敏度的改善。图12A显示了改善之前的灵敏度，而图12B显示了改善之后的灵敏度。

图13A显示了用诊断追踪测序的肝特异性基因数目，而图13B显示了用纤维化评分追踪检测到的肝特异性基因。

图14A显示了用诊断追踪测序的白蛋白转录物，而图14B显示了用纤维化评分追踪检测到的白蛋白转录物。

图15显示了初始分类器：使用来自所有基因的测序数据的NASH相比于对照。

图16显示本文公开的方法、系统和试剂盒允许检测约250个目的基因。

图17A-B显示测序分析改善导致更好的NASH相比于对照的分类器，图17A是改善前，图17B是改善后。

具体实施方式

旨在分析血液中来自非血细胞的RNA者遇到许多未对齐的RNA和极少的信息性mRNA。这可以通过提高从血液中提取的效率和数量来改善。这可以通过在测序之前进行富集，即使用可商购获得的基于捕获的试剂盒来进一步改善。在该过程结束时，信息性RNA(例如来自肝脏的有用的组织特异性mRNA)一般少于约0.3％。这是一个问题，因为超过99.7％的测序浪费在非信息性读取上。其原因是血细胞编码的mRNA构成血液中的大多数无细胞RNA。在典型的处理不佳的血液样品中(例如，使用低速离心去除细胞)，所得血浆中超过85％将是血小板转录物。通过高速离心(例如，16,000X g)或通过过滤除去大的血小板和其他细胞碎片，可以减少但无法消除这一问题。下一种最常见的污染物是粒细胞转录物，再次是单个核细胞和RBC。遗憾的是，这些无法简单地通过离心来去除，并且可能由这些细胞产生的外来体而加重。通过高速离心去除它们的尝试可能会去除大多数外来体并大大降低器官特异性信号。

一种替代方法是选择性地免疫消耗由不感兴趣的细胞贡献的外来体。这可以通过使用对起源细胞具有特异性的抗体来实现。然而，外来体必须表达足够高水平的这些抗原以允许免疫消耗。例如，如通过等离子体测序所确定的，来自淋巴细胞的外来体上的CD45水平足够高，而粒细胞上的CD45水平显然不够高。目的是确定允许免疫消耗的合适的抗体。CD41(血小板)、CD66b(粒细胞)、CD235(RBC)、CD45(淋巴细胞)抗体的组合可用来去除这些污染外来体。这将使人们能够处理更大的血浆样品，并使提取组织特异性RNA的效率更高。

我们确切知道想要研究哪种组织或哪种细胞类型(例如，仅肝细胞)时的一种替代方法是进行直接免疫富集而不是消耗。在这种情况下，我们将使用组织特异性抗体(例如，针对肝细胞的ASGR1)来免疫富集肝特异性外来体。

本文描述的方法、系统和试剂盒涉及使用标志物类型的组合快速、非侵入性地检测病症，以便同时确定可能的病症和可能的受胁迫组织。通过本文公开内容的实践，人们能够对疾病身份及其对一种或多种组织的影响程度作出确信的预测，而不需要对组织或怀疑受到影响的组织进行任何侵入性研究。

通常但并非排他性地，一种标志物是可以容易地与起源组织相关联的循环RNA，使得来自该器官的RNA的相对贡献的增加指示该器官中的或该器官特异性的胁迫。在多个实施方案中，单个标志物和源自器官的聚集RNA均被考虑作为组织状态的指示物。备选地或组合地，包括循环DNA，如以组织特异性方式差异甲基化的DNA，作为组织特异性标志物的一部分或全部。

同时，还检测了指示病症类型的标志物。有广泛范围的标志物被认为是病症类型的指示，包括蛋白质、类固醇、脂质、胆固醇或诸如DNA或RNA的核酸。RNA，如编码与疾病或病症有关的蛋白质的特定转录物，是特别有用的，具有指示疾病状态的甲基化模式的DNA也是如此。通常但不总是，疾病标志物也是容易地通过例如抽血获得的循环标志物。然而，备选方案如X射线、MRI或其他数据被认为是一些疾病的标志物。

通过将这些标志物的水平或身份与参考值或数据集进行比较，可以将患者或患者的样品分类为指示患者中的特定疾病，定位为特定组织或器官。参考值或数据集将根据疾病和组织而不同，并且将不同地包括来自一个或多个健康个体、具有不同程度的病症或组织胁迫的一个或多个个体的数据，来自中间个体的数据，以及从模型预测的数据。当样品的值单独或共同地高于或低于阈值时，或者当它们与同病症或状况相关的参考数据集没有显著差异时，或者当它们与同缺乏病症或状况相关的参考数据集有显著差异时，可以将该样品分类为指示病症或状况。

例如，本文所述的方法、系统和试剂盒可用来常规地在高危人群中筛查多个器官中的一种状况或多种状况的发展或进展。这对于患有慢性状况如代谢综合征、肥胖症、糖尿病、神经变性病症和癌症的受试者尤其有用，其中一种或多种组织处于损伤、损害或衰竭的风险中。

代谢综合征和肥胖症影响全世界庞大且比例不断增长的人口。该群体处于持续且相对较高的发生危及生命的并发症如心脏病发作、中风、肝硬化、胰腺衰竭和肾功能衰竭的风险中。因此，该群体处于在一系列器官和组织中发生并发症的持续风险中。类似地，许多癌症处于突变和转移至不同组织和器官的持续风险中。另外，对癌症施用治疗通常具有成功不确定性，并且期望快速确定这些治疗是否有效或有毒。在这些示例性情况下，使用传统方法如成像技术和活检常规地评估受试者是不切实际的。然而，方法、系统和试剂盒，如本文所述的那些，能够快速检测受试者的一个或多个器官中的损伤、增加的风险和治疗效果，从而提供了监测具有慢性状况的受试者的急性并发症、疾病进展和治疗效果的手段。

以下方法、试剂盒和系统旨在快速且非侵入性地检测受胁迫、受损或受状况或疾病影响的受试者中的组织或器官。在一些情况下，以下方法、试剂盒和系统还确定哪种疾病或状况正在影响受胁迫的组织，或疾病或状况在何种程度上影响该组织。从受试者收集样品，如血浆、唾液或尿液，并对可指示受试者中的疾病和疾病位置的标志物和无细胞多核苷酸进行分析。这些方法、试剂盒和系统通常依赖于从受胁迫的组织或器官释放或分泌到生物流体中的循环无细胞核酸，如血浆或尿液样品中的无细胞RNA。通过关注在特定组织中特异性表达或主要表达的基因，可以基于来自组织的RNA对总循环RNA的相对贡献得出关于该组织的健康状态的推论或结论。通过对相对贡献进行定量，可以有利地定位受状况影响的组织而无需侵入性活检或宏观尺度限制的成像技术。组织特异性核酸与针对各种状况的标志物组合使用，以选择治疗、监测治疗效果，并监测疾病或状况的进展。

确定疾病和受胁迫的组织可能需要将受测受试者样品中组织特异性多核苷酸和标志物的水平与来自对照受试者的至少一种样品的组织特异性多核苷酸和标志物的水平进行比较。所述组织特异性多核苷酸和标志物在本文中可称为组(panel)。在一些情况下，将从受测受试者获得的样品中的标志物和组织特异性多核苷酸的水平与对照受试者的标志物和组织特异性多核苷酸的水平进行比较。在一些情况下，将从受测受试者获得的样品中的标志物和组织特异性多核苷酸的水平与多个对照受试者中的相应水平的平均值进行比较。对照受试者可具有感兴趣的状况，或者对照受试者可以是没有该状况的受试者。

方法、系统和试剂盒允许对一组组织特异性多核苷酸和/或标志物进行检测或定量。已经认识到，基因表达可以在受试者群体内和在受试者群体之间(例如，在不同族群之间)发生巨大变化，并且在这类情况下，一组组织特异性多核苷酸和/或标志物可能是特别有用的。例如，所述方法可包括将该组与至少一个对照组进行比较。虽然每个组织特异性多核苷酸和标志物的表达水平可能不相似，但如果该组与对照组足够相似或明显不同，则仍可对受试者的状况或组织作出结论或推论。以这种方式，组可以提供优于使用单一疾病标志物或单一组织特异性多核苷酸的优点。在一些情况下，所述方法包括将受试者在第一时间点的组与该受试者在第二时间点的组进行比较。因此，控制单个受试者的自然遗传变异和基因表达波动，并且组间的差异更可能是由于受影响的状况或组织的变化造成的。在一些情况下，该组可包含非多核苷酸分子。该组可包含多核苷酸和其他生物分子(例如，肽、脂质、病原体片段等)。

本文所述的方法、试剂盒和系统可用来确定受试者发生疾病或状况的可能性或风险，疾病或状况的进展或严重程度，或者疗法或治疗对疾病或状况的效果。本文公开的试剂盒、系统和方法足够灵敏和准确，足以将标志物或组织特异性多核苷酸的第一水平与该标志物或组织特异性核酸的第二水平进行比较，以便区分状况的风险、状况的进展状态或治疗对状况的改善。在一些情况下，标志物或组织特异性核酸的第一水平对应于在第一时间点来自受试者的样品，而标志物或组织特异性核酸的第二水平对应于在第二时间点来自受试者的第二样品。

可以使用本文公开的试剂盒、系统和方法同时评估多种疾病和组织。以这种方式，本文公开的试剂盒、系统和方法可用来评估至少一种状况的存在或不存在，并鉴定受影响和未受影响的组织。在一些实施方案中，方法包括基于通过本文公开的方法、系统或试剂盒产生的结果来选择或推荐医疗行为。在一些实施方案中，基于该确定，推荐并且任选地采取定制的医疗行为。在一些情况下，定制的医疗行为包括直接处理受胁迫的组织，例如，采用辐射或注射组织。医疗行为的非限制性实例包括进行另外的测试(例如，活检、成像、手术)，治疗受试者的疾病或状况，以及改变受试者的治疗(例如，改变药物组合物的剂量、停止药物组合物的给药、施用不同的或另外的药物组合物)。

本文公开的系统、方法和试剂盒可允许检测多种组织中的状况或疾病。在一些情况下，受试者具有已知影响一种或多种组织的状况，这取决于该状况的程度或严重程度。系统、方法和试剂盒，如本文公开的那些，有利地允许鉴定和靶向治疗多种受胁迫的组织。例如，本文公开的系统可以提供用于检测受试者中的炎症并且由于循环肝脏特异性RNA和心脏特异性RNA的水平而确定肝脏和心脏受到炎症影响的标志物。而且，举例来说，该方法可包括检测血浆样品中的无细胞RNA，该RNA携带与癌症相关的突变(例如，作为癌症的原因或后果而发生的突变)，或者以指示癌症的水平存在。一旦检测到癌症的存在，该方法可进一步包括对来自多种组织的无细胞RNA的组织特异性相对贡献进行定量，以确定哪些组织可能携带肿瘤或其源头。

除了检测受损组织之外，所述方法还进一步允许鉴定或区分引起组织损伤的状况。作为非限制性实例，本文公开了用于检测受试者的肝损伤、鉴定引起肝损伤的状况、选择治疗受试者的疗法和监测疗法有效性的方法。对应于主要在人肝脏中表达的基因的无细胞RNA在受试者的血浆样品中进行定量。血浆样品中此类RNA的水平升高表明存在肝损伤。如本文所述，鉴定或区分疾病通常取决于定量而不仅仅是检测组织特异性RNA和对疾病标志物进行定量。例如，非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)和进展更快且更严重的疾病非酒精性脂肪性肝炎(NASH)可通过相似的肝脏特异性RNA和标志物进行鉴定，但这些分子的水平可能在NASH的情况下比在NAFLD的情况下更高，因为在NASH中发生的肝损伤多于NAFLD。由于在大多数情况下在NASH中发生的肝损伤多于NAFLD，因此在NASH的情况下从肝脏释放的肝脏特异性RNA比在NAFLD的情况下更多。

可以在疾病的早期阶段确定受试者中的疾病存在和位置，因为本文所述的系统和方法提供快速结果、是非侵入性的且便宜。因此，在疾病进展到与早期阶段相比相对更难控制或治疗的晚期阶段之前，可以有利地治疗受试者。例如，本文公开的系统和方法可允许在肿瘤大到足以用诸如CT或PET扫描等成像技术可视化之前确定哪个(哪些)组织或器官具有癌细胞。以这种方式，本文公开的方法和系统在疾病的早期阶段提供集中分析和靶向治疗，如局部注射和靶向放射。

有利地，所述方法和系统提供采用对组织损伤程度而言合适或最佳的疗法进行治疗。在一些情况下，该方法包括对标志物和/或组织特异性多核苷酸进行检测/定量，以评估疗法的有效性或毒性。在一些情况下，继续该疗法。在其他情况下，停止和/或用另一种疗法替换该疗法。无论如何，由于所述方法和系统的快速和非侵入性质，相对于常规治疗优化，可以更频繁地评估并优化治疗效果。

作为非限制性实例，根据常规实践，对正在接受癌症治疗的患者施用化疗，并在三个月后进行MRI以确定肿瘤大小是否减小。当观察到肿瘤大小增加时，执业医师开出不同的疗法，但肿瘤已经转移除外。相反，使用本文所述的方法，患者将在开始治疗后一至两周进行测试，以评估对应于携带肿瘤的组织的组织特异性核酸以及治疗有效性的标志物的水平。当组织特异性核酸和标志物的水平表明治疗无效时，执业医师开出通过类似方法快速确定其为有效的不同疗法。在后一种情况下，相对于利用成像技术的常规方法，肿瘤具有较短的生长时间并且不转移，从而为患者提供更好的预后。

在一些方面，本公开提供了本文公开的系统、样品、标志物和组织特异性多核苷酸的用途。在一些情况下，本文公开了体外样品用于非侵入性地检测受胁迫的受试者中的组织或器官以及作为胁迫原因的疾病或状况的用途。在一些情况下，本文公开了离体样品用于非侵入性地检测受胁迫的受试者中的组织或器官以及作为胁迫原因的疾病或状况的用途。通常，本文公开的用途包括对样品(包括离体样品和体外样品)中的标志物和组织特异性多核苷酸进行定量。本文公开的一些用途包括比较第一样品中标志物的量和组织特异性多核苷酸的量，并将这些量与第二样品中的相应量进行比较。在一些情况下，第一样品来自第一受试者，而第二样品来自对照受试者(例如，健康受试者或具有状况的受试者)。在一些情况下，第一样品来自第一时间点的受试者，而第二样品来自第二时间点的同一受试者。可在对受试者施用疗法之前获得第一时间点，并且可在该疗法之后获得第二时间点。因此，本文还提供了本文公开的样品、标志物、组织特异性多核苷酸、试剂盒和系统用于监测或评价受试者的状况、受试者的组织健康状态或治疗剂的效果的用途。

某些术语

提供以下描述来帮助理解本文公开的方法、系统和试剂盒。本文使用的术语的以下描述并非旨在限制这些术语的定义。在整个本申请中进一步描述并举例说明这些术语。

本文所述的方法、系统和试剂盒通常对无细胞核酸进行检测和定量。由于这个原因，本文所述的生物样品通常是无细胞生物流体。作为非限制性实例，来自受试者的样品可以是从中去除细胞的血液、血浆、血清、尿液或脊髓液。例如，生物分子可以在受试者的血流中循环，因此可以使用检测试剂对来自受试者的血液或血清样品中的标志物进行检测或定量。除非另有说明，否则术语“血浆”和“血清”在本文中可互换使用。然而，在一些情况下，它们被包括在单个样品物质列表中，以表明两者均被本说明书或权利要求所涵盖。

如本文所述的术语“组织特异性多核苷酸”，例如“组织特异性RNA”，通常是指主要在特定组织中表达的多核苷酸。通常，本文公开的方法、系统和试剂盒利用无细胞的组织特异性多核苷酸。本文所述的无细胞组织特异性多核苷酸是以在表达该多核苷酸的组织或器官受损时可在生物流体中进行定量的水平表达的多核苷酸。在一些情况下，本文公开的无细胞组织特异性多核苷酸在生物流体中的存在是由于在组织或器官受损时释放无细胞组织特异性多核苷酸，而不是由于无细胞组织特异性多核苷酸的表达的变化。本文公开的无细胞组织特异性多核苷酸的水平升高指示对相应组织或器官的损害。在一些情况下，本文公开的无细胞多核苷酸在数种组织中表达/产生，但在这些组织的至少一种中以组织特异性水平表达/产生。在这些情况下，无细胞组织特异性多核苷酸的绝对量或相对量指示对特定组织或器官或对组织或器官集合的损害。备选地或另外地，组织特异性多核苷酸是具有组织特异性修饰的核酸。作为非限制性实例，本文公开的组织特异性多核苷酸或标志物包括具有组织特异性甲基化模式的DNA分子(例如，基因的一部分或非编码区)。换句话说，所述多核苷酸和标志物可以在许多组织中类似地表达，或者甚至在整个受试者中普遍表达，但是所述修饰是组织特异性的。通常，本文公开的组织特异性多核苷酸或其水平对疾病不是特异性的。通常，本文公开的组织特异性多核苷酸不编码参与疾病机制的蛋白质。

如本文所用的术语“标志物”包括多种生物分子。标志物在本文中也可称为疾病标志物或疾病的标志物。在一些情况下，标志物用于与多种疾病相关的状况。例如，标志物可用于炎症，该炎症可与心血管疾病、肝炎和癌症相关。作为非限制性实例，标志物包括肽、激素、脂质、维生素、病原体、细胞碎片、代谢物和核酸。在一些情况下，标志物是无细胞核酸。通常，本文公开的标志物不是组织特异性的。然而，在极少数情况下，该标志物是组织特异性的。本文公开的标志物也可称为疾病生物标志物。疾病生物标志物是由于疾病而存在或产生的、由于疾病而失调的、在机理上与疾病有关的、在疾病状态下突变或修饰的或其任何组合的生物分子。标志物可由受试者产生。标志物也可由其他物种产生。例如，标志物可以是由肝炎病毒或链球菌属细菌生成的核酸或蛋白质。鉴定此类标志物的方法可进一步包括对组织特异性多核苷酸进行检测/定量，以确定哪些组织受到这些病原体的感染或影响，并且任选地，达到组织受损的程度。本文公开的疾病标志物通常不在不受该疾病影响的个体中循环。

通常，在本文中可互换使用的术语“无细胞多核苷酸”和“无细胞核酸”是指无需从细胞中提取多核苷酸即可以从样品中分离的多核苷酸。本文公开的无细胞多核苷酸通常是已从受损组织或受损器官释放或分泌的多核苷酸。例如，对组织或器官的损害可能是由于导致细胞溶解的疾病、损伤或其他状况，从而将无细胞多核苷酸从受损组织的细胞释放到循环中。在一些情况下，本文公开的无细胞多核苷酸是组织特异性的。在其他情况下，无细胞多核苷酸不是组织特异性的。在一些情况下，无细胞多核苷酸存在于细胞中或与细胞接触。在一些情况下，无细胞多核苷酸与细胞器、囊泡或外来体接触。在一些情况下，无细胞多核苷酸是无细胞的，意味着无细胞多核苷酸不与细胞接触。除非另有说明，否则本文所述的无细胞多核苷酸是自由循环的。在一些情况下，无细胞多核苷酸是自由循环的，即无细胞多核苷酸不与任何囊泡、细胞器或细胞接触。在一些情况下，无细胞多核苷酸与多核苷酸结合蛋白质(转移酶、核糖体蛋白质等)相缔合，但不与任何其他分子相缔合。

如本文所用的，术语“约”某一数字是指该数字加上或减去该数字的10％。术语“约”某一范围是指该范围减去其最低值的10％至加上其最大值的10％。

除非上下文另有明确规定，否则如本说明书和权利要求书中所使用的，单数形式“一个”、“一种”和“该”包括复数指示物。例如，术语“一个样品”包括多个样品，包括其混合物。

术语“确定”、“测量”、“评价”、“评估”、“测定”和“分析”在本文中通常可互换使用，以指代测量形式，并且包括确定元素是否存在(例如，检测)。这些术语可包括定量、定性或定量和定性测定。评估是相对的或绝对的。“检测……的存在”包括测定某物的存在量以及确定其存在与否。

如本文所用的，术语“治疗”或“处理”用于指代用于在接受者中获得有益或期望的结果的药物或其他干预方案。有益或期望的结果包括但不限于治疗性益处和/或预防性益处。治疗性益处可指症状或正在被治疗的潜在病症的根除或改善。另外，治疗性益处也能如下实现：根除或改善与潜在病症相关的一种或多种生理学症状，使得在受试者中观察到改善，尽管该受试者可能仍受到该潜在病症的折磨。预防性效果包括延缓、防止或消除疾病或状况的出现，延缓或消除疾病或状况的症状发作，减慢、终止或逆转疾病或状况的进展，或其任意组合。对于预防性益处，具有发生特定疾病的风险的受试者或报告疾病的一种或多种生理学症状的受试者可接受治疗，即使可能尚未作出该疾病的诊断。

方法

如前述和以下描述中所讨论的，本文公开的方法旨在非侵入性地检测受胁迫的受试者中的组织或器官，以及确定哪种疾病或状况正在影响受胁迫的组织或器官。本文公开的一些方法包括确定受试者中的疾病或状况的阶段或进展。本文公开的一些方法包括确定对用来治疗受试者中的疾病或状况的疗法的反应。本文公开的一些方法包括确定受试者中的特定组织或器官是否被损害、损伤或感染。本文公开的一些方法包括确定受试者中的特定组织或器官是否受疾病或状况的影响。本文公开的一些方法包括对本文公开的生物分子进行检测或定量。本文公开的一些方法包括对本文公开的标志物和/或组织特异性多核苷酸进行检测或定量。

本文公开的一些方法包括检测、定量和/或分析受试者样品中的至少一种核酸。该方法可包括检测、定量和/或分析生物样品中的至少一种核酸。在一些情况下，该生物样品已被冷冻。在一些情况下，该生物样品从未被冷冻。该组织特异性多核苷酸可以是组织特异性无细胞多核苷酸。该方法可进一步包括将标志物和/或组织特异性无细胞多核苷酸的量分别与该标志物的参考水平和该组织特异性多核苷酸的参考水平进行比较。在一些情况下，不需要与参考水平进行比较。例如，标志物和/或组织特异性无细胞多核苷酸的存在可能足以检测疾病或状况，或确定特定组织是否被疾病或状况损害、损伤或感染。在一些方面，该方法提供疾病或状况的诊断或预后，或评估其进展。

在一些方面，本公开提供了富集血液样品中的循环非血液RNA的方法，其包括消耗该血液样品的血细胞；以及消耗该血液样品的外来体。在一些方面，本公开提供了富集血液样品中的循环非血液RNA的方法，其包括消耗该血液样品的血细胞以产生细胞耗竭的血液样品；以及使该细胞耗竭的血液样品与血细胞表面结合部分接触。

在一些方面，本公开提供了方法，其包括：(a)从受试者获得血液样品；(b)从该血液样品中去除细胞以获得细胞耗竭的样品；(c)从该血液样品中去除细胞外微粒以获得微粒耗竭的样品；以及(d)对该微粒耗竭的样品中与基因相对应的RNA的量进行定量。在一些情况下，该方法包括：(a)从受试者获得血液样品；(b)离心或过滤该血液样品以获得血浆样品；(c)过滤该血浆样品以从该血浆样品中去除血小板，从而产生细胞耗竭的样品；(d)使该细胞耗竭的样品与细胞表面蛋白质结合部分接触，其中该细胞表面蛋白质结合部分能够结合该细胞耗竭的样品中血细胞外来体上的细胞表面蛋白质；(e)从该细胞耗竭的样品中去除该细胞表面蛋白质结合部分，从而从该细胞耗竭的样品中去除该血细胞外来体；以及(f)对该细胞耗竭的样品中的循环无细胞RNA进行定量，其中该无细胞RNA由目的组织表达。

去除细胞

在一些方面，本公开提供了包括从本文公开的样品(例如，生物流体、血液、血浆样品、细胞耗竭的样品)中去除细胞的方法。在一些情况下，去除细胞包括离心该样品。在一些情况下，去除细胞包括离心该样品超过一次。在一些情况下，去除细胞包括离心该样品两次。在一些情况下，方法包括以约5,000g至约25,000g离心该样品。在一些情况下，方法包括以约8,000g至约20,000g离心该样品。在一些情况下，方法包括以约12,000g至约18,000g离心该样品。在一些情况下，方法包括以约14,000g至约18,000g离心该样品。在一些情况下，方法包括以约16,000g离心该样品。在一些情况下，去除细胞包括过滤该样品。过滤样品可包括使样品与孔径为约200微米至约1000微米的过滤器接触。过滤样品可包括使样品与800微米的过滤器接触。

在一些方面，本公开提供了包括从本文公开的样品中去除细胞以产生本文所述的细胞耗竭的样品的方法。在一些情况下，该细胞耗竭的样品基本上不含细胞。在一些情况下，该细胞耗竭的样品含有不到约10个细胞。在一些情况下，该细胞耗竭的样品含有不到约50个细胞。在一些情况下，该细胞耗竭的样品含有不到约100个细胞。在一些情况下，该细胞耗竭的样品含有不到约150个细胞。在一些情况下，该细胞耗竭的样品含有不到约200个细胞。在一些情况下，该细胞耗竭的样品含有不到约500个细胞。在一些情况下，该细胞耗竭的样品含有不到约1000个细胞。

在一些情况下，所述细胞是血细胞。在一些情况下，该细胞是白细胞。在一些情况下，该细胞选自T细胞、B细胞、树突细胞、自然杀伤细胞、干细胞前体、巨噬细胞、单核细胞、粒细胞、血小板、红细胞、循环内皮细胞或循环上皮细胞。在一些情况下，该细胞是血小板。在一些情况下，该细胞是粒细胞。

本文公开的一些方法包括去除至少约90％的最初存在于血液样品中的细胞。本文公开的一些方法包括去除至少约95％的最初存在于血液样品中的细胞。本文公开的一些方法包括去除至少约75％到至少约95％的最初存在于血液样品中的细胞。本文公开的一些方法包括去除至少约75％到至少约99％的最初存在于血液样品中的细胞。在一些情况下，该细胞包括在样品中的细胞碎片。这样的样品在本文中可被称为“细胞耗竭的样品”。

去除细胞外微粒

在一些方面，本公开提供了包括从本文公开的样品(例如，生物流体、血液、血浆样品、细胞耗竭的样品)中去除细胞外微粒的方法。在一些方面，本公开提供了包括从样品中去除至少一种细胞外微粒的方法。在一些方面，本公开提供了包括从样品中去除多种细胞外微粒的方法。在一些情况下，该细胞外微粒被表征为或被称为外来体、囊泡、微囊泡、外来体样囊泡或微粒。在一些情况下，该细胞外微粒是外来体。在一些情况下，该细胞外微粒来自白细胞。在一些情况下，该细胞外微粒来自血细胞。在一些情况下，该细胞外微粒来自循环细胞。血浆或血清中超过90％的外来体来自血细胞。本文公开的方法去除了这类细胞外微粒，从而提高了循环无细胞核酸定量的准确性和灵敏度。

一些方法包括使样品同与细胞外微粒表面上的蛋白质相互作用的结合部分接触。在一些情况下，该样品是细胞耗竭的样品。在一些情况下，该结合部分与已知被循环细胞表达的细胞表面标志物相互作用。在一些情况下，该循环细胞是骨髓来源的细胞。在一些情况下，该循环细胞是血细胞。在一些情况下，该循环细胞是白细胞。在一些情况下，该循环细胞是T细胞。在一些情况下，该循环细胞是B细胞。在一些情况下，该循环细胞是树突细胞。在一些情况下，该循环细胞是自然杀伤细胞。在一些情况下，该循环细胞是干细胞前体。在一些情况下，该循环细胞是巨噬细胞。在一些情况下，该循环细胞是单核细胞。在一些情况下，该循环细胞是粒细胞。在一些情况下，该循环细胞是血小板。在一些情况下，该循环细胞是红细胞。在一些情况下，该循环细胞是循环内皮细胞。在一些情况下，该循环细胞是循环上皮细胞。

一些方法包括使样品同与细胞外微粒表面上的蛋白质相互作用的结合部分接触。在一些情况下，该结合部分是细胞外微粒表面上的蛋白质的受体或配体。在一些情况下，该结合部分是结合蛋白质。在一些情况下，该结合部分是小分子。在一些情况下，该结合部分是适体或核酸。在一些情况下，该结合部分是脂质、脂肪酸、固醇或其他生物聚合物。在一些情况下，该结合部分是抗体。在一些情况下，该结合部分是抗原结合抗体片段。在一些情况下，该抗体或其抗原结合片段结合选自GypA、CD3、CD4、CD8、CD14、CD19、CD20、CD11c、CD123、CD56、CD34、CD14、CD33、CD66b、CD41、CD42b、CD61、CD62、CD138、CD235a、CD146或CD326的细胞表面标志物。在一些情况下，该细胞外微粒来自白细胞，而该细胞表面标志物是CD45。在一些情况下，该细胞外微粒来自粒细胞，而该细胞表面标志物是CD66b。

一些方法包括使样品同与细胞外微粒表面上的蛋白质相互作用的结合部分接触。在一些情况下，该结合部分附接至固体支持物。在一些情况下，该结合部分连接至固体支持物。在一些情况下，该结合部分缀合至固体支持物。在一些情况下，该结合部分与固体支持物相互作用。固体支持物的非限制性实例是珠子、柱、板或阵列。在一些情况下，该结合部分对与样品不混溶的溶液具有亲和力，使得当样品与该结合部分接触后将该溶液加入到样品中时，该结合部分分离到该溶液中，从而从样品中去除细胞外微粒。

一些方法包括使样品同与多个细胞外微粒表面上的多个蛋白质相互作用的多个结合部分接触。在一些情况下，方法包括使样品与至少两个结合部分接触。在一些情况下，方法包括使样品与至少三个结合部分接触。在一些情况下，方法包括使样品与至少四个结合部分接触。在一些情况下，方法包括使样品与约两个结合部分至约五个结合部分接触。一些方法包括使样品与第一结合部分和第二结合部分接触。在一些情况下，第一结合部分与第一细胞上的第一蛋白质相互作用，而第二抗体与第二细胞上的第二蛋白质相互作用。在一些情况下，第一结合部分和第二结合部分是不同的。在一些情况下，第一蛋白质和第二蛋白质是相同的。例如，在一些情况下，第一结合部分和第二结合部分靶向相同的蛋白质，但是两者都被使用，因为不确定哪个结合部分在受试者的样品中最有效。在一些情况下，第一蛋白质和第二蛋白质是不同的。在一些情况下，第一蛋白质和第二蛋白质有至少约10个氨基酸不同。在一些情况下，第一蛋白质和第二蛋白质有至少约100个氨基酸不同。在一些情况下，第一蛋白质和第二蛋白质有至少约200个氨基酸不同。在一些情况下，第一蛋白质和第二蛋白质有至少约400个氨基酸不同。在一些情况下，第一蛋白质和第二蛋白质从不同的基因表达。在一些情况下，第一蛋白质在第二细胞上不表达，并且第二蛋白质在第一细胞上不表达。在一些情况下，第一细胞和第二细胞是两种不同类型的白细胞。在一些情况下，方法包括以与本文公开的去除细胞外微粒相似的方式去除细胞碎片。

本文公开的一些方法包括从本文公开的样品中去除细胞外微粒。在一些情况下，该方法消耗血液样品中至少90％的最初存在于该血液样品中的细胞外微粒。在一些情况下，该方法消耗血液样品中至少99％的最初存在于该血液样品中的细胞外微粒。

本文公开的一些方法包括去除细胞、细胞碎片和细胞外微粒之外的样品的其他组分。其他组分的非限制性实例是微小RNA、核糖体RNA和tRNA等。

捕获细胞外微粒

在一些方面，本公开提供了方法，其包括使样品与蛋白质结合部分接触，其中该蛋白质结合部分能够结合血浆样品中细胞外微粒上的表面蛋白质，其中该细胞外微粒来自受试者的组织；从细胞耗竭的样品中去除该蛋白质结合部分，从而从该样品中移出细胞外微粒；以及对该细胞外微粒中的核酸进行定量，其中该核酸由所述组织表达。在一些情况下，目的组织不是血液。在一些情况下，目的组织是实体器官。在一些情况下，目的组织是肝脏，并且该蛋白质结合部分与SLC7A10或脂肪酸结合蛋白4(FABP4)相互作用。在一些情况下，目的组织是脂肪，并且该蛋白质结合部分与脱唾液酸糖蛋白受体1(ASGR1)或胶质细胞原纤维酸性蛋白(GFAP)相互作用。在一些情况下，目的组织是神经系统组织，并且该蛋白质结合部分与谷氨酸天冬氨酸转运蛋白(GLAST)相互作用。在一些情况下，目的组织是肾脏，并且该蛋白质结合部分与γ-谷氨酰基-转肽酶相互作用。在一些情况下，该细胞表面蛋白质结合部分是抗体或其抗原结合片段。在一些情况下，该细胞外微粒是外来体。来自组织或肿瘤的外来体的非限制性实例包括prostasome、epididimosome、dexosome、texosome和oncosome。

核酸定量

在一些方面，本公开提供了包括对受试者样品中的RNA进行定量的方法。在一些情况下，如本文所述改变或处理样品。在一些情况下，该RNA是无细胞RNA，其也可以被称为循环无细胞RNA。在一些情况下，该RNA不附着于细胞、细胞碎片、细胞外微粒(例如，外来体)或其片段。在一些情况下，该RNA包含信使RNA(mRNA)。在一些情况下，该RNA基本由mRNA组成。在一些情况下，该RNA是mRNA。在一些情况下，该RNA的长度为约75个核苷酸至约300个核苷酸。在一些情况下，该RNA的长度为约100个核苷酸至约250个核苷酸。在一些情况下，该RNA的长度为约125个核苷酸至约225个核苷酸。在一些情况下，该RNA的长度为约300个核苷酸至约5000个核苷酸。

一些方法包括对所述RNA对样品的相对贡献进行定量。一些方法包括对样品的总RNA中该RNA的分数进行定量。本文公开的一些方法包括对该RNA进行测序。在一些情况下，定量包括Q-PCR。在一些情况下，定量包括多重PCR。在一些情况下，定量包括阵列检测方法(例如，微阵列)。在一些情况下，定量包括通过引发和模板切换过程同时添加衔接子进行随机引发。

在一些方面，本公开提供了包括对受试者样品中的RNA进行定量的方法。在一些情况下，该RNA来自组织。在一些情况下，该组织不是液体组织(例如，血液)。在一些情况下，该组织是实体组织。在一些情况下，该组织是器官。在一些情况下，该组织与功能相关。例如，该组织可以是神经系统组织。神经系统组织可以是脑、脊髓、周围神经或其组合。组织的非限制性实例包括肝脏、脂肪、肾脏。在一些情况下，该RNA来自组织特异性细胞类型。在一些情况下，该特异性细胞类型是非血细胞。在一些情况下，该特异性细胞类型是神经细胞类型。神经细胞类型的非限制性实例是星形胶质细胞和少突胶质细胞。在一些情况下，该特异性细胞类型是肝细胞类型。肝细胞类型的非限制性实例是肝细胞、枯否细胞和星状细胞。在一些情况下，该特异性细胞类型是肾细胞类型。肾细胞类型的非限制性实例是肾小管细胞。

在一些方面，本公开提供了包括对受试者样品中的RNA进行定量的方法。在一些情况下，该RNA在目的组织中比在血液中以更高水平表达。在一些情况下，该RNA在目的组织中比在血细胞中以更高水平表达。在一些情况下，该RNA不由血细胞表达。在一些情况下，该RNA在该组织中的表达是在血液中的表达的至少五倍。在一些情况下，该RNA在该组织中的表达是在血液中的表达的至少十倍。在一些情况下，该RNA在该组织中的表达是在血液中的表达的至少二十倍。

在一些情况下，该RNA在该组织中的表达是在其他任何组织中的表达的至少五倍。在一些情况下，该RNA在该组织中的表达是在其他任何组织中的表达的至少十倍。在一些情况下，该RNA在该组织中的表达是在其他任何组织中的表达的至少二十倍。在一些情况下，该RNA在不超过两种组织中的表达是在其他任何组织中的表达的至少五倍。在一些情况下，该RNA在不超过两种组织中的表达是在其他任何组织中的表达的至少十倍。在一些情况下，该RNA在不超过两种组织中的表达是在其他任何组织中的表达的至少二十倍。在一些情况下，该RNA在不超过三种组织中的表达是在其他任何组织中的表达的至少五倍。在一些情况下，该RNA在不超过三种组织中的表达是在其他任何组织中的表达的至少十倍。在一些情况下，该RNA在不超过三种组织中的表达是在其他任何组织中的表达的至少二十倍。

在一些情况下，该RNA在细胞类型中的表达是在其他任何细胞类型中的表达的至少五倍。在一些情况下，该RNA在该细胞类型中的表达是在其他任何细胞类型中的表达的至少十倍。在一些情况下，该RNA在该细胞类型中的表达是在其他任何细胞类型中的表达的至少二十倍。在一些情况下，该RNA在不超过两种细胞类型中的表达是在其他任何细胞类型中的表达的至少五倍。在一些情况下，该RNA在不超过两种细胞类型中的表达是在其他任何细胞类型中的表达的至少十倍。在一些情况下，该RNA在不超过两种细胞类型中的表达是在其他任何细胞类型中的表达的至少二十倍。在一些情况下，该RNA在不超过三种细胞类型中的表达是在其他任何细胞类型中的表达的至少五倍。在一些情况下，该RNA在不超过三种细胞类型中的表达是在其他任何细胞类型中的表达的至少十倍。在一些情况下，该RNA在不超过三种细胞类型中的表达是在其他任何细胞类型中的表达的至少二十倍。

在一些方面，本公开提供了包括对受试者样品中的RNA或其cDNA进行定量的方法。一些方法包括在定量之前扩增该RNA或其cDNA。一些方法包括在定量的同时扩增该RNA。在一些情况下，扩增包括使该RNA或cDNA与无规六聚体杂交。在一些情况下，扩增包括使该RNA或cDNA与序列特异性引物杂交。在一些情况下，扩增包括热循环反应。在一些情况下，扩增包括等温反应。在一些情况下，扩增包括链置换扩增。

系统

在一些方面，本公开提供了消耗生物流体样品中的细胞、细胞碎片和细胞外微粒，以改善生物流体中核酸的检测或定量的系统。一些系统能够去除生物流体的其他组分，例如核糖体RNA、线粒体RNA、细菌RNA。细菌RNA可能来自肠道。在一些情况下，该核酸包含RNA。在一些情况下，该核酸基本上由RNA组成。在一些情况下，该RNA是信使RNA。

在一些方面，本公开提供了捕获生物流体样品中的细胞外微粒的系统，所述细胞外微粒来自非血液组织，包括实体组织或实体器官。在一些方面，本公开提供了从并非循环细胞的细胞捕获细胞外微粒。在一些方面，本公开提供了从并非血细胞的细胞捕获细胞外微粒。

在一些方面，本公开提供了包含结合部分的混合物的系统，所述结合部分能够结合受试者样品中的细胞外微粒。在一些情况下，该结合部分与细胞外微粒表面上的蛋白质相互作用。在一些情况下，该结合部分是细胞外微粒表面上的蛋白质的受体或配体。在一些情况下，该结合部分是与细胞外微粒表面上的蛋白质相互作用的结合蛋白质。在一些情况下，该结合部分是小分子。在一些情况下，该结合部分是适体或核酸。在一些情况下，该结合部分是脂质、脂肪酸、固醇或其他生物聚合物。在一些情况下，该结合部分是抗体。在一些情况下，该结合部分是抗原结合抗体片段。

在一些情况下，所述细胞外微粒来自血细胞。在一些情况下，所述结合部分与细胞外微粒上的蛋白质相互作用或结合，该蛋白质是血细胞上的细胞表面标志物。血细胞的非限制性实例是T细胞、B细胞、树突细胞、自然杀伤细胞、干细胞前体、巨噬细胞、单核细胞、粒细胞、血小板、红细胞、循环内皮细胞和循环上皮细胞。在一些情况下，该细胞是血小板。在一些情况下，该细胞是粒细胞。血细胞上的细胞表面标志物的非限制性实例包括GypA、CD3、CD4、CD8、CD14、CD19、CD20、CD11c、CD123、CD56、CD34、CD14、CD33、CD66b、CD41、CD42b、CD61、CD62、CD138、CD235a、CD146或CD326。

在一些情况下，所述结合部分与细胞外微粒上的蛋白质相互作用或结合，该蛋白质是非血细胞上的细胞表面标志物。非血细胞类型的非限制性实例是星形胶质细胞、肝细胞和脂肪细胞。非血细胞可以来自实体组织或实体器官。实体组织的非限制性实例包括肝脏、脂肪、肾脏、胰腺、心脏、肌肉、骨髓、皮肤、前列腺、睾丸、乳腺、卵巢、子宫、结肠、肺和神经系统组织。肝细胞上的细胞表面标志物的非限制性实例包括ASGR1和GFAP。脂肪细胞上的细胞表面标志物的非限制性实例是SLC7A10和FABP4。星形胶质细胞上的细胞表面标志物的非限制性实例包括GLAST。肾细胞(例如，肾小管细胞)上的细胞表面标志物的非限制性实例包括γ-谷氨酰基-转肽酶。

一些系统包含与多个细胞外微粒表面上的多个蛋白质相互作用的多个结合部分。在一些情况下，系统包含至少两个结合部分。在一些情况下，系统包含至少三个结合部分。在一些情况下，系统包含至少四个结合部分。在一些情况下，系统包含约两个结合部分至约五个结合部分。一些系统包含第一结合部分和第二结合部分。在一些情况下，第一结合部分与第一细胞上的第一蛋白质相互作用，而第二抗体与第二细胞上的第二蛋白质相互作用。在一些情况下，第一结合部分和第二结合部分是不同的。在一些情况下，第一蛋白质和第二蛋白质是相同的。例如，在一些情况下，第一结合部分和第二结合部分靶向相同的蛋白质，但是两者都被使用，因为不确定哪个结合部分在受试者的样品中最有效。在一些情况下，第一蛋白质和第二蛋白质是不同的。在一些情况下，第一蛋白质和第二蛋白质有至少约10个氨基酸不同。在一些情况下，第一蛋白质和第二蛋白质有至少约100个氨基酸不同。在一些情况下，第一蛋白质和第二蛋白质有至少约200个氨基酸不同。在一些情况下，第一蛋白质和第二蛋白质有至少约400个氨基酸不同。在一些情况下，第一蛋白质和第二蛋白质从不同的基因表达。在一些情况下，第一蛋白质在第二细胞上不表达，并且第二蛋白质在第一细胞上不表达。在一些情况下，第一细胞和第二细胞是两种不同类型的白细胞。在一些情况下，所述多个结合部分能够与来自至少两种不同细胞类型的细胞外微粒结合或相互作用。

一些系统包含与多个细胞外微粒表面上的多个蛋白质相互作用的多个结合部分。在一些情况下，所述多个结合部分能够与来自至少两种不同细胞类型的细胞外微粒结合或相互作用。在一些情况下，所述多个结合部分能够与来自至少三种不同细胞类型的细胞外微粒结合或相互作用。在一些情况下，所述多个结合部分能够与来自至少四种不同细胞类型的细胞外微粒结合或相互作用。在一些情况下，所述多个结合部分能够与来自至少五种不同细胞类型的细胞外微粒结合或相互作用。在一些情况下，所述多个结合部分能够与来自至少两种不同类型的循环细胞或血细胞的细胞外微粒结合或相互作用。在一些情况下，所述多个结合部分能够与来自至少三种不同类型的循环细胞或血细胞的细胞外微粒结合或相互作用。在一些情况下，所述多个结合部分能够与来自至少四种不同类型的循环细胞或血细胞的细胞外微粒结合或相互作用。在一些情况下，所述多个结合部分能够与来自至少五种不同类型的循环细胞或血细胞的细胞外微粒结合或相互作用。循环细胞或血细胞类型的非限制性实例包括淋巴细胞、T细胞、B细胞、树突细胞、自然杀伤细胞、干细胞前体、巨噬细胞、单核细胞、粒细胞、血小板、红细胞、循环内皮细胞和循环上皮细胞。

本文公开的一些系统包含固体支持物，其中至少一个结合部分附接至该固体支持物。在一些情况下，该结合部分连接至该固体支持物。在一些情况下，该结合部分缀合至该固体支持物。在一些情况下，该结合部分与该固体支持物相互作用。固体支持物的非限制性实例是珠子、柱、板或阵列。在一些情况下，该结合部分对与样品不混溶的溶液具有亲和力，使得当样品与该结合部分接触后将该溶液加入到样品中时，该结合部分分离到该溶液中，从而从样品中去除细胞外微粒。在一些情况下，该系统包含该溶液。

在一些情况下，本文公开的系统包含用于受试者样品的容器。该容器可以容纳EDTA。该容器可以不容纳EDTA。该样品可以含有细胞。一些系统包含用于从受试者的样品中分离细胞的细胞分离组件。在一些情况下，该细胞分离组件是使该容器旋转以向该容器施加离心力，从而从血液样品中去除至少一部分细胞的机器。备选地或另外地，系统包含用于去除细胞的过滤器。在一些情况下，该过滤器去除样品中的细胞碎片、细胞外微粒或其他组分。通常，该过滤器适合于从样品中的循环无细胞信使RNA中分离这些组分。在一些情况下，该过滤器的孔径为约200微米至约800微米。在一些情况下，该过滤器的孔径为约800微米至约2000微米。在一些情况下，该过滤器的孔径为约400微米至约1200微米。在一些情况下，该过滤器的孔径为约600微米至约1000微米。在一些情况下，该过滤器的孔径为约800微米。

本文公开的一些系统包含至少一种用于对存在于来自受试者的样品中的核酸进行定量的试剂。在一些情况下，该核酸是RNA。在一些情况下，该RNA是信使RNA。在一些情况下，该核酸是互补DNA(cDNA)。在一些情况下，该试剂是与目的核酸互补的寡核苷酸。在一些情况下，该试剂是逆转录酶，并且该系统用来将RNA逆转录成cDNA。在一些情况下，该试剂是与cDNA互补的寡核苷酸。在一些情况下，该系统包含两种能够扩增RNA或cDNA的寡核苷酸。在一些情况下，该试剂是扩增核酸的酶。在一些情况下，该系统包含产生和/或读取Q-PCR或测序读数所必需的机器或试剂。这样的机器和试剂是本领域公知的。

在一些情况下，本文所述的系统和方法包括通过相对熵最大化使用反卷积：基于对混合物的基因表达测量值，对来自复杂混合物特定目的细胞类型/组织/器官如无细胞RNA的相对量进行定量的方法。

假设RNA混合物来自不同组织，所述方法使用该混合物的基因表达值以及每个组织中的基因表达值来求解p，其为构成该混合物的组织的比例的向量。该方法的目的是得出p的值，该值使以下两者之和最小化：1)混合物中观察到的表达谱与以p加权的组织表达谱的线性组合之间的相对熵，和2)在p值必须总和为1的约束下的L2-模罚函数。

由于目标是估计组织贡献上的概率分布，因此必须在所有组织上的概率之和必须为1的约束下进行优化。在当前的实现方式中，通过以下方式来满足在n个组织上的概率总和为1的这种约束：先验地选择参考组织，然后估计n-1个自由参数，该n-1个自由参数代表特定组织相对于参考组织的贡献的对数比。完成参数估计后，可以将对数比转换为概率。将参考组织选择为可能在混合物中高度代表的组织，以使估计的对数比在数值上稳定。其他方法，如使用约束优化方法，也是可行的，但它们可能更容易出现数值困难。

在反卷积之前进行特征选择步骤。从组织基因表达谱构建特征矩阵。将可以是基因或基因的加权线性组合的特征选择为组织特异性的。高度相关的基因可以组合在一起以创建新特征，这降低了噪音并且降低多重共线性。

拟合的P值可以使用对数比检验来计算。

更准确地说，假设一个n乘以f的特征矩阵F，其中n为组织的总数，f为特征的总数，以及观察到的表达谱O的f长向量，我们得出最小化的P值

其中Q是从当值的P值预测的表达谱的F长向量，

Q＝FP

编号的实施方案

通过阅读本文所述的编号实施方案进一步理解本公开内容。1.一种方法，其包括从受试者获得血液样品；离心或过滤所述血液样品以获得血浆样品；过滤所述血浆样品以从所述血浆样品中去除血小板，从而产生细胞耗竭的样品；使所述细胞耗竭的样品与细胞表面蛋白质结合部分接触，其中所述细胞表面蛋白质结合部分能够结合所述细胞耗竭的样品中血细胞外来体上的细胞表面蛋白质；从所述细胞耗竭的样品中去除所述细胞表面蛋白质结合部分，从而从所述细胞耗竭的样品中去除所述血细胞外来体；以及对所述细胞耗竭的样品中的循环无细胞RNA进行定量，其中所述无细胞RNA由目的组织表达。2.一种方法，其包括：从受试者获得血液样品；从所述血液样品中去除细胞以获得细胞耗竭的样品；从所述血液样品中去除细胞外微粒以获得微粒耗竭的样品；对所述微粒耗竭的样品中与基因相对应的RNA的量进行定量。3.实施方案1或2的方法，其中所述去除细胞外微粒包括使所述细胞耗竭的样品同与所述细胞外微粒表面上的蛋白质相互作用的结合部分接触。4.实施方案1或2的方法，其中所述结合部分是抗体或抗原结合抗体片段。5.实施方案4的方法，其中所述抗体或抗原结合抗体片段附接至支持物。6.实施方案4的方法，其中所述抗体与已知被血细胞表达的细胞表面标志物相互作用。7.实施方案6的方法，其中所述血细胞是白细胞。8.实施方案7的方法，所述抗体包括抗CD45抗体。9.实施方案6的方法，其中所述血细胞是粒细胞。10.实施方案9的方法，其中所述抗体包括抗CD66b抗体。11.实施方案4的方法，其包括使所述细胞耗竭的样品同与第一细胞上的第一蛋白质相互作用的第一抗体和与第二细胞上的第二蛋白质相互作用的第二抗体接触。12.实施方案11的方法，其中所述第一蛋白质和所述第二蛋白质有至少10个氨基酸不同。13.实施方案11的方法，其中所述第一蛋白质和所述第二蛋白质由不同的基因表达。14.实施方案11的方法，其中所述第一蛋白质在所述第二细胞上不表达，并且所述第二蛋白质在所述第一细胞上不表达。15.实施方案11的方法，其中所述第一细胞和所述第二细胞是两种不同类型的白细胞。16.实施方案1或2的方法，其中定量包括对所述RNA对所述微粒耗竭的样品的相对贡献进行定量。17.实施方案1或2的方法，其中定量包括对所述RNA进行测序。18.实施方案1或2的方法，其中所述RNA在目的组织中比在所述受试者的其他任何组织中以更高水平表达。19.实施方案18的方法，其中所述目的组织是神经系统组织。20.实施方案18的方法，其中所述目的组织是肝脏、脂肪、肾脏或神经系统组织。21.实施方案1或2的方法，其中去除细胞包括离心或过滤血液。22.实施方案2的方法，其中去除细胞包括过滤所述细胞耗竭的样品以去除血小板。23.实施方案1或2的方法，其包括扩增所述RNA或其cDNA以产生扩增的核酸。24.实施方案23的方法，其中所述扩增包括使所述RNA或cDNA与无规六聚体杂交。25.实施方案1或2的方法，其中所述RNA包括信使RNA。26.实施方案1、2或23的方法，其中定量包括对所述RNA、cDNA或扩增的核酸进行测序。27.实施方案1或2的方法，其中所述RNA在目的组织中比在血液中以更高水平表达。28.实施方案1或2的方法，其中所述细胞外微粒是外来体。29.实施方案28的方法，其中所述外来体来自血细胞。30.实施方案29的方法，其中所述血细胞是血小板。31.实施方案30的方法，其中去除所述细胞外微粒包括使所述细胞耗竭的样品与抗GypA抗体或其GypA抗原结合片段接触。32.实施方案29的方法，其中所述血细胞是红细胞。33.实施方案32的方法，其中去除所述细胞外微粒包括使所述细胞耗竭的样品与抗CD235a抗体或其CD235a抗原结合片段接触。34.实施方案29的方法，其中所述血细胞是粒细胞。35.实施方案34的方法，其中去除所述细胞外微粒包括使所述细胞耗竭的样品与抗CD66b抗体或其CD66b抗原结合片段接触。36.实施方案29的方法，其中所述血细胞是淋巴细胞。37.实施方案36的方法，其中去除所述细胞外微粒包括使所述细胞耗竭的样品与结合CD45、CD19或CD3的抗体或其抗原结合片段接触。38.实施方案1或2的方法，其中所述RNA不附着于细胞、外来体或其片段。39.实施方案1或2的方法，其中所述细胞耗竭的样品被消耗了所述血液样品中至少90％的细胞。40.实施方案1或2的方法，其中所述细胞耗竭的样品包含血浆或血清。41.实施方案1或2的方法，其中所述细胞耗竭的样品基本上由血浆或血清组成。42.实施方案41的方法，其包括从所述血浆或血清中纯化所述RNA。43.实施方案42的方法，其中所述血浆或血清在60摄氏度下孵育1h。44.实施方案43的方法，其包括在离液盐、去污剂、蛋白酶K、2-巯基乙醇或其组合的存在下孵育。45.实施方案43或44的方法，其包括将所述样品与Tris一起孵育。46.实施方案43-45中任一项的方法，其包括破坏脂质结构和蛋白质结构。47.实施方案42的方法，其包括使所述血浆或血清与硅胶柱接触。48.实施方案47的方法，其包括使所述样品与离液盐和100％异丙醇一起孵育，以增强RNA与硅胶柱的结合。49.实施方案48的方法，其包括使用真空歧管使所述样品通过所述硅胶柱。50.实施方案49的方法，其包括用低浓度离液盐和乙醇洗涤所述样品。51.实施方案50的方法，其包括用100％乙醇洗液洗涤所述样品，以除去所述样品中的杂质和抑制剂。52.实施方案48的方法，其包括用低离子缓冲液或水从所述硅胶柱上洗脱RNA。53.实施方案52的方法，其包括使洗脱的RNA与具有极高催化效率的高纯度、抑制剂抗性重组DNA酶一起孵育20分钟，以消除任何DNA。54.实施方案53的方法，其包括使所述RNA通过消除污染物和抑制剂的抑制剂去除柱。55.实施方案53的方法，其包括使用离液盐和66％乙醇将所述RNA结合至硅胶膜，洗涤所述RNA并洗脱。56.实施方案55的方法，其包括用水洗脱。57.一种富集血液样品中的循环非血液RNA的方法，其包括消耗所述血液样品的血细胞；以及消耗所述血液样品的外来体。58.一种富集血液样品中的循环非血液RNA的方法，其包括消耗所述血液样品的血细胞以产生细胞耗竭的血液样品；以及使所述细胞耗竭的血液样品与血细胞表面结合部分接触。59.实施方案57或58的方法，其中消耗包括过滤所述血液样品以除去所述血细胞。60.实施方案59的方法，其中所述血细胞包含血小板。61.实施方案57或58的方法，其中消耗包括离心所述血液样品。62.实施方案57或58的方法，其中所述方法消耗所述血液样品中至少90％的最初存在于所述血液样品中的细胞。63.实施方案57或58的方法，其中所述方法消耗所述血液样品中至少99％的最初存在于所述血液样品中的细胞。64.实施方案57或58的方法，其中所述方法消耗所述血液样品中至少90％的最初存在于所述血液样品中的细胞外微粒。65.实施方案57或58的方法，其中所述方法消耗所述血液样品中至少99％的最初存在于所述血液样品中的细胞外微粒。66.实施方案57或58的方法，其中所述非血液RNA来自实体器官。67.实施方案66的方法，其中所述实体器官是肝脏、脂肪、肾脏或脑。68.实施方案67的方法，其中所述实体器官是脑或脊髓。69.实施方案57或58的方法，其中所述非血液RNA来自非血细胞类型。70.实施方案69的方法，其中所述非血细胞类型是少突胶质细胞。71.实施方案57或58的方法，其包括对所述非血液RNA进行定量。72.实施方案71的方法，其中定量包括选自定量PCR和测序的至少一种方法。73.一种系统，其包含：用于受试者的血液样品的容器；使容器旋转以向该容器施加离心力，从而从所述血液样品中去除至少一部分细胞的机器；用于从所述血液样品中去除血小板的过滤器；以及与细胞外微粒上的蛋白质相互作用的抗体。74.实施方案73的系统，其包含多种抗体。75.实施方案73的系统，其中所述多种抗体包含CD45、CD66b、GypA、CD235a、CD19和CD3中的至少一种。76.实施方案73的系统，其中所述抗体附接于可以接触所述血液样品并从所述血液样品中去除的支持物上，从而从所述血液样品中去除所述细胞外微粒。77.实施方案73的系统，其包含至少一种用于对所述血液样品中存在的RNA进行定量的试剂。78.一种方法，其包括：从受试者获得血液样品；离心或过滤所述血液样品以获得血浆样品；使所述血浆样品与细胞表面蛋白质结合部分接触，其中所述细胞表面蛋白质结合部分能够结合所述血浆样品中细胞外微粒上的细胞表面蛋白质，其中所述细胞外微粒来自所述受试者的组织；从细胞耗竭的样品中去除所述细胞表面蛋白质结合部分，从而从所述细胞耗竭的样品中移出所述细胞外微粒；以及对所述细胞外微粒中的RNA进行定量，其中所述RNA由目的组织表达。79.实施方案78的方法，其中所述组织是实体器官。80.实施方案78的方法，其中所述细胞表面蛋白质结合部分是抗体或其抗原结合片段。81.实施方案78的方法，其中所述组织是肝脏。82.实施方案80的方法，其中所述细胞表面蛋白质是脱唾液酸糖蛋白受体1(ASGR1)或胶质细胞原纤维酸性蛋白(GFAP)。83.实施方案78的方法，其中所述组织是脂肪。84.实施方案83的方法，其中所述细胞表面蛋白质是SLC7A10或脂肪酸结合蛋白4(FABP4)。85.实施方案78的方法，其中所述组织是神经系统组织。86.实施方案85的方法，其中所述细胞表面蛋白质是谷氨酸天冬氨酸转运蛋白(GLAST)。87.实施方案78的方法，其中所述组织是肾脏。88.实施方案87的方法，其中所述细胞表面蛋白质是γ-谷氨酰基-转肽酶。

实施例

给出以下实施例是为了说明本发明的各个实施方案的目的，而不意味着以任何方式限制本发明。这些实施例以及目前代表优选实施方案的本文所述方法是示例性的，而非旨在限制本发明的范围。本领域技术人员将会想到包含在由权利要求范围所限定的本发明精神之内的其变化以及其他用途。

实施例1：无细胞RNA的分离

V2提取方法：将血液样品采集在EDTA管中，以1900g离心10min。将血浆分离到新的管中(图3中的富含血小板的血浆)。为了去除血小板，随后将血浆以16000g离心并通过0.8μm的过滤器。在一些情况下，将血浆冷冻并在37℃下融化。为了从血浆中纯化核酸，将样品在Tris背景中存在高浓度离液盐、去污剂、蛋白酶K和2-巯基乙醇的情况下于60℃孵育1h，以破坏脂质结构和蛋白质结构。裂解后，向样品中加入额外的离液盐和100％异丙醇，以增强核酸与硅胶柱的结合。使用真空歧管使样品通过硅胶膜。除100％乙醇洗液外，还用低浓度离液盐和乙醇彻底洗涤样品，以去除杂质和抑制剂(多糖、生物盐、蛋白质)。用低离子缓冲液或水洗脱核酸。随后，使样品与具有极高催化效率的高纯度、抑制剂抗性重组DNA酶一起孵育20min，以消除任何DNA。为了防止在下游应用中抑制逆转录酶反应，使cfRNA通过去除污染物和抑制剂(多酚、腐殖酸)的抑制剂去除柱。为了去除残留的酶和杂质并浓缩cfRNA，使用离液盐和66％乙醇使样品与硅胶膜结合，洗涤并在15ul水中洗脱。通过使用2100Bioanalyzer(Agilent Technologies Inc.,La Jolla,CA)在Agilent RNA 6000Pico芯片中运行1ul样品来估算cfRNA的量、大小和完整性。

可以将该方法与先前已知的方法(在本文中也被称为旧提取方法)进行比较(参见图3)。先前已知的方法的示例如下。将1ml血浆在室温下融化，并在2M GTC、120mM Tris-HCl、20mM CaCl₂、2％吐温20、1％Triton X-100、2-巯基乙醇和200ul蛋白酶K(20mg/ml)的存在下于55℃孵育30min。裂解后，加入离液盐和乙醇，并使样品旋转通过基于二氧化硅的基质。用2.5M GTC、50mM柠檬酸盐和37.7％乙醇洗涤后，将核酸在水中洗脱。随后，在37℃下用DNA酶I内切核酸酶处理样品30min。最后，使用33％乙醇和离液盐使样品与二氧化硅基质结合，洗涤并在15ul水中洗脱。通过使用SuperScript III逆转录酶、Platinum DNA聚合酶和SYBR Green的qPCR估算mRNA的量。使用人18S转录物作为估算RNA浓度的替代物(18S_F：5’-GGCCCTGTAATTGGAATGAGTC；18S-反向：5’-CCAAGATCCAACTACGAGCTT；Integrated DNATechnologies,WCO.,San Diego,CA)。使用人脑组织总RNA生成校准曲线(FirstChoiceHuman Brain Reference Total RNA，Thermo Fisher Scientific,Inc.)。在CFX96 TouchReal-Time PCR Detection System(Bio-Rad Laboratories,Inc.,Hercules,CA)上进行实时定量PCR。

实施例2.无细胞核酸的免疫消耗和富集

从受试者获得血浆样品。血浆中含有来自多种血细胞类型的外来体。使血浆与CD45抗体一起孵育。将靶向CD45抗体的磁性颗粒添加到血浆样品中。使用磁体去除磁性颗粒和结合的结构，留下未结合的外来体。如通过RNA测序所测定的，除去外来体后，所得样品含有较少的来自单个核血细胞的转录物，表明来自该细胞类型的转录物消耗了10倍，如表1所示。

通过测序对样品进行分析，下表显示了由特定细胞类型代表的读取的％。例如，单个核细胞(淋巴细胞和单核细胞)在消耗前占细胞的8.831％，而在消耗后占0.893％。

表1.外来体去除前后组织特异性转录物的分数

实施例3.评价用于量化无细胞RNA的Q-PCR效率

将由肝脏mRNA的qPCR产生的每个扩增子与肝组织mRNA的滴定进行比较，以确定qPCR反应的效率。将效率计算为与每个循环加倍相比的产率百分比，对于理想的PCR反应预期为100％。结果示于图5中。x轴是纤维化阶段。查询的RNA对应于以下基因：

实施例4.从相同量的RNA开始，两个PCR重复之间的再现性。

从对照供体血浆池中获得RNA。15微升提取物中含有来自1mL血浆的RNA。结果参见图7。X和Y轴上显示的是PCR的Ct计数。

实施例5：使用抗体混合物去除多种血细胞外来体

从受试者获得血浆样品。血浆中含有来自多种血细胞类型的外来体。将具有结合对应于多种血细胞类型的细胞表面标志物的抗体的磁珠添加到血浆样品中并进行孵育。备选地或另外地，使用与在许多血细胞类型上表达的细胞表面标志物结合的单一抗体。向样品施加磁体，并从血浆样品中去除不需要的外来体，留下目的外来体。去除外来体后，所得样品含有少得多的来自血细胞的转录物，从而提高了对组织特异性转录物的检测灵敏度。

按照以下步骤分析剩余样品中的目的核酸。

·采集：EDTA-2次离心后过滤->优选的血小板减少是进行一次低速离心，随后进行高速离心(16k)。冷冻上清液。

·提取：融化样品，随后过滤，Qiagen CNA试剂盒->来自贫血小板血浆的产率增加10倍，除较长的转录物外还有较小的cfRNA种类(100个碱基)

·净化：多酚抑制剂去除柱，柱外重组DNA酶，净化柱

·RT：使用高浓度无规六聚体的SS IV 2步骤

·RQ-PCR：巢式设计，在包含所有引物的预扩增步骤中使用不同的引物，随后进行外切核酸酶1处理以去除单链引物，随后使用一对用于最终PCR检测反应的巢式引物在单独的微室中进行最终扩增。包括来自剩余血细胞和其他器官(目的器官除外)的核酸以供归一化。

·使用Swift 1S制备样品中核酸的测序文库，随后进行靶标富集。

·数据处理：在比对前进行部分装配，基于熵进行血细胞指定。

图16：右图包含先前讨论的所有改进：1)从“Molstract”切换到新提取(CNA)试剂盒，2)添加多酚抑制剂去除柱，3)从Clontech Smarter切换到Swift 1s文库制备。4)从单重捕获富集切换到多重(16个样品)捕获富集。

虽然本文已经示出并描述了本发明的优选实施方案，但对于本领域技术人员明显的是，这些实施方案仅以示例的方式提供。本领域技术人员在不脱离本发明的情况下现将想到许多变化、改变和替代。应当理解，在实施本发明的过程中可以采用本文所述的本发明实施方案的各种替代方案。旨在以所附权利要求书限定本发明的范围，并由此涵盖这些权利要求范围内的方法和结构及其等同物。

Claims (20)

1.一种方法，其包括：

a)从受试者获得血液样品；

b)从所述血液样品中去除细胞以获得细胞耗竭的样品；

c)从所述血液样品中去除细胞外微粒以获得微粒耗竭的样品；

d)对所述微粒耗竭的样品中与基因相对应的无细胞RNA的量进行定量。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述去除细胞外微粒包括使所述细胞耗竭的样品同与所述细胞外微粒表面上的蛋白质相互作用的结合部分接触。

3.根据权利要求1所述的方法，其中所述结合部分是抗体或抗原结合抗体片段。

4.根据权利要求3所述的方法，其中所述抗体或抗原结合抗体片段与已知被血细胞表达的细胞表面标志物相互作用。

5.根据权利要求3所述的方法，其中所述抗体包括抗CD45抗体。

6.根据权利要求3所述的方法，其中所述抗体包括抗CD66b抗体。

7.根据权利要求1所述的方法，其包括使所述细胞耗竭的样品同与第一细胞上的第一蛋白质相互作用的第一抗体和与第二细胞上的第二蛋白质相互作用的第二抗体接触。

8.根据权利要求7所述的方法，其中所述第一蛋白质在所述第二细胞上不表达，并且所述第二蛋白质在所述第一细胞上不表达。

9.根据权利要求1所述的方法，其中所述细胞外微粒是外来体。

10.根据权利要求9所述的方法，其中所述外来体来自血细胞。

11.根据权利要求10所述的方法，其中所述血细胞是血小板，并且其中去除所述细胞外微粒包括使所述细胞耗竭的样品与抗GypA抗体或其GypA抗原结合片段接触。

12.根据权利要求10所述的方法，其中所述血细胞是红细胞，并且其中去除所述细胞外微粒包括使所述细胞耗竭的样品与抗CD235a抗体或其CD235a抗原结合片段接触。

13.根据权利要求10所述的方法，其中所述血细胞是粒细胞，并且其中去除所述细胞外微粒包括使所述细胞耗竭的样品与抗CD66b抗体或其CD66b抗原结合片段接触。

14.根据权利要求10所述的方法，其中所述血细胞是淋巴细胞，并且其中去除所述细胞外微粒包括使所述细胞耗竭的样品与结合CD45、CD19或CD3的抗体或其抗原结合片段接触。

15.根据权利要求1所述的方法，其中所述细胞耗竭的样品在60摄氏度下孵育1h。

16.根据权利要求15所述的方法，其包括在离液盐、去污剂、蛋白酶K、2-巯基乙醇或其组合的存在下孵育所述细胞耗竭的样品。

17.根据权利要求16所述的方法，其包括将所述样品与Tris一起孵育。

18.根据权利要求1所述的方法，其包括破坏脂质结构和蛋白质结构。

19.根据权利要求1所述的方法，其包括使所述细胞耗竭的样品与硅胶柱接触。

20.根据权利要求19所述的方法，其包括使所述细胞耗竭的样品与离液盐和100％异丙醇一起孵育，以增强RNA与所述硅胶柱的结合。

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