CN105821031A - 一种二氯甲烷法提取dna的原理 - Google Patents
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Abstract
本发明属于DNA提取技术领域且公开了一种有机二氯甲烷法提取DNA的原理,核DNA的提取原理是:以低渗法裂解细胞,之后通过离心收集细胞核,核内DNA通过加入SDS、Triton、Tween20等去垢剂或加热煮沸法将细胞膜、核膜破坏,使DNA从细胞核内释放,再加入蛋白酶K,水解膜蛋白和核蛋白,使DNA游离在溶液中,随后以不同的方法去除杂质,收集DNA,抽提DNA中最为经典的为有机法。传统的有机提取法(即经典的饱和酚-氯仿法):利用有机的蛋白质变性剂酚、氯仿(三氯甲烷)交替抽提,使蛋白质变性,有效地去除蛋白质等杂质,该二氯甲烷法提取DNA的原理,克服酚的缺点,加速有机相与液相分层,最后用更加环保的另一种有机溶剂‑二氯甲烷进行抽提DNA,去除核酸溶液中的迹量酚,得到了同样高质量和高浓度的DNA。
Description
技术领域
本发明涉及一种有机法提取DNA的原理,具体涉及一种二氯甲烷法提取DNA的原理,属于DNA提取技术领域。
背景技术
脱氧核糖核酸(缩写为DNA)又称去氧核糖核酸,是一种分子,双链结构,由脱氧核糖核苷酸(成分为:脱氧核糖、磷酸及四种含氮碱基)组成。可组成遗传指令,引导生物发育与生命机能运作,主要功能是长期性的资讯储存,可比喻为“蓝图”或“食谱”,其中包含的指令,是建构细胞内其他的化合物,如蛋白质与RNA所需,带有遗传讯息的DNA片段称为基因,其他的DNA序列,有些直接以自身构造发挥作用,有些则参与调控遗传讯息的表现,组成简单生命最少要265到350个基因。
现有有机法DNA提取主要原料为三氯甲烷(又名氯仿),但是三氯甲烷是现在制作冰毒的必需原料,属于限购试剂,在实验中很难正常买到;其次,三氯甲烷具有高腐蚀性和毒性,对我们的环境和生活有着严重的影响,为了更为有效和环保的进行实验,我们尝试了在这个DNA提取方法中将二氯甲烷(易购买,毒性小)替代三氯甲烷(又名氯仿),结果得到了同样高浓度和高质量的DNA,为此,我们提出一种有机二氯甲烷法提取DNA的原理。
发明内容
本发明要解决的技术问题克服现有的缺陷,提供一种二氯甲烷法提取DNA的原理,该二氯甲烷法提取DNA的原理,克服三氯甲烷自身的缺点;加速有机相与液相分层,最后用更为环保并效果相同的二氯甲烷替代三氯甲烷抽提DNA,去除核酸溶液中的迹量酚,不仅保证了DNA的提取率,而是更加环保和切合实际的提供另一种有机的DNA提取方法,有效解决背景技术中的问题。
为了解决上述技术问题,本发明提供了如下的技术方案:
(1)血液(痕):取血液100μl(血痕0.5cm2)置1.5ml移液器管中,加入400μl TES(10mmol/L缓冲液,pH 8.0,100mmol/L氯化钠,1mmol/L EDTA),10%SDS 40μl,10mg/ml PK8μl,37℃水浴过液,以等体积酚/二氯甲烷/异戊醇(25:24:1)抽提2-4次,二氯甲烷/异戊醇(24:1)抽提1次。加2倍体积冷无水乙醇和1/10体积3mol/L氯化钠沉淀DNA,置-20℃2h后10000r/min离心20min,倾去无水乙醇,70%-75%乙醇洗涤10000rpm 5min,弃乙醇, DNA干燥后加适量ddH2O(pH 8.2)溶解备用。
(2)组织:取10mg左右组织,研磨后,置1.5ml移液器管中,加入400μl TES,10%SDS40μl,10mg/ml PK12μl,后继步骤同⑴。
(3)毛根:取4-6根带毛囊毛发(0.3cm),置0.5ml移液器管中,加入100μl TES,10%SDS 10μl,10mg/ml PK8μl,39mmol/L DTT 10μl,后继步骤同⑴。
(4)唾液斑:取唾液斑1.0-2.0cm2,剪碎,TES浸泡1h,用灭菌牙签搅动载体以使细胞脱离载体,去载体,10000rpm离心10min,弃上清,于沉淀内加入400μl TES,10%SDS 40μl,10mg/ml PK8μl,37℃过夜或56℃两小时,后继步骤同⑴。
(5)混合斑:取混合斑0.5cm2,剪碎,TES4℃浸泡2h,去载体,10000rpm离心10mm,弃上清液,于沉淀内加入400μl TES,10%SDS 40μl,10mg/ml PK8μl,52℃3h,用TES反复洗涤3次除去阴道上皮细胞,方法①再加入400μl TES,10%SDS40μl,10mg/ml PK15μl,39mm DTT40μl,37℃过夜或56℃2小时,以等体积酚/二氯甲烷/异戊醇(25:24:1)抽提2-4次,二氯甲烷/异戊醇(24:1)抽提1次。加2倍体积冷无水乙醇和1/10体积3mol/L氯化钠沉淀DNA,置-20℃2h后10000r/min离心20min,倾去无水乙醇,DNA干燥后加适量ddH2O(pH 8.2)溶解备用;方法②加入5%CHELEX-100 100μl,10mg/ml PK10μl,39mm DTT20μl,37℃过夜或56℃2小时,剧烈振荡,100℃加热10min,剧烈振荡,10000r-min 10min,取上清液进行检测扩增。
(6)骨、指甲:同血液DNA提取,骨和指甲的消化时间延长至3天到1周,蛋白酶K用量为25μl(20mg/ml)左右,消化时加入适量39mM DTT。
(7)污染检材DNA提取:检材用TES液洗涤1-2次后以酚-二氯甲烷法提取DNA,提取的DNA经无水乙醇、3M氯化钠涫淀后再加入TES、10mg/ml PK、10%SDS进行二次消化,再以酚-二氯甲烷法提取DNA。
本发明所达到的有益效果是:一种二氯甲烷法提取DNA的原理,采用酚抽提细胞DNA,能够使蛋白质变性,同时抑制了脱氧核糖核酸酶的降解作用。用苯酚处理匀浆液时,由于蛋白与DNA联结键已断,蛋白分子表面又含有很多极性基团与苯酚相似相溶。蛋白分子溶于酚相,而DNA溶于水相,使用酚的优点:1.有效变性蛋白质;2.抑制了脱氧核糖核酸酶的降解作用,采用二氯甲烷抽提细胞DNA,克服酚的缺点;加速有机相与液相分层,最后用二氯甲烷抽提,去除核酸溶液中的迹量酚。通过这种改良的有机法(即酚-二氯甲烷法)最后提取到了和三氯甲烷相同效果的DNA,改进了一种更加环保、实用的科研实验方法。
具体实施方式
以下对本发明的优选实施例进行说明,应当理解,此处所描述的优选实施例仅用于说明 和解释本发明,并不用于限定本发明。
实施例:本发明一种二氯甲烷法提取DNA的原理:
(1)血液(痕):取血液100μl(血痕0.5cm2)置1.5ml移液器管中,加入400μl TES(10mmol/L缓冲液,pH 8.0,100mmol/L氯化钠,1mmol/L EDTA),10%SDS 40μl,10mg/ml PK8μl,37℃水浴过液,以等体积酚/二氯甲烷/异戊醇(25:24:1)抽提2-4次,二氯甲烷/异戊醇(24:1)抽提1次。加2倍体积冷无水乙醇和1/10体积3mol/L氯化钠沉淀DNA,置-20℃2h后10000r/min离心20min,倾去无水乙醇,70%-75%乙醇洗涤10000rpm 5min,弃乙醇,DNA干燥后加适量ddH2O(pH 8.2)溶解备用。
(2)组织:取10mg左右组织,研磨后,置1.5ml移液器管中,加入400μl TES,10%SDS40μl,10mg/ml PK12μl,后继步骤同⑴。
(3)毛根:取4-6根带毛囊毛发(0.3cm),置0.5ml移液器管中,加入100μl TES,10%SDS 10μl,10mg/ml PK8μl,39mmol/L DTT 10μl,后继步骤同⑴。
(4)唾液斑:取唾液斑1.0-2.0cm2,剪碎,TES浸泡1h,用灭菌牙签搅动载体以使细胞脱离载体,去载体,10000rpm离心10min,弃上清,于沉淀内加入400μl TES,10%SDS 40μl,10mg/ml PK8μl,37℃过夜或56℃两小时,后继步骤同⑴。
(5)混合斑:取混合斑0.5cm2,剪碎,TES4℃浸泡2h,去载体,10000rpm离心10mm,弃上清液,于沉淀内加入400μl TES,10%SDS 40μl,10mg/ml PK8μl,52℃3h,用TES反复洗涤3次除去阴道上皮细胞,方法①再加入400μl TES,10%SDS40μl,10mg/ml PK15μl,39mm DTT40μl,37℃过夜或56℃2小时,以等体积酚/二氯甲烷/异戊醇(25:24:1)抽提2-4次,二氯甲烷/异戊醇(24:1)抽提1次。加2倍体积冷无水乙醇和1/10体积3mol/L氯化钠沉淀DNA,置-20℃2h后10000r/min离心20min,倾去无水乙醇,DNA干燥后加适量ddH2O(pH 8.2)溶解备用;方法②加入5%CHELEX-100 100μl,10mg/ml PK10μl,39mm DTT20μl,37℃过夜或56℃2小时,剧烈振荡,100℃加热10min,剧烈振荡,10000r-min 10min,取上清液进行检测扩增。
(6)骨、指甲:同血液DNA提取,骨和指甲的消化时间延长至3天到1周,蛋白酶K用量为25μl(20mg/ml)左右,消化时加入适量39mM DTT。
(7)污染检材DNA提取:检材用TES液洗涤1-2次后以酚-二氯甲烷法提取DNA,提取的DNA经无水乙醇、3M氯化钠涫淀后再加入TES、10mg/ml PK、10%SDS进行二次消化,再以酚-二氯甲烷法提取DNA。
DNA提取原理:动物和植物组织的脱氧核糖核蛋白(DNP)可溶于水或浓盐溶液(如1mol/L氯化钠),但在0.14mol/L氯化钠盐溶液中溶解度最低,而核酸核蛋白(RNP)则在0.14mol/L 氯化钠中溶解度最大,利用这一性质可将其分开。将沉淀物溶解于生理盐水,加入去污剂十二烷基硫酸钠(SDS)溶液,使DNA与蛋白质分离开。加入固体氯化钠使其浓度达到1mol/L,使DNA溶解。加氯仿-异戊醇去除蛋白质,也可重复该步操作得较纯DNA。最后用95%乙醇沉淀DNA。溶解:将离心后除去RNA的沉淀,用30ml生理盐水溶解,充分搅拌后,匀浆一次。加4毫升10%SDS溶液,使溶液的SDS浓度达到1%左右,边加边搅拌,放置60℃水浴保温10分钟(不停搅拌),冷却。加固体氯化钠,使溶液氯化钠浓度达到1mol/L,充分搅拌10分钟;除杂质:加等体积氯仿-异戊醇混合液,充分震荡10分钟,8000r/min离心7分钟,取上层液量好体积,倒入烧杯中(离心管),加同体积的氯仿-异戊醇混合液,重复上次操作。直至界面不出现蛋白凝胶为止;沉淀:准确量取上清液体积,加2倍体积95%冷乙醇,搅拌后,置冰箱静止冷却,待有白色丝状物出现,约10-15分钟,离心8000r/min离心7分钟,得白色沉淀;溶解:将沉淀物用0.1mol/L氢氧化钠约10毫升溶解,得DNA溶液。溶液I—溶菌液:溶菌酶:它是糖苷水解酶,能水解菌体细胞壁的主要化学成分肽聚糖中的β-1,4糖苷键,因而具有溶菌的作用。当溶液中pH小于8时,溶菌酶作用受到抑制。葡萄糖:增加溶液的粘度,维持渗透压,防止DNA受机械剪切力作用而降解。EDTA:(1)螯合Mg2+、Ca2+等金属离子,抑制脱氧核糖核酸酶对DNA的降解作用;(2)EDTA的存在,有利于溶菌酶的作用,因为溶菌酶的反应要求有较低的离子强度的环境。溶液II-NAOH-SDS液:氢氧化钠:核酸在pH大于5,小于9的溶液中,是稳定的。但当pH>12或pH<3时,就会引起双链之间氢键的解离而变性。在溶液II中的NAOH浓度为0.2mo1/L,加抽提液时,该系统的pH就高达12.6,因而促使染色体DNA与质粒DNA的变性。SDS:SDS是离子型表面活性剂。它主要功能有:(1)溶解细胞膜上的脂质与蛋白,因而溶解膜蛋白而破坏细胞膜。(2)解聚细胞中的核蛋白。(3)SDS能与蛋白质结合成为R-O-SO3-…R+-蛋白质的复合物,使蛋白质变性而沉淀下来。但是SDS能抑制核糖核酸酶的作用,所以在以后的提取过程中,必须把它去除干净,防止在下一步操作中受到干扰。溶液III--3mol/L NAAC(pH4.8)溶液:NAAC的水溶液呈碱性,为了调节pH至4.8,必须加入大量的冰醋酸。所以该溶液实际上是NAAC-HAC的缓冲液。用pH4.8的NAAC溶液是为了把pH12.6的抽提液,调回pH至中性,使变性的质粒DNA能够复性,并能稳定存在。而高盐的3mol/L NAAC有利于变性的大分子染色体DNA、RNA以及SDS-蛋白复合物凝聚而沉淀之。前者是因为中和核酸上的电荷,减少相斥力而互相聚合,后者是因为钠盐与SDS-蛋白复合物作用后,能形成较小的钠盐形式复合物,使沉淀更完全。用无水乙醇沉淀DNA,这是实验中最常用的沉淀DNA的方法。乙醇的优点是可以任意比和水相混溶,乙醇与核酸不会起任何化学反应,对DNA很安全,因此是理想的沉淀剂。DNA溶液是DNA以水合状态稳定存在,当加入乙醇时,乙醇会夺去DNA周围的水分子,使DNA失水而易 于聚合。一般实验中,是加2倍体积的无水乙醇与DNA相混合,其乙醇的最终含量占67%左右。因而也可改用95%乙醇来替代无水乙醇(因为无水乙醇的价格远远比95%乙醇昂贵)。但是加95%的乙醇使总体积增大,而DNA在溶液中有一定程度的溶解,因而DNA损失也增大,尤其用多次乙醇沉淀时,就会影响收得率。折中的做法是初次沉淀DNA时可用95%乙醇代替无水乙酵,最后的沉淀步骤要使用无水乙醇。也可以用0.6倍体积的异丙醇选择性沉淀DNA。一般在室温下放置15-30分钟即可。在用乙醇沉淀DNA时,在pH为8左右的溶液中,DNA分子是带负电荷的,加一定浓度的NAAC或NACL,使Na+中和DNA分子上的负电荷,减少DNA分子之间的同性电荷相斥力,易于互相聚合而形成DNA钠盐沉淀,当加入的盐溶液浓度太低时,只有部分DNA形成DNA钠盐而聚合,这样就造成DNA沉淀不完全,当加入的盐溶液浓度太高时,其效果也不好。在沉淀的DNA中,由于过多的盐杂质存在,影响DNA的酶切等反应,必须要进行洗涤或重沉淀。加进去的RNASE本身是一种蛋白质,为了纯化DNA,又必须去除之,加SDS可使它们成为SDS-蛋白复合物沉淀,再加KAC使这些复合物转变为溶解度更小的钾盐形式的SDS-蛋白质复合物,使沉淀更加完全。也可用饱和酚、氯仿抽提再沉淀,去除RNASE。在溶液中,有人以KAC代替NAAC,也可以收到较好效果。在基因操作实验中,选择缓冲液的主要原则是考虑DNA的稳定性及缓冲液成分不产生干扰作用。磷酸盐缓冲系统(PKA=7.2)和硼酸系统(PKA=9.24)等虽然也都符合细胞内环境的生理范围(pH),可作DNA的保存液,但在转化实验时,磷酸根离子的种类及数量将与Ca2+产生Ca3(PO4)2沉淀;在DNA反应时,不同的酶对辅助因子的种类及数量要求不同,有的要求高离子浓度,有的则要求低盐浓度,采用TRIS-HCL(PKA=8.0)的缓冲系统,由于缓冲液是TRISH+/TRIS,不存在金属离子的干扰作用,故在提取或保存DNA时,大都采用TRIS-HCL系统,而TE缓冲液中的EDTA更能稳。抽提DNA去除蛋白质时,酚与二氯甲烷是非极性分子,水是极性分子,当蛋白水溶液与酚或二氯甲烷混合时,蛋白质分子之间的水分子就被酚或二氯甲烷挤去,使蛋白失去水合状态而变性。经过离心,变性蛋白质的密度比水的密度为大,因而与水相分离,沉淀在水相下面,从而与溶解在水相中的DNA分开。而酚与二氯甲烷有机溶剂比重更大,保留在最下层。作为表面变性的酚与二氯甲烷,在去除蛋白质的作用中,各有利弊,酚的变性作用大,但酚与水相有一定程度的互溶,大约10%~15%的水溶解在酚相中,因而损失了这部分水相中的DNA,而二氯甲烷的变性作用不如酚效果好,但二氯甲烷与水不相混溶,不会带走DNA。所以在抽提过程中,混合使用酚与二氯甲烷效果最好。经酚第一次抽提后的水相中有残留的酚,由于酚与二氯甲烷是互溶的,可用二氯甲烷第二次变性蛋白质,此时一起将酚带走。也可以在第二次抽提时,将酚与二氯甲烷混合(1:1)使用。在抽提DNA时,为了混合均匀,必须剧烈振荡容器数次,这时在混合液内易产生气泡,气泡会阻止相互间的充分作 用。加入异戊醇能降低分子表面张力,所以能减少抽提过程中的泡沫产生。一般采用二氯甲烷与异戊酵为24:1之比。也可采用酚、二氯甲烷与异戊醇之比为25:24:1(不必先配制,可在临用前把一份酚加一份24:1的二氯甲烷与异戊醇即成),同时异戊醇有助于分相,使离心后的上层水相,中层变性蛋白相以及下层有机溶剂相维持稳定。酚与二氯甲烷是非极性分子,水是极性分子,当蛋白水溶液与酚或二氯甲烷混合时,蛋白质分子之间的水分子就被酚或二氯甲烷挤去,使蛋白失去水合状态而变性。经过离心,变性蛋白质的密度比水的密度为大,因而与水相分离,沉淀在水相下面,从而与溶解在水相中的DNA分开。而酚与二氯甲烷有机溶剂比重更大,保留在最下层。作为表面变性的酚与二氯甲烷,在去除蛋白质的作用中,各有利弊,酚的变性作用大,但酚与水相有一定程度的互溶,大约10%~15%的水溶解在酚相中,因而损失了这部分水相中的DNA,而二氯甲烷的变性作用不如酚效果好,但二氯甲烷与水不相混溶,不会带走DNA。所以在抽提过程中,混合使用酚与二氯甲烷效果最好。经酚第一次抽提后的水相中有残留的酚,由于酚与二氯甲烷是互溶的,可用二氯甲烷第二次变性蛋白质,此时一起将酚带走。也可以在第二次抽提时,将酚与二氯甲烷混合(1:1)使用。在抽提DNA时,为了混合均匀,必须剧烈振荡容器数次,这时在混合液内易产生气泡,气泡会阻止相互间的充分作用。加入异戊醇能降低分子表面张力,所以能减少抽提过程中的泡沫产生。一般采用二氯甲烷与异戊酵为24:1之比。也可采用酚、二氯甲烷与异戊醇之比为25:24:1(不必先配制,可在临用前把一份酚加一份24:1的二氯甲烷与异戊醇即成),同时异戊醇有助于分相,使离心后的上层水相,中层变性蛋白相以及下层有机溶剂相维持稳定。
最后应说明的是:以上所述仅为本发明的优选实施例而已,并不用于限制本发明,尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明,对于本领域的技术人员来说,其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改,或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内,所作的任何修改、等同替换、改进等,均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (1)
1.一种二氯甲烷法提取DNA的原理,其特征在于,各种生物样本具体DNA提取操作方法:
(1)血液(痕):取血液100μl(血痕0.5cm2)置1.5ml移液器管中,加入400μl TES(10mmol/L缓冲液,pH 8.0,100mmol/L氯化钠,1mmol/L EDTA),10%SDS40μl,10mg/ml PK8μl,37℃水浴过液,以等体积酚/二氯甲烷/异戊醇(25:24:1)抽提2-4次,二氯甲烷/异戊醇(24:1)抽提1次。加2倍体积冷无水乙醇和1/10体积3mol/L氯化钠沉淀DNA,置-20℃2h后10000r/min离心20min,倾去无水乙醇,70%-75%乙醇洗涤10000rpm 5min,弃乙醇,DNA干燥后加适量ddH2O(pH8.2)溶解备用;
(2)组织:取10mg左右组织,研磨后,置1.5ml移液器管中,加入400μlTES,10%SDS 40μl,10mg/ml PK12μl,后继步骤同⑴;
(3)毛根:取4-6根带毛囊毛发(0.3cm),置0.5ml移液器管中,加入100μl TES,10%SDS 10μl,10mg/ml PK8μl,39mmol/L DTT 10μl,后继步骤同⑴;
(4)唾液斑:取唾液斑1.0-2.0cm2,剪碎,TES浸泡1h,用灭菌牙签搅动载体以使细胞脱离载体,去载体,10000rpm离心10min,弃上清,于沉淀内加入400μl TES,10%SDS 40μl,10mg/ml PK8μl,37℃过夜或56℃两小时,后继步骤同⑴;
(5)混合斑:取混合斑0.5cm2,剪碎,TES4℃浸泡2h,去载体,10000rpm离心10mm,弃上清液,于沉淀内加入400μl TES,10%SDS 40μl,10mg/ml PK8μl,52℃3h,用TES反复洗涤3次除去阴道上皮细胞,方法①再加入400μl TES,10%SDS40μl,10mg/ml PK15μl,39mm DTT40μl,37℃过夜或56℃2小时,以等体积酚/二氯甲烷/异戊醇(25:24:1)抽提2-4次,二氯甲烷/异戊醇(24:1)抽提1次。加2倍体积冷无水乙醇和1/10体积3mol/L氯化钠沉淀DNA,置-20℃2h后10000r/min离心20min,倾去无水乙醇,DNA干燥后加适量ddH2O(pH 8.2)溶解备用;方法②加入5%CHELEX-100100μl,10mg/ml PK10μl,39mm DTT20μl,37℃过夜或56℃2小时,剧烈振荡,100℃加热10min,剧烈振荡,10000r-min10min,取上清液进行检测扩增;
(6)骨、指甲:同血液DNA提取,骨和指甲的消化时间延长至3天到1周,蛋白酶K用量为25μl(20mg/ml)左右,消化时加入适量39mM DTT;
(7)污染检材DNA提取:检材用TES液洗涤1-2次后以酚-二氯甲烷法提取DNA,提取的DNA经无水乙醇、3M氯化钠涫淀后再加入TES、10mg/ml PK、10%SDS进行二次消化,再以酚-二氯甲烷法提取DNA。
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