JPH03101689A

JPH03101689A - 核酸の抽出方法又は除去方法

Info

Publication number: JPH03101689A
Application number: JP23732889A
Authority: JP
Inventors: Toshiaki Sakka; 目　利明
Original assignee: Tosoh Corp
Current assignee: Tosoh Corp
Priority date: 1989-09-14
Filing date: 1989-09-14
Publication date: 1991-04-26

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】（産業上の利用分野）本発明は、生体試料等の核酸を含有するさまざまな試料
から核酸を抽出し又は除去する方法に関する。

（従来の技術）近年、種々の分野において、生体試料からの核酸の抽出
が盛んに行われている。例えば遺伝子工学やＤＮＡプロ
ーブの作製においては、目的とする蛋白質を生産する細
胞からｍＲＮＡやＤＮＡを抽出する操作が、またＤＮＡ
ブローブを用いて例えばウイルスＤＮＡ　（ＲＮＡ）を
検出する臨床診断においては生体試料から検出されるべ
きＤＮＡ（ＲＮＡ）を抽出する操作が行われる。

以上の様に、核酸を抽出する操作は種々の分野において
非常に重要なものである。

従来、核酸の抽出は、例えば苛性試薬を試料に添加し、
次いでフェノール又はフェノール／クロロホルム抽出を
１〜３回行い、最終的にエタノール沈澱を行う方法や、
細胞に界面活性剤とブロテイナーゼＫを作用させ、次い
でフェノール抽出を行い、更にエタノール沈澱を行う方
法が知られている。また、ＲＮＡを抽出する方法として
、細胞にチオシアン酸グアニジンを添加し、一定の密度
に調製した遠心溶液中で超遠心を行う方法や、イオン交
換力ラム、ゲル濾過あるいは電気泳動を行う方法が知ら
れている。更には生体試料からの核酸の抽出キットや抽
出装置が知られている。これらは、例えばブロテイナー
ゼＫを使用して細胞を溶角タすると同時に蛋白質を分解
し、得られる溶液からイオン交換カラムを用いて核酸を
抽出するものか、又は試料をブロテイナーゼＫで処理し
、次いでフェノール抽出を行い、更にアルコール沈澱を
行うものである。

（従来技術の課題）前記した様な核酸の抽出方法では、繁雑な操作が必要で
あり、時間がかかるうえに危険な有機溶媒での処理を必
要とし、しかも、得られる核酸の量が少ないという収率
的な課題がある。

具体的に、例えば苛性試薬を試料に添加し、次いでフェ
ノール又はフェノール／クロロホルム抽出を１〜３回行
い、エタノール沈澱を行う方法では、操作自体が繁雑で
あることから時間がかかり、かつ危険なアルカリ性試薬
やクロロホルム等の有機溶媒を使用しなければならない
。界面活性剤とプロテイナーゼＫを作用させ、次いでフ
ェノール抽出を行い、更にエタノール沈澱を行う方法で
は、ブロテイナーゼＫによる蛋白質の分解に時間がかか
るという課題がある。細胞にチオシアン酸グアニジンを
添加し、一定の密度に調製した遠心溶ｌ＆中で超遠心を
行う方法では、遠心分離操作におよそ１日かかるという
課題がある。イオン交換力ラム、ゲル濾過あるいは電気
泳動を行う方法では、操作が繁雑であり、かつその実施
には時間がかかるという課題がある。以上説明した方法
においては、操作の繁雑性のため、例えばその操作を自
動化することが非常に困難であるという課題もある。

生体試料からの核酸の抽出キットや抽出装置についても
、プロテイナーゼＫを使用するためその反応にＩ．１間
がかかる等の課題がある。

（課題を解決するための手段）本発明者らは、簡便な操作により実施可能であり、かつ
繁雑な操作の必要ない核酸の抽出方法について鋭意検討
した結果、従来の技術に見られる課題を解決した本発明
の方法を完成するに至った。

本発明によれば、試料から核酸を除去する方法も同時に
提供される。即ち本発明は、アルカリ性条件下で試料と
蛋白質変性剤を接触させ、次いでアルコールを添加して
沈澱を得又は沈澱を除去することを特徴とする核酸の抽
出方法又は除去方法である。以下、本発明を詳細に説明
する。

本発明の方法は、拭料からＤＮＡやＲＮＡ等の核酸を抽
出又は除去する方法に関するものである。

本明細書でいう核酸とは、ＤＮＡ及び／又はＲＮＡをを
意味するが、それらは一重饋であっても二重鎖であって
もよく、またその遺伝学的な性質にも制限がない。例え
ばＤＮＡは培養された細胞、細菌又はウイルス等のゲノ
ムＤＮＡの他、ミトコンドリアや葉緑体に含有されるＤ
ＮＡであっても良＜：、ＲＮＡはメッセンジャーＲＮＡ
やトランスファーＲＮＡであっても良い。

核酸を含有する試料については、組織、細胞、血液、胆
汁、膿汁゜、髄液、糞便、唾液、喀痰等の生体試料を例
示できるが、その他にも、例えば細胞や細菌等の破砕液
であっても良い。これらの試料について、含有される蛋
白質や核酸が蛋白質変性剤やアルコールと接触できない
もの、即ち試料が細胞等であり、細胞膜や細胞壁がこれ
らの接触を妨げると千１１１１１される場合や核酸と蛋
白質が塊として試料中に存在し、該塊の内部までこれら
が到達できないと予測される場合等には、試料を破砕、
撹拌等して変性剤等と接触可能な状態に処理する。

細胞膜や細胞壁等を破砕するには、例えばホモジナイズ
や界面活性剤処理あるいは超音波処理等を実施しても良
い。

本発明においては、まずアルカリ性条件下にて核酸を含
む試料中の蛋白質を不完全に変性するのに適当な最終濃
度となる様に蛋白質変性剤を試料に添加する。ここで、
以上の操作をアルカリ性条件下で実施するため、試料に
アルカリ性物質を添加する。アルカリ性物質としては、
例えば水酸化ナトリウムや水酸化アンモニウム等、アル
カリ金属元素やアルカリ土類元素の水酸化物等を制限な
く使用出来る。本発明においては、試料のｐＨを７より
高く設定すれば良いが、核酸の収率又は除去効率の点か
らすればｐＨ８．０以上がよく、より好ましくはｐＨ９
．０以上である。アルカリ性物質の試料への添加は、前
記蛋白質変性剤の試料への添加に先立って実施される必
要はなく、蛋白質変性剤の添加と同時に又はその後に実
施されても良い。即ち、後に説明するアルコールを添加
する操作の前に、試料中の核酸及び蛋白質がアルカリ性
溶岐中で蛋白質変性剤と共存している様にすれば良い。

蛋白質変性剤としては、従来公知であるものが制限なく
使用できる。例えばチオシアン酸グアニジン、塩酸グア
ニジン、尿素又はドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）あ
るいはサルコシル等の界面活性剤は、蛋白質変性作用が
充分であり、本発明において好適に使用出来る。また、
界面活性剤としては、例えばオクチルグルコシドやオク
チルチオグルコシドの様な、膜蛋白質の抽出に使用され
るものも本発明においては使用できる。試料中の蛋白質
を不完全に変性させる様な蛋白質変性剤の最終濃度を前
記いた変性剤について例示すれば、チオシアン酸グアニ
ジンであれば２〜５Ｍ程度、好ましくは３Ｍ程度である
。２Ｍ以下では蛋白質の変性の度合いが少なく、また５
Ｍ以上では蛋白質が完全に変性してしまい、後にエタノ
ール等のアルコールを添加した場合に蛋白質が凝集沈澱
を起こしてしまい、核酸の回収が困難になる。塩酸グア
ニジンでは３Ｍ〜５Ｍ程度、好ましくは４Ｍ程度であり
、尿素では２〜５Ｍ程度が良い。界面活性剤によっては
蛋白質の完全な変性は起り難いため、その最終濃度に特
別の制限はないが、本発明を実施する前に使用する界面
活性剤を用いて予備試験を実施し、決定すると良い。

以上の操作を実施する場合の温度等の諸条件は、通営の
生化学反応を実施する場合に準じて決定すれば良い。

次に、適当なアルコールを試料に添加し、核酸を沈澱（
析出）させる。アルコールとしては、例えばエタノール
、ｎブロパノール、ｉｓｏ−プロパノール、ｎ−ブタノ
ール、ｓｅｃ−ブタノール、ｔｅｒｔ−ブタノール、ｎ
−アミルアルコール、ｉｓｏ−アミルアルコール、ｔｅ
ｒｔ−アミルアルコール等を例示することが出来る。

アルコールを試料に添加することにより、試料中の核酸
は沈澱（析出）するから、遠心分離や膜濾過等を実施す
ることにより試料中の核酸或分を抽出することができる
。また、遠心分離や膜濾過等を実施して核酸を抽出した
残りの戊分には、試料中の蛋白質や色素、更には多糖類
等を得ることが出来る。

抽出された核酸や蛋白質について、例えば本発明の後に
蛋白質変性剤を含まないアルコール等で洗浄する操作を
丈施する事等については何等制限はない。また、本発明
により核酸が除去された後の蛋白質変性剤溶液について
も、例えば本発明の実施後に透析等を実施して変性剤ｉ
Ｑ度を低下させる事等については何等制限はない。

（発明の効果）本発明は、最終的にアルコールを試料に添加した時に変
性した蛋白質が沈澱（析出）しない様に、アルコールの
添加に先立ってアルカリ性条件下で蛋白質の変性を実施
する。本発明では危険な有機溶媒を使用する必要がなく
、しかも試料への蛋白質変性剤、アルコールの添加とそ
の後の沈澱の分離・除去操作のみで尖施可能である。従
って、その実施にかかる時間も極めて短時間であり、従
来、半日から２日必要であった核酸の抽出又は除去操作
がより迅速に実施可能となる。このため、大量の核酸を
抽出する必要のある逍伝子工学の分野等においては特１
４有用な方法である。

前記した様に、本発明は極めて簡便な操作により実施可
能であるから、これを自動化することも可能である。

また、本発明では、同一の反応容器内ですべての操作を
実施することが可能であり、また、カラム等による沈澱
の分離・除去も必要ではないから試料の損失が少なく、
従って高い収率で核酸を抽出し又は蛋白質を損失するこ
となく核酸を除去することが可能である。同一の反応容
器内ですべての操作を実施することが可能であることは
、例えば抽出又は除去されるべき核酸が危険なウイルス
ＤＮＡ等であり、試料が該ウイルスに感染した細胞であ
る場合には、その汚染を最少限にすることが出来ること
をも意味している。

（実施例）以下本発明を更に詳細に説明するために実施例を記載す
るが、これら実施例は一例であって本発明を限定するも
のではない。

実施例　ＩＢ　Ｌ　Ｖ　（Ｂｏｖｌｎｅ　ＬｅｕｋｃｍＩａ　Ｖｉ
ｒｕｓ　；　Ｒ．　Ｎ　ａ　ｎｃｙら、ＶＩＲＯＬＯＧ
Ｙ，第１３８巻、第８２頁、１９８４年）ＤＮＡの遺伝
子を組込んだＭ１３ファージを常法に従って調製した。

１００μｌ牛血清中に１　ｎ　ｇＤＮＡを持つ前記ファ
ージを添加したサンプルを２本調製し、それぞれに２０
％ＳＤＳ溶液を２０μｌづつ添加した後、約１分間穏や
かに撹袢した。一方のサンプルに対して０．６ＭのＮａ
ＯＨ溶液を１００μｌ添加してそのｐＨを１４．０とし
、他の一方に対しては５倍濃度のＳＳＣ　（０．７Ｍ塩
化ナトリウム、０．０７Ｍクエン酸）を１００μｌ添加
した。

なお、このＳＳＣを添加したサンプルのｐＨは約７．０
である。

ＳＤＳの蛋白質変性効果を強めるために、サンプルを６
０℃条件下に１０分間放置した後、１５０００ｒｐｍで
５分間遠心分離して沈澱（析出）を分離した。

この結果、ＮａＯＨを添加していない、ｐＨ７条件下で
ＳＤＳを作用させたサンプルでは牛血清に由来する蛋白
質が大量に抽出され、該沈澱からの核酸んの抽出は不可
能であったのに対して、ＮａＯＨを添加してｐＨ１４．
０条件下でＳＤＳを作用させたサンプルでは沈澱は核酸
成分であり、蛋白質の沈澱は見られなかった。

なお、参考のためにＢＬＶＤＮＡの一部分を図１に示す
。

実施例　２実施例１で得られた核酸成分からなる沈澱を１００μｌ
の０．７Ｍ塩化ナトリウム・クエン酸溶戚に溶解した。

図１に示された塩基配列に｝１１補的な塩基配列からな
るＤＮＡ　（図２参照）を市販のＤＮＡ合成装置（Ａｐ
ｐｌｉｅｄ　　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製３８１Ａ）を
用いて合威した。合成されたＤＮＡの５′をアミノ化し
、アルカリ性フオスファターゼを結合させてプローブと
した。

このプローブを使用してドットプロット法により抽出さ
れた核酸中の図１に示されるＤＮＡの存在について調査
した。この時、実施例１で使用した牛血冫ｎを対照とし
て使用し、同様の調査を実施した。

この結果、実施例１で抽出された核酸成分では図１のＤ
ＮＡの７ｉ在を示すスポット発色が示されたのに対し、
対照（牛血冫＋’！　）ではスポット発色は認められな
かった。

以上、実施例１及び２の結果は、本発明によれば高濃度
蛋白質溶液（牛血清）からｌｎＨのＤＮＡ（核酸）が抽
出可能であることを示すものである。

実施例　３図１に示されるＢＬＶＤＮＡの一部を組込んだＭ１３フ
ァージを調製した。

１００μｌ牛血清中に１　ｎ　ｇＤＮＡを持つ前記ファ
ージを添加したサンプルを６本調製し、塩酸グアニジン
を最終濃度でそれぞれ０、２、３、４、５、６Ｍとなる
様に添加した後、約１分間穏やかに撹拌した。サンプル
に対して０．６ＭのＮａＯＨ溶液を１００μｌ添加して
そのｐＨを１４．０とし、１０分間放置した後１５００
Ｏｒｐｍで５分間遠心分離して沈澱（析出）を分離した
。

この結果、最終濃度０、２及び６Ｍの塩酸グアニジンを
添加したサンプルでは、沈澱に大量の蛋白質戊分が見ら
れ、該沈澱からの核酸の抽出は不可能であったが、３、
４及び５Ｍの場合には蛋白質成分は殆ど見られなかった
。

実施例　４実施例３で得られた核酸成分からなる沈澱を１００μｌ
の５倍ＳＳＣに溶解した。

丈施例２の様にして調製された、図１に示された塩基配
列に相補的な塩基配列からなるＤＮＡをプローブとして
使用し、ドットプロット法により抽出された核酸中の図
１に示されるＤＮＡの存在について調査した。この時、
実施例３で使用した牛血清を対照として使用し、同様の
調査を実施した。

この桔果、実施例３で抽出された核酸成分では図１のＤ
ＮＡの在在を示すスポット発色が示されたのに対し、対
照（牛血清）ではスポット発色は認められなかった。

以上、実施例３及び４の結果も、本発明によれば高濃度
蛋白質溶液（牛血清）からｌｎｇのＤＮＡ（核酸）が抽
出可能であることを示すものである。

【図面の簡単な説明】

第１図は、本発明の実施例１及び３で使用した、ＢＬＶ
ＤＮＡの一部分を示すものである。図中、５′及び３′
は記載されたＤＮＡ５−末端及び３一末端を示すもので
ある。なお、第１図で使用されているその他の記号につ
いても、通堂の遺伝子学で使川される記号と同様の意味
である。図中、下線を付した部分は、図２に示されるＤＡＮが特
異的に対合する部分である。第２図は、本発明の尖施例２及び４で使用された、第１
図に示されたＤＮＡの一部分に相捕的なＤＮＡを示すも
のである。

Claims

【特許請求の範囲】

（１）アルカリ性条件下で試料と蛋白質変性剤を接触さ
せ、次いでアルコールを添加して沈澱を得又は沈澱を除
去することを特徴とする核酸の抽出方法又は除去方法。
（２）蛋白質変性剤が塩酸グアニジン、チオシアン酸グ
アニジン、尿素又はドデシル硫酸ナトリウムであること
を特徴とする請求項第（１）項記載の方法。
（３）ｐＨ８．０以上のアルカリ条件下で実施されるこ
とを特徴とする請求項第（１）又は第（２）項記載の方
法。
（４）アルコールがエタノール、プロパノール、ブタノ
ール、ペンタノール又はヘキサノールから選ばれる少な
くとも一のアルコールであることを特徴とする請求項第
（１）項〜第（３）項いずれかに記載の方法。