JPH02295484A - Ｄｎａの単離精製法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 この発明は適当な培地で培養された真核細胞、原核細胞
およびウィルスで複製される２本鎖プラスミドＤＮＡま
たは１本鎖バクテリオファージＤＮＡの単離精製方法に
関する。

従来の技術 組換えＤＮＡの研究においては、ＤＮＡ分子は一般に細
菌およびバクテリオファージーの培養物から単離される
。例えば、２本鎖プラスミドＤＮＡは液体の栄養肉汁培
地中で培養した大腸菌等の細菌の菌体内で生産され、そ
れを出発材料として単離される。バタテリオファージＭ
１３１本鎖鋳型ＤＮＡは適当な大腸菌宿主中で増殖しｔ
；バクテリオファージＭ１３によって生産される。この
鋳型ＤＮＡは宿主菌から栄養肉汁培地中へ放出されたバ
クテリオファージから単離される。

これらのプラスミドＤＮＡ分子もしくは鋳型ＤＮＡ分子
を単離することによって、該分子の塩基配列分析が可能
となり、さらに単離されたＤＮＡは診断、その他の分析
、重要なポリペプチドをコード化する遺伝子との組換体
の作製、および該ペプチドの生産に用いるベクター等と
して有効に利用される。

細菌菌体からプラスミドＤＮＡを単離する常用法として
ビルンボイム（Ｈ．Ｃ．Ｂｉｒｎｂｏｉｏ＋）とドリー
（Ｊ．Ｄｏｌ２ｙ）の方法が例示される。［「ア・ラビ
ッド・アルカライン・エクストラクシ目ン・プロセジュ
ア・フォー・スクリーニング・レコンビナント・プラス
ミド・ディー・エヌ・二一（Ａ　　ＲａｐｉｄＥｘｔｒ
ａｃｔｉｏｎ　Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ　ｆｏｒ　Ｓｃｒｅ
ｅｎｉｎｇ　Ｒｅｃｏｍ−ｂｉｎａｎｔ　Ｐ１ａｓｎ＋
ｉｄ　ＤＮＡ）．Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ
．．第７巻、第１５１３ページーｌ５２３ページ（１９
７９年）参照］。１本鎖鋳型ＤＮＡは類似の方法によっ
て単離される。［例えば、レーダー（　Ｌ　ｅｄｅｒ）
らの報文、Ｓｃｉｅｎｃｅ，第１９６巻、第１７５ペー
ジ（１９７７）参照］。

一般にこれらの方法は、薗体を界面活性剤と塩溶液を含
む適当な反応液中でリゾチームで溶解させる溶解工程と
、ＤＮＡを含む該溶解物を低温で放置の後、フェーノー
ルもしくはクロロホルムまたはこれらの混合物を用いて
抽出もしくは除タンパク処理する除タンパク質工程で構
成される。その後、核酸は沈澱処理によって夾雑する菌
体成分の脂質、及び１部のタンパク質成分から分離され
る。

これら２つの工程、すなわち、溶解と除タンパク質処理
は、溶解工程で用いる試薬と除タンパク質工程で用いる
試薬が混和しないために別々に行われる。従って、核酸
を菌体内のタンパク質夾雑物から分離するには、溶解と
除タンパク質処理の２工程の操作が必要であった。現在
使用されている種々の方法についてはマニアチス（Ｍａ
ｎｉａｔｉｓ）らの「モレキュラー・クローニング・ア
・ラボラトリー・マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　　
Ｃ　Ｉｏｎｉｎｇ　−　ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａ
ｎｕａｌ）Ｊ、Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（　１　９　８　２年）に記載さ
れている。

これらの方法によるＤＮＡの単離精製は煩雑に行われて
おり、また、マニアチスらの工程を実施するには多くの
時間を必要とするので、組換えＤＮＡを取り扱う分野に
おいては、より効率的なＤＮＡの単離方法が要請されて
いる。

さらに、これらの従来法ではいずれもその作業を人手に
頼っているため、（１）低作業能率、（２）作業者の訓
練、（３）単離される核酸フラグメントの純度および収
率のばらつき、（４）作業者に対する安全性などの問題
点があった。

発明が解決しようとする課題 この発明はこのような要請に応え、より効率的なＤＮＡ
分子の単離精製法、ならびにその方法に適した装置を提
供するためになされたものである。

課題を解決するだめの手段 即ちこの発明は、培養液から遠心分離した細胞を室温下
で、 （ｉ）グルコース含有等張性緩衝液（第１溶液）、（ｉ
ｉ）第１溶液、界面活性剤および塩を含宵する溶液（第
２溶液）、および （ｉｉｉ）第２溶液およびＤＮＡの溶解作用と除タンパ
ク質作用を有する試薬組成物を含有する溶液（第３溶液
） の各溶液中における撹拌処理に順次付すことによって、
該細胞の溶解と除タンパク質処理をおこなった後、第３
溶液から細胞質残渣を遠心分離処理によって除去するこ
とを特徴とするＤＮＡの単離精製法および該方法を実施
するのに好適な装置に関する。

培養液中の細胞を遠心分離処理によって沈澱させ、培養
液中の主要な夾雑物と分離する。この方法を１本鎖鋳型
ＤＮＡの単離に適用する場合には、バタテリオファージ
ーと宿主細菌菌体とを低速遠心分離によって、細菌菌体
は沈澱にし、バクテリオファージは液体培地中に残存さ
せて分離する事により目的が達せられる。また、宿主細
菌菌体から得られるプラスミドＤＮＡとバクテリオファ
ージの鋳型ＤＮＡの両者が必要な時は、細菌菌体とバク
テリオファージを同時に沈澱させればよい。

遠心分離の速度と所要時間は使用する培養液の量を考慮
して適宜調整すればよく、望ましい遠心分離は約１　．
５　０　０９で１０分間である。

上記のようにして培養液から分離された細胞は溶解と除
タンパク質処理に付される。

菌体を細胞壁溶解酵素（リゾチーム）不存在下で溶解さ
せ、ついで室温での除タンパク質処理を行う。菌体は等
張性緩衝液中で穏やかに撹拌する。

望ましい緩衝液としてグルコース、エチレンジアミン四
酢酸（ＥＤＴＡ）８よびトリスー塩酸を含有するｐＨ約
７．５の緩衝液が例示される。上記の撹拌処理を行った
後、塩と界面活性剤溶液を［望ましくは水酸化ナトリウ
ムとドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）］を菌の懸濁液
に添加する。この混合物を撹拌処理に付した後、以下に
詳述する新規なＤＮＡを溶解し、かつ除タンパク質作用
を有する試薬組成物を添加する。撹拌処理を行うことに
よって、ＤＮＡの溶解と除タンパク質工程を同時に行う
。用いる等優性緩衝液、塩および界面活性剤は当該分野
の常法に従い、選択すれば良い。

上記の溶菌と除タンパク質処理をおこなった溶液系から
細胞質残渣を遠心分離処理によって除去することによっ
てＤＮＡ含有溶液が得られる。

遠心分離の速度と所要時間は当業者であれば適宜選定で
きるが、好ましくは約１，５００ｇで約ｌＯ分間行う。

沈澱を完全に除くために遠心分離を１−５回行ってもよ
く、また遠心分離の間に撹拌処理をはさむこともできる
。

上述の処理においては、沈澱がコンパクトになるので細
胞質残渣の遠心分離は一層容易におこなわれる。

以上のようにして得られたＤＮＡ含有溶液はさらに以下
の後処理に付される。

プラスミドＤＮＡもしくは鋳型ＤＮＡをアルコールを添
加することによって、溶液中から沈澱させる。液の混合
を完全にするために撹拌を行ってもよい。沈澱したＤＮ
Ａは室温での遠心分離によって遠心管に付着させる。Ｄ
ＮＡを沈澱させるのに使用するアルコール溶液としては
インプロパノールが好ましいが、１００％エタノールの
ような他の低級アルコールを使用してもよい。

この工程では通常の遠心管に変えてフィルター付きの遠
心管を用いることもできる。この場合の好ましいフィル
ターは孔径約０．８ミクロンの二トロセルロース製のフ
ィルターである。この工程に適した別のフィルターとし
てナイロン製等の７ィルターを使用してもよい。

何れの遠心管を用いても適当な遠心分離パラメーターは
当業者であれば容易に決定することが出来る。

遠心管に付着したＤＮＡを繰り返し洗浄することにより
、洗浄液に可溶な夾雑物をＤＮＡ沈澱から除去する。こ
の洗浄処理はエタノールのような低級アルコールを用い
て行うことが出来るが、好ましくは７０％エタノールを
用いて行ってもよい。

夾雑物を除去するのに充分な洗浄回数はｌ一約６回であ
るが、一般的には３回が好ましい。

洗浄したＤＮＡを低イオン強度緩衝液中で、室温で放置
することにより溶解する。この種の緩衝液はＲＮＡ分解
酵素、トリスー塩酸緩衝液およびＥＤＴＡを含有しても
よい。また、ＤＮＡ単離技術の分野において既知の他の
緩衝液を使用してもよい。

上述の本発明によるＤＮＡ単離精製法を実施するのに好
適な装置は、培養液からの細胞の遠心分離手段、分離し
た細胞の溶解と除タンパク質処理用溶液の供給手段、分
離した細胞を含有する該処理用溶液の撹拌手段および該
処理用溶液からの細胞質残渣の遠心分離手段を具備する
。

培養液からの細胞分離手段としては遠心分離器が好まし
い。この場合、本発明によるＤＮＡ単離精製操作は全て
約５００〜２．０００ｇ以下の遠心力，並びに室温で実
施できるため、従来法の場合のような、約１０．０００
９以上の遠心力を発生する冷却保冷機構付き遠心分離器
は不要であり、冷却機構を具備しない約２，０　０　０
以下の遠心力を発生する遠心分離器で十分である。

分離した細胞の溶解と陳タンパク質処理をおこなう前記
の第１溶液〜第３溶液の成分の供給手段としては輸液ポ
ンプが簡便である。

また、後処理に使用するアルコール溶液や低イオン強度
緩衝液等も輸液ポンプを用いて供給すればよい。

細胞を含有するこれらの処理溶液を撹拌する手段、例え
ば振盪ミキサー等は上記の遠心分離器に一体的に装着さ
せるのが好ましく、これによって作業工程の時間的短縮
を計ることができる。

細胞質残渣の除去手段としても遠心分離器が好ましい。

従って、以下の実施例４において詳述するように、遠心
上澄の移し替え機構、遠心上澄の廃液機構および遠心管
の移動機構を装備させることによって一台の撹拌機構付
き遠心分離器によってＤＮＡの一連の単離精製操作を自
動化させることができる。

また、細胞の溶菌と除タンパク質処理によって生成する
沈澱の強度が高いので、沈澱がコンパクトになり、遠心
分離し易くなるので、前記の細胞の分離と細胞質残渣の
分離を一台の遠心分離器でおこなうこ七ができ、装置の
小型化を計ることが可能となる。遠心上澄の移し替え等
はすべて傾斜法によっておこなうことができるので、装
置が筒単化されると共に該作業工程の時間的短縮を計る
ことができる。

上記のＤＮＡ分子の単離精製方法ならびに装置はプラス
ミドＤＮＡおよび１本鎖鋳型ＤＮＡ分子のいずれにも適
用できる。また、室温で安定な試薬を使用するので、１
本鎖鋳型ＤＮＡと２本鎖プラスミドＤＮＡの両方の単離
と精製を単一の操作によって行うことが出来る。さらに
本発明方法によれば、従来技術に比べて、ＤＮＡ分子の
収量が増加すると共に、純度も同等もしくはそれ以上に
なる。

本発明の工程は、原核細胞の他に種々の生体組織、例え
ば真核細胞のＤＮＡの単離を含む種々のＤＮＡ単離法に
適用することが出来る。

以下、本発明を実施例によってさらに説明する。

実施例ｌ 除タンパク質作用を持った試薬組成物の調製５Ｍ酢酸カ
リウム４８ｙａＱと氷酢酸３２ｍＱを混合し、第１溶液
を調製する（酢酸カリウムと酢酸との１ｉ量比は３：２
にするのが好ましい）。７エノール９　．　９　ｍＱに
８−ヒドロキシキノリン０．１重量％、クロロホルム９
　．　９　ｍＱおよびインアミルアルコール０　．　２
　ｍ（ｌをこの順序で添加して第２溶液を調製する。上
記２種の溶液を混合することによって、安定な単一相組
成物（ｐｉ｛８．０）を得る。

実施例２ フィルターを用いた細菌菌体からプラスミドＤＮＡの単
離 ＳＯＢＭ培地（マニアチスらの前記文献、第６９ページ
参照）５ｍαに大腸菌ＪＭＩＯＩおよびＭ１３ｍｐｌ９
バクテリオファージを接種し、３７℃で一晩培養する。

菌体を３　，　０　０　０　ｒｐｍ（約１，６００ｇ）
で１０分間の遠心分離処理で沈澱として集める。培地を
除いた後、沈澱を５０ｍＭグルコース、１０ｍＭＥＤＴ
Ａを含むｌｏｍＭ｝リスー塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）０
．３−で懸濁し、室温で撹拌を２分問おこなう。ついで
ｌ％ＳＤＳを含む０．２ＮＮａＯＨ　０．６ｍＱを添加
し、該溶液を室温で１５秒間穏やかに撹拌を行った後、
３０秒間放置し、さらに穏やかな撹拌を１５秒間行う。

この溶液に実施例１で調製したｉ成物０．５４＋＋＋Ｑ
を添加する。この混合物を穏やかに１５秒間撹拌し、３
０秒間放置した後、１５秒間の撹拌を行い、次いで約１
，５００ｇで１５分間の遠心分離処理に付す。

得られた上澄を、孔径０．８ミクロンの酢酸セルロース
製フィルターおよび５ｍｌ２のレシーバー管を備えた遠
心管（シェリヒエ・アンド・シュエル社製）に移す。該
試験管内にインプロパノール１．３１ＩＩ１２を添加し
、穏やかな撹拌処理を行った後、室温で２分間放置する
。試験管内の内容物を室温下、約１．５００ｇで４分間
の遠心分離処理し、ＤＮＡをフィルターに付着させる。

ＤＮＡをフィルターに付着させた状態で、７０％エタノ
ール０　．　５　ｍＱを試験管内に入れ、遠心分離処理
をさらに２分間行う。この処理操作を３回以上繰り返す
ことによって夾雑物を完全に除去する。

レシバー管を除去し、蓋のないエッペンドル７管（　１
　．　５　ｍＱ）を取り付ける。ｌｍＭ　　ＥＤＴＡお
よび２　０　ｔｔｇ／ｄのＲＮＡ分解酵素（ＲＮａｓｅ
　　Ａ）を含むｌｏｍＭトリスー塩酸緩衝液（ｐＨ８．
０）０．１ｍＱを該試験管内にいれ、室温で３０分間放
置することによってＤＮＡを７イルターから溶出させる
。

該管とその内容物を室温下、約１　，５　０　０ｇで４
分間の遠心分離処理に付す。

得られた溶液ｌＯμＱを別のエツベンドルフ管内に入れ
る。１０倍濃度のＥｃｏＲＩ緩衝液［ニュー・イングラ
ンド・バイオラブズ社（Ｎｅｗ　ＥｎｇｌａｎｄＢ　ｉ
ｏ１ａｂｓ）製］１．２，ｕｆ２をＥｃｏＲＩ制限酵素
１単位と共に添加し、得られた溶液を３７゜Ｃで２時間
反応する。ＤＮＡフラグメント含有溶液をゲル電気泳動
法によって分析し、７．２Ｋｂの線状２本鎖ＤＮＡを確
認する。

マニアチスらの前記文献に記載された方法によって同じ
培養液からＤＮＡを精製した所、本発明による工程を用
いる上記方法の場合と同じ結果が得られることがゲル電
気泳動法による分析データーによって確認されたが、本
発明による工程を使用する事によって、単離されるＤＮ
Ａフラグメントの収量は著しく高くなる。

実施例３ バクテリオファージＭ１３からの鋳型ＤＮＡの単実施例
２で用いた培養液を同様の低速遠心分離地理に付す。バ
クテリオファージを含む遠心上澄１．５Ｍ食塩を含むポ
リエチレングリコール（ＰＥＧ，分子量８　０　０　０
）溶液２０ｍｆｆを入れておいた別の管に移す。この場
合、菌体を含む沈澱は用いない。撹拌を繰り返すことに
よって、２種の溶液を管内で混合させ、これを室温で少
なくとも３０分間放置する。

該溶液を低速遠心分離処理（約１．５００９）にｌＯ分
間付すことによってバクテリオファージを沈澱として分
離し、上澄は捨てる。

バタテリオファージをグルコース、ＥＤＴＡｔ−含むト
リスー塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）０．９ｍＱ中で撹拌処
理により懸濁した後、実施例ｌの試薬組成物０．７ｍＱ
を加えて溶解する。撹拌処理を行った後、残渣を低速遠
心分離によって除去する。

得られた上澄を、孔径０．８ミクロンの酢酸セルロース
製フィルターおよび５＋ａＱのレシバー管を備えた遠心
管（シェリヒエ・アンド・シュエル社製）に移す。該試
験管内にインプロパノール１．３ｍαを添加し、穏やか
な撹拌処理を行った後、室温で２分間放置する。試験管
内の内容物を室温下、約１．５００ｇで４分間の遠心分
離処理し、ＤＮＡをフィルターに付着させる。ＤＮＡを
フィルターに付着させた状態で、７０％エタノール０：
５ｍＱを試験管内に入れ、遠心分離処理をさらに２分間
行う。この処理操作を３回以上繰り返すことによって夾
雑物を完全に除去する。

レシハー管ヲ除去し、蓋のないエッベンドルフ管（１．
５ｍＩ２）を取り付ける。ｌｍＭ　　ＥＤＴＡおよび２
０ｐｙ／ｍＱのＲＮＡ分解酵素（ＲＮａｓｅ　　Ａ）を
含むｌｏｍＭトリスー塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）０．１
ｍＱを該試験管内にいれ、室温で３０分間放置すること
によってＤＮＡをフィルターから溶出させる。

該管とその内容物を室温下、約１　，５　０　０ｇで４
分間の遠心分離処理に付す。

得られた溶液０．５μＱをサンガーのジデオキシ・シー
ケンシング・プロトコールにおいて使用する。

ＤＮＡ７ラグメント含有溶液をゲル電気泳動法によって
分析し、線状単鎖Ｍ１３ＤＮＡを確認する。

マニアチスらの前記文献に記載された方法によって同じ
培養液からＤＮＡを精製した所、本発明による工程を用
いる上記方法の場合と同じ結果が得られることがゲル電
気泳動法による分析データーによって確認されたが、本
発明による工程を使用する事によって、単離されるＤＮ
Ａフラグメントの収量は著しく高くなる。

実施例４ 自動化装置による２本鎖プラスミドＤＮＡの単離第１図
に示す斜視図によって、自動化装置によるプラスミドの
単離精製例を以下に説明する。

２倍濃度のＬ　−　ｂｒｏｔｈ　　５　ｒ＊Ｑに、プラ
スミドｐｕＣ１８で形質転換しＩ；大腸菌ＪＭＩＯＩを
接種し、３７℃で一晩培養する。該培養物を遠心管に移
し、さらに試料保管部（１）に、予め決められた順序に
したがってセットする。

制御部（２）に試料数、遠心分離条件、各種試薬の添加
量などの必要なパラメーターを入力の後、スタートボタ
ンを押すことにより、操作を開始す試料を含む遠心管は
遠心管の移動装置（３）によって遠心分離器（４）を構
成するローターの所定の位置に収納される。この状態の
拡大斜視図を第２図に示す。予め定められた数の遠心管
を収納の後、制御部からの指令で４　．０　０　０ｒｐ
ｍ（１　．９　０　０９）、ｌＯ分間の遠心分離によっ
て、グラスミドを含む菌体と培養液を分離する。

遠心分離の終わった遠心管を遠心管の移動装置（３）を
用いて、廃液装置（５）に移動し、不用となった遠心上
澄を傾斜法で捨てる。菌体を含む遠心管は遠心管の移動
装置（３）を用い遠心分離器に戻す。

該遠心管に５Ｏｎ＋Ｍグルコース、ｌｏｍＭＥＤＴＡお
よびｌＯＩＩＭトリスー塩酸を含有する溶液（ｐＨ７．
５）０．４＋＊（２を加え、遠心器に付加した撹拌機能
を利用した撹拌を３０秒間行い、菌体を懸濁する。つい
で、ｌ％ＳＤＳを含有する０．２ＮＮａＯＨ　　Ｏ．６
ｍｆｆを添加し、同じ機能・を利用して該溶液を室温で
３０秒間穏やかに撹拌する。

この溶薗液に実施例ｌの試薬組成物０．６−を添加する
。該混合物を遠心器に付加した撹拌機能を用いて、室温
で３０秒間撹拌し、ついで４．００　０ｒｐｍ（１．９
　０　０ｇ）５分間の遠心分離処理を行う。この撹拌・
遠心旭理を１−５回、好ましくは３回繰り返す。

遠心分離の終わっｔ；遠心管を遠心管の移動装置（３）
により、デカンテーション装置（６）に移動し、上澄を
予め遠心管の移動装置（３）を用いてセットしておいた
新しい遠心管に移す。

遠心上澄（　１　．　２　ｍａ）を含む遠心管を遠心管
の移動装置（３）を用いて、遠心器にセットし、該遠心
管内にインプロパノール１、２ｒｎＱを添加し、穏やか
な撹拌処理を行った後、生じた沈澱を４．０００ｒｐｍ
（１．９　０　０９）でｌＯ分間の遠心分離処理を行う
ことにより、プラスミドを沈澱として得る。

不用となった遠心上澄は遠心管の移動装置（３）で遠心
管を廃液装置（５）に移動し、デカンテーシジンにより
取り除く。

プラスミドを含む該遠心管を再び遠心器にセットし、７
０％エタノールＬ．ＯｍＱを加えた後、３０秒間撹拌、
４　，０　０　０ｒｐｎ＋（１　．９　０　０ｇ）１分
間の遠心分離処理を行う。この処理操作を３回以上繰り
返すことにより、夾雑物を完全に除去する。なお、洗浄
にもちいたエタノールは遠心管の移動装置（３）と廃液
装置（５）を併用することにより除く。

沈澱状のプラスミドを含む遠心管にｌＯｍＭトリスー塩
酸緩衝液（ｐＨ８．０）とｌＩＩＭ　　ＥＤＴＡから成
る試薬溶液Ｑ　．　ｌ　ｍＱを入れ、プラスミド溶液を
得る。該遠心管を遠心管の移動装置（３）を用いて、遠
心管保管部（７）に、決められた順序でセットする。

該ＤＮＡ溶液ｌＯμＱをゲル電気泳動法によって分析し
、２．７Ｋｂの２本鎖ＤＮＡを確認する。

マニアチスらの前記文献に記載された方法によって同じ
培養液からＤＮＡを精製した所、本発明による工程を用
いる上記方法の場合と同じ結果が得られることがゲル電
気泳動法による分析データーによって確認されたが、本
発明による自動化装置を使用する事によって、単離され
るＤＮＡフラグメントの収量は著しく高くなり、試料間
の収率の変動も少なくなる。さらにこのシステムにより
、節約される時間は約４０−５０％であった。

本発明による方法と装置は当業者であれば適宜修正変更
することができ、このような態様も本発明に包含される
ものである。

発明の効果 タンパク質や脂質が夾雑する菌体抽出液からＤＮＡの単
離精製に本発明による方法および装置、特に自動化装置
を適用すれば、従来決に比べて、ＤＮＡ分子およびその
フラグメントの単離精製を効率よく行うことが出来るだ
けでなく、ＤＮＡ分子等の単離収量は著しく増加する。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明方決を実施するのに好適なＤＮＡ単離精
製用自動化装置の一態様を示す斜視図である。 第２図は第ｌ図に示す装置に組み込まれた遠心分離器の
一態様を示す拡大斜視図である。 （１）は試料保管部、（２）は制御部、（３）は遠心管
移動装置、（４）は撹拌機構を有する遠心分離器、（５
）は廃液装置、（６）はデカンテーション装置、（７）
は遠心管保管部を示す。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、培養液から遠心分離した細胞を室温下で、（ｉ）グ
   ルコース含有等張性緩衝液（第１溶液）、（ｉｉ）第１
   溶液、界面活性剤および塩を含有する溶液（第２溶液）
   、および （ｉｉｉ）第２溶液およびＤＮＡの溶解作用と除タンパ
   ク質作用を有する試薬組成物を含有する溶液（第３溶液
   ） の各溶液中における撹拌処理に順次付すことによって、
   該細胞の溶解と除タンパク質処理をおこなった後、第３
   溶液から細胞質残渣を遠心分離処理によって除去するこ
   とを特徴とするＤＮＡの単離精製法。 ２、細胞が、真核細胞、原核細胞およびウィルスで感染
   された細胞のいずれかである請求項１記載の方法。 ３、ＤＮＡが２本鎖プラスミドＤＮＡまたは１本鎖バク
   テリオファージＤＮＡを含む請求項１記載の方法。 ４、バクテリオファージがＭ１３である請求項３記載の
   方法。 ５、培養液中に残存する宿主細胞を低速遠心分離に付す
   ことによって、バクテリオファージから分離し、ついで
   該遠心上清をさらに遠心分離処理に付すことによって、
   培養液からバクテリオファージを分離させる請求項１記
   載の方法。 ６、第３溶液から細胞質残渣を除去した残液にアルコー
   ルを添加することによってＤＮＡを沈澱させ、該沈澱を
   、アルコール溶液を用いて洗浄した後、低イオン強度緩
   衝液を用いて溶解させる請求項１〜４いずれかに記載の
   方法。 ７、培養液からの細胞の遠心分離手段、分離した細胞の
   溶解と除タンパク質処理用溶液の供給手段、分離した細
   胞を含有する該処理用溶液の撹拌手段および該処理用溶
   液からの細胞質残渣の遠心分離手段を備えたことを特徴
   とするＤＮＡの単離精製用装置。