CN108593755A - 一种细胞外泌物质采样与原位检测方法及装置 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种细胞外泌物质采样与原位检测方法与装置，包括向所述微流体探针内注入有机溶剂，利用有机溶剂萃取待测细胞的待测部位的外泌物质得到待测样品并送入检测装置。所述微流体探针包括用于接收并流通所述有机溶剂并采样的毛细管，毛细管具有一U型结构，U型结构的顶端开有取样口，将U型结构顶端移动到待测细胞的待测部位，流通在所述毛细管内的有机溶剂通过取样口萃取待测细胞的待测部位的外泌物质，进而得到待测样品。本发明的方法和装置能在保持细胞处于原始状态的情况下对细胞外泌物进行采样及原位检测，实现亚细胞水平的细胞外泌物分析。
Description
技术领域
本发明属于细胞研究技术领域，涉及一种细胞外泌物质采样与原位检测方法及装置，尤其涉及一种基于微流体技术的细胞外泌物质采样与原位检测方法及装置。
背景技术
作为绝大部分生命体最基本的结构和功能单元，细胞的行为将直接影响生命体的性质，因而细胞成为了经久不衰的研究热点。细胞会通过胞吞胞吐等方式实现与外界的物质交换，而这种交换物质的行为能够反映细胞的状态，比如人们可以通过外泌体来检测癌细胞的存在，这对于癌症的早期诊断有着很大的参考价值。近年来，人们对于细胞的研究已经进展到了单细胞水平，但即使是对于单个细胞，它的不同部位也会有一定的差异性，因而亚细胞水平的研究逐渐引起了科研工作者的关注。
对于细胞的研究手段多种多样，如光学成像，荧光分析，电泳分析，色谱及质谱分析等。其中质谱检测技术因其分析速度快、普适性强、分辨率高等优点，而广泛用于细胞分析。目前的细胞质谱分析也已经发展到了单细胞水平，可以对单个细胞内的成分进行分析，其中的膜片钳技术已经实现了对于细胞部分内容物的分析。然而这种分析一旦进行这种质谱分析，就势必会对细胞造成严重影响，而对于细胞状态分析不一定只能通过对于其内容物的分析来实现。因此发展一种在细胞正常生存状态下进行亚细胞水平的外泌物的分析技术就至关重要。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术存在的技术问题，提供一种微流体技术的细胞外泌物质采样与原位检测方法及装置，本发明的方法和装置能在保持细胞处于原始状态的情况下对细胞外泌物进行采样及原位检测，实现亚细胞水平的细胞外泌物分析。
为达到本发明的目的，本发明一方面提供了一种细胞外泌物质采样与原位检测方法，包括：
在细胞培养装置中对待测细胞进行培养；
将微流体探针移动到待测细胞的待测部位；
向所述微流体探针内注入有机溶剂，利用有机溶剂萃取待测细胞的待测部位的外泌物质得到待测样品，并送入检测装置。
根据本发明的一些实施方式，所述微流体探针包括：
用于接收并流通所述有机溶剂并采样的毛细管；
与所述毛细管的一端连接的锥形末端，用于将所述待测样品送入检测装置；
用于固定所述毛细管和锥形末端的固定环。
根据本发明的优选实施例，所述毛细管具有一U型结构，所述U型结构的顶端开有取样口。
根据本发明的一些实施例，所述毛细管的一端连接有机溶剂源，另一端连接所述锥形末端。
在一些具体的实施方式中，将所述毛细管的U型结构顶端移动到待测细胞的待测部位，通过有机溶剂源将有机溶剂注入到毛细管中并使其流通，由于有机溶剂在取样口由于表面张力的限制不会通过取样口泄露至外部，有机溶剂通过开在U型结构顶端的取样口萃取待测细胞的待测部位的外泌物质，进而得到含有待测细胞的待测部位的外泌物质的待测样品。
根据本发明的优选实施例，所述有机溶剂包括烃类化合物、羟基类化合物、含氮化合物和含氧化合物中的一种或多种，优选包括甲醇、乙醇、丙醇、丁醇、乙腈、丙酮、甲烷、乙烷、丙烷、丁烷、戊烷和己烷中的一种或多种。
根据本发明的一些实施方式，所述所述锥形末端的一端与所述毛细管连接，另一端为尖端，所述尖端与所述检测装置的进样口相对，毛细管中的待测样品溶液在尖端出口形成喷雾进入检测装置的取样口。
在一些具体的实施例中，所述尖端与所述检测装置的进样口之间的距离为1±0.1cm。
需要说明的是，所述尖端与所述检测装置的进样口相对指的是，所述尖端与所述检测装置的进样口的中心线在一条直线上相对。
根据本发明的一些实施例，所述有机溶剂载有电压(电压范围为500V-5000V，优选为2000V)，从毛细管的一端注入载有电压的有机溶剂，载有电压的液体在锥形末端的尖端由于电压的作用形成电离子化喷雾进入质谱检测器的进样口。
根据本发明的优选实施例，所述检测装置为质谱检测器。
本发明另一方面提供了一种细胞外泌物质采样与原位检测装置，包括：
细胞操纵平台，其上培养有待测细胞；
位于所述细胞操纵平台上方的微流体探针，用于采样得到含有待测细胞的待测部位的外泌物质的待测样品，并送入检测装置；
与所述微流体探针连接的检测装置，用于接收所述待测样品并对其进行检测。
根据本发明的一些实施例，所述细胞操纵平台包括：
载物台；
位于所述载物台上表面的细胞培养装置，所述细胞培养装置内盛装有细胞培养基溶液，用于培养待测细胞；
设置于所述载物台下方的对准装置，用于对待测细胞进行观察和定位。
根据本发明的优选实施方式，所述细胞培养装置优选为培养皿，其设置在所述载物台的上表面，其内盛装有细胞培养基溶液，培养待测细胞。
在一些具体的实施例中，所述待测细胞以102～104个/平方厘米的密度种植在所述培养装置中。
根据本发明那个的优选实施例，所述对准装置设置于所述载物台下方，包括显微镜物镜，可用来对待测细胞进行观察和定位。
根据本发明的一些实施方式，所述微流体探针包括：
用于接收并流通所述有机溶剂并采样的毛细管；
与所述毛细管的一端连接的锥形末端，用于将所述待测样品送入检测装置；
用于固定所述毛细管和锥形末端的固定环。
根据本发明的优选实施例，所述毛细管具有一U型结构，所述U型结构的顶端开有取样口。
根据本发明的一些实施例，所述毛细管的一端连接有机溶剂源，另一端连接所述锥形末端。
根据本发明的一些实施方式，所述毛细管的内径为40-250微米，优选为40微米。
根据本发明的优选实施例，或所述取样口的直径为5-30微米，优选为5微米。
根据本发明的一些实施例，所述锥形末端的一端与所述毛细管连接，另一端为尖端；所述尖端与所述检测装置的进样口相对，毛细管中的待测样品溶液在尖端出口形成喷雾进入检测装置的取样口。
在一些具体的实施例中，所述尖端与所述检测装置的进样口之间的距离为1±0.1cm。
需要说明的是，所述尖端与所述检测装置的进样口相对指的是，所述尖端与所述检测装置的进样口的中心线在一条直线上相对。
根据本发明的一些实施例，所述有机溶剂载有电压(电压范围为500V-5000V，优选为2000V)，从毛细管的一端注入载有电压的有机溶剂，载有电压的液体在锥形末端的尖端由于电压的作用形成电离子化喷雾进入质谱检测器的进样口。
在一些具体的实施例中，所述尖端的内径为10微米。
根据本发明的一些实施方式，所述微流体探针还包括：
用于固定所述毛细管的支撑装置；
将所述支撑装置连接在所述载物台的移动装置，用于使所述支撑装置在载物台上移动，进而移动所述毛细管，以将U型结构的顶端移动到待测细胞的待测部位。
根据本发明的一些实施方式，对于所述支撑装置没有特别的限定，能固定所述毛细管即可；优选所述支撑装置为一透明硬质PVC板，通过胶粘剂与所述毛细管粘合，并与所述移动装置固定连接。
根据本发明的优选实施例，所述检测装置为质谱检测器。
本发明装置的工作过程和工作原理如下：
在载物台上的培养皿中培养待测细胞，通过对准装置观察，调整载物台和移动装置以使微流体探针的毛细管的U型顶端靠近待测细胞的待测部位；从毛细管的一端注入从毛细管的一端注入载有电压压的有机溶剂，有机溶剂在毛细管中流通，有机溶剂通过开在U型结构顶端的取样口萃取待测细胞的待测部位的外泌物质，进而得到含有待测细胞的待测部位的外泌物质的待测样品；待测样品从毛细管的另一端进入锥形末端，由于电压的作用在锥形末端的尖端形成电离子化喷雾进入质谱检测器的进样口，进而进行检测。
本发明的优点和有益技术效果如下：
(1)本发明能够在保持细胞处于原始状态的情况下对细胞外泌物进行采样及原位检测。
(2)本发明通过萃取技术将细胞的溶剂从培养基更换成有机溶剂，大大提高了离子化效率并减弱了水溶性物质的影响(如培养基中的盐类)，从而灵敏度大大提高。
(3)本发明能够实时检测培养中的单个细胞外部不同部位的分泌物种类及水平，从而在部队细胞造成损伤的情况下获得亚细胞水平的代谢信息。
附图说明
在下文中将基于实施例并参考附图来对本发明进行更详细的描述。其中：
图1为本发明实施例的细胞外泌物质采样与原位检测装置的结构示意图；
图2为本发明实施例的微流体探针结构示意图；
图3为本发明实施例的细胞操纵平台结构示意图；
附图标记说明：1、微流体探针；2、细胞操纵平台；3、毛细管第一端口；4、毛细管；5、固定装置；6、固定环；7、锥形末端；8、待测样品；9、进样口；10、细胞培养装置；11、待测细胞；12、载物台；13、对准装置；14、细胞培养基溶液；15、取样口。
在附图中，相同的部件使用相同的附图标记，附图并未按照实际的比例。
具体实施方式
下面将结合附图对本发明作进一步说明。
如图1所示，本发明细胞外泌物质采样与原位检测装置包括微流体探针1、细胞操纵平台2和检测装置。
微流体探针1包括：毛细管4、锥形末端7、固定环6和固定装置5；其中，毛细管4具有一U型结构，所述U型结构的顶端开有取样口15；毛细管4优选为玻璃材质，内径为40-250微米，取样口15的直径优选为5-30微米；毛细管4的第一端口3连接有机溶剂源，第二端口通过固定环6连接锥形末端7；锥形末端7远离毛细管的一端为尖端，其内径为10微米，尖端与所述检测装置的进样口相对；毛细管4通过固定装置5固定，固定装置5通过移动装置连接载物台12，用于使支撑装置在载物台上移动，进而移动毛细管4。
细胞操纵平台2包括载物台12、细胞培养装置10和对准装置13；其中，细胞培养装置10位于载物台12的上表面，其内装有细胞培养基溶液14，并培养有待测细胞11；对准装置13设置于载物台12的下方，优选为一显微镜物镜，用于对待测细胞进行观察和定位。
检测装置优选为质谱检测器，其包括进样口9，与锥形末端7的尖端连接/相对。
实施例1
本实施例选用内径为100μm的玻璃毛细管，其U型结构的顶端开有取样口，取样口的直径为5μm；
在载物台12上的培养皿10中以102～104个/平方厘米的密度种植并培养待测细胞11；通过对准装置13观察，调整载物台12和移动装置以使毛细管4的U型顶端处的取样口15对准待测细胞11的待测部位；
从毛细管的第一端口3注入载有2000V的高压的正己烷，使其毛细管4中流通，通过取样口15与培养基溶液14的接触并萃取待测细胞的待测部位的外泌物质，进而得到含有待测细胞的待测部位的外泌物质的待测样品8；待测样品8从毛细管的另一端进入锥形末端7，在锥形末端7由于高压的作用形成电离子化喷雾进入质谱检测器的进样口9，进而进行检测，产生质谱信号。
虽然已经参考优选实施例对本发明进行了描述，但在不脱离本发明的范围的情况下，各部件的结构、尺寸、设置位置及形状都是可以有所变化的，在本发明技术方案的基础上，凡根据本发明原理对个别部件进行的改进和等同变换，均不应排除在本发明的保护范围之外。
在本发明的描述中，需要理解的是，术语“上”、“下”、“前”、“后”、“竖直”、“水平”、“顶”、“底”“内”、“外”等指示的方位或位置关系为基于附图所示的方位或位置关系，仅是为了便于描述本发明和简化描述，而不是指示或暗示所指的装置或元件必须具有特定的方位、以特定的方位构造和操作，因此不能理解为对本发明的限制。此外，术语“第一”、“第二”等仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性。下面结合附图和实施例对本发明进行详细的描述。
Claims (10)
1.一种细胞外泌物质采样与原位检测方法，包括：
在细胞培养装置中对待测细胞进行培养；
将微流体探针移动到待测细胞的待测部位；
向所述微流体探针内注入有机溶剂，利用有机溶剂萃取待测细胞的待测部位的外泌物质得到待测样品，并送入检测装置。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述微流体探针包括：
用于接收并流通所述有机溶剂的毛细管；
与所述毛细管的一端连接的锥形末端，用于将所述待测样品送入检测装置；
用于固定所述毛细管和锥形末端的固定环。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述毛细管具有一U型结构，所述U型结构的顶端开有取样口；
将所述毛细管的U型结构顶端移动到待测细胞的待测部位，流通在所述毛细管内的有机溶剂通过开在U型结构顶端的取样口萃取待测细胞的待测部位的外泌物质，进而得到含有待测细胞的待测部位的外泌物质的待测样品。
4.根据权利要求1-3中任意一项所述的方法，其特征在于，所述有机溶剂包括烃类化合物、羟基类化合物、含氮化合物和含氧化合物中的一种或多种，优选包括甲醇、乙醇、丙醇、丁醇、乙腈、丙酮、甲烷、乙烷、丙烷、丁烷、戊烷和己烷中的一种或多种。
5.一种细胞外泌物质采样与原位检测装置，包括：
细胞操纵平台，其上培养有待测细胞；
位于所述细胞操纵平台上方的微流体探针，用于采样得到含有待测细胞的待测部位的外泌物质的待测样品，并送入检测装置；
与所述微流体探针连接的检测装置，用于接收所述待测样品并对其进行检测。
6.根据权利要求5所述的装置，其特征在于，所述细胞操纵平台包括：
载物台；
位于所述载物台上表面的细胞培养装置，所述细胞培养装置内盛装有细胞培养基溶液，用于培养待测细胞；
设置于所述载物台下方的对准装置，用于对待测细胞进行观察和定位。
7.根据权利要求5或6所述的装置，其特征在于，所述微流体探针包括：
用于接收并流通所述有机溶剂的毛细管；
与所述毛细管的一端连接的锥形末端，用于将所述待测样品送入检测装置；
用于固定所述毛细管和锥形末端的固定环。
8.根据权利要求5-7中任意一项所述的装置，其特征在于，所述毛细管具有一U型结构，所述U型结构的顶端开有取样口；和/或所述毛细管的内径为40-250微米，优选为40微米；和/或所述取样口的直径为5-30微米，优选为5微米。
9.根据权利要求5-8中任意一项所述的装置，其特征在于，所述锥形末端的一端与所述毛细管连接，另一端为尖端；
所述尖端与所述检测装置的进样口相对，毛细管中的待测样品溶液在尖端出口形成喷雾进入检测装置的取样口。
10.根据权利要求5-9中任意一项所述的装置，其特征在于，所述微流体探针还包括：
用于固定所述毛细管的支撑装置；
将所述支撑装置连接在所述载物台的移动装置，用于使所述支撑装置在载物台上移动，进而使移动所述毛细管，以将U型结构的顶端移动到待测细胞的待测部位。
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