CN104334712A - 用溶剂萃取法操作的低有机可萃取深层过滤器介质 - Google Patents

用溶剂萃取法操作的低有机可萃取深层过滤器介质 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种细胞培养进料、包括化学处理的絮凝进料的初步澄清深层过滤方法，所述进料包含感兴趣的靶生物分子如mAb、哺乳动物细胞培养物或细菌细胞培养物，所述方法利用含有介质的初步澄清深层过滤器，所述介质具有显著较低的冲洗要求，导致冲洗后较低水平的有机萃取物从介质中释放，并且具有对预处理进料流增加的通量，无需使用初步澄清离心步骤或初步澄清切向流微量过滤步骤。用于流体细胞培养进料、包括化学处理的絮凝进料的初步澄清的初步澄清深层过滤装置，含有具有可变孔隙评级的多孔层的多孔深层过滤器介质，并获得在通过具有显著较低冲洗要求的介质过滤的原料中测量的期望水平的总有机萃取物(1-3ppm)，所述进料含有絮凝的细胞碎片和/或具有约0.5μm至约200μm的颗粒大小分布的胶体微粒。还提供试剂盒和使用及制造该试剂盒的方法。

Description

用溶剂萃取法操作的低有机可萃取深层过滤器介质
相关申请
本专利申请要求于2012年6月6日提交的美国临时专利申请61/656,263以及2012年6月27日提交的美国临时专利申请61/664,999的优先权，其全部内容以其整体援引加入。
技术领域
一般来说，本发明涉及用于细胞培养进料初步澄清的低有机可萃取介质。在某些具体实施方案中，本发明提供细胞培养进料等的初步澄清深层过滤方法，其利用含有多孔介质的初步澄清深层过滤装置，所述介质具有显著较低的冲洗要求，导致冲洗后较低水平的有机萃取物从所述介质中释放，并且具有对预处理进料流增加的通量，无需使用初步澄清离心步骤或初步澄清切向流微量过滤步骤。
背景技术
制备包括蛋白如单克隆抗体(mAb)在内的药物级别的生物分子是一个复杂的制备过程，包括设计用来制备用于患者的高质量产物的多种过滤、离心和色谱技术。细胞培养收获物和高固体原料的澄清可以是艰巨的任务，这是由于来自现代化生产批量生物反应器的大体积收获物(≤25,000L)和高细胞密度通常在随后的色谱操作之前需要初步以及二次澄清。因此，细胞收获物和高固体原料如哺乳动物细胞和mAb的制备过程的收获和澄清方案是过去20年左右进行的许多演变和评价的产物。
现在通常期望哺乳动物细胞培养物和mAb的收获技术以高收率(>95％)和最小细胞破裂的方式操作。随着产物分子滴度增加，较高的细胞团和较大量的产物对下游纯化步骤提出挑战。较高的细胞密度在澄清和无菌过滤期间造成困难。较高的产物浓度一般导致增加的杂质负荷且需要较大的色谱设备。因此，提高效率和通量形式的改良大受欢迎。
进料、进料流、原料、细胞培养液等(包括高固体进料，例如含有mAb和哺乳动物细胞培养原料的高固体进料)的初步澄清去除大量生物质，特别是全细胞和其他较大的细胞碎片，然后二次澄清，去除较小的胶体颗粒以及损害下游过滤器容量的其他颗粒。在mAb和哺乳动物细胞培养液和原料的生产过程中，离心通常是初步澄清步骤。
mAb生产商投入了大量时间和精力增加原料的产物滴度。然而，虽然较高滴度增加细胞培养生产率，但是其还产生具有较大量生物质和细胞碎片含量的原料。含有这样较大量生物质和细胞碎片的进料可以在离心后产生高浊度离心物(centrate)。高浊度离心物常减少离心下游使用的二次澄清深层过滤器和随后的无菌过滤器的通量。减少的通量引起一系列问题，从增加的加工成本到加工过程的偏差，这是由于过滤器的堵塞和长期加工延迟。最后，使用离心初步澄清在运行之间需要广泛的经过验证的清洁程序以试图减少批次和治疗性分子物质之间交叉污染的风险。
在期望于相对短的时间内加工多种产物的试验或临床规模的生物治疗药物生产中，这特别有问题。离心清洁程序减慢试验工厂转换至生产不同生物分子的能力，并且大大增加生产运行之间交叉污染的风险。此外，在初步澄清步骤中，离心无法有效地从这些原料去除所有微粒和细胞碎片，因此在离心步骤之后，随后的色谱步骤之前需要利用深层过滤的二次澄清步骤。
或者，已证实连续过滤运行可用于从原料去除不同大小的细胞和细胞碎片，但是通常体积通量限制应用于较小体积(<1000L)，其中过滤器设备具有合理的大小。过滤的使用大大减少交叉污染的风险，并且在运行之间无需清洁和清洁验证，这是由于过滤装置的一次性性质。不幸的是，低通量要求大量的过滤器单元，这可以减少过滤产量，因为每个连续步骤通过过滤器装置和设备的滞留体积造成部分进料溶液的损失。
为了进一步提高澄清性能、通量和下游过滤操作，已使用细胞培养收获物的絮凝。絮凝剂沉淀细胞、细胞碎片和蛋白，这是因为蛋白上的电荷与聚合物(例如聚电解质)上的电荷的相互作用，产生不溶性复合体，并且随后通过剩余电荷相互作用或通过复合体上的疏水斑块桥接不溶性复合体以形成较大的簇集。为了去除这些大簇集，离心步骤或切向流微滤是澄清的主要模式，然后进行二次澄清步骤，由此深层过滤广泛用于在捕获色谱步骤之前澄清细胞培养液。因为离心不可以递送不含颗粒的离心物，下游需要进一步安装深层过滤器(二次深层过滤)和无菌过滤器。
切向流微量过滤(也称为交叉流微量过滤)与离心竞争从哺乳动物细胞培养物收获和澄清mAb和治疗性产物。这种技术提供的一个优点是产生不含颗粒的收获液，需要极少的额外过滤。但是，用于细胞培养收获物的切向流微量过滤膜常受到膜污染问题(即无法挽回的膜通量(flux)下降)的困扰，并且通常需要严格复杂的操作条件，并伴随每次使用之后对每个膜的完全清洁方案(对离心也是如此)。解决切向流微量过滤膜污染问题的一种方式是使用更亲水的膜，其通常被认为较不容易受到显著污染。
深层过滤器澄清介质广泛用于澄清细胞培养进料，并证实具有减少浊度，去除一些可溶杂质例如DNA、宿主细胞蛋白和内毒素的能力。深层过滤器澄清介质通常由纤维素的纤维床材料、湿强度树脂粘结剂和无机助滤剂例如硅藻土构成。树脂粘结剂有助于赋予湿强度，提供吸附电荷以结合杂质和使组合物(即纤维素和助滤剂)材料脱落最小化。硅藻土为过滤器提供高表面积区域，并有助于吸收性能。然而，两种成分(纤维素和树脂粘结剂)已知有助于有机萃取物。因此，这些深层过滤器需要在用于减少有机萃取物之前被冲洗，这可以是昂贵而费时的。基于现存过滤器的上述限制，存在开发具有显著较低的冲洗要求和对预处理进料流增加的通量的下一代深层过滤介质的需要。
发明概述
对于上述需要和与进料、进料流、原料、细胞培养液等的初步澄清工序相关的问题，本发明通过使用初步澄清深层过滤工艺克服挑战，所述初步澄清深层过滤工艺使用初步澄清深度过滤装置，其包含具有显著较低的冲洗要求的多孔介质，导致冲洗后较低水平的有机萃取物从介质中释放，并且具有预处理进料流的增加通量。
本发明还包括用于减少有机萃取物从初步澄清深层过滤介质中释放的方法，由此在冲洗后通过多孔介质过滤的进料中测量的有机萃取物的总水平约为1-3ppm，所述方法包括：
a)提供具有多孔深层过滤器介质的深层过滤装置；
b)用有机溶剂从所述介质中萃取；以及
c)以约10升/m2/小时至约600升/m2/小时的流速冲洗所述介质，由此在冲洗后通过所述介质过滤的原料中测量的有机萃取物的总水平约为1-3ppm。
本发明还包括使用初步澄清深层过滤装置的初步澄清深层过滤方法，所述装置包含多孔介质，所述介质具有显著较低的冲洗要求，导致冲洗后较低水平的有机萃取物从所述介质中释放：
a)提供具有多孔深层过滤器介质的初步澄清深层过滤装置；
b)用有机溶剂从所述介质中萃取；
c)以约10升/m2/小时至约600升/m2/小时的流速冲洗所述介质，由此在冲洗后通过所述介质过滤的原料中测量的有机萃取物的总水平约为1-3ppm；以及
d)冲洗后使原料通过所述介质。
本发明还包括用于含有感兴趣的靶生物分子和多种细胞碎片及胶体微粒的进料、进料流、原料、细胞培养液等的初步澄清的方法，无需使用使用初步澄清深层过滤的初步澄清离心步骤或初步澄清切向流微量过滤步骤，所述初步澄清深层过滤包含多孔介质，所述介质具有显著较低的冲洗要求，导致冲洗后较低水平的有机萃取物从所述介质中释放，所述方法包含：
a)提供具有多孔介质的初步澄清深层过滤装置，所述介质具有显著较低的冲洗要求，导致冲洗后较低水平的有机萃取物从所述介质中释放；
b)提供含有感兴趣的靶生物分子和多种细胞碎片和微粒的进料流，其中所述细胞碎片和微粒具有约0.5μm至约200μm的颗粒大小分布；
c)使多孔深层过滤器介质与所述进料流接触，由此所述深层过滤器介质能以约10升/m2/小时至约300升/m2/小时的流速过滤具有约0.5μm至约200μm的颗粒大小分布的细胞碎片和微粒，由此在冲洗后通过所述介质过滤的原料流中测量的有机萃取物的总水平约为1-3ppm；以及
d)从所述细胞碎片和微粒中分离所述感兴趣的靶生物分子，无需使用初步澄清离心步骤或初步澄清切向流微量过滤步骤。
本发明进一步包含用于含有感兴趣的靶生物分子或生物治疗药物的絮凝进料和絮凝细胞碎片、材料以及胶体微粒的初步澄清的方法，其使用初步澄清深层过滤装置，无需使用初步澄清离心步骤或初步澄清切向流微量过滤步骤，所述方法包含：
a)提供含有多孔介质的深层过滤装置，所述多孔介质具有显著较低的冲洗要求，导致冲洗后较低水平的有机萃取物从所述介质中释放；
b)提供化学絮凝剂；
c)提供含有感兴趣的靶生物分子和多种细胞材料、碎片以及胶体微粒的进料；
d)将所述化学絮凝剂与所述进料组合；
e)在所述进料中形成化学絮凝的细胞材料、碎片和胶体微粒，以及任选地化学絮凝所述感兴趣的靶生物分子；
f)使多孔深层过滤器介质与含有化学絮凝的细胞材料、碎片和胶体微粒的所述进料接触；以及
g)分离感兴趣的絮凝的生物分子种类和多种絮凝的细胞材料，无需使用离心澄清步骤或切向流微量过滤步骤，其中在冲洗后通过所述介质过滤的进料中测量的有机萃取物的总水平约为1-3ppm。
本发明请求保护用于减少来自初步澄清深层过滤器的有机萃取物的方法，其使用具有初步澄清深层过滤装置的萃取系统，所述初步澄清深层过滤装置含有较低有机可萃取介质。
本发明请求保护无需使用初步澄清离心澄清步骤或初步澄清切向流微量过滤步骤的初步澄清。所述深层过滤装置能够以约10升/m2/小时至约600升/m2/小时的流速过滤含有具有约0.5μm至200μm的颗粒大小分布的颗粒的高固体原料，直到TMP达到20psi。本文教导的初步澄清深层过滤器介质包括用有机溶剂萃取的具有可变孔隙评级(pore rating)的分级(graded)多孔层。萃取溶剂HFE-72DE(3MTM St.Paul,MN,USA的NovecTM EngineeredFluid HFE-72DE)或其可能的替代(HFE-71DE、HCFC-141b、Vertrel MCA或Vertrel MCA+)之一均为用于烃和碳氟化合物脂肪(grease)和油的溶剂。
附图说明
并入并构成本说明书的一部分的附图说明目前考虑的本发明的实施方案，并且与说明一起用来解释本发明的原理。
图1A、1B、1C、1D、1E和1F示出根据本发明的初步澄清深层过滤器实施例的不同示意方案，其中图1A、1C和1E示出具有至少7层的初步澄清深层过滤器，用于聚合物絮凝剂(智能聚合物)处理的进料，图1B、1D和1F示出具有至少8层的初步澄清深层过滤器用于化学处理的进料(酸处理)。
图2示出根据本发明的不同实施方案的具有不可萃取介质的初步澄清过滤器在600升/m2/小时的工作流速的冲洗曲线。
图3示出根据本发明的多个实施方案的具有可萃取介质的初步澄清过滤器在600升/m2/小时的工作流速的冲洗曲线。
图4示出根据本发明的多个实施方案的具有可萃取介质的初步澄清过滤器在100升/m2/小时的工作流速的冲洗曲线。
具体实施方案
无论上文或下文引用的所有出版物、专利和专利申请整体援引加入本文，与具体并单独地表明每个单独的出版物、专利或专利申请援引加入本文相同。
为了本说明书和所附权利要求书的目的，除非另有说明，无论是否明确指出，说明书和权利要求书中使用的表示成分的数量、材料的百分比或比例、反应条件的所有数目以及其他数值应理解为在所有情况下受到术语“约”修饰。术语“约”一般指认为等同于所列举的值(即，具有相同功能或结果)的一定范围的数目。在许多情况下，术语“约”可以包括最近的有效数字左右的数目。
因此，除非有相反的指示，以下说明书和所附权利要求书中所示的数值参数为近似值，其可以根据本发明追求获得的期望特性而变化。至少，并且不试图限制将等同原则应用于权利要求的保护范围，每个数值参数应当至少根据报道的有效数字的数目并通过应用普通的舍入技术来理解。
尽管示出本发明的广泛范围的数值范围和参数为近似值，但是具体实例中所示的数值尽可能精确地报道。但是，任何数值固有地包含在它们各自的测试测量中发现的标准差所致的必需的某些误差。此外，本文公开的所有范围应理解为涵盖其中包括的所有亚范围。例如，“1-10”的范围包括最小值1和最大值10之间的任何和所有亚范围(并且包括最小值1和最大值10)，即具有等于或大于1的最小值以及等于或小于10的最大值的任何和所有亚范围，例如5.5-10。
在进一步详细描述本发明之前，会定义许多术语。使用这些术语并不限制本发明的范围，而仅用来方便本发明的描述。
如本文所用，单数形式“一个(a)”、“一个(an)”和“所述(the)”包括复数指代，除非上下文另有明确指定。
本文所用术语“感兴趣的生物分子”可以是期望的靶分子，例如期望的感兴趣的产物或多肽(例如抗体)，或者其可以是需要从含有期望的靶分子的样品去除的不期望的实体。这些不期望的实体包括但不限于例如选自下述的一或多种杂质：宿主细胞蛋白、DNA、RNA、蛋白聚集物(aggregate)、细胞培养添加剂、病毒、内毒素、全细胞和细胞碎片。另外，感兴趣的生物分子也可以通过如本文所述的刺激响应性聚合物或化学处理(例如，酸处理)结合并沉淀。
本文所用术语“捕获步骤”通常指用于将靶分子与刺激响应性聚合物或色谱树脂结合的方法，其产生含有所述靶分子和所述聚合物或树脂的沉淀物的固相。典型地，随后利用洗脱步骤回收靶分子，所述洗脱步骤从固相去除靶分子，从而导致从一种或多种杂质分离靶分子。在不同的实施方案中，所述捕获步骤可以利用色谱介质如树脂、膜或整体柱(monolith)进行，或者利用聚合物如刺激响应性聚合物、聚电解质或结合靶分子的聚合物进行。
本文所用术语“细胞培养添加剂”指某种分子(例如非蛋白添加剂)，其被添加到细胞培养过程中以促进或改善细胞培养或发酵过程。在根据本发明的一些实施方案中，本文所述刺激响应性聚合物结合并沉淀一或多种细胞培养添加剂。示例性的细胞培养添加剂包括消泡剂、抗生素、染料和营养素。
本文所用短语“细胞培养物”包括细胞、细胞碎片和胶体颗粒、感兴趣的生物分子、HCP和DNA。
本文所用术语“色谱”指将感兴趣的分析物(例如靶分子)从混合物中存在的其他分子分离的任意种类的技术。通常，由于混合物的单个分子在移动相影响下迁移通过静止媒介的速率不同，或结合和洗脱过程不同，所述感兴趣的分析物从其他分子中分离。
术语“色谱树脂”或“色谱介质”在本文中可互换使用，并且指任意种类的相(例如固相)，其将感兴趣的分析物(例如靶分子)与混合物中存在的其他分子分离。通常，作为在移动相的影响下，或者在结合和洗脱过程中，混合物中不同分子迁移通过静止固相的速率差异的结果，所关注的分析物从其他分子分离。不同类型的色谱介质的实例包括例如阳离子交换树脂、亲和树脂、阴离子交换树脂、阴离子交换膜、疏水相互作用树脂和离子交换整体柱。
本文所用术语“澄清步骤”通常指最初用于生物分子纯化的一或多个步骤。所述澄清步骤通常包含使用一或多个步骤去除细胞和/或细胞碎片，所述一个或多个步骤包括任何以下单独步骤或它们的各种组合，例如离心和深层过滤、沉淀、絮凝和沉降。在一些实施方案中，本发明提供对常用于不同纯化方案的传统和澄清步骤的改进。澄清步骤通常包括去除一或多种不期望的实体，并且通常在包括捕获期望的靶分子的步骤之前进行。澄清的另一方面是去除样品中的可溶性和不溶性成分，所述成分后来可导致纯化过程中的无菌过滤器污染，由此使得整个纯化过程更经济。
在一些实施方案中，纯化过程另外使用一或多个“色谱步骤”。典型地，如有必要，这些步骤可在使用根据本发明的刺激响应性聚合物将靶分子从一或多种不期望的实体中分离后进行。
本文所用术语“组合物”、“溶液”或“样品”指利用本文所述的一或多种刺激响应性聚合物或化学处理(例如，酸处理)纯化的靶分子或期望产物与一种或多种不期望的实体或杂质的混合物。在一些实施方案中，所述样品包含原料或细胞培养基，靶分子或期望的产物分泌入所述培养基。在一些实施方案中，所述样品包含靶分子(例如治疗性蛋白或抗体)与一或多种杂质(例如宿主细胞蛋白、DNA、RNA、脂质、细胞培养添加剂、细胞和细胞碎片)。在一些实施方案中，所述样品包含分泌到细胞培养基中的感兴趣的靶分子。
术语“中国仓鼠卵巢细胞蛋白”和“CHOP”在本文可互换使用，指来自中国仓鼠卵巢(“CHO”)细胞培养物的宿主细胞蛋白(“HCP”)的混合物。HCP或CHOP通常作为杂质存在于细胞培养基或裂解物(例如收获的含有感兴趣的蛋白或多肽(例如CHO细胞中表达的抗体或免疫粘附素)的细胞培养液)中。通常，包含感兴趣的蛋白的混合物中存在的CHOP的量提供感兴趣的蛋白的纯度的度量。典型地，蛋白混合物中的CHOP的量以相对于混合物中感兴趣的蛋白的量的百万分比表示。
术语“污染物”、“杂质”和“碎片”在本文中可互换使用，指任意外源或有害材料，包括生物高分子例如DNA、RNA、一或多种宿主细胞蛋白(HCP或CHOP)、内毒素、病毒、脂质以及一或多种添加剂，其可存在于含有感兴趣的蛋白或多肽(例如抗体)的样品中，使用根据本发明的刺激响应性聚合物将所述蛋白或多肽从一或多种所述外源或有害分子中分离。在一些实施方案中，本文所述的刺激响应性聚合物从含有感兴趣的蛋白或多肽以及一或多种杂质的样品结合并沉淀所关注的蛋白或多肽。在其他实施方案中，本文所述的刺激响应性聚合物结合并沉淀一或多种杂质，从而将感兴趣的多肽或蛋白从一或多种杂质中分离。
应当理解当所述宿主细胞为其他哺乳动物细胞类型、大肠杆菌、酵母细胞、昆虫细胞或植物细胞时，HCP指在宿主细胞的裂解物中找到的除靶蛋白之外的蛋白。
本文所用术语“深层过滤器”(例如梯度-密度深层过滤器)在过滤器材料深度内完成过滤。这类过滤器的常见类型是包含连接(或者固定)的随机基质以形成流动通道的复杂的曲折迷宫的过滤器。在这些过滤器中的颗粒分离通常由纤维基质截留或吸附至纤维基质所致。用于细胞培养液和其他原料的生物加工的最常用的深层过滤器介质由纤维素纤维、助滤剂如DE以及带正电荷的树脂粘结剂组成。不像绝对过滤器，深层过滤器介质在整个多孔介质截留颗粒，允许截留大于和小于孔径的颗粒。颗粒截留被认为包括通过疏水、离子和其他相互作用来大小排阻和吸附。污染机制可包括孔堵塞、滤饼形成和/或孔收缩。深层过滤器是有利的，因为它们去除污染物，并且还是一次性形式，从而消除了验证问题。
本文所用术语“可萃取的”指在适合的溶剂存在的情况下，污染物能够潜在地迁移或从塑料和聚合物化合物中萃取入生物药物或药物制剂等，所述塑料和聚合物化合物例如用于制造过滤器介质或膜、过滤器壳体介质或膜支撑层、环形垫圈或所述过滤器的任意其它聚合成分。
本文所用术语“萃取剂”通常指具有良好清洗性能的液体物质。它们增加的溶解力、低表面张力、耐燃性和稳定性使得其很适合用于蒸气脱脂应用。它们专门用于耐用地清洗土壤的例如油、脂肪和蜡的媒介。包括HFE-71DE、HFE-72DE、HCFC-141b、Vertrel MCA或Vertrel MCA+的溶剂均为用于烃和碳氟化合物脂肪和油的溶剂；所述溶剂还泡胀大多数弹性体。高溶解力和低毒性使得它们成为破坏臭氧层化合物、氯化溶剂以及溴丙烷的理想替代物。
本文所用术语“絮凝”指向溶剂中添加本文所述的絮凝剂如聚合物或化学处理(例如酸处理)，从而去除一或多种悬浮的不溶性或可溶性杂质。必须将聚合物以允许自发形成不溶性聚合体的浓度加入溶液，所述不溶性团聚体能通过典型的固液分离方法从溶液中去除。
在使用本文所述的刺激响应性聚合物从包含靶分子和一或多种杂质的组合物或样品中纯化靶分子(例如感兴趣的多肽或蛋白)的情况下，术语“分离(isolating)”、“纯化”和“分离(separating)”在本文中可互换使用。在一些实施方案中，通过利用本文所述的刺激响应性聚合物从样品中去除(完全或部分)一或多种杂质，增加样品中靶分子的纯度。在另一个实施方案中，通过将靶分子从样品中的一或多种杂质中沉淀，增加样品中靶分子的纯度。
本文所用短语“低(low)或较低(lower)有机可萃取介质”指一种介质，当用有机溶剂萃取时，导致萃取物的去除，所述萃取物能在夸张的时间和温度条件下从材料中迁移进入包括水的溶剂。
本文所用术语“单克隆抗体”指获自一群实质上均质的抗体的抗体，即构成该群的各个抗体除了少量可能天然存在的突变之外是相同的。
术语“百万分之(parts per million)”或“ppm”在本文中可互换使用，指使用本文所述的刺激响应性聚合物纯化的期望的靶分子(例如靶蛋白或抗体)的纯度的度量。相应地，该度量可用于测量纯化过程后存在的靶分子量，或测量不期望的实体的量。在一些实施方案中，本文所用的单位“ppm”指以毫克/毫升计的感兴趣的蛋白中的以纳克/毫升计的溶液中的杂质例如HCP或CHOP的量(即CHOP ppm＝(CHOP ng/ml)/(感兴趣的蛋白mg/ml))。当所述蛋白是干燥的时(例如通过低压冻干法)，ppm指(CHOP ng)/(感兴趣的蛋白mg))。
术语多肽的“pI”或“等电点”在本文中可互换使用，指多肽的正电荷与其负电荷平衡的pH值。pI可由多肽的氨基酸残基或多肽携带的糖的唾液酸残基的净电荷计算而得，或由等电点聚焦确定。
本文所用术语“沉淀”指将结合(例如在具有感兴趣的生物分子的复合物中)或不结合聚合物或其他可溶性物质从水性和/或可溶性状态改变成非水性的和/或不溶性状态。
本文所用术语“孔径”和“标称(nominal)孔径”指保留60-98％比率的大部分微粒的孔径。
术语“多肽”或“蛋白”在本文中可互换使用，通常指具有多余约10个氨基酸的肽和蛋白。在一些实施方案中，本文所述的刺激响应性聚合物用于从与蛋白或多肽一同存在于样品中的一或多种不期望的实体中分离蛋白或多肽。在一些实施方案中，所述一或多种实体是可以与被纯化的蛋白或多肽一同存在于样品中的一或多种杂质。如上讨论，在一些实施方案中，本文所述的刺激响应性聚合物在将刺激加入样品时特异性地结合并沉淀感兴趣的蛋白或多肽。在其他实施方案中，在加入刺激时，本文所述的刺激响应性聚合物结合并沉淀除感兴趣的蛋白或多肽以外的实体，例如宿主细胞蛋白、DNA、病毒、全细胞、细胞碎片和细胞培养添加剂。
本文所用短语“初步澄清深层过滤器”指能够去除全细胞和细胞碎片，从而伴随着含有感兴趣的靶生物分子和多种细胞碎片以及胶体微粒的进料的初步澄清的过滤器，无需使用初步澄清离心步骤或初步澄清切向流微量过滤步骤。
术语“感兴趣的蛋白”、“靶多肽”、“感兴趣的多肽”和“靶蛋白”在本文中可互换使用，通常指治疗性蛋白或多肽，包括但不限于使用根据本发明的刺激响应性聚合物纯化的抗体。
在一些实施方案中，使用本文所述的刺激响应性聚合物分离(isolate)、分离(separate)或纯化感兴趣的多肽或蛋白的“纯化步骤”可以是产生“均质”或“纯”组合物或样品的总纯化方法的一部分，本文所用的该术语是指组合物或样品，其在包含感兴趣的蛋白的组合物中包含少于100ppmHCP，或者少于90ppm，少于80ppm，少于70ppm，少于60ppm，少于50ppm，少于40ppm，少于30ppm，少于20ppm，少于10ppm，少于5ppm，或少于3ppm HCP。本文所用“初步澄清”包括用絮凝剂去除聚集的细胞生物质，包括尺寸大于约10微米(μm)的絮凝的细胞碎片和胶体微粒或较小的颗粒。
本文所用术语“盐”指通过酸和碱的相互作用形成的化合物。可用于本文所述方法中采用的不同缓冲液的不同的盐包括但不限于乙酸盐(例如乙酸钠)、柠檬酸盐(例如柠檬酸钠)、氯化物(例如氯化钠)、硫酸盐(例如硫酸钠)或钾盐。本文所用术语“溶剂”通常指能够溶解或分散一或多种其他物质以提供溶液的液体物质。溶剂包括水性和有机溶剂，其中有用的有机溶剂包括非极性溶剂、乙醇、甲醇、异丙醇、乙腈、己二醇、丙二醇和2,2-硫双乙醇。
术语“靶分子”、“靶生物分子”、“期望的靶分子”和“期望的靶生物分子”在本文中可互换使用，通常指感兴趣的多肽或产物，其被期望从一或多种不期望的实体中纯化或分离，所述不期望的实体例如可以存在于含有所述感兴趣的多肽或产物的样品中的一或多种杂质。
本文所用术语“通量”指通过过滤器过滤的体积。
在本发明中，开放的分级层的使用允许较大的颗粒透过，并在过滤器的深层内被捕获，而不是收集在表面上。
优势是较高的通量，并且保留大的固体(约0.5微米至约200微米)，同时消除了滤饼形成的问题。在初步澄清过滤器中使用开放孔为这些深层过滤器提供压力的线性增加，固体保留，而压力没有显著增加，因此产生高通量。过滤器的结构尺寸结合层的优化(孔径和厚度)产生了卓越的过滤特性，其可以保留大量固体。
在本发明中，开放的分级层的使用允许进料流中较大的絮凝颗粒透入过滤器深层，并在过滤器的孔内被捕获，而不是收集在表面上。本文提供的初步澄清深层过滤器这样设置：“开放的”顶层构成所述深层过滤器的粗滤(prefiltration)区以捕获较大的絮凝颗粒，而底层构成精滤(polishing)区，其捕获较小的残留的聚集絮凝颗粒。
具有该类型设置的初步澄清深层过滤器展现出如下优势：(i)较高通量，(ii)较大絮凝固体的保留，以及(iii)消除滤饼形成的问题。在本文教导的初步澄清过滤器中使用所述开放孔提供压力的线性增加，固体保留，而压力没有显著增加，由此产生更高、更期望的通量。
根据本发明的初步澄清深层过滤器的实例如图1A、1B、1C、1D、1E和1F所示，其中图1A、1C和1E示出具有至少7或8层的初步澄清深层过滤器，并在用聚合物絮凝剂(例如智能聚合物或传统絮凝剂)处理细胞培养进料时使用。
图1B、1D和1F示出具有至少7层的初步澄清深层过滤器，并在用化学处理的进料(例如酸处理)处理细胞培养进料时使用。
图1A所示的初步澄清深层过滤器示出当用聚合物絮凝剂(例如智能聚合物)处理细胞培养进料时使用的初步澄清深层过滤器，其具有非织造纤维如聚丙烯的约100微米标称孔径的两(上)层，约0.4cm厚，具有非织造纤维如聚丙烯的约50微米标称孔径的另外两层，约0.4cm厚，具有非织造纤维如聚丙烯的约25微米标称孔径的另外两层，约0.4cm厚，然后约0.35cm厚的诸如纤维素(CE25)材料的单层，以及约0.35cm厚的诸如硅藻土(DE40)材料的另一单层。
图1B所示的初步澄清深层过滤器示出当化学处理(例如酸处理)细胞培养进料时使用的初步澄清深层过滤器，其具有非织造纤维如聚丙烯的约25微米标称孔径的两(上)层，约0.4cm厚，具有非织造纤维如聚丙烯的约10微米标称孔径的另外两层，约0.4cm厚，具有非织造纤维如聚丙烯的约5微米标称孔径的另外两层，约0.4cm厚，然后约0.35cm厚的诸如纤维素(CE25)材料的单层，然后约0.35cm厚的诸如硅藻土(DE40)材料的另一单层。可以选择纤维素或硅藻土层作为最低(底)层。
图1C所示的初步澄清深层过滤器示出当用聚合物絮凝剂(例如智能聚合物)处理细胞培养进料时使用的初步澄清深层过滤器，其具有包含非织造纤维如聚丙烯的约100微米标称孔径的两(上)层，约0.4cm厚，具有非织造纤维如聚丙烯的约100微米标称孔径的另外两层，约0.4cm厚，具有包含非织造纤维如聚丙烯的约100微米标称孔径的另外两层，约0.4cm厚，然后约8微米厚的非织造纤维如聚丙烯的单层(底部)，约0.2cm厚。
图1D所示的初步澄清深层过滤器示出当化学处理(例如酸处理)细胞培养进料时使用的初步澄清深层过滤器，其具有包含非织造纤维如聚丙烯的约50微米标称孔径的两(上)层，约0.4cm厚，具有非织造纤维如聚丙烯的约25微米标称孔径的另外两层，约0.4cm厚，具有非织造纤维如聚丙烯的约10微米标称孔径的另外两层，约0.4cm厚，然后约0.35cm厚的诸如纤维素(CE25)材料的单层，然后约0.35cm厚的诸如硅藻土(DE40)材料的另一单层。可以选择纤维素或硅藻土层作为最低(底)层。
图1E所示的初步澄清深层过滤器示出当用聚合物絮凝剂(例如智能聚合物)处理细胞培养进料时使用的初步澄清深层过滤器，其具有包含非织造纤维如聚丙烯的约100微米标称孔径的两(上)层，约0.4cm厚，具有非织造纤维如聚丙烯的约50微米标称孔径的另外两层，约0.4cm厚，具有包含非织造纤维如聚丙烯的约25微米标称孔径的另外两层，约0.4cm厚，然后约0.35cm厚的诸如纤维素(CE25)材料的单层，以及约0.35cm厚的诸如硅藻土(DE40)材料的另一单层。
图1F所示的初步澄清深层过滤器示出当化学处理(例如酸处理)细胞培养进料时使用的初步澄清深层过滤器，其具有包含非织造纤维如聚丙烯的约35微米标称孔径的两(上)层，约0.4cm厚，具有非织造纤维如聚丙烯的约15微米标称孔径的另外两层，约0.4cm厚，具有包含非织造纤维如聚丙烯的约10微米标称孔径的另外两层，约0.4cm厚，然后约0.35cm厚的诸如纤维素(CE25)材料的单层，然后约0.35cm厚的诸如硅藻土(DE40)材料的另一单层。可以选择纤维素或硅藻土层作为最低(底)层。
本文中使用效率参数K描述对具体原料的固体含量归一的过滤效率。参数K允许对具有不同固体含量的进料的过滤进行有效比较。
以下提供的实施例用于向本领域技术人员提供关于如何制备本发明的组合物以及如何实施本发明的方法的完整公开和描述，并且不是为了限制发明人考虑其发明的保护范围。已努力确保所用数字(例如量、温度等)的准确度，但是应当考虑一些实验误差和偏差。除非另有说明，温度以摄氏度C计，化学反应在大气压或跨膜压下进行，如本文所示，术语“环境温度”指约25℃，“环境压力”指大气压。本发明将通过以下实施例进一步阐明，所述实施例意在例示本发明。
实施例
实施例1
图2示出具有不可萃取介质的初步澄清过滤器在600升/m2/小时的工作流速的冲洗曲线。
在有代表性的实验中，由非织造纤维、纤维素和硅藻土(DE)分级层或非织造纤维分级层组成的深层过滤器在600升/m2/小时的流速下冲洗约100L/m2。如图1所示，由非织造纤维、纤维素和硅藻土(APC和BPC)分级层组成的深层过滤器的冲洗曲线具有约8-10ppm的TOC，而由非织造纤维(CPC)分级层组成的深层过滤器具有约4ppm的TOC。对于约100L/m2的冲洗体积，对照深层过滤器(D0HC)的TOC(ppm)为1-3ppm。
实施例2
图3示出根据本发明的多个实施方案的具有可萃取介质的初步澄清过滤器在600升/m2/小时的工作流速的冲洗曲线。
在有代表性的实验中，由可萃取的非织造纤维、纤维素和硅藻土(DE)分级层或可萃取的非织造纤维分级层组成的深层过滤器在600升/m2/小时的流速下冲洗约100L/m2。非织造纤维过滤器介质滚筒(直径12.5”，宽16”)用3M的氢碳氟化合物溶剂(HFE–72E)在TSC萃取器中萃取，喷雾时间1200min，干燥时间1500min。对于约100L/m2的冲洗体积，由非织造纤维、纤维素和硅藻土(APC和BPC)分级层组成的深层过滤器的冲洗曲线具有约1-3ppm的TOC，而无冲洗体积时由非织造纤维(CPC)分级层组成的深层过滤器具有低于1ppm的TOC。对于约100L/m2的冲洗体积，对照深层过滤器(D0HC)的TOC(ppm)为1-3ppm。即使具有可萃取的非织造介质的APC和BPC深层过滤器具有与D0HC大概相同的100L/m2冲洗体积，以达到目标的1-3ppm的TOC，APC和BPC的柱体积比D0HC多一倍，这表明冲洗体积减少一半，这样能显著减少具有较高通量的初步澄清深层过滤器的整个过程的冲洗。
实施例3
图4示出根据本发明的多个实施方案的具有可萃取介质的初步澄清过滤器在100升/m2/小时的工作流速的冲洗曲线。
在有代表性的实验中，由可萃取的非织造纤维、纤维素和硅藻土(DE)或可萃取的非织造纤维分级层组成的深层过滤器在600升/m2/小时的流速下冲洗约100L/m2。非织造纤维过滤器介质滚筒(直径12.5”，宽16”)用3M的水化碳氟化合物溶剂(HFE–72E)在TSC萃取器中萃取，喷雾时间1200min，干燥时间1500min。对于约90L/m2的冲洗体积，由非织造纤维、纤维素和硅藻土(APC和BPC)分级层组成的深层过滤器的冲洗曲线具有约1-3ppm的TOC，而无冲洗体积时由非织造纤维(CPC)分级层组成的深层过滤器具有低于1ppm的TOC。对于约100L/m2的冲洗体积，对照深层过滤器(D0HC)的TOC(ppm)为1-3ppm。
实施例4
用于可萃取的和不可萃取的非织造纤维的静态浸泡实验。
在有代表性的实验中，用水化碳氟化合物溶剂(Dupont的VertrelMCA+，3M的HFE–72E)萃取非织造纤维介质的圆盘(disk)，浸泡时间1分钟，80℃下干燥时间1小时。23cm2的可萃取的和不可萃取的非织造圆盘在50ml Milli-Q水中浸泡1小时，并分析总有机萃取物(TOC)。所有可萃取样品的TOC低于1ppm，然而所有非织造可萃取样品的TOC较高。表1比较了可萃取的和不可萃取的非织造纤维的总有机萃取物(TOC)。
表1 可萃取和不可萃取介质的总有机萃取物(TOC)比较。
构成材料 标称孔隙评级(μm) 萃取溶剂 TOC(ppm)
聚丙烯 200 无 3
聚丙烯 200 Vertrel MCA+ <1
聚丙烯 200 HFE-72E <1
聚丙烯 50 无 5
聚丙烯 50 Vertrel MCA+ <1
聚丙烯 50 HFE-72E <1
聚丙烯 5 无 4
聚丙烯 5 Vertrel MCA+ <1
聚丙烯 5 HFE-72E <1
实施例5
具有可萃取和不可萃取介质的深层过滤器去除聚集的和小生物分子微粒的过滤性能。
使用以下方法测试实施例1-2的APC过滤器装置的过滤性能。用1M冰醋酸处理未澄清的细胞培养收获物，将pH值调至4.8，搅拌30分钟。在用Milli-Q水冲洗后，深层过滤器操作未处理的和酸处理的未澄清进料，用压力传感器监测通过每个过滤器的TMP。先用≥约50L Milli-Q水冲洗所述深层过滤器，每平方米过滤器面积600L/m2/h，以湿润所述过滤器介质并冲出萃取物。未处理的和酸沉淀的未澄清收获物以100L/m2/h加载，直至通过任意一个过滤器的TMP达到20psig。
表2比较了filter(D0HC)与可萃取的和不可萃取的初步澄清深层过滤器对酸处理的进料的过滤通量。
表2 具有可萃取和不可萃取介质的初步澄清(APC)深层过滤器对酸处理的进料(pH＝4.8)的过滤通量比较。
实施例6
具有可萃取和不可萃取介质的深层过滤器去除聚集的和小生物分子微粒的过滤性能。
使用以下方法测试实施例1-2的CPC过滤器装置的过滤性能。在用Milli-Q水冲洗后，深层过滤器操作未处理的和SmP处理的未澄清进料，用压力传感器监测通过每个过滤器的TMP。用0.2wt％智能聚合物(SmP)剂量(wt％)处理未澄清的细胞培养收获物，搅拌15分钟。先用≥约50L Milli-Q水冲洗所述深层过滤器，每平方米过滤器面积600L/m2/h，以湿润所述过滤器介质并冲出萃取物。未处理的和SmP处理的未澄清收获物以100L/m2/h加载，直至通过任意一个过滤器的TMP达到20psig。
表3比较了filter(D0HC)与可萃取的和不可萃取的初步澄清深层过滤器对实施例3中描述的进料(0.2％(w/v)智能聚合物(SmP)处理的进料)的过滤通量。
表3 实施例1-2中所述的初步澄清(CPC)深层过滤器对0.2％(w/v)智能聚合物(SmP)处理的进料的过滤通量比较。
上文所示的公开可以涵盖具有独立功用的多个不同发明。虽然这些发明中的每一个以其优选形式公开，并不认为如本文公开和说明的其具体实施方案具有限制意义，因为许多变化是可能的。本发明的主题包括本文公开的各种元件、特征、功能和/或特性的所有新的和非显而易见的组合和亚组合。以下权利要求特别指出认为新的和非显而易见的某些组合和亚组合。特征、功能、元件和/或特性的其他组合和亚组合中包含的发明可以在从这个或相关申请要求优先权的申请要求保护。无论涉及不同发明或相同发明，并且无论范围广于、窄于、等于或不同于原始权利要求，还认为这样的权利要求包括在本文所教导的发明的主题内。

Claims (26)

1.用于减少从初步澄清深层过滤介质中释放有机萃取物的方法，由此在冲洗后通过所述介质过滤的进料中测量的有机萃取物的总水平约为1-3ppm，所述方法包括：
a)提供具有多孔深层过滤器介质的深层过滤装置；
b)用有机溶剂从所述介质中萃取；以及
c)以约10升/m2/小时至约600升/m2/小时的流速冲洗所述介质，由此冲洗后通过所述介质过滤的原料中测量的有机萃取物的总水平约为1-3ppm。
2.权利要求1的方法，其中所述深层过滤器包含至少2个非织造纤维分级层。
3.权利要求1的方法，其中所述萃取剂选自HFE-71DE、HFE-72DE、HCFC-141b、Vertrel MCA或Vertrel MCA+，所有溶剂均用于烃和碳氟化合物脂肪和油。
4.权利要求1的方法，其中所述深层过滤器包含至少3个非织造纤维分级层。
5.权利要求4的方法，其中所述分级层具有约0.3cm至约3cm的总厚度。
6.权利要求1的方法，其中所述细胞碎片和胶体微粒具有约0.5μm至约200μm的颗粒大小分布，以及大于约10μm的平均颗粒大小。
7.权利要求2的方法，其中所述深层过滤器介质包含非织造纤维、纤维素和硅藻土分级层的复合物，所述分级层具有开放的标称孔隙大小评级，足以过滤化学絮凝的原料。
8.权利要求1的方法，其中所述感兴趣的靶生物分子包括单克隆抗体(mAb)、多克隆抗体和生物治疗药物。
9.权利要求1的方法，其中所述化学絮凝剂是聚合物或酸。
10.权利要求1的方法，其中所述化学絮凝剂是智能聚合物。
11.权利要求10的方法，其中所述智能聚合物是改性聚胺。
12.权利要求9的方法，其中所述酸是乙酸。
13.权利要求4的方法，其中所述非织造纤维包含聚丙烯、聚乙烯、聚酯或尼龙。
14.初步澄清深层过滤方法，其使用含有多孔介质的初步澄清深层过滤装置，冲洗后具有较低水平的有机萃取物从所述介质释放，所述方法包含：
a)提供具有多孔深层过滤器介质的初步澄清深层过滤装置；
b)用有机溶剂从所述介质中萃取；以及
c)以约10升/m2/小时至约600升/m2/小时的流速冲洗所述介质，
d)产生较低有机可萃取介质，由此通过所述介质过滤的原料中测量的有机萃取物的总水平约为1-3ppm；以及
d)使原料通过所述介质。
15.权利要求14的方法，其中所述深层过滤器包含至少2个非织造纤维分级层。
16.权利要求14的方法，其中所述萃取剂选自HFE-71DE、HFE-72DE、HCFC-141b、Vertrel MCA或Vertrel MCA+，所有溶剂均用于烃和碳氟化合物脂肪和油。
17.权利要求14的方法，其中所述深层过滤器包含至少3个非织造纤维分级层。
18.权利要求17的方法，其中所述分级层具有约0.3cm至约3cm的总厚度。
19.权利要求14的方法，其中所述细胞碎片和胶体微粒具有约0.5μm至约200μm的颗粒大小分布，以及大于约10μm的平均颗粒大小。
20.权利要求15的方法，其中所述深层过滤器介质包含非织造纤维、纤维素和硅藻土分级层的复合物，所述分级层具有开放的标称孔隙大小评级，足以过滤化学絮凝的原料。
21.权利要求14的方法，其中所述感兴趣的靶生物分子包括单克隆抗体(mAb)、多克隆抗体和生物治疗药物。
22.权利要求14的方法，其中所述化学絮凝剂是聚合物或酸。
23.权利要求14的方法，其中所述化学絮凝剂是智能聚合物。
24.权利要求23的方法，其中所述智能聚合物是改性聚胺。
25.权利要求22的方法，其中所述酸是乙酸。
26.权利要求14的方法，其中所述非织造纤维包含聚丙烯、聚乙烯、聚酯或尼龙。
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